結合ephb4、抑制血管發生和腫瘤生長的抗體的製作方法

2023-09-23 04:13:15

專利名稱：結合ephb4、抑制血管發生和腫瘤生長的抗體的製作方法
結合EPHB4、抑制血管發生和腫瘤生長的抗體本申請是發明人於2005年3月11日提交的題為「結合EPHB4、抑制血管發生和腫瘤生長的抗體」的中國專利申請200580015376. 9的分案申請。相關申請本申請要求於2004年9月23日遞交的美國臨時申請60/612，908、於2004年9月23日遞交的美國申請10/949，720以及2004年3月12日遞交的美國申請10/800，350的優
先權。相關申請的完整教導全部在此處引用作為參考。
背景技術：
EphB4，有時也稱為肝配蛋白受體B4或肝細胞瘤跨膜激酶(HTK)，是跨膜受體蛋 白-酪氨酸激酶家族中的一員。EphB4含有一個由配體結合結構域(也稱為球蛋白結構域)、富半胱氨酸結構域以及一對III型纖連蛋白重複(見如圖5)組成的細胞外結構域。胞漿結構域中含具有兩個保守酪氨酸殘基的近膜區、蛋白質酪氨酸激酶結構域、不育a基序(SAM)以及PDZ結構域結合基序。EphB4與膜結合配體肝配蛋白B2相互作用(Sakano，S.等人，Oncogene. 1996 Aug 15 ；13(4) :813-22 ；Brambilla R.等人 EMBO J. 1995 Jul 3 ；14(13) :3116-26) o EphB4與Eph家族的其他成員一樣,通過結合成簇的膜連接肝配蛋白配體而被活化(Davis S 等人，Science. 1994 Nov4 ;266 (5186) :816-9)，提示 Eph 受體的活化需要表達受體的細胞與表達配體的細胞間的接觸。一旦配體結合，EphB4受體形成二聚體並自磷酸化近膜區的酪氨酸殘基從而達到完全活化。一般認為當表達EphB4的細胞遇到表達肝配蛋白B2的細胞時，EphB4-肝配蛋白B2的相互作用和聚合會激發兩種細胞內的信號轉導。EphB4_肝配蛋白B2信號轉導涉及血管發生(Wang等人.Cell. 1998May 29;93(5) :741-53 ;Gerety 等人，Mol Cell. 1999S印；4(3) :403-14)。血管發生是從先前存在的微管結夠的內皮中產生新的血管，是宿主體內實體腫瘤生長、進展和轉移的關鍵步驟。在正常的生理性血管發生中，血管內皮與其周圍基質成分間的自分泌、旁分泌以及鄰分泌相互作用在空間和時間上都受到嚴格的調節。此外，促血管發生和血管穩定的細胞因子以及生長因子的水平和活性也保持平衡。與之相反，活躍腫瘤生長所必需的病理性血管發生持續不衰，是正常血管發生系統失調節的表現。特別是實體和造血系統類型的腫瘤，更與高水平的異常血管發生相關。一般認為腫瘤的發生包括一系列有序而相互作用的步驟，最終導致產生具有侵襲性生長潛能的自主性克隆。這些步驟包括持續的生長和無限的自我更新。腫瘤細胞種群的一般特徵在於生長信號的自供給、對生長抑制信號敏感性降低以及對凋亡的耐受。起始異常生長的遺傳的或細胞發生的事件通過阻斷凋亡，將細胞維持在一個延長的「就緒」狀態。本公開內容的目的在於提供可抑制血管發生和腫瘤生長的試劑和治療手段。發明概述本公開內容一方面提供了抑制EphB4介導功能的多肽試劑，包括可以結合EphB4並通過特定途徑影響EphB4的抗體及其抗原結合部分。正如此處所述，EphB4和肝配蛋白B2參與了多種疾病狀態,包括癌症和與有害或過度血管發生相關的疾病。因此，此處公開的某些多肽試劑也可用於治療此類疾病。此外，本公開內容涉及在多種腫瘤中EphB4和/或肝配蛋白B2常常高水平表達這一發現。因此，能夠下調EphB4或肝配蛋白B2功能的多肽試劑可以通過直接作用於腫瘤細胞而影響腫瘤，也可以通過間接作用於腫瘤募集的血管發生過程而對腫瘤產生影響。在某些實施方案中，本公開內容提供了特別適於用下調EphB4或肝配蛋白B2功能的試劑治療的腫瘤類型的鑑定。本公開內容的某些方面提供了可與EphB4胞外部分的表位相結合而抑制EphB4活性的分離的抗體或其抗原結合部分。分離的抗體或其抗原結合部分可結合於位於圖lEphB4序列中的胺基酸16-198的表位。例如，該表位可能處在與肝配蛋白B2結合的EphB4球蛋白結構域(GD)中。分離的抗體或其抗原結合部分可結合於位於圖lEphB4序列中的胺基酸 324-429或430-537的表位。例如，分離的抗體或其抗原結合部分可以結合於EphB4的第一纖連蛋白樣結構域(FNDl)或第二纖連蛋白樣結構域(FND2)。分離的抗體或其抗原結合部分可以抑制EphB4 二聚化或多聚化並可以任選地抑制肝配蛋白B2刺激的EphB4自磷酸化。分離的抗體或其抗原結合部分可以抑制培養的內皮細胞形成脈管、體內組織的血管形成、植入動物角膜的組織的血管形成、植入動物體內的基質膠(matrigel)組織栓的血管形成和/或小鼠中人類腫瘤異種移植物的生長。優選的結合圖lEphB4序列中胺基酸16-198的表位的抗體包括此處以No. 001、No. 023、No. 035和No. 079表示的抗體。優選的結合圖lEphB4序列中胺基酸428-537的表位的抗體包括此處以No. 047、No. 057、No. 85H、No. 098和No. 138表示的抗體。本公開內容的某些方面提供了可與EphB4胞外部分的表位相結合而刺激EphB4活性的分離的抗體或其抗原結合部分。例如此處所述的分離抗體或其抗原結合部分可結合位於圖lEphB4序列中胺基酸324-429或430-537的表位，並刺激EphB4激酶活性。該分離的抗體或其抗原結合部分可以結合EphB4的FNDl或FND2。該抗體可以選自此處以No. 85L、No. 091、No. 121 和 No. 131 表示的抗體。本公開內容提供此處公開的任一抗體的人源化形式，以及含有至少一個來源於此處公開抗體CDR部分(特別是CDR3)的抗體及其抗原結合部分。在優選的實施方案中，抗體為與其將施用的受試者免疫相容的單克隆抗體，優選可臨床施用於人體的抗體。本公開內容的某些方面提供了能夠產生此處公開抗體的雜交瘤,特別是能產生選自以下抗體的雜交瘤，所述抗體表示為No. 001、No. 023、No. 035、No. 079、No. 047、No. 057、No. 85H、No. 098、No. 138、No. 085L、No. 091 和 No. 131。可產生抗體 No. 023 (位於胺基酸16-198內的表位)、抗體No. 091 (活化激酶的抗體；位於胺基酸324-429的表位)、抗體No. 098 (位於胺基酸430-537的表位)、抗體No. 131 (位於胺基酸324-429的表位)以及抗體No. 138 (位於胺基酸430-537的表位)的雜交瘤儲存於美國典型培養物保藏中心(ATCC)，10801 University Boulevard, Manassas, VA20110-2209。ATCC 中產抗體 No. 023、No. 091、No. 098、No. 131 和 No. 138 的雜交瘤保藏識別號分別為 PTA-6208、PTA-6209、PTA-6210、PTA-6214 和 PTA-6211，其中 PTA-6208、PTA-6209、PTA-6210、PTA_6211 的保藏日期為2004年9月14日，PTA-6214的保藏日期為2004年9月16日。因此，本公開內容的某些具體方面提供了選自具有ATCC保藏識別號PTA-6208、PTA-6209、PTA-6210、PTA-6214 和 PTA-6211 的雜交瘤細胞。
驚奇的是，抑制配體結合的抗體、抑制EphB4激酶活化的抗體和活化EphB4激酶活性的抗體在生物測定中都抑制EphB4介導的事件。因此，本公開內容提供了治療癌症的方法，包括向所需患者施用有效劑量的分離的抗體或其抗原結合部分，所述抗體或其抗原結合部分可與位於EphB4胞外部分的表位結合併抑制EphB4活性或活化EphB4激酶活性。任選患者已被診斷為患有選自結腸癌、乳腺腫瘤、間皮瘤、前列腺腫瘤、鱗狀細胞癌、卡波西肉瘤以及白血病的癌症。可以全身或局部施用分離的抗體或其抗原結合部分。此外，本公開內容提供了抑制患者血管發生的方法，包括向所需患者施用有效劑量的分離的抗體或其抗原結合部分，所述抗體或其抗原結合部分可與位於EphB4胞外部分的表位結合併抑制EphB4活性或活化EphB4激酶活性。任選患者被診斷患有黃斑變性。本公開內容的某些方面提供了含有此處公開的任一分離的抗體或其抗原結合部分的藥物製品，以及此類抗體或其抗原結合部分在製備用於治療癌症的藥物製品中的用途。所述癌症可任選地選自結腸癌、乳腺腫瘤、間皮瘤、前列腺腫瘤、鱗狀細胞癌、卡波西肉瘤以及白血病。某些方面而言，此處公開的抗體可以共價連接(或者穩定相聯)於一個額外的功能性部分，例如標記或賦於所需藥代動力學性質的部分。標記的實例包括那些適於用螢光檢測法、正電子成像術檢測法以及核磁共振檢測法的標記。例如，標記可以選自螢光標記、放射活性標記以及具有特殊核磁共振信號的標記。諸如聚乙二醇(PEG)部分的部分可被固定於抗體或其抗原結合部分上，以提高其血清半衰期。附圖簡述
