表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑的篩選方法及由其篩選的抑制劑的製作方法

2023-09-23 03:33:10 1

專利名稱：表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑的篩選方法及由其篩選的抑制劑的製作方法
技術領域：
本發明涉及表皮生長因子受體(EpidermalGrowth Factor Receptor :EGFR),X 其，涉及能夠迅速大量篩選出抑制上述EGFR的酪氨酸激酶(tyrosine kinase)的活性的抑制劑(inhibitors)的篩選方法，更具體而言，涉及利用蛋白質晶片而超高速地大量篩選出抑制EGFR酪氨酸激酶活性的物質的方法，以及由此篩選出的抑制劑。
背景技術：
表皮生長因子受體(Epidermal Growth Factor Rec印tor ；以下簡稱為〃 EGFR") 是分子量為170千道爾頓(kDa)的結合在膜上的蛋白質，其在上皮細胞的表面上被表達出來。EGFR屬於作為細胞周期調節分子類(class)的蛋白質酪氨酸激酶的生長因子受體家族 (family)。EGFR在胞外區結合自身的配體(EGF或TGF-α )時被激活，其結果，使同一受體的細胞內的酪氨酸激酶區發生自身磷酸化反應。EGFR 為作為生長啟動癌基因(growth promoting oncogene)的 erbB 或 ErbBl 的蛋白質產物，該erbB或ErbBl為，在被認為在多種人類癌症的發病和發展中起到重要的作用的原始致癌基因(protooncogenes)ERBB家族中的一員。尤其，觀察出了不僅在膠質母細胞瘤(glioblastomas)，還在乳房癌，膀胱癌，肺癌，頭部癌，頸部癌，及胃癌中，EGFR的表達增加。ERBB癌基因家族，將在結構上有關聯的4個跨膜(transmembrane)受體，S卩，EGFR、 HER-2/neu (erbB2) ,HER-3 (erbB3)以及HER-4 (erbB4)進行編碼。臨床上報導了如下內容， 即，對腫瘤而言，ERBB癌基因的增幅和/或受體的過度表達不僅與對治療方法的反應性有關，還與疾病的復發和患者的預後不良有關。EGFR由下述的3個主要區域構成，即為胞外區(extracellular domain ECD)，其被糖基化(glycosylated)，且包含具有作為雙半胱氨酸富集區域的配體結合袋 (ligand-binding pocket)；短的跨膜區；以及，胞內區，其具有固有的酪氨酸激酶活性。跨膜區使配體結合區與胞內區結合。隨著對非糖基化形態的EGFR的研究，通過對胺基酸和 DNA鹼基序列的分析得知，EGFR的蛋白質骨架的分子量為132kDa，且具有1186個胺基酸殘基。當EGF或TGF-α與EGFR結合時，信號傳導通路被激活，其結果，細胞增殖。 EGFR分子的二聚化(dimerization)、構象變化(conformational change)以及內在化 (internalization)起到傳導細胞內信號的作用，其通過調節細胞的生長而實現。由於影響生長因子受體功能的調節、或受體或配體的過度表達而相連的基因突變，因此其結果細胞增殖。進一步，已知，對於化療或對放射線的耐藥性而言，EGFR在細胞的分化、細胞運動性 (motility)的提高、蛋白質的分泌、血管新生(neovascularization)、侵犯(invasion)以及癌細胞轉移等中起到某種作用。在癌症治療中，用於幹預治療(therapeutic intervention)的有前景的靶標中包含屬於人表皮生長因子受體激酶軸(HER kinase axis)的多個成員。所述成員在
