克隆有丙醯化酶基因的螺旋黴素鏈黴菌的構建方法

2023-10-17 12:35:29 4

專利名稱：克隆有丙醯化酶基因的螺旋黴素鏈黴菌的構建方法
技術領域：
本發明涉及微生物領域。
丙醯螺旋黴素是一種新藥，目前尚未用於臨床，但是據藥理實驗初步結果看，體內外抗菌活性優於目前臨床使用的乙醯螺旋黴素，目前尚無產品。當前獲得丙醯螺旋黴素可以採用下列方法1.生物轉化法中國醫學科學院醫藥生物技術研究所劉若瑩教授在中國專利申請號為87104407中介紹一種生物轉化法，該法基本上將具有丙醯化酶活性的生米卡鏈黴菌變株在28℃條件下培養48小時後，於培養液中加入螺旋黴素，在菌株的丙醯化酶作用下，使螺旋黴素生物轉化成為丙醯螺旋黴素。
採用上述生物轉化發酵方法獲得丙醯螺旋黴素時，可以減少因化學合成所造成的三廢汙染;可以將具有丙醯化酶活性的生米卡鏈黴菌製備成固相化細胞，從而提高生物轉化率，有利於工業生產。但此法存在著缺點，它必須通過發酵獲得螺旋黴素，才能進行生物轉化，因此工藝複雜，成本較高。
2.半合成方法採用半合成方法使螺旋黴素4″-0丙醯化，從而獲得丙醯螺旋黴素，該法需先通過發酵獲得螺旋黴素後再用化學方法，在保護其它位點情況下進行半合成，因此，工藝仍很複雜，成本高，有三廢汙染，且目前尚無報導。
3.基因工程方法目前有人採用其它基因克隆路線(尚未發表)，將生米卡鏈黴菌的醯化酶基因克隆至螺旋黴素產生菌株中，但得到的產物成分較多，除螺旋黴素外，還有乙醯螺旋黴素和丙醯螺旋黴素以及其它醯化成份。由於多組份，為化學提取和使用均帶來很大困難，從而直接影響經濟效益，目前未有報導。
本發明目的在於採用基因工程方法，構建一種可直接產生丙醯螺旋酶素的基因工程菌，只需將其一次發酵即可獲得丙醯螺旋黴素產品，從而簡化生產步驟，可使丙醯螺旋黴素佔產物總組成的20%以上並減少生產過程中的三廢汙染。
本發明目的是這樣達到的將有丙醯化酶基因的重組質粒轉化至螺旋黴素生產菌株，選擇出所需轉化子，再經原位雜交即可獲得丙醯螺旋黴素基因工程菌，即克隆有丙醯化酶基因的螺旋黴素鏈黴菌。
以下結合附圖對本發明進行詳細說明。
附

圖1是克隆有丙醯化酶基因的螺旋黴素鏈黴菌的構建步驟方框圖;
附圖2是丙醯化酶基因克隆菌株(Streptomyces lividans TK 54 No.9菌株)孢子絲;
附圖3是No.9重組質粒轉化子的轉化產物薄層層析圖;
附圖4是No.9重組質粒轉化子的轉化產物生物顯跡圖;
附圖5是丙醯螺旋黴素高壓液相色譜;
附圖6是NO.9重組質粒轉化子的轉化產物高壓液相色譜;
附圖7為Southern分子雜交圖;
附圖8是NO.9重組質粒的限制性內切酶圖譜;
附圖9是原位雜交放射自顯影圖;
附圖10是Southern分子雜交圖;
附圖11圖No.61轉化子發酵產物薄層層析圖;
附圖12為NO.61轉化子發酵產物生物顯跡圖;
附圖13是丙醯螺旋黴素高壓液相色譜;
附圖14是NO.61轉化子發酵產物高壓液相色譜;
附圖15是丙醯螺旋黴素質譜分析圖;
附圖16是NO.61轉化子發酵產物質譜分析圖;
附圖17是丙醯螺旋黴素基因工程菌孢子絲照片;
附圖18為丙醯螺旋黴素基因工程菌孢子(1×12000);
附圖19為丙醯螺旋黴素結構示意圖。
附圖1是本發明克隆有丙醯化酶基因的螺旋黴素鏈黴菌(也稱丙醯螺旋黴素基因工程菌)構建步驟方框圖。
從附圖1可見，第一步驟是鳥槍克隆，其原理是以研究任何生物體的基因為對象，將酶切後的不同大小、簡單或複雜的基因經載體帶入特定受體菌中，並進行分離、篩選、純化和擴增。在鳥槍克隆法中，以質粒PIJ702為載體，它具有硫鏈絲菌素抗性基因和黑色素基因，因此，一旦插入外源基因後極易選擇，且拷貝數高，易於製備，若選用其它質粒作載體則難以選擇轉化子。在鳥槍克隆法中將限制性內切酶BglⅡ酶切過的生米卡鏈黴菌(Streptomyces mycarofaciens)總DNA經T4-DNA連接酶進行連接;第二步驟是轉化，重組後的質粒被引入受體菌中，引入的步驟稱之為轉化。本發明將上述連接過的DNA轉化至變鉛青鏈黴菌TK54(S·lividans TK 54)原生質體;第三步驟為挑選轉化子及提取重組質粒，先選擇抗硫鏈絲菌素的轉化子，即以硫鏈絲菌素為選擇標記，挑選耐藥轉化子，然後提取重組質粒，選出生米卡鏈黴菌No.9重組質粒;第四步驟為含丙醯化酶基因的生米卡鏈黴菌No.9重組質粒的轉化，該No.9重組質粒轉化至螺旋黴素產生菌株(Streptomyces spiramyceticus)，以硫鏈絲菌素為轉化子選擇標記;第五步驟為挑選克隆有NO.9重組質粒的轉化子，先選擇抗硫鏈絲菌素的菌落，然後進行原位雜交，採用「分子克隆」手冊標準方法進行，以P32-標記的NO.9重組質粒為探針，對上述轉化子進行原位雜交，從中選擇，得到陽性雜交菌落。
