治療腫瘤的自體免疫細胞及其製備方法
2023-05-23 15:36:16
專利名稱：治療腫瘤的自體免疫細胞及其製備方法
技術領域：
本發明涉及醫學生物工程技術領域，是一種治療腫瘤的自體免疫細胞及其製備方法。
背景技術：
眾所周知，腫瘤目前已成為人類的第一殺手。正常人每天都可能產生突變的瘤細胞，只因為有自身免疫系統的防禦監控作用而不發生腫瘤。大量研究資料表明腫瘤的發生和腫瘤細胞逃避免疫反應的主要機制有兩方面，一方面是腫瘤細胞的免疫原性低，其主要組織相容性複合體MHC分子表達異常，使T細胞對抗原不能識別，因而不能激活T細胞殺傷腫瘤細胞；另一方面，由於腫瘤病人的抗原遞呈細胞功能缺陷，無法有效地遞呈腫瘤抗原，因此不能激發機體混合淋巴細胞反應和腫瘤特異性細胞毒性效應CTL反應，從而影響機體產生特異性的抗瘤排斥作用，造成腫瘤在體內不斷生長，並廣泛播散，最終影響多臟器功能。目前，臨床上主要的治療手段採用手術切除瘤體，放療，化療。放療、化療存在特異性差，毒副作用強，效果不確定等缺點，對於已發生轉移的腫瘤病人，手術切除也不能取得令人滿意的療效。
發明內容
本發明針對腫瘤病人的抗原遞呈細胞功能缺陷，以及腫瘤細胞免疫原性低，不能激發自身免疫系統的防禦監控作用的特點，採用病人自體外周血中獲得的單核細胞，加細胞因子，誘導並擴增出有效數量的抗原遞呈細胞，並用自體腫瘤中提取的mRNA致敏此細胞製備出能夠特異表達自體腫瘤抗原，並能高表達抗原遞呈作用的抗原遞呈細胞，進而調動自身免疫功能誘導出強烈的抗腫瘤免疫效應，實現抑瘤，殺瘤作用。其優點有(1)由於採用的是自體腫瘤抗原，其特異性強，安全性高，可明顯誘導出抗自體腫瘤的特異性CTL，而對體內正常細胞無損傷作用，並有利於重建對該腫瘤的防禦監控能力，防止復發。(2)由於治療過程中所用細胞和mRNA均來源於病人自身組織，沒有外源基因的導入，故可杜絕感染其他疾病的可能。(3)毒副作用小，和傳統的放療、化療相比，運用該法無噁心、嘔吐、脫髮等不良反應，經試用可顯著提高病人的生存質量。(4)從病人外周血中分離獲得單核細胞，加入細胞因子來誘導並擴增有效數量的抗原遞呈細胞的方法，易於操作。
本發明製備方法如下一、製備腫瘤組織mRNA1、製備組織勻漿將手術當時取下的鮮活瘤體組織，立即放置在液氮罐中，然後取出稱重，並在低溫狀態下超聲粉碎，得組織勻漿。
2、製備mRNA以每克組織加1ml的比例將mRNA提取試劑TRI201 REAGENT加入組織勻漿，混勻後吸到無菌離心管，在15-30℃孵育5分鐘。再以每毫升TRI201 REAGENT加0.2ml氯仿的比例加入氯仿，加蓋後快速顛倒混勻，在15-30℃孵育2-3分鐘。在2-8℃下，以12000g離心15分鐘，取上層無色水相至處理過的無菌離心管中。根據前面的TRI201 REAGENT加入量按每毫升加0.5ml異丙醇的比例在上清液中加入異丙醇，置15-30℃孵育10分鐘。在2-8℃下以12000g離心10分鐘。棄上清，沉澱中加75％酒精洗滌，加入量與前面加入的TRI201 REAGENT相同，混勻後在2-8℃下以7500g離心5分鐘，棄上清，得mRNA沉澱，溫室乾燥後，溶於無RNA酶的去離子水中，置-70℃低溫保存備用。
二、製備抗原遞呈細胞1、製備白細胞在無菌條件下由靜脈抽取病人外周血400ml，加檸檬酸-右旋葡萄糖ACD-A 125u/ml抗凝，用水平離心機以2800轉/分離心10分鐘，取白膜層得1-2×109個白細胞懸液備用。餘下血漿及紅細胞回輸病人。
2、製備單核細胞用淋巴細胞分離液從上述收集的白細胞懸液中分離得到單核細胞，或直接用血細胞分離機從病人外周血收集3×107個單核細胞。用完全培養基懸浮細胞，以1×107個細胞/袋的數量分裝入血袋培養，共三袋。37℃5％CO2孵箱培養2小時後，用貼壁法從單核細胞中分離獲得貼壁的單核細胞。
3、製備抗原遞呈細胞在獲得的單核細胞中再加入含有細胞因子升白能(rhGM-CSF)20ug/ml，和白細胞介素-4(rhIL-4)8ug/ml的完全培養基100ml/袋，培養過程中，每3天以半量培養基換液一次，誘導生成所需的抗原遞呈細胞。
三、製備治療腫瘤的自體免疫細胞——負載腫瘤抗原的抗原遞呈細胞在誘導生成所需的抗原遞呈細胞期間，進行脂質體介導的腫瘤細胞mRNA轉染抗原遞呈細胞。首先將分離所得的單核細胞培養48小時，然後將製備好的腫瘤細胞mRNA20ul和脂質體20ul混勻，加入培養細胞中，進行脂質體介導的腫瘤細胞mRNA轉染抗原遞呈細胞，轉染時間為4小時。按以上方法於培養的第5天再轉染一次。培養第8天加腫瘤壞死因子TNF-α250ng/袋，促進負載腫瘤抗原的抗原遞呈細胞的成熟。常規培養至該細胞成熟，收集成熟細胞，用生理鹽水洗2次，以1500轉/分鐘離心10分鐘。製備的細胞以5×105個/袋分裝，每天靜脈輸入一袋，連輸三天。