4例如前列腺、肺或乳房的實體性上皮細胞瘤(solid epithelial tumor)等中，經常過度表達(upregulated)，此外，在膠質母細胞瘤(glioblastoma)等中也過度表達。EGFR 為HER激酶軸的成員之一，一直以來成為用於開發幾種相互不同的癌症的治療方法而選擇的靶標。EGFR 酪氨酸激酶抑制劑(EGFR tyrosine kinase inhibitors :EGFR-TKIs) 為這樣的治療方法之一，其理由在於，EGFR通路的激活需要酪氨酸殘基的可逆磷酸化過程。換言之，EGFR-TKI對起到觸發和/或維持引起腫瘤細胞生長和分化的細胞信號通路的作用的細胞表面受體進行阻斷。具體而言，認為這些抑制劑對命名為HER-I的 EGFR激酶區域進行幹涉(interfere)。更加有效的EGFR-TKI中存在三種化合物系列， 它們是喹唑啉(quinazolines)、吡啶並嘧啶(pyridopyrimidines)以及吡咯並嘧啶 (pyrrolopyrimidines)。已經出現了對上述EGFR的多種抑制劑，其中包含已作為對多種癌症的治療而進行臨床實驗的多種抑制劑。最新的摘要可參閱de Bono, J. S. and Rowinsky, Ε.K. (2002)," The ErbB Receptor Family :A Therapeutic Target For Cancer" ,Trends in Molecular Medicine,8, S19—26。例如，如圖1所示，在EGFR的胞外區上結合自身的配體(EGF或TGF- α )而信號傳導通路被激活時，存在於胞內區的EGFR激酶，在磷酸基的存在下，使ΡΙ3-Κ、GRB2、SOS等 EGFR激酶底物(substrate)上的酪氨酸(Tyr)磷酸化(pY)，從而激發細胞的信號傳導。但是，此時如果存在EGFR酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKIs)，上述EGFR-TKIs則會對EGFR激酶區進行幹涉(interfere)而抑制上述底物的酪氨酸被磷酸化，從而阻斷細胞的信號傳導通路。最近，出現了對上述EGFR的多種抑制劑，臨床開發後被註冊新藥的化合物中的兩種為吉非替尼(Gefitinib)(由AstraZeneca UK Ltd.開發的化合物ZD1839 ；能夠以商標名易瑞沙(IRESSA)購入，以下簡稱為"IRESSA「)和厄羅替尼(Erlotinib)(由Genentech, Inc.和OSIPharmaceuticalsdnc.開發的化合物0SI774 ；能夠以商標名特羅凱(TARCEVA) 購入，以下簡稱為『『TARCEVA〃)，兩者皆得到了鼓舞性的臨床結果(Presentations at ASCO 2003 and WCLC, Aug. 2003)。使用IRESSA或TARCEVA的現有的癌症治療方法為，將各化合物以不超過500mg的量每日口服給藥。IRESSA. 和TARCEVA 為口服有效(orally active)
的喹唑啉系化合物，其直接抑制EGFR分子上的酪氨酸激酶的磷酸化。以競爭性方式作用於 EGFR的三磷酸腺苷(ATP)的結合部位。此外，酪氨酸激酶抑制劑中還包含EGFR抑制劑，其已知的種類有AG494、AG825、 AG1478> EI-146> HDBA> Tyrphostin 46、Tyrphostin 47、 Tyrphostin 51 \)JsR Tyrphostin 1等。另外，還開發出了用於抑制EGFR的小型核苷酸抑制劑(U. S Pat. Nos. 5914269and 6187585)。另一方面，現有的酪氨酸激酶抑制劑篩選技術為，在研究所或醫院等中以診斷為目的且被廣泛採用的技術之一的酶聯免疫吸附法(enzyme linked immunosorbentassay, ELISA)為唯一可用的方法。但是，該方法不僅需要較多的蛋白質的量，而且為非特異性反應，且存在不適於大量篩選的問題。由此，如今切實需要一種為了篩選EGFR激酶抑制劑而將數萬個化合物快速且容易進行篩選的方法。

發明內容
為了解決上述問題，本發明的目的在於提供一種，能夠從各種單一化合物庫中迅速地大量篩選出，能夠優秀地抑制EGFR酪氨酸激酶的活性的新的抑制物質的方法。另外，本發明的目的在於，事先從包含在單一化合物庫中的多個化合物中揀選出候選物質，以準備化合物池(Pool)，從而減少用於篩選的費用和時間，並更容易地篩選出具有比現有技術更顯著的優秀的抑制效果的抑制劑。另外，目的在於，通過如上所述方法來篩選出，能夠優秀地抑制由EGFR激酶引起的自身磷酸化以及其它多種底物的磷酸化的酪氨酸激酶抑制劑，並通過如此篩選出的抑制劑來更加提高，在與EGFR相關的疾病中的藥物(medicines)的有效性。