以下對各步驟進行詳細說明。
(一)鳥槍克隆1.含有丙醯化酶基因的生米卡鏈黴菌無活性變株(Streptomyces mycarofaciens)總DNA的分離基本上採用Sambrook方法(Sambrook，J.et alMolecular cloning.A laboratory Manual.Seccond Edition.Cold Spring.Horbour.P1.42，1989)，生米卡鏈黴菌生長於26～28℃，採用SGYS培養基培養48～50小時(澱粉2～4%;硫酸胺0.3%;蛋白腖0.3-0.5%;葡萄糖2%;酵母膏0.5%;磷酸氫二鉀0.05%;硫酸鎂0.02%;碳酸鈣0.5%自然PH)，於4℃～10℃離心(3000轉/分)去上清液得溼菌絲2克左右，加入3-5ml的Saline-EDTA緩衝液(0.15MNaCl，0.01MEDTA，PH8.0)其中含溶菌酶5mg/ml，於35-37℃水浴保溫30-60分鐘，立即置於-20℃冰箱，令其迅速凍結，加入15-20mlTris-SDS緩衝液(0.1M Tris，1%SDS，0.1M NaClPH9.0)置於60℃化凍，再置於-20℃凍結並再度於60℃化凍，加入20ml酚於室溫下振蕩抽提，於12000-14000轉/分4-10℃離心15-20分鐘，取上清液，加入2倍體積預冷過的無水乙醇，-20℃放置2小時以上，12000-15000轉/分4-10℃離心10-15分鐘，棄去乙醇，沉澱物溶於Saline-Citrate緩衝液中(0.15M NaCl，0.015M檸檬酸鈉)，加入250微升RNA酶(1微克/微升)，37℃保溫1小時，加入等體積酚振蕩去蛋白，12000-15000轉/分，10分鐘左右，取上清，加入2倍體積預冷過的無水乙醇，-20℃放置2小時以上，12000-15000轉/分離心10分鐘左右溶於2mlTE緩衝液(10mM Tris.HCl，1.0mM EDTA PH8.0)，加入0.5ml醋酸鹽-EDTA，(3.0M醋酸鈉，0.001M EDTA，PH7.0)，迅速振蕩，加入1.5-2.0ml異丙醇，緩慢振蕩，出現絮狀沉澱，逐滴加入乙醇，置於-20℃2小時以上，12000-15000轉/分離心10分鐘左右，棄灑精，沉澱溶於2ml Saline-檸檬酸緩衝液中，自加入醋酸鹽-EDTA步驟後重複2-3次，樣品置於-20℃備用，得到含丙醯化酶基因生米卡鏈黴菌無活性變株總DNA。
本發明所採用的分離方法的特徵在於，採用反覆快速冷凍和解凍法，如其中，當將離心後的溼菌絲加入含溶菌酶的Saline-EDTA緩衝液後，35～37℃水浴保溫後立即於-20℃凍結，加入Tris-SDS緩衝液後於60℃化凍，再度於-20℃凍結和60℃化凍。其目的在於簡化方法，可用便宜試劑並便於配製。
2.質粒PIJ702的提取含有質粒PIJ702的變鉛青鏈黴菌Tk54(Streptomyces lividans TK54)培養於YEME培養基中(酵母粉0.3%，蛋白腖0.5%，麥芽提取物0.3%，葡萄糖1-2%，蔗糖34%，MgCl0.1%，餘量為無鹽水，PH7.0-7.2)，26-28℃培養40-48小時，2000-2500轉/分離心10分鐘左右，去上清，用STE緩衝液洗滌(蔗糖10.3%，EDTA25mM，Tris.HCl25mM，PH8.0)離心(2000-2500轉/分)棄上清液，加入10-15mlSTE緩衝液(內含5mg/ml溶菌酶，37℃，30-60分鐘保溫，加入20ml鹼性SDS溶液(0.2N NaOH，1%SDS)於冰浴中放置5-10分鐘，加入15ml 3M醋酸鈉，於冰浴放置30-60分鐘，12000-15000轉/分離心15-30分鐘，取上清，加入2.5倍體積預冷無水乙醇，-20℃放置2小時以上，12000-15000轉/分離心15-30分，除上清加入10mlTE緩衝液，1/10體積3M醋酸鈉和2.5倍體積預冷無水乙醇，-20℃放置2小時以上，12000-15000轉/分離心，15-30分，真空乾燥，溶於1毫升TE緩衝液，-20℃保存備用，得到質粒PIJ702。