圖I顯示人EphB4前體蛋白的胺基酸序列(SEQ ID NO :1)。圖2顯示人EphB4蛋白的cDNA核苷酸序列(SEQ ID NO :2)。圖3顯示B4ECv3蛋白的胺基酸序列(顯示了包含未切割Eph B4前導肽的前體的預測序列)(SEQ ID NO 3) o圖4顯示B4ECv3NT蛋白的胺基酸序列(顯示了包含未切割Eph B4前導肽的前體的預測序列)(SEQ ID NO 4)。圖5顯示針對EphB4產生的單克隆抗體以及這些抗體的表位圖。EphB4胞外結構域的拓撲結構如圖所示，包括球蛋白結構域(G)、富半胱氨酸結構域(C)以及兩個3型纖連蛋白結構域(Fl和F2)。圖6顯示肝配蛋白B2多克隆抗體和EphB4多克隆抗體對腫瘤細胞生長的影響。A)H28細胞系；B)H2373細胞系；以及C)H2052細胞系。圖7顯示EphB4單克隆抗體的親和力測試結果。顯示了親和力排序(從最弱到最強)。圖8顯示在bFGF存在或不存在時，利用示例性EphB4抗體(No. 138)進行小鼠角膜微囊測定的結果。圖9顯示EphB4抗體抑制SCC15異種移植腫瘤的生長。

圖10顯示EphB4抗體導致SCC15頭頸部癌腫瘤類型中的凋亡、壞死和血管發生減少。圖11顯示全身性施用EphB4抗體導致腫瘤消退。發明詳述
I.EphB4抗體以及其他結合多肽本公開內容中部分提供了能夠被多肽結合劑有效靶定的EphB4分子的確定部分，所述多肽結合劑如抗體、抗體的抗原結合部分以及非免疫球蛋白抗原結合支架。此處所述的EphB4多肽結合劑可用於治療多種疾病，特別是癌症和與有害性血管發生相關的疾病。本公開內容提供了抑制一種或多種EphB4介導的功能(如肝配蛋白B2結合或EphB4激酶活性)的抗體及其抗原結合部分。此類結合劑可用於在體外或體內抑制EphB4的功能，優選用於治療癌症和與有害性血管發生相關的疾病。本公開內容也提供了活化EphB4激酶活性(通常通過評估EphB4磷酸化狀態進行測定)的抗體及其抗原結合部分。驚奇的是，在細胞水平和體內測定中此類抗體也抑制EphB4功能。因此，此類結合劑可用於在體外和體內抑制EphB4功能，並優選用於治療癌症和與有害性血管發生相關的疾病。儘管並不指望局限於某一特定的機制，但這些抗體不僅刺激了 EphB4激酶的活性，也刺激了從膜內去除EphB4，從而降低了 EphB4的整體水平。EphB4屬於跨膜受體蛋白酪氨酸激酶家族。EphB4的胞外部分由配體結合結構域(也稱為球蛋白結構域)、富半胱氨酸結構域以及一對III型纖連蛋白重複(見如圖I) 組成。胞漿結構域中含具有兩個保守酪氨酸殘基的近膜區、蛋白質酪氨酸激酶結構域、不育a基序(SAM)以及PDZ結構域結合基序。EphB4對膜結合配體肝配蛋白B2具有特異性(Sakano, S.等人1996 ;Brambilla R.等人1995)。EphB4通過結合成簇的、膜連接的肝配蛋白配體而被活化(Davis S等人1994),提示Eph受體的活化需要表達受體的細胞與表達配體的細胞間的接觸。一旦結合配體，EphB4受體形成二聚體並自磷酸化近膜區的酪氨酸殘基從而達到完全活化。此處使用的術語「EphB4」是指來自包括人在內的哺乳動物的EphB4多肽。在一個實施方案中，產生針對某一分離和/或重組的哺乳動物EphB4或其部分(如肽)，或針對表達重組哺乳動物EphB4的宿主細胞的抗體(免疫球蛋白)。在某些方面，本發明的抗體特異地結合於EphB4蛋白質的胞外結構域(此處稱為EphB4可溶性多肽)。例如EphB4可溶性多肽含有球蛋白結構域，並能夠與肝配蛋白B2相結合。圖2提供了 EphB4可溶性多肽的實例。此處使用的EphB4可溶性多肽包括EphB4可溶性多肽的片段、功能性變體以及修飾的形式。「免疫球蛋白」為四聚體分子。天然存在的免疫球蛋白中，每一四聚體是由兩對相同的多肽鏈組成的，每一對中含有一條「輕」鏈(約25kDa)和一條「重」鏈(約50-70kDa)。每條鏈的氨基端部分包含負責主要識別抗原的長約100至110或更多胺基酸的可變區。而每一條鏈的羧基端則存在主要負責效應器功能的恆定區。人輕鏈可分為K和X輕鏈。重鏈可分為ii、S、Y、a或e ,並定義抗體的同種型分別為IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在輕鏈和重鏈中，可變區和恆定區之間通過長約12個或更多胺基酸的「J」區相連，重鏈中還含有一個長約10個胺基酸的「D」區。詳見《Fundamental Immunology》第7章(Paul, W.編輯，第二版.Raven Press, N. Y. (1989))(此處整體引用作為參考)。每一輕/重鏈對的可變區形成抗體結合位點，這樣完整的免疫球蛋白具有兩個結合位點。免疫球蛋白可以組成更高級的結構。IgA —般為兩個四聚體的二聚體。IgM —般為五個四聚體的五聚體。免疫球蛋白鏈的一般結構相同，具有由三個高變區(也稱為互補決定區或CDR)連接的相對保守構架區(FR)。來自每對兩條鏈的CDR由構架區連接，使之能結合於特異的表位。從N-末端到C-末端，輕鏈和重鏈都含有結構域FR1、⑶Rl、FR2、⑶R2、FR3、CDR3和FR4。胺基酸在每一結構域中的分配與Kabat Sequences of Proteins ofImmunological Interest(National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987and1991)),或 Chothia&Lesk J. Mol. Biol. 196 :901-917(1987) ；Chothia 等人，Nature342 878-883(1989)中的定義一致。「抗體」是指完整的免疫球蛋白或其與完整抗體競爭特異性結合的抗原結合部分。可以通過重組DNA技術、或酶或化學裂解完整抗體來產生抗原結合部分。抗原結合部分中包括Fab、Fab'、F(ab' )2、Fv、dAb，以及至少含有足以使特異性抗原結合於多肽的部分免疫球蛋白的互補決定區(CDR)片段、單鏈抗體(scFv)、單結構域抗體、嵌合抗體、雙抗體及多肽。此處術語「抗EphB4抗體」和「EphB4抗體」可互換使用。Fab片段是由VL、VH、CL和CH I結構域組成的單價片段；F(ab' ).sub.2片段是 含有兩個在鉸鏈區通過二硫鍵橋相連的Fab片段的二價片段；Fd片段由VH和CHl結構域組成；Fv片段由抗體的單臂VL和VH結構域組成；而dAb片段(Ward等人，Nature 341 544-546，1989)由VH結構域組成。單鏈抗體(scFv)中，VL和VH區通過合成的連接子配對形成單價分子,所述連接子可使它們成為一條單獨的蛋白質鏈(Bird等人，Science 242 :423_426，1988 ;以及Huston 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 :5879-5883,1988)。雙抗體為二價的雙特異性抗體，其中VH和VL結構域表達於同一條多肽鏈上，但其使用的連接子太短而不能使這兩個區域之間在同一條鏈上配對，因此其中的結構域不得不與另一條鏈上的互補結構域發生配對，從而產生兩個抗原結合位點(見如Holliger, P.等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448，1993，以及 Pol jak，R.J.等人，Structure 2:1121-1123,1994)。一個分子中可能以共價結合或非共價結合的形式含有一個或多個CDR。抗體中可能含有一個或多個結合位點。如果結合位點多於一個，則這些結合位點可能彼此相同，也可能不一樣。例如天然存在的免疫球蛋白中具有兩個相同的結合位點，單鏈抗體或Fab片段中含有一個結合位點，而「雙特異性」或「雙功能」抗體含有兩個不同的結合位點。術語「人抗體」包括具有一個或多個來自人免疫球蛋白序列的可變區和恆定區的所有抗體。在優選的實施方案中，所有的可變區和恆定區都來自人免疫球蛋白序列(完整的人抗體)。可如下通過多種途徑製備這些抗體。術語「嵌合抗體」是指含有來自一個抗體的一個或多個區域以及來自其他一個或多個抗體的一個或多個區域的抗體。在優選實施方案中，一個或多個CDR來自人抗EphB4抗體。