為了達到上述目的，本發明提供一種EGFR酪氨酸激酶抑制劑的篩選方法，其為表皮生長因子受體(Epidermal Growth Factor Receptor :EGFR)酪氨酸激酶抑制劑(EGFR tyrosine kinase inhibitors :EGFR_TKIs)的篩選方法，其包含在蛋白質晶片上附著能夠被EGFR酪氨酸激酶激活的EGFR酪氨酸激酶底物(substrate)的步驟；在附著有所述底物的蛋白質晶片上使EGFR酪氨酸激酶、ATP、Mg2+以及單一化合物庫的化合物池進行反應的步驟；使能夠識別由所述反應而被磷酸化的底物且附著有螢光物質的抗體，與所述被磷酸化的底物進行反應的步驟；在與所述被磷酸化的底物的反應結束之後，用緩衝溶液洗滌的步驟；以及測定所述洗滌後的螢光物質的強度的步驟。在此，還可以在使所述單一化合物庫的化合物池進行反應的步驟之前，還包括對所述單一化合物庫所包含的多個化合物進行藥效基團(pharmacophore)的搜索，並進行與所述EGFR酪氨酸激酶的結構虛擬結合的對接仿真的步驟；以及通過所述藥效基團搜索和對接仿真所選擇的化合物來準備化合物池的步驟。另外，所述藥效基團(pharmacophor)的搜索是指，從由喹唑啉(quinazolines)、 吡啶並嘧啶(pyridopyrimidines)以及吡咯並嘧啶(pyrrolopyrimidines)所組成的群中選擇的至少一個作為基本模型(model)，從而選擇出與所述基本模型的結構相似性較高的一定數量的化合物。所述對接仿真的執行，更優選如下方式，即，使所述選擇出的一定數量的化合物與所述EGFR酪氨酸激酶進行虛擬結合，從而選擇出結構上匹配可能性較高的一定數量的化合物。另外，還可以是所述EGFR酪氨酸激酶底物為，選自PLC-gammal、EGFR、aic、Grl32/ mSos、P91、PI3-kinase、Ras/Gap以及Cbl中的至少一個物質，且所述單一化合物庫由低分子化合物和天然來源化合物組成。進一步，與所述被磷酸化的底物進行反應的步驟，優選包括使能夠識別由所述反應而被磷酸化的底物的第一抗體，與所述被磷酸化的底物進行反應的步驟；以及使能夠識別進行了所述反應的第一抗體且附著有螢光物質的第二抗體，與所述第一抗體進行反應的步驟。另一方面，本發明的另一實施方式為，一種具有表皮生長因子受體(Epidermal Growth Factor Receptor :EGFR) M Sl # Bl Φ # ffl (EGFR tyrosine kinase inhibiting)的化合物，其特徵在於，包括如下化學結構2-{l6-(5，6-二羥基-4-氧代-2-苯基-4H-苯並吡喃-7-基氧基)-3，4，5_三羥基-四氫-吡喃_2_羰基]-氨基}-4_甲磺醯基-丁酸甲酯；6,7- 二羥基-4-(鄰-甲苯基氨基-甲基)_苯並吡喃-2-烷；或者，N-[3-(3，4-二羥基苯)_丙烯醯]-2-羥基-苯甲醯胺。與此同時，本發明還可以為，一種治療或預防癌症的藥物組合物，其特徵在於，包含上述的化合物。其它實施例的具體事項包含在具體實施方式
及附圖中。根據上文所述的本發明，在蛋白質晶片上附著可以被EGFR酪氨酸激酶活化的 EGFR酪氨酸激酶底物(substrate)，並將附著有上述底物的蛋白質晶片與EGFR酪氨酸激酶、ATP、Mg2+以及單一化合物庫中的化合物池(pool)進行反應，從而能夠從各種單一化合物庫中迅速地大量篩選出能夠優秀地抑制EGFR酪氨酸激酶的活性的新的抑制物質。另夕卜，通過對包含在上述單一化合物庫中的多個化合物的藥效基團 (pharmacophore)的搜索和與上EGFR酪氨酸激酶的結構進行虛擬結合的對接仿真，來事先揀選出候選物質而準備化合物池，從而具有如下效果，即，減少用於篩選的時間和費用，且容易地篩選出具有比現有技術更顯著的抑制效果的抑制劑。另外，根據上述本發明而篩選出的具有EGFR激酶抑制效果的抑制劑為，優秀的 EGFR激酶抑制物質，並且，對EGFR所致的自身磷酸化以及其它多種底物的磷酸化的抑制上表現出優秀的效果，且能夠更加提高在EGFR相關疾病中的藥物(medicines)的有效性。