本發明採用PIJ702為載體，因為它具有硫鏈絲菌素抗性基因和黑色素基因，因此一旦插入外源基因後極易選擇，且本質粒拷貝數高，易於製備，本提取方法快速而簡便。
3.酶切採用限制性內切酶BglⅡ分別酶切上述PIJ702質粒DNA和生米卡鏈黴菌總DNA，酶切緩衝液為10×Y10緩衝液(Tris 10mM，MgCl26mM，巰基乙醇7mM，NaCl10mM)，37℃保溫反應1小時以上。
4.連接將以上BglⅡ酶切過的生米卡鏈黴菌總DNA和BglⅡ酶切過的PIJ702質粒DNA(二者濃度比3～5∶1最好為5∶1)在T4-DNA連接酶作用下，於10-14℃放置3小時以上，連接緩衝液組成為Tris 60mM，MgCl26mM，巰基乙醇10mM，PH7.5，得到重組DNA分子。本方法特點在於由BglⅡ切過的生米卡鏈黴菌總DNA的濃度和由BglⅡ酶切過的PIJ702質粒DNA濃度比為3～5∶1，最好為5∶1，在14℃下過夜進行連接反應。
(二)轉化本發明採用PEG處理除去受體菌細胞壁，在原生質體形成的情況下，直接和DNA接觸，進行轉化，再在特定再生培養基中生長，使細胞壁重新形成，成為轉化子。
1.原生質體的製備將變鉛青鏈黴菌TK 54(Streptomyces lividans TK54)種於25mlYEME培養基中(並中加入適量玻璃珠)，26-28℃培養24-30小時，再以10-15%接種於新鮮YEME培養基中(加入0.5%甘氨酸，適量玻璃珠)26-28℃培養36-40小時，2000-3000轉/分離心，10-15分鐘，去上清，用10.3%蔗糖溶液洗滌並離心兩次，加入4-5mlP緩衝液(Tris 0.31%，MgCl2·6H2O2.04%，葡萄糖0.1%，CaCl2·2H2O，0.386%，蔗糖10%)其中含有溶菌酶1-2mg/ml，於26-28℃放置30分鐘以上，於相差顯微鏡下觀察原生質體形成率大於90%，於1500-2000轉/分離心5分鐘左右，去上清，用1-2mlP緩衝液洗滌一次，1500-2000轉/分離心5分鐘左右，將所得原生質體懸浮於100微升P緩衝液中。
本方法特點原生質體形成率高。
2.轉化操作本發明在轉化操作中採用Hopwood(Hopwood，D.A.et al.Genetic Manipulation in streptomyces.The John Innes Foundation，Norwich，p110.1985.)方法。取50微升變鉛青鏈黴菌TK54的原生質體與1微克以下，最好為0.5微克的上述已連接的DNA樣品混勻，加入25%PEG1000(P緩衝液中)1ml，緩慢振蕩3-5分鐘，立即加入5ml P緩衝液，於1500-2000轉/分離心5分鐘左右，用P緩衝液洗滌並離心一次，將原生質體懸浮於1mlP緩衝液中，取50-100微升塗布R2瓊脂平板(蔗糖10.3%，酵母粉0.4%，CaCl2·2H2O0.7%，酪蛋白水解物0.01%，Tris0.3%，K2SO40.025%，蛋白腖0.3-0.5%，MgCl2·6H2O1%，葡萄糖1%，KH2PO40.003%，瓊脂1.5，微量元素溶液0.2%，(ZnCl20.004%，Na2B4O7·10H2O0.001%，MnCl2·4H2O0.001% CuCl2·2H2O0.001%，FeCl3·6H2O0.02%)28-30℃培養18-20小時後，於每一瓊脂平板上加入一定體積軟瓊脂上層(與R2相同，但瓊脂為0.6%)內含硫鏈絲菌素終濃度為25μg/ml，28-30℃培養7-14天得到抗硫鏈絲菌素的轉化子。
本方法特點轉化率高。