在更優選的實施方案中，所有的CDR均來自人抗EphB4抗體。在另一優選的實施方案中，來自多於一個人抗EphB4抗體的⑶R混合併匹配在一個嵌合抗體中。例如，在一個嵌合抗體中，來自第一種人抗EphB4抗體輕鏈的CDRl可能與來自第二種人抗EphB4抗體輕鏈的⑶R2和⑶R3結合，而重鏈的⑶R則可能來自第三種抗EphB4抗體。此外，構架區可能來自相同的抗EphB4抗體之一、來自一個或多個不同的抗體(如人抗體或人源化抗體)。「中和抗體」是指能夠抑制EphB4與肝配蛋白B2結合的抗體，足量抗EphB4抗體可將與肝配蛋白B2結合的EphB4 (可溶性)量減少至少約20 %，優選至少40 %，更優選60 %，甚至更優選80 %，或甚至更優選85 %。可以通過本領域普通技術人員已知的任何方法測量結合的減少，例如通過體外競爭性結合測定測量。測量結合減少的實例可見以下的實施例。「活化EphB4激酶的抗體」是指當加入到表達EphB4的細胞、組織或有機體中時，可活化至少約20% EphB4激酶活性的抗體。在優選實施方案中，活化EphB4激酶活性的抗體可活化至少40%、更優選60%、甚至更優選80%，或甚至更優選85%的激酶活性。一般而言，通過EphB4自身的磷酸化狀態(酪氨酸自磷酸化)來測量激酶活性。此處所用的術語「標記」或「標記的」是指將另一種分子整合於抗體中。在一個實施方案中，標記為可檢測的記號，例如摻入放射性標記的胺基酸，或向多肽連接具有可由標記抗生物素蛋白(例如含有螢光標記或酶活性而能被光學或比色法檢測的鏈黴抗生物素蛋白)檢測的生物素化部分。在另一實施方案中，標記或記號可為治療性的，例如藥物綴合物或毒素。可以使用本領域已知的多種標記多肽和糖蛋白的方法。多肽標記的實例包括(但不僅限於)如下放射性同位素或放射性核素(例如3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc ;lllln、1251、1311)、螢光標記(例如FITC、羅丹明、鑭磷光體)、酶標記(例如辣根過氧化物酶、3半乳糖苷酶、螢光素酶、鹼性磷酸酶)、化學發光標記、生物素化基團、由第二報告子識別的預確的定多肽表位(例如亮氨酸拉鏈對序列、第二抗體結合位點、金屬結合結構域、表位標 籤)、磁性試劑(如釓螯合物)、毒素(如百日咳毒素)、紫杉醇、細胞鬆弛素B、短桿菌肽D、溴乙唳、吐根鹼、絲裂黴素、依託泊苷(etoposide)、替尼泊苷(tenoposide)、長春新鹼、長春鹼、秋水仙鹼、阿黴素、柔毛黴素、二輕基炭疽菌素二酮(dihydroxy anthracin dione)、米託蒽醌(mitoxantrone)、mitliramycin、放線菌素D、l_脫氫睪酮、糖皮質激素、普魯卡因、丁卡因、利多卡因、普奈洛爾和嘌呤黴素以及它們類似物或同系物。在一些實施方案中，標記通過不同長度的間隔臂連接以降低可能的空間位阻。如下文實施例所示，申請人已經製造出若干針對EphB4的單克隆抗體，以及能夠產生EphB4單克隆抗體的雜交瘤細胞系。這些抗體還具有其他許多方面的特徵，例如它們抑制EphB4及其配體(例如肝配蛋白B2-中和抗體)間的相互作用的能力，它們抑制EphB4受體二聚化或多聚化的能力，它們誘導EphB4的酪氨酸磷酸化的能力、它們與其他Eph家族成員之間的交互反應性、它們抑制血管發生的能力以及它們抑制腫瘤生長的能力。此外，表位測圖研究顯示這些EphB4抗體可特異結合EphB4的一個或多個區域(例如球蛋白結構域、富半胱氨酸結構域或III型纖連蛋白結構域)。例如EphB4抗體可結合兩個III型纖連蛋白結構域。某些方面而言，本發明的抗體可以特異結合EphB4蛋白質的胞外結構域(EOT)(此處也稱為可溶性EphB4多肽)。可溶性EphB4多肽可含有包含球蛋白(G)結構域(SEQ IDNO 1中的胺基酸29-197)的序列，並任選含有其他結構域，如富半胱氨酸結構域(SEQ IDNO: I中的胺基酸239-321)、第一 3型纖連蛋白結構域(SEQ ID NO: I中的胺基酸324-429)及第二 3型纖連蛋白結構域(SEQ ID NO : I中的胺基酸434-526)。圖3_4中提供了示例性的EphB4可溶性多肽。如此處使用的，EphB4可溶性多肽包括EphB4可溶性多肽的片段、功能性變體以及修飾的形式。本發明在某些方面提供了對EphB4或EphB4部分具有結合特異性的抗體(抗EphB4)。這些抗體的實例包括(但不僅限於)圖5所示的EphB4抗體編號1、23、35、47、57、79、85L、85H、91、98、121、131 和 138。所述免疫球蛋白任選以至少約 1x10'1x10'1x10'1x10_9M或更低的親和力結合EphB4。任選抗體及其部分結合肝配蛋白B2的親和力與結合含球蛋白配體結合結構域的EphB4多肽可溶性胞外部分大致相同。此處公開的抗體優選對EphB4具有特異性，而與Eph或肝配蛋白家族的其他成員結合微小。在本發明的另一方面，抗EphB4抗體同時具有物種和分子選擇性。在一個實施方案中，抗EphB4抗體結合人、cynomologous或恆河猴(rhesus)的EphB4。在優選實施方案中，抗EphB4抗體並不與小鼠、大鼠、豚鼠、狗或兔的EphB4結合。任選地，抗體能結合來自不同物種(例如人和小鼠)的多種不同的EphB4。按照說明書的這一教導，可以利用本領域公知的方法確定抗EphB4抗體的物種選擇性。例如，可以使用Western印跡、FACS、ELISA或RIA確定物種的選擇性。在優選實施方案中,可以利用Western印跡確定物種的選擇性。在另一實施方案中，抗EphB4抗體與EphB4結合的趨勢比之與來自同一物種的EphB4家族其他成員的結合趨勢至少高50倍，優選高100或200倍。可以按照本說明的教導利用本領域公知的方法確定選擇性。例如，可以利用Western印跡、FACS、ELISA或RIA確定選擇性。在優選實施方案中，通過Western印跡確定分子的選擇性。在某些實施方案中，本發明的抗體結合EphB4的一個或多個特異性結構域。例如， 抗體與一個或多個EphB4的胞外結構域(如球蛋白結構域、富半胱氨酸結構域以及第一 3型纖連蛋白結構域和第二 3型纖連蛋白結構域)結合。例如，EphB4抗體編號1、23、35和79結合圖I序列中跨越球蛋白結構域的胺基酸16-198區域的表位。EphB4抗體編號85L、85H、91和131結合圖I序列中內含第一 3型纖連蛋白結構域的胺基酸324-429區域的表位。EphB4抗體編號47、57、85H、98、121和138可結合圖I序列中內含第二 3型纖連蛋白結構域的胺基酸430-537區域的表位。任選地，受試抗體(如EphB4抗體號85H)可結合EphB4的至少兩個結構域(圖5)。抗EphB4抗體可以為IgG、IgM、IgE、IgA或IgD分子。在優選實施方案中，抗體為IgG，且屬於IgGl、IgG2、IgG3或IgG4亞型。在更優選的實施方案中，抗EphB4抗體為IgG2亞類。可以通過本領域已知的任何方法確定EphB4抗體的類別和亞類。一般而言,可以使用對某一特定類別和亞類的抗體具有特異性的抗體，來確定抗體的類別和亞類。此類抗體可以購得。可以通過ELISA、Western印跡以及其他技術確定類別和亞類。或者也可以通過對抗體重鏈和/或輕鏈中恆定區全部或部分測序，將其胺基酸序列與不同類別和亞類的免疫球蛋白的已知胺基酸序列進行比較，並確定抗體的類別和亞類。為說明所需，示例性的EphB4抗體的類別和亞類見於下表I。在某些實施方案中，含有來自不同物種的部分的單鏈抗體，和嵌合、人源化或靈長類化(CDR移植的)抗體，以及嵌合或CDR移植的單鏈抗體也包括在本發明抗體的抗原結合部分中。可以通過常規技術將這些抗體的多個部分化學性的連接在一起，也可以利用遺傳工程技術將之製備成連續的蛋白質。例如，可以表達編碼嵌合或人源化鏈的核酸來製備連續的蛋白質。見如Cabilly等人，美國專利No. 4，816，567 ；Cabilly等人，歐洲專利No. 0，125，023 ；Boss 等人，美國專利 No. 4，816，397 ；Boss 等人，歐洲專利 No. 0，120，694 ；Neuberger, M. S.等人.,WO 86/01533 ；Neuberger,M. S.等人.，歐洲專利 No. 0, 194, 276B1 ；Winter,美國專利No. 5，225，539 ；以及Winter，歐洲專利No. 0，239，400B1。關於靈長類抗體，也參見 Newman, R.等人.，BioTechnology, 10 :1455-1460 (1992)。關於單鏈抗體，見如 Ladner 等人 ，美國專利 No. 4, 946, 778 ；以及 Bird, R. E.等人，Science, 242 423-426(1988)。