圖1為用於說明根據本發明的在EGFR胞外區結合配體(EGF或TGF-α )而激活信號傳導通路的過程的一示例的模擬圖。圖2為用於說明在進行根據本發明的篩選方法時，執行藥效基團的搜索和對接仿真的過程的一示例的模式圖。圖3為用於舉例說明，以依賴本發明的EGFR酪氨酸激酶的濃度的方式，實現底物 (PLC-gammal)的磷酸化的實驗結果的照片及其圖表。圖4為根據本發明使用PLC-gammal以作為底物，從而從單一化合物庫中篩選出 EGFR酪氨酸激酶抑制劑的示例的實驗結果的照片及其圖表。圖5為對於根據本發明篩選出的抑制劑E12、H7、C12以及現有的抑制劑 Tyrphostin 51進行了不同濃度的磷酸化抑制程度實驗的結果照片及其圖表。圖6為舉例表示根據本發明篩選出的抑制劑E12、H7以及C12的化學結構及其名稱，以及通過對接仿真而做出的與EGFR酪氨酸激酶的結合結構的示意圖。圖7為根據本發明將EGFR作為底物使用而舉例證明自身磷酸化具有濃度依賴性的實驗結果的照片及其圖表。圖8為舉例表示對於根據本發明篩選出的抑制劑E12、H7、C12以及現有的酪氨酸磷酸化抑制劑51的EGFR自身磷酸化抑制實驗結果，以及此時的活性抑制濃度 (half-maximal抑制濃度，IC50)的照片。圖9為舉例表示對於根據本發明篩選出的抑制劑E12、H7、C12以及現有的抑制劑酪氨酸磷酸化抑制劑51的人宮頸癌細胞(HeLa細胞)的增殖抑制實驗結果，以及此時的活性抑制濃度(half-maximal抑制濃度，IC50)的照片。
具體實施例方式下面參照附圖對本發明的一較佳實施方式進行詳細說明。本發明中為了篩選出能夠抑制EGFR酪氨酸激酶(EGFR kinase)，即對EGFR底物 (substrate)的酪氨酸進行磷酸化的酶的活性的抑制劑，從而將可以與上述EGFR酪氨酸激酶結合而被其活化的EGFR酪氨酸激酶底物(substrate)附著在蛋白質晶片上，並且在上述附著有底物的蛋白質晶片上使供給磷酸基的ATP、輔助因子(co-factor)Mg2+以及單一化合物庫中的化合物池(pool)與EGFR酪氨酸激酶一同進行了反應。上述蛋白質晶片採用ftOteoChip (Proteogen Inc.，首爾，韓國)。上述ftOteoChip 為在胺化了的(aminated)玻璃載片(GlassSlides)上塗覆杯芳烴(calixarene)衍生物而成，而上述杯芳烴衍生物起到雙官能團分子連接基團 (Bifunctional molecular linker)白勺作用。並且，作為上述EGFR酪氨酸激酶底物，只要是能夠被EGFR酪氨酸激酶活化的蛋白質則沒有特別限制，可以採用該技術領域中公知的所有種類的底物。例如，可採用選自 PLC-gammal、EGFR、Shc、Grt2/mSos、P91、PI3-kinase、Ras/Gap 以及 Cbl 中的至少一種物質。另外，上述單一化合物庫可包含低分子化合物以及天然來源化合物，現有的作為 EGFR酪氨酸激酶抑制劑而熟知的大部分化合物為單一化合物，從此點看來，本發明的特徵為除單一化合物之外，還包含有天然來源化合物。如此，在附著有EGFR酪氨酸激酶底物的蛋白質晶片上使EGFR酪氨酸激酶，ATP、 Mg2+以及單一化合物庫中的化合物池(pool)進行反應時，包含在上述化合物池中的特定的化合物可抑制上述EGFR酪氨酸激酶所致的上述底物的磷酸化，並為了對此進行確認，本發明的特徵在於，將附著有螢光物質且能夠識別上述被磷酸化的底物的抗體，在已進行了上述化合物池的反應的蛋白質晶片上追加進行反應。在現有技術中，如整聯蛋白等受體，能夠與對抑制劑候選物質起到拮抗作用的其它配體蛋白質結合，並能夠在上述配體蛋白質上直接附著螢光物質，但是，根據本發明的 EGFR酪氨酸激酶並非與抑制劑候選物質起拮抗作用，而是上述激酶磷酸化活性因抑制劑候選物質而被抑制，且無法在上述激酶上直接附著螢光物質，因此本發明中特別利用能夠識別由於上述化合物池的反應而被磷酸化的底物的其它抗體，並在此附著螢光物質，以便最後檢測出螢光物質的強度。其中，使能夠識別上述的被磷酸化的底物的其他抗體進行反應的過程還能通過下述的兩個階段來實現，即，將能夠識別被磷酸化的底物的第一抗體與上述被磷酸化的底物進行反應，接著將能夠識別已進行上述反應的第一抗體且附著有螢光物質的第二抗體與上述第一抗體進行反應。接下來，在與如上所述的被磷酸化的底物的反應結束之後，用緩衝溶液洗滌，並測定螢光物質的強度，從而篩選出EGFR酪氨酸激酶抑制劑，此時，上述螢光物質的強度較低是說明底物的磷酸化的程度較低，這意味著由於特定的化合物而上述底物的磷酸化被抑制，因此可以將在上述螢光物質的強度較低的斑點上進行反應的化合物，確定為能夠優秀地抑制EGFR酪氨酸激酶的活性的抑制劑。另一方面，本發明為了節省用於篩選的時間和費用，而在構成單一化合物庫中的化合物池時，可以通過對包含在上述單一化合物庫中的多個化合物的藥效基團