(三)挑選轉化子1.選擇抗硫鏈絲菌素的轉化子於28-30℃培養7-14天後，陸續從R2瓊脂平板挑選含重組質粒的菌落，如前所述本發明是從PIJ702BglⅡ酶切位點插入生米卡鏈黴菌BglⅡ酶切片段的，因為BglⅡ位於PIJ702黑色素編碼區，因此凡是含有重組質粒的轉化子則呈白色，而只含有PIJ702質粒的轉化子呈黑色，根據上述顏色區別可以很快挑選出含重組質粒的轉化子。本方法特點由於所用載體PIJ702帶有特殊的編碼黑色素基因，因此易於從顏色變化選擇轉化子，方法簡便。
2.重組質粒的提取在重組粒提取中，本發明採用Katz的快速鹼變性方法(Katz.E et al1983，J.Gen.Microbiol.1292703)，其中，每次選取10-50株不等轉化子，種於2ml YEME培養基中(加入少量玻璃珠)，26-28℃培養24-30小時，10%-15%轉種於新鮮YEME培養基2ml(加入少量玻璃珠)中，26-28℃培養40-48小時，2000-2500轉/分，離心5-10分鐘，去上清，用STE緩衝液洗滌，離心，去上清液，加入0.2-0.5mlSTE緩衝液(內含5-3mg/ml溶菌酶)37℃，30-60分，加入0.3-0.5ml鹼性SDS溶液，冰浴5-10分，加入0.2-0.4ml 3M醋酸鈉冰浴30分-1小時，12000-15000轉/分離心15-30分鐘，取上清，加入2.5倍體積預冷過的無水乙醇，-20℃放置2小時以上，12000-15000轉/分離心15-30分，去上清液，加入200μl TE緩衝液，1/10體積3M醋酸鈉和2.5倍體積預冷無水乙醇，-20℃2小時以上，於12000-15000轉/分離心15-30分鐘，去上清，真空乾燥，溶於50μl TE緩衝液中，取適量進行瓊脂糖凝膠水平平板電泳(1%瓊脂糖)，電壓為3.5V/cm，緩衝液為Loening緩衝液(Tris.HCl0.036M，Na2HPO40.036M，EDTA0.001M，PH7.8)。
將瓊脂糖凝膠電泳後確定為重組質粒的樣品，再進行限制性內功酶BglⅡ的酶切，酶切後的DNA片段與在同一瓊脂糖凝膠電泳平板上泳動的入噬菌體DNA限制性內切酶HindⅢ酶切片段泳動距離進行比較(λ-HindⅢ為分子量標準)，可確定各片段分子量大小。本發明挑選了分子量為10.0Kb，插入片段為4.16Kb的No.9重組質粒。含No.9重組DNA的No.9轉化子的形態見附圖2。附圖2是變鉛青鏈黴菌TK 54 No.9菌株(丙醯化酶克隆菌株)孢子絲照片，所用斜面培養基(%)麥芽糖1、酵母粉0.4、葡萄糖0.4、瓊脂1.5、自然PH，溫度28～30℃，培養6-7天;其生長形態為有較多氣生菌絲、孢子較多、頂部有捲曲、氣生菌絲呈灰白色、產生紫紅色色素、菌落表面平滑、基內菌絲呈紫紅色。
為了確認含NO.9重組質粒的NO.9轉化子是否已經克隆有來自生米卡鏈黴菌的丙醯化酶基因，通過NO.9轉化子的生物轉化來觀察克隆菌株是否具有將螺旋黴素轉化為丙醯螺旋黴素的能力。
將NO.9轉化子培養於YEME培養基中，28-30℃培養40-48小時後，加入500mg-200g/升螺旋黴素，再於28-30℃培養40-48小時，上述培養液經2000-3000轉/分離心10-20分鐘，棄菌絲，上清液在PH8.0左右用乙酸丁酯進行抽提，然後轉至PH2.0-3.0的磷酸緩衝液中，重複一次，最後用二氯甲烷抽提，減壓乾燥，將上述樣品用矽膠柱層析進行進一步純化，以氯仿-甲醇(75∶25)洗脫，收集高活性部分，濃縮、乾燥，得出NO.9轉化子生物轉化產物。
下述步驟是對NO.9轉化子的生物轉化產物的確定步驟(1)薄層層析採用0.1N NaOH配製的矽膠GF254板進行層析，以乙酸乙酯∶甲醇＝9∶1展層，以碘顯跡(附圖3)。附圖4是含NO.9重組質粒轉化子轉化產物的薄層層析圖，圖中橫坐標1代表乙醯螺旋黴素樣品;2代表丙醯螺旋黴素樣品;3代表NO.9轉化子轉化產物樣品;4代表變鉛青鏈黴菌TK54生物轉化產物樣品;5代表螺旋黴素樣品。