此外，也可以生產抗體的功能性片段，包括嵌合、人源化、靈長類化或單鏈抗體的片段。受試抗體的功能性片段保留了其來源的全長抗體中至少一項結合功能和/或調控功能。優選的功能性片段保留了相應全長抗體中的抗原結合功能(例如，對EphB4的特異性)。某些優選的功能性片段保留了抑制一種或多種EphB4特徵性功能(如結合特異性、信號轉導活性，和/或激活細胞反應)的能力。例如在一個實施方案中，EphB4抗體的功能性片段能夠抑制EphB4與其一種或多種配體(如肝配蛋白B2)之間的相互作用，和/或抑制其一項或多項受體介導功能，如細胞遷移、細胞增殖、血管發生和/或腫瘤生長。例如,包括(但不僅限於)Fv、Fab、Fab'和F(ab' )2在內能結合EphB4受體或其部分的抗體片段，都包括在本發明中。可通過酶裂解或重組技術生產此類片段。例如，木瓜蛋白酶或胃蛋白酶裂解分別能夠產生Fab或F(ab' )2片段。也可以利用其中已於天然終止位點上遊引入一個或多個終止子密碼的抗體基因，來產生多種截短形式的抗體。例如，可以設計編碼F(ab' )2重鏈的嵌合基因中含有編碼重鏈CHl結構域和鉸鏈區的DNA序列。人源化抗體為來自於非人物種的抗體，其中突變了構架和重鏈及輕鏈恆定區中 的某些胺基酸以避免或消除在人中的免疫反應。或者也可通過將來自人抗體的恆定區與非人物種的可變區融合來產生人源化抗體。如何製備人源化抗體的實例可見於美國專利No. 6，054，297,5, 886，152和5，877，293。人源化抗體可含有來自不同免疫球蛋白的部分，其中任選至少有一個部分來源於人。因此，本發明涉及對EphB4(如人EphB4)具有結合特異性的人源化免疫球蛋白，所述免疫球蛋白中包括非人源(如嚙齒類的)的抗原結合區，以及至少部分的人免疫球蛋白(如人構架區、人恆定區或其部分)。例如，人源化抗體可以含有具所需特異性的非人(如小鼠)來源的免疫球蛋白部分，以及來自人的免疫球蛋白序列(如嵌合免疫球蛋白)，通過常規技術(如合成)將其化學連接，或利用遺傳工程技術製備連續的多肽(如可以表達編碼嵌合抗體的蛋白質部分的DNA以產生連續的多肽鏈)。本發明人源化免疫球蛋白的另一實例是含有一個或多個免疫球蛋白鏈的免疫球蛋白，所述免疫球蛋白鏈中具有非人源CDR(如來自非人抗體的一個或多個CDR)和來自人輕鏈和/或重鏈的構架區(如有或無構架改變的移植CDR的抗體)。在一個實施方案中，人源化免疫球蛋白能夠與鼠單克隆抗體競爭結合EphB4多肽。術語人源化免疫球蛋白也包括嵌合或移植CDR的單鏈抗體。本發明的某些實施方案提供了 EphB4拮抗物抗體。此處所述的術語「拮抗物抗體」是指能夠抑制一項或多項EphB4功能的抗體，例如抑制其結合活性(如配體結合)和信號轉導活性(如EphB4的成簇或磷酸化、刺激細胞應答，如刺激細胞遷移或細胞增殖)。例如，拮抗物抗體能夠抑制(減弱或防止)EphB4受體與天然配體(如肝配蛋白B2或其片段)之間的相互作用。優選的針對EphB4的拮抗物抗體能夠抑制EphB4介導的功能，包括內皮細胞遷移、細胞增殖、血管發生和/或腫瘤生長。任選地，拮抗物抗體結合EphB4的胞外結構域。本發明的其他實施方案提供了活化EphB4激酶的抗體。此類抗體可增強EphB4激酶的活性，即使在沒有肝配蛋白B2時也是如此。在某些情況下，此類抗體可用於刺激EphB4。然而，申請人注意到令人驚奇的是，在大部分細胞水平和體內測定中此類抗體表現如拮抗物抗體。此類抗體似乎與兩個III型纖連蛋白結構域中的至少一個相結合，特別是圖I中的胺基酸324-429區域。
某些實施方案也提供抗獨特型抗體。抗獨特型抗體識別與另一抗體的抗原結合位點相關的抗原決定簇。可以通過免疫相同物種的動物製備針對第二抗體的抗獨特型抗體，所述動物優選為與用來產生第二抗體的動物同一品系。見如美國專利No. 4，699，880。在一個實施方案中，產生針對受體或其部分的抗體，而這些抗體可隨後用於產生抗獨特型抗體。由此產生的抗獨特型抗體能夠結合與受體結合的化合物(如受體功能的配體)，且可用於免疫測定中以檢測或鑑定或定量此類化合物。儘管此類抗獨特型抗體自身不結合受體，它也可以作為EphB4受體功能的抑制劑。這樣的抗獨特型抗體也可稱為拮抗劑抗體。本發明的某些方面提供了雜交瘤細胞系，以及這些雜交瘤細胞系所產生的單克隆抗體。本發明的細胞系除了生產單克隆抗體之外還有其他用途。例如，本發明的細胞系可融合於其他細胞(如有合適藥物標記的人骨髓瘤、小鼠骨髓瘤、人-小鼠雜合骨髓瘤(heteromyeloma)或人類淋巴母細胞細胞)，以產生其他的雜交瘤，從而可促成編碼單克隆抗體基因的轉移。此外，該細胞系還可用作編碼抗EphB4免疫球蛋白鏈的核酸的來源，可以分離和表達所述核酸(例如利用任何合適的技術轉移到其他細胞(見如Cabilly等人，美國專利No. 4，816，567 ;Winter，美國專利No. 5，225，539)。例如，可以分離含有重排抗EphB4輕鏈或重鏈的克隆(如通過PCR)，或者可以從分離自該細胞系的mRNA製備cDNA文庫，並分離編碼抗EphB4免疫球蛋白鏈的cDNA克隆。因此，可得到抗體重鏈和/或輕鏈或其部分的編碼核酸，並根據重組DNA技術用之於多種宿主細胞或體外翻譯系統中產生特定的免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或它們的變體(如人源化免疫球蛋白)。例如，可將編碼人源化免疫球蛋白或免疫球蛋白鏈的變體的核酸(包括cDNA)或其衍生物置於合適的原核或真核載體(如表達載體)中，並通過合適的方法(例如轉化、轉染、電穿孔法、感染)導入合適的宿主細胞，從而使該核酸可與一個或多個表達控制元件有效連接(如進入載體或整合入宿主細胞基因組)。為生產所需，可將宿主細胞保持在適於表達的條件下(例如存在誘導子並添加適當鹽、生長因子、抗生素、營養補充物等的合適培養基)，以生產編碼多肽。如有需要，可以回收和/或分離編碼蛋白質(如從宿主細胞中或培養基中)。應當理解生產方法包括在轉基因動物的宿主細胞中表達(見如，W092/03918,GenPharm International，1992年3月19日公開)。II.抗體生產方法可以如此處所述或利用其他合適的技術製備免疫抗原，並生產多克隆和單克隆抗體。已描述了多種方法。見如Kohler等人.，Nature, 256 :495-497 (1975)以及Eur.J. Immunol. 6 :511-519(1976) ；Milstein 等人 ，Nature266 :550-552(1977) ；Koprowski等人 ，美國專利 No. 4, 172, 124 ；Harlow, E.和 D. Lane, 1988, Antibodies A LaboratoryManual, (Cold Spring Harbor Laboratory Cold Spring Harbor, N.Y. ) ；CurrentProtocols In Molecular Biology,Vol. 2(Supplement 27,Summer; 94),Ausubel,F. M.等人 ，Eds. , (John ffiley&Sons New York, N. Y. ), ChapterlI, (1991)。一般而言，可以通過將永生細胞系(如骨髓瘤細胞系，如SP2/0)與抗體產生細胞融合而製備雜交瘤細胞。抗體產生細胞(優選脾臟或淋巴結細胞)獲自利用目標抗原免疫的動物。可以利用選擇性培養條件分離融合細胞(雜交瘤)，並通過有限稀釋克隆。通過適當的檢測(如ELISA)選擇能產生具有所需特異性抗體的細胞。也可使用其他適當的方法生產或分離具有所需特異性的抗體，包括如從文庫中選、擇重組抗體的方法、或依賴於免疫能夠生產全組人抗體的轉基因動物(如小鼠)的方法。見如 Jakobovits 等人,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90 :2551-2555 (1993) ;Jakobovits 等人.，Nature, 362 :255-258(1993) ;Lonberg 等人.，美國專利 No. 5，545，806 ；Surani 等人.，美國專利 No. 5，545，807。作為說明，可以利用來自EphB4多肽的免疫原(如能夠引發發抗體應答的EphB4多肽或其抗原性片段，或EphB4融合蛋白)免疫哺乳動物，如小鼠、倉鼠或兔。見如《Antibodies A Laboratory Manual.》Harlow 和 Lane 編輯(Cold Spring Harbor Press 1988)。