具體實施例方式一、製備腫瘤組織mRNA。
1、製備組織勻漿將手術當時取下的鮮活瘤體組織，立即放置在液氮罐中。然後取出稱重，按常規在低溫狀態下超聲粉碎，每次超聲30秒，共50次，注意防止RNA的降解，得組織勻漿。
2、製備mRNA以每克組織加1ml的比例將TRI201 REAGENT加入組織勻漿，混勻後吸到無菌離心管，在15-30℃孵育5分鐘。再以每毫升TRI201 REAGENT加0.2ml氯仿的比例加入氯仿，加蓋後快速顛倒混勻，在15-30℃孵育2-3分鐘。在2-8℃下，以12000g離心15分鐘，取上層無色水相至處理過的無菌離心管中。根據前面的TRI201 REAGENT加入量按每毫升加0.5ml異丙醇的比例在上清液中加入異丙醇，置15-30℃孵育10分鐘。在2-8℃下12000g離心10分鐘。棄上清，沉澱中加75％酒精洗滌，加入量與前面加入的TRI201 REAGENT相同，混勻後在2-8℃下7500g離心5分鐘，棄上清，得mRNA沉澱，溫室乾燥後，溶於無RNA酶的去離子水中，置-70℃低溫保存備用。
二、製備抗原遞呈細胞1、製備白細胞在無菌條件下由靜脈抽取病人外周血400ml，加125u/mlACD-A抗凝，用水平離心機以2500g離心10分鐘，取白膜層，得1-2×109個白細胞的細胞懸液。餘下血漿和紅細胞由靜脈回輸給病人。
2、製備單核細胞用淋巴細胞分離液從上述收集的白細胞懸液中分離單核細胞。具體方法為將獲得的1-2×109個白細胞懸液以1∶1的比例用PH7磷酸緩衝液稀釋，加入淋巴細胞分離液中，用水平離心機2500轉/分鐘離心15分鐘，棄上清，用PH7.2的D-Hank’s緩衝液10ml分別洗細胞3次，以去除血小板，用完全培養基懸浮細胞，以1×107個細胞/袋的數量分裝入血袋培養，共三袋。在37℃ 5％CO2孵箱培養2小時後，吸棄培養上清，用培養基輕輕洗培養板以去除非貼壁細胞，即獲得貼壁的單核細胞。
3、製備抗原遞呈細胞在每袋貼壁的單核細胞中加入含有細胞因子rh/GM-CSF20ug/ml和rhIL-48ug/ml的完全培養基100ml，培養過程中，每3天以半量培養液換液一次。誘導生成所需的抗原遞呈細胞。
三、製備治療腫瘤的自體免疫細胞——負載腫瘤抗原的抗原遞呈細胞在誘導生成所需的抗原遞呈細胞期間，進行脂質體介導的腫瘤細胞mRNA轉染抗原遞呈細胞。首先將分離所得的單核細胞在37℃ 5％CO2孵箱培養48小時，將培養基更換為無血清、無抗菌素的1640培養基，然後將製備好的腫瘤細胞mRNA20ul和脂質體20ul混勻，加入培養的單核細胞中，進行脂質體介導的腫瘤細胞mRNA轉染抗原遞呈細胞，轉染時間為4小時。轉染後立即更換含rhGM-CSF20ug/ml和rhIL-48ug/ml的完全培養基100ml繼續培養。按以上方法於培養的第5天再轉染一次。培養第8天，加入TNF-d 250ng/袋，促進負載腫瘤抗原的抗原遞呈細胞的成熟。培養第11天，收集細胞。此細胞為腫瘤細胞mRNA致敏的抗原遞呈細胞。經流式細胞儀鑑定此細胞的特異表面標誌HLA-DR、HLA-ABC、CD83、CD40、CD80、Cdla，確定其為負載腫瘤抗原的成熟的抗原遞呈細胞，亦即為本發明治療腫瘤的自體免疫細胞。
臨床使用時，收集成熟細胞，用10ml生理鹽水分別洗2次，以1500轉/分鐘離心10分鐘，所得細胞分裝成5×105個/袋，由靜脈輸給病人，每天1袋連輸三天。
權利要求
1.一種製備腫瘤自體免疫細胞的方法，其特徵在於包括如下步驟(1)製備自體腫瘤組織mRNA；(2)從自體血分離製備單核細胞；(3)加細胞因子誘導擴增抗原遞呈細胞；(4)用上述mRNA轉染抗原遞呈細胞得負載腫瘤抗原的抗原遞呈細胞即腫瘤自體免疫細胞。
2.權利要求1所述製備方法所製得的腫瘤自體免疫細胞用於治療腫瘤的用途。
全文摘要
本發明涉及醫學生物工程技術領域,是一種治療腫瘤的自體免疫細胞及其製備方法,包括製備自體腫瘤組織mRNA;由自體血分離製備單核細胞;加細胞因子誘導擴增抗原遞呈細胞;再用腫瘤mRNA轉染抗原遞呈細胞即得負載腫瘤抗原的抗原遞呈細胞,亦即治療腫瘤的自體免疫細胞。本發明所得的免疫細胞因採用自體腫瘤和自體血製備,故特異性強、安全性高,毒副作用小,經試用可顯著提高病人的生存質量。
文檔編號A61P35/00GK1360025SQ01139230
公開日2002年7月24日 申請日期2001年12月26日 優先權日2001年12月26日
發明者許琳, 盧是月, 戴榮, 徐江英 申請人:中國人民解放軍第二軍醫大學