8(pharmacophore)的搜索，以及與上述EGF酪氨酸激酶的結構進行虛擬結合的對接仿真，來揀選候選物質，進而準備化合物池。S卩，上述藥效基團(Pharmacophore)是為了將分子(或化合物)與特定的酶、蛋白質或受體進行有效結合所必須知悉的多種官能團(化學性質)的3D排布(Sutter等， 2000)，用於揀選出具有與現有作為EGFR酪氨酸激酶抑制劑所公知的IRESSA或TARCEVA 的結構相似的藥效基團的化合物。例如，從由喹唑啉(quinazolines)、吡啶並嘧啶 (pyridopyrimidines)以及吡咯並嘧啶(pyrrolopyrimidines)組成的群中選擇的至少一個作為基本模型(model)，從而先揀選出與上述基本模型的結構相似性較高的一定數量的化合物。另外，進行上述對接仿真是指，使包含在單一化合物庫中的多個化合物與上述 EGFR酪氨酸激酶進行虛擬結合，從而揀選出在結構上匹配可能性較高的一定數量的化合物。本發明通過藥效基團搜索和對接仿真而揀選出候選物質，以準備化合物池，從而具有如下效果，即，減少用於篩選的時間和費用，且能夠容易篩選出具有比現有技術更顯著的抑制效果的抑制劑。本發明能夠通過下述實施例而更易於理解，並且，下述實施例以舉例說明本發明為目的，而並非限定權利要求的範圍所限定的保護範圍。_仿丨丨1 靈勁勿白備媒酣議口X·方直圖2為用於說明在進行根據本發明的篩選方法時，進行藥效基團的搜索和對接仿真的過程的一示例的模式圖，為了進行虛擬篩選而使用了化學計算集團(Chemical Computing Group) ^M^JfR^i^itilJM (Molecular Operating Environment, Μ0Ε)禾呈序。虛擬篩選方法，一併使用了藥效基團(pharmachphore)的搜索和分子對接仿真。首先，製作出了與現有的作為EGFR酪氨酸激酶抑制劑而被熟知的IRESSA以及 TARCEVA的結構近似的藥效基團基本模型，在IBS的40000個庫化合物中揀選出7000個具有與上述基本模型近似的藥效基團的化合物。然後，以這些7000個化合物為對象，對EGFR激酶的X-Ray結構實施了對接仿真， 從而選定了對接得分較高的前300個化合物。用於對接計算的搜索算法，使用α三角 (Alpha Triangle)方法來實施對每個配體化合物的最多500000次的結構變化能量計算。 該方法使用了如下算法，即，將分子的三個點(point)形象化為三角形，並判斷出與受體蛋白質的其它三角形匹配與否，從而進行對接的算法。評分方法使用LondondG方法而對每個配體計算了最多10個位姿(p0se)。MOE所支持的評分方法有LondondG、AffinitydG, AlphaHB三種，在本計算中使用的LondondG如下。 LondondG函數，作為參數使用，由於結合而產生的旋轉/平移熵(rotational/ translation entropy)變化、由於配體(Iigand)的結合而產生的彈性能(flexibilityenergy)的減少、氫結合能、金屬離子連接(ligation)，去溶能(desolavtion energy)差異等。通過如上所述的方法，揀選出對接仿真結果中得分即LondondG值最優秀的300個化合物，從而準備了用於蛋白質晶片篩選的化合物池。t施例2 由EGFR激的底物的磷酸僕^應實齡首先，本實施例中為了了解結合在晶片上的EGFR激酶底物的穩定性，從而確認上述EGFR激酶底物與EGFR激酶之間的反應程度。蛋白質晶片使用了ftOteoChipTMO^roteogen，Inc.，首爾，韓國)，在 ProteoChip (Proteogen, Inc.，首爾，韓國)上以微陣列(CM-1000 ；Proteogen，Inc.，首爾，韓國)的方式將EGFR激酶底物按不同濃度分別點樣，從而形成EGFR激酶底物微陣列 (microarray)。EGFR激酶底物使用從Calbiochem公司購買的PLC-gammal，將上述底物溶解於包含30%甘油的磷酸鹽緩衝溶液(phosphate-buffered saline, PBS)後，點樣到 I^oteoChip 上，然後，在4°C的潮溼環境中過夜而使其固定。