使蛋白質或肽具有免疫原性的技術包括與載體綴合或其他本領域公知的技術。可以在佐劑存在時施用EphB4多肽的免疫原性部分。可以通過檢測血漿或血清中的抗體效價來監測免疫的進展。可以利用標準ELISA或其他免疫測定法，利用免疫原作為抗原來評估抗體水平。在一個實施方案中，本發明抗體對EphB4蛋白的胞外部分(如SEQ ID NO :3或4)或其片段具有特異性。在另一實施方案中，本發明的抗體對EphB4蛋白的胞內部分或跨膜部分具有特異性。在利用EphB4多肽的抗原性製品免疫動物後可以獲得抗血清，且如有需要，可從 血清中分離出多克隆抗體。為生產單克隆抗體，從經免疫的動物中收集抗體產生細胞(淋巴細胞)，並用標準體細胞融合的方法將之與永生細胞(如骨髓瘤細胞)融合，以產生雜交瘤細胞。此類技術為本領域所公知，包括如雜交瘤技術(原創於Kohler和Milstein，(1975)Nature, 256 :495-497)，人 B 細胞雜交瘤技術(Kozbar 等人.，(1983) Immunology Today, 4 72),以及EBV雜交瘤技術產生人單克隆抗體(Cole等人 ，(1985)Monoclonal Antibodiesand Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. 77-96頁)。可以通過免疫化學的方法篩查雜交瘤細胞中對EphB4多肽有特異反應性抗體的產生，以及從含有此類雜交瘤細胞的培養物中分離的單克隆抗體。在某些實施方案中，可以利用常規技術將本發明的抗體進行片段化，並通過上述所有與抗體相同的方法篩查這些片段的功效。例如，用胃蛋白酶處理抗體能夠產生F(ab)2片段。可以處理所產生的F (ab) 2片段還原其中的二硫鍵，進而產生Fab片段。在某些實施方案中，本發明的抗體還包括抗體的由至少一個⑶R區域所致的對EphB4多肽具有親和力的雙特異性、單鏈、以及嵌合和人源化分子。也可以應用生產單鏈抗體的技術(美國專利No. 4，946，778)生產單鏈抗體。還可以用轉基因小鼠或包括其他哺乳動物在內的其他生物來表達人源化抗體。產生這些抗體的方法為本領域所公知。見如Cabilly 等人 ，美國專利 No. 4，816，567 ；Cabilly 等人 ，歐洲專利 No. 0，125，023 ；Queen等人.，歐洲專利No. 0, 451, 216 ；Boss等人.,美國專利No. 4, 816, 397 ；Boss等人.，歐洲專利 No. 0, 120, 694 ；Neuberger,M. S.等人.,WO 86/01533 ；Neuberger,M. S.等人.，歐洲專利No. 0，194，276 ;Winter，美國專利 No. 5，225，539 ；winter,歐洲專利 No. 0，239，400 ；Padlan,E.A.等人.，歐洲專利申請No. 0，519，596A1。也見Ladner等人.，美國專利No. 4，946，778 ；Huston，美國專利 No. 5，476，786 ；以及 Bird, R. E.等人 ，Science, 242 :423-426 (1988)) 可以使用合成的和/或重組核酸來製備編碼所需人源化鏈的基因(如cDNA)，從生產此類人源化免疫球蛋白。例如，可以利用PCR誘變方法來改變編碼人或人源化鏈的DNA序列(如先前的人源化可變區的DNA模板)，以構建人源化可變區的編碼核酸(如DNA)序歹丨J (見如 Kamman, M.等人.，Nucl. Acids Res.，17 :5404(1989)))))) ；Sato, K.等人.，Cancer Research, 53 :851-856 (1993) ;Daugherty,B. L等人.,Nucleic Acids Res. ,19(9)2471-2476(1991);以及 Lewis，A. P.和 J. S. Crowe, Gene, 101 :297-302 (1991))。利用這些或其他合適的方法，也可以生產變體。在一個實施方案中，可誘變克隆的可變區並可選擇具有所需特異性的變體的編碼序列(如從噬菌體文庫中，見如Krebber等人.，美國專利No. 5，514，548 ；Hoogenboom 等人 ，W093/06213,發表於 1993 年 4 月 I 日)。在某些實施方案中，進一步將抗體附著於能被檢測的標記(如標記可為放射性同位素、螢光化合物、酶或酶輔因子)。其活性部分可以為放射活性劑，如放射活性重金屬(如鐵螯合物；釓或錳的放射活性螯合物；氧、氮、鐵、碳或鎵的正電子發射體；43K、52Fe、57Co、67Cu、67Ga、68Ga、123I、125I、mI、132I或"Tc。固定於此類部分的結合劑可用作顯像劑，以診斷用有效劑量施用於哺乳動物(如人)，然後檢測該顯像劑的定位和累積。可以通過放射性閃爍掃描、核磁共振成像、計算機斷層成像或正電子發射成像來檢測顯像劑的定位和累積。利用針對EphB4的抗體或其他結合多肽進行免疫閃爍掃描來檢測和/或診斷癌症和脈管系統。例如標記99鎝、111銦、125碘的針對EphB4標誌的單克隆抗體即可用於此類顯像。顯然對於技術人員而言，施用的放射性同位素的量取決於所用的放射性同位素。本領域的普通技術人員即能根據某一用作活性部分的放射性核素的比活性和能量，熟練地得出所需施用的顯像劑劑量。一般而言，每劑顯像劑施用0. 1-100毫居裡，優選1-10毫居裡，最常施用的劑量 為2-5毫居裡。因此，本發明中用作顯像劑的組合物，包括綴合於含有0. 1-100毫居裡的放射活性部分的靶部分，在某些實施方案中優選1-10毫居裡，在某些實施方案中優選2-5毫居裡，在某些實施方案中更優選1-5毫居裡。在某些優選的實施方案中，本發明的抗體為單克隆抗體，而在某些實施方案中，本發明提供生產新抗體的方法。例如，一種生產能特異性結合EphB4多肽的單克隆抗體的方法包括向小鼠施用一定劑量的免疫原性組合物(所述組合物中含可有效激活可測水平免疫應答的EphB4多肽)，從小鼠中獲得產生抗體的細胞(如來自脾臟的細胞)，並將抗體產生細胞與骨髓瘤細胞融合以獲取產生抗體的雜交瘤，測試該產生抗體的雜交瘤以鑑定能產生可特異性結合EphB4多肽的單克隆抗體的雜交瘤。一旦得到，即可在細胞培養物中增殖該雜交瘤，任選在雜交瘤衍生細胞產生可與EphB4多肽特異性結合的單克隆抗體的培養條件中進行。可以從細胞培養物中純化該單克隆抗體。此外，用於篩查抗體以鑑定所需抗體的技術可能會影響所得抗體的性質。例如，將用於某些治療目的的抗體應當優選能夠針對特定的細胞類型。因此，為得到此類抗體，可能需要篩選出結合表達目標抗原的細胞的抗體(例如通過螢光活化的細胞分選)。與之類似，如果將用於結合溶液中的抗原，可能需要測試其溶液結合力。有多種不同的方法可用於測試抗體-抗原的相互作用，以鑑定所需的特定抗體。此類技術包括ELISA、表面等離振子共振結合測定(如Biacore結合測定，Bia-core AB, Uppsala, Sweden)、夾層測定(如順磁珠系統，IGEN International, Inc. , Gaithersburg, Maryland)、western 印跡、免疫沉澱測定和免疫組織化學。本發明的抗體可用於多種應用，包括研究、診斷和治療性應用。例如，它們可用於分離和/或純化受體或其部分，也可用於研究受體結構(如構象)和功能。III.診斷性應用在某些方面，本發明的多種抗體可用於檢測或測量EphB4受體的表達，例如在內皮細胞(如靜脈內皮細胞)中，或在被轉染EphB4受體基因的細胞中。因此，它們也可為診斷或研究目的，用於如細胞分選和成像(例如流式細胞術，以及螢光活化細胞分選)的應用中。在某些實施方案中，為診斷目的可以標記或不標記抗體或抗體的抗原結合片段。一般而言，診斷測定需要檢測由於抗體與EphB4結合而導致的複合物形成。可以直接標記這些抗體。可使用的多種標記包括但不僅限於放射性核素、螢光劑、酶、酶底物、酶輔因子、酶抑制劑和配體(如生物素、半抗原)。多種合適的免疫測定為技術人員所公知(見如美國專利No. 3，817，827 ;3，850，752 ;3，901，654 ;和4，098，876)。未標記的抗體可用於如凝集測定等測定中。未標記抗體也可與另外的(一種或多種)可用於檢測抗體的適當試劑組合使用，所述試劑如可與第一抗體反應的標記抗體(如第二抗體)(如對未標記免疫球蛋白具有特異性的抗獨特型抗體或其他抗體)，或其他合適的試劑(如標記的A蛋白)。也可用化學基團如聚乙二醇(PEG)、甲基或乙基、或糖基衍生EphB4抗體。這些基團有助於改善抗體的生物學特性，例如可提高其血清半衰期或提高組織結合力。