由圖可見NO.9轉化子轉化產物(樣品3)和標準丙醯螺旋黴素(樣品2)Rf值相同。因此說明轉化產物是丙醯螺旋黴素。樣品1為乙醯螺旋黴素，其Rf值與NO.9轉化產物不同，樣品5為螺旋黴素，是在生物轉化過程中加入的樣品和變鉛青鏈黴菌生物轉化產物(4)同，說明該菌本身不具有轉化螺旋黴素為丙醯螺旋黴素的能力，NO.9轉化子之所以具有轉化螺旋黴素成為丙醯螺旋黴素能力，是由於含有NO.9重組質粒的緣故。
同時可以進行生物顯跡(附圖4)。生物檢定菌為八疊球菌(Sarcinalutea)。八疊球菌保存斜面培養基組分為麥芽糖1%、酵母粉0.4%、葡萄糖0.4%、瓊脂1.5%、自然PH。其檢定培養基為蛋白腖1-2%、酵母粉0.2-0.4%、牛肉膏0.1-0.3%、葡萄糖0.1-0.3%、瓊脂1.2-1.5%，PH8.0。附圖5是含NO.9重組質粒轉化子轉化產物生物顯跡圖。橫坐標上1代表變鉛青鏈黴菌TK54生物轉化產物樣品，2代表NO.9轉化子生物轉化產物樣品;3代表螺旋黴素樣品;4代表標準丙醯螺旋黴素樣品。從圖可見NO.9轉化子生物轉化產物樣品1和標準丙醯螺旋黴素樣品4有相同的Rf值，而且均有抗八疊球菌的生物活性;變鉛青鏈黴菌TK54生物轉化產物1與螺旋素樣品相同，說明該菌本身無轉化螺旋黴素為丙醯螺旋黴素的能力。
(2)高壓液相色譜分析採用國產C-18柱，流動相為乙腈0.2M醋酸胺∶水＝53∶10∶37，柱溫為30℃，在232nm紫外光下檢測(見附圖5和圖6)。
附圖5是丙醯螺旋黴素高壓液相色譜，附圖6是含NO.9重組質粒轉化子轉化產物高壓液相色譜，從此二圖可知，含NO.9重組質粒的NO.9轉化子生物轉化產物高壓液相色譜的保留時間與丙醯螺旋黴素基本相同，因此確證轉化子生物轉化產物為丙醯螺旋黴素。
鑑於上述結果已確證NO.9轉化子可以轉化螺旋黴素成為丙醯螺旋黴素，說明丙醯化酶基因位於NO.9重組質粒的4.16Kb DNA片段部分。
為了確證4.16Kb DNA片段確實來源於生米卡鏈黴菌變株DNA，進行了Southern分子雜交。Southern分子雜交方法見Sambrook.J的文章(Sambrook.J，1989，Molecular cloning.A.laboratory.Manual.Second Edition.Cold Spring Harbour，P.1.42.)本方法原理DNA分子為雙螺旋結構，彼此以G-C，A-T互補方式形成雙鏈結構，基於具有同源性的DNA單鏈可以重新配對互補的原理，因此建立了本方法。其中，用NO.9重組質粒作為探針和BglⅡ酶切過的生米卡鏈黴菌總DNA進行雜交。
採用同前述方法提取了生米卡鏈黴菌變株總DNA和NO.9重組質粒DNA，依前述同條件用限制性內切酶BglⅡ分別酶切生米卡鏈黴菌總DNA和NO.9重組質粒，並按同前方法進行瓊脂糖凝膠水平平板電泳。電泳畢，以溴化乙錠染色(0.5μg/ml)在紫外燈下攝影隨後操作按下列步驟進行a.DNA的變性和固定將上述電泳畢凝膠浸於200-300ml0.25N HCl中緩慢振蕩10-20分，棄去鹽酸，重複用0.25N HCl再振蕩10-20分，以無鹽水洗滌除去鹽酸，再用0.5M NaOH/1M NaCl 200-300ml洗滌兩次，每次10-20分，棄去上述溶液後，用無鹽水衝洗，再加入200-300ml 0.5M Tris.HCl/1M NaCl洗滌，棄去用無鹽水衝洗再換成0.5M Tris，HCl/3M NaCl200-300ml振蕩洗滌，在凝膠上放置與其大小相同的硝酸纖維素濾膜(預先用20×SSC浸泡過，20×SSC組分為3M NaCl、0.3M檸檬酸鈉)進行DNA膜轉移，過夜放置，次日取下濾膜，於紫外燈下檢查DNA轉移是否完全，室溫下晾乾膜後置於真空乾燥烤箱內，80℃烤2-3小時。
b.探針的製備採用NO.9重組質粒作為探針，用同位素P32進行缺刻翻譯標記，反應在14℃反應3.5小時，反應畢加下終止液(10mM Na EDTA，1%SDS)，用葡聚糖凝膠(Sephadex.G-50)柱將標記的NO.9質粒和殘存未標記的同位素分開，經液體閃爍計數器記錄CPm值後，探針(P32標記的NO.9質粒)在沸水中煮10-5分即刻置於冰浴中。