然後，將固定著EGFR激酶底物(PLC-gammal)的蛋白質晶片用包含3%牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)的 PBS封閉(blocking)後，用洗滌溶液(PBST 包含0. 5% Tween 20的PBS，pH7. 4)洗滌而去除未固定的底物和BSA。接下來，在附著有上述底物的蛋白質晶片上與ATP/Mg2+混合物一同使EGFR酪氨酸激酶以不同濃度分別進行反應。上述ATP/Mg2+混合物和EGFR酪氨酸激酶使用了從UPSTATE 公司購買的產品，上述EGFR酪氨酸激酶的濃度設定為，在10 5，000 μ 1/ml分別不同。反應中使用了緩衝溶液(IOOmM M0PS,5mMDTT, PBS, pH7. 2)而在30°C的潮溼環境中進行了一小時的反應。根據上述反應，三磷酸基(ATP)的磷酸使得底物的酪氨酸序列被磷酸化，此後，用洗滌溶液將沒有進行反應的三磷酸基、反應後產生的二磷酸基、EGFR酪氨酸激酶以及緩衝溶液進行去除。然後，將識別上述被磷酸化的底物的第一抗體(購買UPSTATE公司以及 Abfrontier公司的產品)稀釋到以1 100比例含有30%甘油和10% BSA的PBS溶液中， 並在30°C的潮溼環境中，與包含上述被磷酸化的底物的晶片反應了一小時。然後，用洗滌溶液洗滌晶片，並將識別第一抗體的、附著有螢光的第二抗體，在包含10% BSA和30%甘油的PBS溶液中以100 1稀釋之後，在30°C潮溼且無光的環境中， 與包含上述第一抗體的晶片反應了一小時。將結束了如上所述的反應之後的晶片用洗滌溶液洗滌，使用GENETIX公司製造的 Aquire 螢光掃描儀來分析了晶片上的螢光強度，其結果如圖3所示。圖3為用於舉例說明，以依賴本發明的EGFR酪氨酸激酶的濃度的方式，實現底物(PLC-gammal)的磷酸化的實驗結果的照片及其圖表，如該圖所示，對上述底物 (PLC-gammal)和EGFR激酶之間的反應程度進行確認的結果，從EGFR激酶以依賴濃度的方式活化上述EGFR激酶底物來判斷，由此確認被固定的EGFR激酶底物為正常。^MM 3 從單一化合物庫中高諫地,大量f帝詵Ml EGFR^IS抑制劑首先，採用與上述實施例2相同的方法，在蛋白質晶片上附著了 EGFR激酶底物 (PLC-gammal)，此時底物的濃度為每Imm晶片為20 μ g。然後，在附著有上述底物的蛋白質晶片上，與ATP/Mg2+混合物以及EGFR酪氨酸激酶一同將作為陽性對照的ImM酪氨酸磷酸化抑制劑51 (Tyrphostin51)以及在上述實施例1中選擇的300個庫化合物按不同化合物區分而分別以50mM的濃度進行了反應。其它過程與實施例2相同，反應結束後對晶片進行螢光強度分析的結果如圖4所示。圖4為根據本發明使用PLC-gammal以作為底物，從而從單一化合物庫中篩選出 EGFR酪氨酸激酶抑制劑的示例的實驗結果的照片及其圖表，如該圖所示，可以篩選出EGFR 酪氨酸激酶抑制效果比現有的作為EGFR酪氨酸激酶抑制劑而熟知的Tyrphostin 51更優秀的化合物，並作為示例來選擇其中的三種並將其命名為H07，E12，C12。實施例4 篩詵出的抑制劑的桉不同濃度的EGFR激酶抑制效果實騎對在上述實施例3中選擇的三個化合物進行了上述化合物的不同濃度的EGFR激酶活性抑制效果的實驗。S卩，上述實施例3中，將300個化合物分別以50mM濃度進行了反應，但是在本實施例中，分別將H07，E12，C12化合物以1 μ M 100 μ M的不同濃度來進行反應，其它過程與實施例2相同。對反應結束後的晶片進行的螢光強度分析的結果如圖5所示。圖5為對於根據本發明篩選出的抑制劑E12、H7、C12以及現有的抑制劑 Tyrphostin 51進行了不同濃度的磷酸化抑制程度實驗的結果照片及其圖表，如該圖中所示，可以確認，根據本發明的抑制劑Ε12，Η7，C12以依賴濃度的方式抑制EGFR酪氨酸激酶的活性。