在一個實施方案中，本發明的抗體可用於酶免疫測定中，其中受試抗體或第二抗體與酶綴合。當含有EphB4蛋白的生物樣品與受試抗體結合時，在抗體和EphB4蛋白之間產生了結合。在一個實施方案中，含有表達EphB4蛋白質細胞(如內皮細胞)的樣品與受試抗體組合，在抗體和具有EphB4蛋白作為抗體識別表位的細胞之間產生了結合。這些被結合的細胞可以從未結合試劑中分離出來，並且通過例如將樣品與經酶作用後會產生顏色或其他可檢測變化的酶底物相接觸，來確定是否存在特異結合細胞的抗體-酶綴合物。在另一實施方案中，可以不標記受試抗體，而加入能夠識別受試抗體的第二標記抗體。在某些方面，也可以製備用於檢測生物樣品中是否存在EphB4蛋白的試劑盒。此類試劑盒包含可以結合EphB4蛋白或所述受體部分的抗體，以及一種或多種適於檢測抗體和EphB4複合物或其部分存在的輔助試劑。本發明的抗體組合物可提供單獨凍幹形式或與對其他表位具特異性的其他抗體的組合凍幹形式。試劑盒中可含有這些標記或未標記的抗體，以及附加成分(如緩衝液，如Tris、磷酸鹽和碳酸鹽；穩定劑；賦形劑；殺生物劑和/或惰性蛋白質，如牛血清白蛋白)。例如，可以提供抗體與附加成分一道的凍幹混合物，也可單獨提供附加成分以任使用者組合。一般而言，這些附加材料的重量小於活性抗體量的5%，根據抗體濃度通常其總量為至少約0. 001%重量。當使用能夠結合單克隆抗體的第二抗體時，該抗體可包含在試劑盒中，例如在獨立的小瓶或容器中。如果存在，則第二抗體一般是標記的，可以通過與上述抗體製劑類似的方法配製。與之類似，本發明也涉及檢測和/或定量細胞中EphB4或其受體部分的表達，其中含有細胞或其級分(如膜級分)的組合物與可結合EphB4或其受體部分的抗體在適於抗體與之結合的條件下相接觸，並監測抗體的結合。檢測到抗體，即指示在抗體和EphB4或其受體部分之間形成了複合物，表明存在受體。可以通過標準方法測定抗體與細胞之間的結合，例如那些描述於實施例中的方法。該方法可用於檢測EphB4在個體細胞中的表達。任選地，可通過如流式細胞術評估EphB4在內皮細胞表面的定量表達，染色強度可與疾病的易感性、進程或風險關聯。本發明也涉及檢測哺乳動物對於某些疾病易感性的方法。用作說明，該方法可用於檢測哺乳動物對某些疾病的易感性，所述疾病的進程取決於細胞中EphB4的量和/或該哺乳動物中EphB4陽性細胞的數目。在一個實施方案中，本發明涉及檢測哺乳動物對於腫瘤的易感性。在該實施方案中，將待測樣品與結合EphB4或其部分的抗體在適於所述抗體結合的條件下相接觸，其中該樣品含有在正常個體中表達EphB4的細胞。檢測到抗體的結合和/或檢測到結合量，提示該個體對腫瘤有易感性，其中受體水平越高，個體對腫瘤的易感性就越高。申請人以及其他團體已經發現EphB4的表達與腫瘤的生長和進展相關聯。本發明的抗體也可用於進一步揭示個體中EphB4表達與血管發生相關性疾病之間的關係。IV.治療性應用在某些實施方案中，本發明提供了抑制血管發生以及治療血管發生相關性疾病(或紊亂)的組合物和方法。在另一些實施方案中，本發明提供了抑制或降低腫瘤生長的方法以及治療患有癌症個體的方法。這些方法包括如上所述向個體施用治療有效量的一種或多種EphB4抗體。這些方法特別針對於動物，尤其是針對人的治療性和預防性治療。
如上所述，血管發生相關性疾病包括但不僅限於血管發生依賴性腫瘤，包括如實體腫瘤、血液產生的腫瘤(如白血病)、以及腫瘤轉移；良性腫瘤，如血管瘤、聽神經瘤、神經纖維瘤、沙眼和化膿性肉芽腫；炎性紊亂，如免疫或非免疫性炎症；慢性關節型風溼病和銀屑病；眼血管新生性疾病,如糖尿病視網膜病變、早產兒視網膜病、黃斑變性、角膜移植物排斥反應、新生血管性青光眼、晶體後纖維組織增生；虹膜紅變Asler-Webber症候群；心肌血管發生；斑塊新血管發生；毛細血管擴張症；血友病性關節；血管纖維瘤；以及傷口肉芽腫和傷口癒合；毛細血管擴張銀屑硬皮病(telangiectasia psoriasis scleroderma)、化膿性肉芽腫、冠脈側支、缺血性肢體血管發生；角膜疾病、虹膜紅變、關節炎、糖尿病性新血管發生、骨折、脈管形成、造血。應當理解本發明的方法和組合物也可用於治療非血管發生依賴性癌症(腫瘤)。此處所用的術語「非血管發生依賴性癌症」，是指腫瘤組織中沒有或有很少新生血管的癌症(腫瘤)。具體而言，本發明的抗體可用於治療或預防癌症(腫瘤)，包括但不僅限於，結腸癌、乳腺癌、間皮腫瘤、前列腺癌、膀胱癌、頭頸部鱗狀細胞癌(HNSCC)、卡波西肉瘤以及白血病。在此類方法的某些實施方案中，可以一起(同時)或在不同時間(順序)施用一種或多種EphB4抗體。此外，抗體可以與另一種治療癌症或抑制血管發生的試劑聯合施用。在特定的實施方案中，本發明的受試抗體也可以與其他抗體治療劑(單克隆或多克隆)一起使用。在某些實施方案中，可單獨使用本發明的受試抗體。或者受試抗體可與其他常規抗癌療法聯合使用，這些療法用於治療或預防增殖性紊亂(如腫瘤)。例如，此類方法可用於預防性癌症預防、預防手術後的癌症復發及轉移，以及作為其他常規癌症療法的輔助療法。本發明認為通過使用一種或多種本發明的EphB4抗體，能夠增強常規癌症療法的有效性(如化學治療、放射性治療、光療、免疫療法以及手術)。大批常規化合物具有抗腫瘤活性。這些化合物已用作藥劑，在化療中縮小實體腫瘤、防止轉移和進一步生長，或減少白血病或骨髓惡性疾病中惡性細胞的數量。儘管化療在治療多種類型腫瘤中都很有效，許多抗腫瘤化合物會引發非期望的副作用。已知當聯合兩種或更多不同治療方法時，這些治療方法可協同作用而減少各治療的劑量，進而減少各化合物在較高劑量時帶來的有害副作用。另一些情況下，對某一治療反應不佳的腫瘤可能會對兩種或多種不同治療的聯合療法產生反應。當本發明的主要EphB4抗體與其他常規抗腫瘤劑聯合施用時，不管是同時施用還是順序施用，此類抗體都能夠增強抗腫瘤試劑的療效或克服對此類抗腫瘤劑的細胞耐受。這使得抗癌劑的劑量減少，從而降低了非期望副作用，或在耐受細胞中重建了抗腫瘤劑的有效性。可用於聯合抗腫瘤療法的藥物化合物包括(僅為說明):氨苯哌酮、安吖啶(amsacrine)、阿那曲唑(anastrozole)、門冬酸胺酶、卡介苗、比卡魯胺(bicalutamide)、博來黴素、布舍瑞林(buserelin)、白消安、喜樹鹼、卡培他濱(capecitabine)、卡鉬、卡莫司汀(carmustine)、苯丁酸氮芥、順鉬、克拉屈濱(cladribine)、氯屈膦酸(clodronate)、秋水仙鹼、環磷醯胺、去乙醯環丙氯地孕酮、阿糖胞苷、達卡巴嗪(dacarbazine)、放線菌素D、柔紅黴素、雙烯雌酚、已烯雌酚、多西他賽(docetaxel)、多柔比星、表柔比星、雌二醇、雌莫 司汀(estramustine)、依託泊苷、依西美坦(exemestane)、非格司亭(filgrastim)、氟達拉濱(fludarabine)、氟氫可的松、氟尿卩密唳、氟玲甲基睪丸素、氟他胺(flutamide)、吉西他濱(gemcitabine)、染料木黃酮、戈舍瑞林(goserelin)、輕基脲、去甲氧基柔紅黴素、異環磷醯胺、伊馬替尼(imatinib)、幹擾素、伊利替康(irinotecan)、伊立替康(ironotecan)、來曲唑、甲醯四氫葉酸、亮丙瑞林(Ieuprolide)、左旋咪唑、洛莫司汀(Iomustine)、氮芥、甲孕酮、甲地孕酮、馬法蘭(苯丙酸氮芥)、巰嘌呤、巰乙磺酸鈉、甲氨蝶呤、絲裂黴素、米託坦(mitotane)、米託蒽醌、尼魯米特(nilutamide)、諾考達唑(nocodazole)、奧曲肽、奧沙利鉬(oxaliplatin)、紫杉醇、帕米磷酸鹽(pamidronate)、戍糖苷、普卡黴素、卩卜吩姆鹽(porfimer)、甲基節肼、雷替曲塞(raltitrexed)、美羅華(rituximab)、鏈脲佐菌素、蘇拉明、三苯氧胺、替莫唑胺(temozolomide)、替尼泊苷、睪丸酮、硫鳥嘌呤、三胺硫磷、二氯鈦烯、拓撲替康(topotecan)、曲妥珠單抗(trastuzumab)、維生素A酸、長春鹼、長春新鹼、長春地辛和長春瑞濱。