c.雜交將已烤乾的硝酸纖維素濾膜浸泡於5×SSC溶液中至溼，再用6×SSC浸泡2-5分鐘，將膜置於雜交袋中，進行預雜交，預雜交液中含有6×SSC，0.5%SDS，5×Denhardts溶液(0.01%Ficoll，0.01%牛血清清蛋白，0.01%PVP)，100μg/ml鮭魚精DNA(在沸水中煮過5-10分鐘，置於冰浴中)，封袋後於68℃水浴放置4小時以上，然後將袋剪開一口，取出預雜交液，加入雜交液，其中含有6×SSC0.01M EDTA 5×Denhardts 0.5%SDS100μg/ml已變性處理過的鮭魚精DNA，另外加入已用P32標記的探針，NO.9質粒DNA，封袋後，於68℃雜交20小時以上，雜交畢，將膜從袋中取出於65℃3×SSC中洗滌10-30分，再於2×SSC中洗滌20-30分，最後於1×SSC中洗滌30分，室溫下晾乾膜，用塑料薄膜將膜包好後置於X光片暗盒中，上置X光片，進行放射自顯影，於-80℃放置適當時間，取出衝洗後即可獲雜交結果(附圖7)。
在附圖7中，左圖是Southern分子雜交前瓊脂糖凝膠電泳，右圖是Southern分子雜交後放射自顯影圖，在圖中1代表BglⅡ酶切的NO.9重組質粒;2代表BglⅡ酶切生米卡鏈黴菌變株DNA;3代表NO.9重組質粒。從右圖看，樣品1(BglⅡ酶切NO.9重組質粒)和BglⅡ酶切的生米卡鏈黴菌變株DNA的樣品2在同一位置有相同雜交帶，說明NO.9重組質粒中4.16Kb片段(圖中小片段)與生米卡鏈黴菌總DNA有同源性，它確係來源於生米卡鏈黴菌總DNA，而不是汙染的結果。儘管從左圖看樣品2呈連續降解的核苷酸狀態，無明顯帶狀，但是在雜交後從右圖可見樣品1和BglⅡ酶切的生米卡鏈黴菌變株DNA(樣品2)在同一位置，有相同雜交帶出現。
限制性內切酶圖譜是表明不同限制性內切酶在某種質粒DNA上相互位置的圖譜，是質粒DNA重要特徵。按前述方法對NO.9重組質粒DNA進行酶切和雙酶切。(BamHⅠ，KpnⅠ，PVuⅡ，KPnⅠ-PVuⅡ，PVuⅡ-BamHⅠ，KPnⅠ-BamHⅠ)從而繪製出NO.9重組質粒的特徵限制性內切酶圖譜(見附圖8)。
附圖8表明，生米卡鏈黴菌來源4.16Kb DNA片段(圖中粗黑實線部分)是由BglⅡ酶切位點插入質粒PIJ702的(黑細線部分)。在4.16kb DNA片段部分有一個KPnⅠ兩個BamHⅠ和一個SalⅠ酶切位點。本圖表明了這三種酶在該片段中的相關位置。該質粒分子量為10.0kb。
(四)含丙醯化酶基因的NO.9重組質粒的轉化目的通過NO.9重組質粒轉化進入螺旋黴素生產菌株Streptomyces spiramyceticus.使丙醯化酶基因在其中克隆表達，以形成能直接產生丙醯螺旋黴素的基因工程菌。
1.S.spiramyceticus原生質體的製備將該菌種於一種可溶性培養基中(牛肉膏0.3-0.4%，蛋白腖0.5-0.8%，酵母粉0.3-0.5%，PH7.1)培養並中加入適量玻璃珠，28-30℃一級培養40-48小時後，以10-15%接種於新鮮同種培養基中，(加入適量玻璃珠，0.5%甘氨酸)28-30℃二級培養24-30小時，基本按前述方法製備原生質體，但溶菌酶加量為5-15mg/ml，成球達90%以上需1.5-3小時。在現有技術中，一級時間培養時間短，而二級培養時間長，在本發明中，將一級培養時間改為40～48小時，而二級培養時間改變24～30小時。這是由於在這個時間中，菌絲生長狀況最佳。因此形成原生質體效率高，可達90%以上。如按現有技術，將兩個時間間隔調換過來，則菌絲生長的生理狀況衰老，所形成的原生質體效率極低(大約為20～30%)，無法進行轉化。此外，本發明所加溶菌酶量顯著高於製備其它鏈黴菌所用量，本發明加入溶菌酶為5～15毫克/毫升，最佳條件為10毫克/毫升，如低於5毫克/毫升，則原生質體幾乎不形成;形成原生質體的時間為1.5～3小時，若少於1.5小時，則原生質體形成率僅20%，若高於3小時，則原生質體有破裂，也無法進行轉化。
2.轉化操作與前述Hopwood轉化方法基本相同。
(五)挑選克隆有NO.9重組質粒的轉化子1.選擇抗硫鏈絲菌素的菌落凡是在R2再生瓊脂平板(含硫鏈絲菌素終濃度為25μg/ml)均全部挑選。
2.原位雜交原理與Southern分子雜交大體相同，探針可以與轉化子菌落直接雜交以確定其DNA同源性。本方法適用於快速、準確、大量篩選陽性克隆菌株，尤其當克隆片段不能表現一種能方便檢測的表型時，這種方法則更為適宜。