圖6為舉例表示根據本發明篩選出的抑制劑Ε12、Η7以及C12的化學結構及其名稱，以及通過對接仿真而做出的與EGFR酪氨酸激酶的結合結構的示意圖，如此圖中所示， 上述根據本發明的抑制劑Ε12，Η7，C12分別具有如下結構，即，2- {[6- (5,6- 二羥基_4_氧代_2_苯基_4Η_苯並吡喃_7_基氧基)_3，4，5_三羥基-四氫-吡喃-2-羰基]-氨基}-4_甲磺醯基-丁酸甲酯；(Β0Χ1-Ε12)；6，7-二羥基-4-(鄰-甲苯基氨基-甲基)_苯並吡喃-2-烷；N-[3-(3，4-二羥基苯)_丙烯醯]-2-羥基-苯甲醯胺(B0X2-C12)，這與現有技術中已知的EGFR激酶抑制劑的結構完全不同。實施例5 =EGFR激酶所致的EGFR的自身磷酸化反應實驗首先，替代在上述實施例2中作為EGFR激酶底物的PLC-gammal而使用了 EGFR， 並基於此進行了由EGFR激酶引起的EGFR的自身磷酸化反應實驗。其結果如圖7所示，可以確定如下事實，即，即使使用EGFR以作為EGFR激酶底物，也由於EGFR酪氨酸激酶而底物 (EGFR)的磷酸化以依賴濃度的方式實現。另一方面，確認了在作為EGFR激酶底物而使用EGFR的情況下，根據本發明而篩選出的抑制劑E12，H7以及C12是否能夠抑制EGFR激酶的活性。代替在上述實施例2中作為 EGFR激酶底物的PLC-gammal而以10mg/mL濃度附著了 EGFR，此時將EGFR激酶100ng/mL 和ATP/Mg2+在緩衝溶液(100mMM0PS，5mMDTT，PBS，pH 7. 2)中進行混合而處理，此時，分別將通過上述的實施例3和實施例4而篩選出的化合物E12 (450mM)，H7 (1. 8mM)，C12 (1. 8mM)， Tyrphostin(ImM)的濃度稀釋5倍而一同進行反應。圖8為舉例表示對於根據本發明篩選出的抑制劑E12、H7、C12以及現有的抑制劑酪氨酸磷酸化抑制劑51的EGFR自身磷酸化抑制實驗結果和此時的活性抑制濃度
11(half-maximal抑制濃度，IC50)的照片，如該圖中所示，可以確認上述E12，H7，C12能夠將 EGFR的自身磷酸化以依賴濃度的方式進行抑制。實施例6 篩詵出的抑制劑的牛物活件分析通過人宮頸癌細胞(HeLa細胞)的增殖抑制實驗，分析了根據本發明而篩選出的抑制劑的生物活性。細胞增殖實驗根據MTT溴化[(3-(4,5-二甲噻唑-2基-2，5-二苯基-2H-四唑鐺]實驗協議(protocol)進行。首先，將HeLa細胞在塗覆有聚苯乙烯(Polystyrene)96-孔組織培養板中按每孔 4X103個的細胞濃度來添加。由此靜置M小時之後，將根據本發明的抑制劑E12、H07、C12 和現有的抑制劑Tyrphostin 51分別與包含10% FBS的培養混合溶液一同添加到各個孔中，並反應72小時。此時，上述E12、H07、C12和Tyrphostin 51分別以10 μ M 100 μ M的濃度進行反應。然後向各個孔中添加5mg/ml MTT溶液10 μ 1，並在37°C反應3小時。然後， 去掉各個孔中的上清液之後，將顯色反應物(Formazancrystal)溶解於100 μ 1的二甲基亞碸(Dimethyl sulfoxide, DMS0)中，並用酶聯免疫檢測儀(ELISA Reader) (595nm)測定了吸光度。圖9為舉例表示根據本發明篩選出的抑制劑E12、H7、C12以及現有的抑制劑酪氨酸磷酸化抑制劑51的人宮頸癌細胞(HeLa細胞)的增殖抑制實驗結果和此時的活性抑制濃度(half-maximal抑制濃度，IC5tl)的照片。圖9中空白(Media alone)顯示在沒有添加樣品(Sample)的培養液中將HeLa細胞進行增殖的結果。由此，根據本發明的E12、H7、C12 化合物表現出了比Tyrphostin51 (Tyrosin kinase inhibitor 酪氨酸激酶抑制劑)更優秀的抑制效果，其中E12和H7具有最卓越的抑制EGFR酪氨酸激酶的抑制作用。另外，根據上述E12，H7，C12化合物來阻礙HeLa細胞的增殖50 %時所需的濃度(半數(half-maximal)抑制濃度)分別顯示為 27. 96 士 3. 30 μ M，11. 95 士 0. 39 μ M， 41. 83士6. 29 μ Μ，在上述化合物中Η7表現出能夠最有效地抑制HeLa細胞的增殖。一方面，在上述中將本發明以特定的較佳實施例來圖示並進行說明。但本領域技術人員應知悉，在沒有脫離權利要求書中體現的本發明的技術特徵或領域的情況下，可以對本發明進行多種改造及變化。本發明提供一種能夠從各種單一化合物庫中超高速地大量篩選出具有EGFR激酶抑制效果的物質的方法，且由此篩選出的抑制劑對由EGFR激酶引起的自身磷酸化以及其它底物的磷酸化抑制表現出優秀的效果，從而能夠更加提高在EGFR相關疾病中的藥物 (medicines)的有效性。