可以根據其作用機制，將這些化學治療的抗腫瘤化合物分為以下類別，例如抗代謝/抗癌試劑，如嘧啶類似物(5-氟尿嘧啶、氟尿嘧啶、卡培他濱、吉西他濱以及阿糖胞苷)和嘌呤類似物、葉酸拮抗劑及相關抑制劑(巰嘌呤、硫鳥嘌呤、戊糖苷和2-氯脫氧腺苷(克拉屈濱)；抗增殖/抗有絲分裂試劑，包括天然產物，如長春花生物鹼類(長春鹼、長春新鹼和長春瑞濱)；微管破壞劑，如紫杉鹼(紫杉醇、紫杉萜)、長春新鹼、長春鹼、諾考達唑、埃博黴素和諾維本(navelbine);鬼臼毒素(依託泊苷、替尼泊苷)；DNA破壞試劑(放線菌素、安吖啶、蒽環黴素(anthracycline)、博來黴素、白消安、喜樹鹼、卡鉬、苯丁酸氮芥、順鉬、環磷醯胺、環磷醯胺cytoxan、放線菌素D、柔紅黴素、多柔比星、表柔比星、六甲嘧胺奧沙利鉬、異環磷醯胺、馬法蘭(苯丙酸氮芥)、merchlorehtamine、絲裂黴素、米託蒽醌、亞硝脲、普卡黴素、甲基苄肼、紫杉醇、紫杉特爾、替尼泊苷、三亞乙基硫代磷酸胺和依託泊苷(VP16))；抗生素如放線菌素(放線菌素D)、柔紅黴素、多柔比星(阿黴素)、去甲氧基柔紅黴素、蒽環黴素、米託蒽醌、博來黴素、普卡黴素(光輝黴素)和絲裂黴素；酶(L-天門冬氨酸酶，可系統代謝L-天門冬氨酸並除去不能合成自身L-天門冬氨酸的細胞中的L-天門冬氨酸)；抗血小板製劑；抗增殖/抗有絲分裂烷化劑如氮芥(氮芥、環磷醯胺及其類似物、馬法蘭、苯丁酸氮芥)、次乙亞胺和甲基三聚氰胺(六甲嘧胺和噻替派)、烷基磺酸鹽-白消安、亞硝脲(卡莫司汀(BCNU)及其類似物、鏈脲佐菌素)、trazenes-darcarbazinine (DTIC);抗增殖/抗有絲分裂抗代謝劑如葉酸類似物(甲氨蝶呤)；鉬配位複合物(順鉬、卡鉬)、甲基苄肼、羥基脲、米託坦、氨苯哌酮；激素、激素類似物(雌激素、三苯氧胺、戈舍瑞林、比卡魯胺、尼魯米特)和芳化酶抑制劑(來曲唑、阿那曲唑)；抗凝劑(肝素、合成肝素鹽以及其他凝血酶抑制劑)；纖維溶解劑(如組織血纖維蛋白溶酶原激活物、鏈激酶和尿激酶)、阿司匹林、雙H密達莫、噻氯匹定(ticlopidine)、氯卩比格雷(clopidogrel)、阿昔單抗(abciximab);抗遷移劑；抗分泌劑(breveldin);免疫抑制劑(環孢菌素、他克莫司(tacrolimus) (FK-506)、西羅莫司(雷帕黴素)、咪唑硫嘌呤、黴酚酸酯)；抗血管發生化合物(TNP-470、染料木黃酮)以及生長因子抑制劑(血管內皮生長因子(VEGF)抑制劑、成纖維細胞生長因子(FGF)抑制劑)；血管緊張素受體阻斷劑；一氧化氮供體；反義寡核苷酸；抗體(曲妥珠單抗)；細胞周期抑制劑和分化誘導物(維A酸)；mT0R抑制劑、拓撲異構酶抑制劑(阿黴素、安吖啶、喜樹鹼、柔紅黴素、放線菌素D、eniposide、表阿黴素、依託泊苷、去甲氧基柔紅黴素和米託蒽醌、拓撲替康、伊利替康)、皮質類固醇(可的松、地塞米松、氫化可的松、甲基強的松龍、強的松和強的松龍)；生長因子信號轉導激酶抑制劑；線粒體功能失調誘導劑和級聯反應激活劑；以及染色質斷裂劑。
在某些實施方案中，可用於聯合抗血管發生療法的藥物化合物包括(I) 「生血管分子」釋放抑制劑，如bFGF(鹼性成纖維細胞生長因子)；(2)血管發生分子中和劑，如抗3 bFGF抗體；以及(3)內皮細胞對血管發生刺激的應答抑制劑，包括膠原酶抑制劑、基膜更新抑制劑、血管張力類固醇、來自真菌的血管發生抑制劑、血小板因子4、血小板反應蛋白、關節炎藥物(如D-青黴胺和硫代蘋果酸金)、維生素D3類似物、a幹擾素等等。其他提及的血管發生抑制劑，參見 Blood 等人 ，Bioch. Biophys. Acta.，1032 :89-118 (1990)，Moses等人.，Science, 248 1408-1410 (1990)，Ingber 等人.，Lab. Invest.，59 :44-51 (1988)，以及美國專利 No. 5，092，885,5, 112，946,5, 192，744,5, 202，352 和 6573256。此外，還有很多種化合物可用於抑制血管發生，例如肽或阻斷VEGF介導血管發生途徑的試劑、內皮素蛋白質或衍生物、血管張力素的賴氨酸結合片段、黑色素或促黑色素化合物、血纖維蛋白溶酶原片段(如血纖維蛋白溶酶原的Kringles 1_3)、肌I丐蛋白亞基、玻連蛋白av@3拮抗劑、來自皂化蛋白B的肽、抗生素或類似物(如四環素或新黴素)、含地諾孕素組合物、含耦聯於肽的MetAP-2抑制核的化合物、化合物EM-138、查耳酮及其類似物，以及naaladase抑制劑。見如美國專利 No. 6，395，718,6, 462，075,6, 465，431,6, 475，784,6, 482，802,6, 482，810、6，500，431,6, 500，924、6，518，298、6，521，439,6, 525，019,6, 538，103,6, 544，758、6，544，947,6, 548，477,6, 559，126 以及 6，569，845。根據聯合治療的性質，當施用其他治療時和/或施用其他治療後，仍可繼續施用本發明的抗體。可以單劑或多劑形式施用本發明抗體。在某些情況下，於常規療法之前的至少若干天開始施用抗體；而另一些情況下，則在施用常規療法前即刻或同時開始施用抗體。V.藥物組合物和施用模式在某些實施方案中，本發明的受試抗體與可藥用載體一起配製。可以單獨施用此類抗體或作為藥物製劑(組合物)的成分之一施用。這些化合物可以任何便於施用的方式配製，以在人或獸醫藥物中使用。組合物中也可含有潤溼劑、乳化劑以及潤滑劑(例如十二烷基硫酸鈉和硬脂酸鎂)，還可含有著色劑、釋放劑、包被劑、甜味劑、調味劑和芳香劑、防腐劑以及抗氧化劑。受試抗體的製劑形式包括適於經口、膳食、局部、胃腸外(如經靜脈、經動脈、肌內、皮下注射)、吸入(如經氣管、經鼻或口吸入、經鼻滴入)、經直腸和/或經陰道施用形式。其他適於施用的方法中也可含有可再裝料或可生物降解的裝置以及緩釋聚合裝置。本發明的藥物組合物也可以作為聯合治療的一部分與其他試劑共同施用(在同一製劑中或在獨立製劑中)。製劑可以方便地為單劑形式，並可通過任何製藥領域公知的方法來製備。可與載體材料結合以產生單劑形式的活性成分量，取決於即將治療的宿主和具體的施用方式。一般而言，可與載體材料結合以產生單劑形式的活性成分的量為能夠產生治療效果的化合物量。
在某些實施方案中，製備這些製劑或組合物的方法包括，與另一類型的抗腫瘤或抗血管發生劑和載體以及任選一種或多種輔助成分相組合。一般而言，可以利用液相載體或精細分割的固相載體或兩者來製備製劑，其後如有必要進行產品成型。用於經口施用的製劑形式可以為膠囊劑、扁囊劑、丸劑、片劑、錠劑(使用可口基質，通常為蔗糖和阿拉伯膠或黃芪膠)、粉劑、顆粒劑，或者為水或非水液體中的溶液或懸液齊U、或為水包油或油包水乳液劑、或為酏劑或糖漿劑、或為軟錠劑(使用惰性基質，如凝膠和甘油、或蔗糖和阿拉伯膠)和/或漱口液等，其中每種劑型中均含有預定量的一種或兩種受試抗體作為活性成分。在經口施用的固體劑型中(膠囊、片劑、丸劑、糖衣丸劑、粉劑、顆粒劑等)，可將一種或多種本發明的受試抗體與一種或多種可藥用載體混合，所述載體如檸檬酸鈉、或磷酸二鈣，和/或以下任一種(I)填充劑或增量劑，例如澱粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和/或矽酸；(2)粘合劑，例如羧甲基纖維素、藻酸鹽、凝膠、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和/或阿拉伯膠；(3)保溼劑，如甘油；(4)分解劑，如瓊脂、碳酸鈣、馬鈴薯或木薯澱粉、藻酸、某些矽酸鹽，以及碳酸鈉；(5)溶液延遲試劑，如石蠟；(6)吸收增速劑，如季銨化合物；(7)潤溼劑，例如十六醇和單硬脂酸甘油酯；(8)吸收劑，例如高嶺土和班脫粘土； (9)潤滑劑，如滑石、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂、固體聚乙二醇、十二烷硫酸鈉及其混合物；以及(10)著色劑。對於膠囊、片劑和丸劑而言，藥物組合物還可含有緩衝劑。也可以乳糖或奶糖，以及高分子量聚乙二醇等為賦形劑，使用相似類型的固體組合物作為軟及硬填充凝膠膠囊的填充劑。經口施用的液體劑型包括可藥用的乳化劑、微乳化劑、溶液、懸浮液、糖漿以及酏齊U。除了活性成分以外，液體劑型還可含有本領域常用的惰性稀釋劑，例如水或其他溶劑、增溶劑和乳化劑如乙醇、異丙醇、碳酸乙酯、醋酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1，3-丁二醇、油(特別是棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄欖油、蓖麻油、芝麻油)、甘油、四氫呋喃甲醇、聚乙二醇以及山梨糖的脂肪酸酯，及其混合物。除惰性稀釋劑外，口服組合物也可含有佐劑，如潤溼劑、乳化和懸浮劑、甜味劑、調味劑、著色劑、芳香劑以及防腐劑。懸浮液中除了活性化合物之外，可含有懸浮劑，如乙氧基異十八醇、聚氧乙烯山梨醇和山梨酯、微晶纖維素、偏氫氧化鋁、斑脫土、瓊脂和黃芪膠及其混合物。本發明方法可以局部施用於皮膚或黏膜(如子宮頸和陰道黏膜)。