隨機挑選上述轉化子菌落，點種於已鋪在SASM瓊脂平板上的硝酸纖維素薄膜(已消過毒)上(SASM成份澱粉2-5%，黃豆餅粉1-3%，NaCl 0.3-0.5%，CaCO30.4-0.6%，瓊脂1.5% PH7.5)。28℃-30℃，培養40-48小時，取出膜，置於3張3MM厚濾紙上(紙已用10-15mg/ml溶菌酶P緩衝液浸泡過)，靜置30-60分鐘，以形成原生質體，再將濾紙(菌落朝上)移至用1%SDS，1M NaOH浸泡過的3張3MM厚濾紙上，放置20-30分鐘，再放置於幹厚濾紙上，以除去多餘液體，然後置於用中和溶液(70%PH7.5 1MTris-HCl和30%5M NaCl)浸泡過的三張厚濾紙，5-10分鐘，重複三次，再置於用90%乙醇處理過的厚濾紙上5-10分，室溫下晾乾，將膜置於80℃真空乾燥烤箱烘烤1.5-3小時。隨後的操作步驟和試劑全部同前述Southern分子雜交。以P32標記的No9重組質粒為探針，原位雜交結果見圖9，從中挑選了陽性雜交結果包括NO.61在內的克隆菌株進行工作。
採用了原位雜交方法來篩選轉化子，也是本構建方法的特徵，本發明用原位雜交方法從200株轉化子中挑選出陽性轉化子130餘株，僅用了4天時間，效率高，工作準確性強。而若用常規快速質粒抽提法，則需10天以上，且誤差較大。
附圖9是原位雜交放射自顯影圖。圖中1為NO.9質粒DNA作為雜交陽性對照。
2為S.spiramyceticus受體菌，圖中未出現黑色雜交點，說明該菌與NO.9重組質粒無DNA同源性，是負對照。
3是NO.61轉化子，具有與陽性對照相同強度的陽性雜交點，因此說明它和NO.9重組質粒有DNA同源性，是陽性雜交菌落。
為了進一步選擇NO.61克隆菌株，還可進行Southern分子雜交。以NO.9重組質粒為探針，與BglⅡ酶切過的螺旋黴素鏈黴菌受體菌總DNA和NO.61轉化子總DNA雜交。
按前述方法製備了NO.61轉化子菌株和受體菌S.spiramyceticus總DNA。將NO.9重組質粒和分別用BglⅡ酶切過的上述兩種總DNA進行瓊脂糖凝膠電泳，條件與前相同，以NO.9重組質粒作為探針，其它操作裝步驟同於前述部分。結果見附圖10。
附圖10是Southern分子雜交圖，其中，a為雜交前瓊脂糖凝膠電泳;b是雜交後放射自顯影。附圖中1代表BglⅡ酶切NO.61轉化子DNA;2代表BglⅡ酶切S.spiriamyceticus DNA;3代表NO.9重組質粒。
由b.可見NO.9重組質粒(3)與S.spiramyceticus受體菌(2)未出現雜交帶，而與NO.61克隆菌株(1)有明顯雜交帶，說明NO.9重組質粒與克隆受體菌S.spiramyceticus沒有DNA同源性，而與NO.61克隆菌株有DNA同源性。表明NO.9重組質粒確已轉化至S.spiramyceticus受體菌中而獲得NO.61克隆菌株。
本步驟確證了NO.9重組質粒和NO.61克隆菌株總DNA有同源雜交帶，而與受體菌S.spiramycetions DNA無同源性，說明NO.9重組質粒確已克隆至NO.61菌株。
七.S.streptomyceticus NO.61克隆菌株的發酵目的為了確證NO.61克隆菌株的發酵產物。
將NO.61克隆菌株種於下列培養基澱粉3-5%，黃豆並粉2-4%，NaCl0.3-0.5%，蛋白腖0.5-2%，CaCO30.5%，於28-30℃振蕩培養40-48小時，以10-15%接種於發酵培養基澱粉4-7%，玉米漿0.5-2.5%，葡萄糖1.5-3.0%，NH4NO30.4-0.7%，Mg2SO40.5-2.5%，KH2PO40.03-0.06%，NaCl0.5-1.5%，CaCO30.3-0.6%，餘為自來水，PH6.5-7.0。28℃-30℃振蕩培養，96-120小時，於3000轉/分離心發酵液，取上清棄去菌絲，提取步驟同前。得到丙醯螺旋黴素。
丙醯螺旋黴素的確證為了證實包括NO.61在內的克隆菌株發酵產物為丙醯螺旋黴素，因此選擇No61克隆菌株進行若干檢測1.薄層層析方法同前，碘顯跡和生物顯跡均表明發酵產物中具有與丙醯螺旋黴素Rf值相同的組分(圖11、圖12)。