權利要求
1.一種EGFR酪氨酸激酶抑制劑的篩選方法，其為表皮生長因子受體(Epidermal Growth Factor Receptor :EGFR)酪氨酸激酶抑制劑(EGFR tyrosine kinase inhibitors EGFR-TKIs)的篩選方法，其包含在蛋白質晶片上附著能夠被EGFR酪氨酸激酶活化的EGFR酪氨酸激酶底物 (substrate)的步驟；在所述附著有底物的蛋白質晶片上，使EGFR酪氨酸激酶、ATP、Mg2+以及單一化合物庫的化合物池(pool)進行反應的步驟；使能夠識別由所述反應而被磷酸化的底物且附著有螢光物質的抗體，與所述被磷酸化的底物進行反應的步驟；在與所述被磷酸化的底物的反應結束之後，用緩衝溶液洗滌的步驟；以及測定所述洗滌後的螢光物質的強度的步驟。
2.根據權利要求1所述的EGFR酪氨酸激酶抑制劑的篩選方法，其特徵在於， 在使所述單一化合物庫的化合物池進行反應的步驟之前，還包括對所述單一化合物庫所包含的多個化合物進行藥效基團(pharmacophor)的搜索，並進行與所述EGFR酪氨酸激酶的結構虛擬結合的對接仿真的步驟；以及通過所述藥效基團搜索和對接仿真所選擇的化合物來準備化合物池的步驟。
3.根據權利要求2所述的EGFR酪氨酸激酶抑制劑的篩選方法，其特徵在於， 所述藥效基團(pharmacophor)的搜索是指，從由喹唑啉(quinazolines)、吡啶並嘧啶(pyridopyrimidines)以及吡咯並嘧啶(pyrrolopyrimidines)所組成的群中選擇的至少一個作為基本模型(model)，從而選擇出與所述基本模型的結構相似性較高的一定數量的化合物。
4.根據權利要求3所述的EGFR酪氨酸激酶抑制劑篩選方法，其特徵在於，所述對接仿真的執行是指，使所述選擇出的一定數量的化合物與所述EGFR酪氨酸激酶進行虛擬結合，從而選擇出結構上匹配可能性較高的一定數量的化合物。
5.根據權利要求1所述的EGFR酪氨酸激酶抑制劑的篩選方法，其特徵在於，所述 EGFR 酪氨酸激酶底物為，選自 PLC-gammal、EGFR、She, Grb2/mSos, P91、 PI3-kinase、Ras/Gap以及Cbl中的至少一個物質。
6.根據權利要求1所述的EGFR酪氨酸激酶抑制劑的篩選方法，其特徵在於， 所述單一化合物庫由低分子化合物和天然來源化合物組成。
7.根據權利要求1所述的EGFR酪氨酸激酶抑制劑的篩選方法，其特徵在於， 與所述被磷酸化的底物進行反應的步驟，包括使能夠識別由所述反應而被磷酸化的底物的第一抗體，與所述被磷酸化的底物進行反應的步驟；以及使能夠識別進行了所述反應的第一抗體且附著有螢光物質的第二抗體，與所述第一抗體進行反應的步驟。
8.一種具有表皮生長因子受體(Epidermal Growth Factor Receptor :EGFR)酪氨酸激酶抑制(EGFR tyrosine kinase inhibiting)作用的化合物，其特徵在於，包括如下化學結構2- {[6- (5,6- 二羥基-4-氧代-2-苯基-4H-苯並吡喃_7_基氧基)_3，4，5-三羥基-四氫-吡喃-2-羰基]-氨基}-4_甲磺醯基-丁酸甲酯；·6，7- 二羥基-4-(鄰-甲苯基氨基-甲基)-苯並吡喃-2-烷；或者 N- [3- (3，4- 二羥基苯)-丙烯醯]-2-羥基-苯甲醯胺。
9. 一種治療或預防癌症的藥物組合物，其特徵在於， 包含權利要求8所述的化合物。
全文摘要
本發明，在蛋白質晶片上附著了可以被EGFR酪氨酸激酶活化的EGFR酪氨酸激酶底物(substrate)，並在附著有上述底物的蛋白質晶片上使EGFR酪氨酸激酶、ATP、Mg2+以及單一化合物庫的化合物池(pool)進行反應，從而能夠迅速並大量地篩選出能夠有效地抑制EGFR酪氨酸激酶的活性的新的抑制物質。
文檔編號G01N33/573GK102341708SQ200980157759
公開日2012年2月1日 申請日期2009年3月31日 優先權日2009年3月16日
發明者崔榮晉, 康仁哲, 金應允 申請人:湖西大學校產學協力團