這使得直接向腫瘤輸送的機會最大，而誘發副作用的機會最小。局部製劑還可含有很多種已知有效的皮膚或角質層穿透增強劑中的一種或多種。此類增強劑的實例為2-吡咯烷酮、N-甲基-2-吡咯烷酮、二甲基乙醯胺、二甲基甲醯胺、丙二醇、甲醇或異丙醇、二甲基亞碸和月桂氮卓酮。還可含有使製劑可用於化妝品的其他試劑。此類試劑的實例為脂肪、蠟、油、染料、芳香劑、防腐劑、穩定劑以及表面活性試劑。也可含有本領域已知的角質離解劑。實例為水楊酸和硫磺。局部或經皮施用的劑型包括粉劑、噴 霧劑、膏劑、糊劑、霜劑、洗液、凝膠、溶液、貼劑以及吸入劑。可以在無菌條件下將受試抗體與可藥用載體以及任何可能需要的防腐劑、緩衝液或推進劑混合。膏劑、糊劑、霜劑及凝膠中除抗體外還可含有賦形劑，例如動物和植物脂肪、油、蠟質、石蠟、澱粉、黃芪膠、纖維素衍生物、聚乙二醇、矽樹脂、斑脫土、矽酸、滑石和氧化鋅，或其混合物。粉劑和噴霧劑中除了抗體外還可含有賦形劑，如乳糖、滑石、矽酸、氫氧化鋁、矽酸鈣以及聚醯胺粉劑，或這些物質的混合物。此外，噴霧劑中還常規含有推進劑，例如含氯氟烴和揮發性非取代烴，如丁烷和丙烷。適於胃腸外施用的藥物組合物可能含有一種或多種抗體組合一種或多種可藥用的無菌等張水性或非性水溶液、分散液、懸浮液或乳化液，或者在臨近使用前可以重建為無菌注射溶液或分散體系的無菌粉劑，其中可含有抗氧化劑、緩衝物、抑菌劑、使製劑與欲施用的受者血液等張力的溶質，或懸浮劑或增稠劑。可用於本發明藥物組合物的合適水性或非水性載體包括，水、乙醇、多羥基化合物(如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其適當混合物、植物油(如橄欖油)、可注射有機酯(如油酸乙酯)。通過如使用包被材料(如卵磷脂)、保持分散體系中的所需顆粒大小以及使用表面活性劑，可以保持適當的流動性。這些組合物中也可含有佐劑，例如防腐劑、潤溼劑、乳化劑和分散劑。可以通過加入多種抗細菌和抗真菌劑來阻止微生物的作用，例如對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚山梨酸酯(phenol sorbic acid)等。組合物中也可以含有等張劑,如糖、氯化鈉等。此外,通過加入可延遲吸收的試劑(如單硬脂酸鋁及凝膠)，能夠延長可注射藥物劑型的吸收。通過在可生物降解的聚合物(如聚交酯-聚乙醇酸交酯)中形成一種或多種抗體的微膠囊基質，來製備可注射的貯存劑型。根據藥物與聚合物之間的比例以及所用具體聚合物的性質，可以控制藥物的釋放速率。其他可生物降解的聚合物的實例包括，聚(正酯類)(poly(orthoesters))和聚(酐)。也可將藥物包於與機體組織相容的脂質體或微乳狀液中，從而製備貯存的可注射製劑。用於陰道內或直腸施用的製劑可以為栓劑，其可通過將一種或多種本發明的化合物與一種或多種合適的非刺激性賦形劑或載體混合製備，所述賦形劑或載體包括如可可月旨、聚乙二醇、栓劑蠟或水楊酸鹽，且所述賦形劑或載體在室溫下為固體，而在體溫下為液體，因此會溶解在直腸或陰道腔內而釋放出活性化合物。
實施例至此已經對本發明做了一般性描述，參照以下實施例可以更好地理解本發明，所述實施例在此處僅為說明本發明的某些方面及實施方案，而不在於限制本發明。實施例I.肝配蛋白B2和EohB4多克降抗體對腫瘤細胞牛長的影響從Santa CruzBiotech(Santa Cruz, CA)購得兩種 EphB4 多克隆抗體(H-200 和N-19)。H-200抗體(也稱為sc-5536)具有相應於人EphB4胞外結構域中胺基酸201-400的表位區域，而N-19抗體(也稱為sc-7285)具有人EphB4胞外結構域N-末端內的表位區域。此外，從R&D Systems (Minneapolis, MN)購得肝配蛋白B2多克隆。從ATCC (Manassas，VA)獲取三種間皮瘤細胞系(H28、H2052和H2373)，用於測試這些EphB4和肝配蛋白B2多克隆抗體的抗腫瘤活性。將這些細胞(約5，000細胞/孔)置於48孔平板中，並在第二天用不同濃度的各種抗體處理。在第4天進行細胞存活測定(MTT)。EphB4和肝配蛋白B2多克隆抗體對腫瘤細胞生長的影響見圖6。實施例2. EphB4單克隆抗體對血管發生和腫瘤生長的影響A. EphB4抗體的產生和功能性分析在小鼠體內產生針對EphB4胞外結構域(E⑶)的抗EphB4單克隆抗體。將EphB4E⑶(見如圖5)克隆入表達載體H^UnpGEX)中，以產生EphB4E⑶融合蛋白(如GST-E⑶)。通過親和層析法純化表達於大腸桿菌BL21內的EphB4E⑶融合蛋白。在GST融合蛋白的情況下，用凝血酶裂解GST結構域。利用A蛋白層析法從雜交瘤上清液中純化單克隆抗體。這些單克隆抗體包括EphB4 抗體號 1、23、35、47、57、79、85L、85H、91、98、121、131
和138 (圖5)。抗體作圖研究顯示了這些抗體各自的表位結構域(圖5)。分析每一 EphB4抗體的結合親和力並顯示於圖7。進行進一步的實驗以分析這些抗體的功能活性，包括它們與其結合配偶體(如肝配蛋白B2)的競爭能力、活化EphB4酪氨酸磷酸化的能力、抑制HUAEC中體外脈管形成的能力、通過基質膠栓測定其抑制體內血管發生的能力、激活SCC15腫瘤細胞凋亡或壞死的能力，以及抑制SCC15異種移植物生長的能力。結果總結於下表I。表I. EphB4抗體活性概述
權利要求
1.分離的抗體或其抗原結合部分，所述抗體或其抗原結合部分結合EphB4胞外部分的表位。
2.權利要求I的分離的抗體或其抗原結合部分，其中所述抗體或其抗原結合部分結合促進腫瘤細胞的凋亡並抑制EphB4與肝配蛋白B2的結合。
3.權利要求I的分離的抗體或其抗原結合部分，其中所述抗體或其抗原結合部分結合位於圖I的EphB4序列中胺基酸16-198的表位。
4.權利要求I的分離的抗體或其抗原結合部分，其中所述抗體或其抗原結合部分結合位於圖I的EphB4序列中胺基酸324-429或430-537的表位。
5.權利要求4的分離的抗體或其抗原結合部分，其中所述抗體或其抗原結合部分抑制EphB4 二聚體或多聚體的形成。
6.權利要求I的分離的抗體或其抗原結合部分，其中所述抗體或其抗原結合部分結合EphB4的第一纖連蛋白樣結構域(FNDl)。
7.權利要求I的分離的抗體或其抗原結合部分，其中所述抗體或其抗原結合部分結合EphB4的第二纖連蛋白樣結構域(FND2)。
8.權利要求I的分離抗體或其抗原結合部分，其中所述抗體或其抗原結合部分抑制肝配蛋白B2刺激的EphB4自磷酸化。
9.權利要求I的分離的抗體或其抗原結合部分，其中所述抗體或其抗原結合部分抑制培養的內皮細胞形成脈管。
10.權利要求I的分離的抗體或其抗原結合部分，其中所述抗體或其抗原結合部分抑制體內組織的血管形成。
11.權利要求10的分離的抗體或其抗原結合部分，其中所述抗體或其抗原結合部分抑制植入動物角膜的組織的血管形成。
12.權利要求10的分離的抗體或其抗原結合部分，其中所述抗體或其抗原結合部分抑制植入動物體內的基質膠組織栓的血管形成。
13.權利要求I的分離的抗體或其抗原結合部分，其中所述抗體或其抗原結合部分減少小鼠中人腫瘤異種移植物的生長。
14.權利要求I的分離的抗體，其中所述抗體是人源化抗體。
15.權利要求I的分離的抗體，其中抗體為單克隆抗體。
16.權利要求15的分離的抗體，其中單克隆抗體可臨床施用於人。
17.產生權利要求1-16中任意項的抗體的雜交瘤。
18.權利要求1-16中任意項的抗體或其抗原結合部分在製備用於抑制患者中血管發生的藥物中的用途。
19.權利要求18的用途，其中患者被診斷為黃斑變性。
20.含有權利要求I的分離的抗體或其抗原結合部分的藥物製品。
21.權利要求1-16中任意項的分離的抗體或其抗原結合部分在製備治療癌症的藥物製品中的用途。
22.權利要求21的用途，其中癌症選自結腸癌、乳腺腫瘤、間皮瘤、前列腺腫瘤、鱗狀細胞癌、卡波西肉瘤和白血病。
23.權利要求1-16中任意項的分離的抗體或其抗原結合部分，其中所述抗體或其抗原結合部分共價連接於額外的功能部分 。
全文摘要
本發明的某些實施方案提供了多肽組合物(如可與EphB4結合的抗體及其抗原結合部分)，以及抑制EphB4活性的方法。本發明的另一些實施方案則提供了治療腫瘤或治療血管發生相關疾病的方法和組合物。
文檔編號C07K16/30GK102746401SQ20111026196
公開日2012年10月24日 申請日期2005年3月11日 優先權日2004年3月12日
發明者N·科爾苔茲, P·吉爾, R·雷迪, S·佐祖爾亞, V·卡拉斯諾佩洛夫 申請人:瓦斯基因治療公司