附圖11是NO.61轉化子發酵產物薄層層析圖。其中1代表丙醯螺旋黴素;2代表NO.61轉化子發酵產物;3代表螺旋黴素。附圖11表明NO.61轉化子產物(2)具有Rf值與丙醯螺旋黴素(1)相同的成份。從而證明NO.61克隆菌株的發酵產物中有丙醯螺旋黴素。此外NO.61轉化子也產生與螺旋黴素(3)Rf值相同產物，說明它也產生螺旋黴素。
附圖12是NO.61轉化子發酵產物生物顯跡圖，其中1代表丙醯螺旋黴素;2代表NO.61轉化子發酵產物。附圖12表明，NO.61轉化子發酵產物(2)具有與丙醯螺旋黴素(1)相同的Rf值，且均有抗八疊球菌的生物活性，因此證明NO.61轉化子發酵產物中有丙醯螺旋黴素。
2.高壓液相色譜分析採用μ Bondapack TM C18柱，流動相為甲醇水(用磷酸調至PH2.8-2.9)＝67∶33，室溫操作，於232nm進行紫外檢測(圖13、14)。
附圖13是丙醯螺旋黴素高壓液相色譜圖。附圖14是NO.61轉化子發酵產物高壓液相色譜圖。可見NO.61克隆菌株產物中具有與標準丙醯螺旋素保留時間相似的組分(見箭頭所示)，說明NO.61克隆菌株能產生丙醯螺旋黴素。
3.質譜分析採用FAB法，結果見附圖15和圖16。附圖15是丙醯螺旋黴素質譜分析圖;附圖16是NO.61轉化子發酵產物質譜分析圖。
從結果可見標準丙醯螺旋黴素Ⅱ在942處有一分子離子峰，NO.61克隆菌株在943處有一分子離子峰，數值相同，說明該克隆菌株產物中有丙醯螺旋黴素Ⅱ組分。
綜上所述，我們通過前述七步主要技術關鍵步驟獲得了可以直接產生丙醯螺旋素的基因工程菌株。該菌株形態見附圖17和18。附圖17為克隆有丙醯化基因的螺旋黴素鏈黴菌NO.61菌株(丙醯螺旋黴素基因工程菌)孢子絲照片。所用SASM培養基為澱粉4.0%、黃豆餅粉2.0%、NaCl0.4%、CaCO30.5%、瓊脂1.5%，PH7.5，15磅、20分滅菌，於28℃培養8-10天。
生長形態氣生菌絲孢子較少，氣生菌絲為灰白色，菌落表面呈皺褶，不產生色素，基內菌絲為椰殼色。
附圖18是克隆有丙醯化酶基因的螺旋黴素鏈黴菌NO.61菌株(丙醯螺旋黴素基因工程菌)孢子(1×12000)照片，該照片說明該孢子具有棘狀突起。附圖19是丙醯螺旋黴素結構示意圖。
本發明構建方法提供可用於工業生產的丙醯螺旋黴素基因工程菌，效價500μg/ml以上，丙醯螺旋黴素在總產物中含量為20%以上，菌種遺傳性狀穩定，在一般條件下除螺旋黴素外，只產生丙醯螺旋黴素。
權利要求
1.克隆有丙醯化酶基因的螺旋黴素鏈黴菌的構建方法，其特徵在於a、鳥槍克隆以質粒PIJ702為載體將經限制性內切酶Bg1Ⅱ分別酶切過的米生卡鏈黴菌(Streptomyces mykarofaciens)總DNA和PIJ702質粒DNA，以3～5∶1濃度比，在T4-DNA連接酶作用下，於10～14℃放置3小時以上進行連接反應，得到重組DNA分子。b、轉化採用a步驟中連接後的重組DNA，以變鉛青鏈黴菌TK54的原生質體為受體，按Hopwood等人的方法將連接後的DNA轉化進入所說的受體菌中；c、挑選轉化子及提取重組質粒以含硫鏈絲菌素終濃度為25微克/毫升的R2瓊脂平板挑選含重組質粒的轉化子，在所說的含硫鏈絲菌素R2平板上所選的白色菌落即為含重組質粒的轉化子，然後採用快速鹼變性方法提取含重組質粒轉化子，將瓊脂糖凝膠電泳後確定為重組質粒的樣品再進行限制性內切酶Bg1Ⅱ的酶切，酶切後的DNA片段與在同一瓊脂糖凝膠電泳平板上泳動的入噬菌體DNA限制性內切酶HindⅢ酶切片段泳動距離進行比較，從而確定各片段分子量大小，挑選出其中質粒分子量為10.0kb，插入片段為4.16kb的NO.9重組質粒；從而得到NO.9重組質粒DNA；d、NO.9重組質粒的轉化以螺旋黴素鏈黴菌為受體菌，按照Hopwood等人的方法，將該NO.9重組質粒轉化進入受體菌內，使丙醯化酶基因在其中克隆和表達；e、挑選克隆有NO.9重組質粒的轉化子。在含硫鏈絲菌素終濃度為25微克/毫升的R2再生瓊脂平板上進行挑選轉化子，採用Hopwood等人的方法進行原位雜交，以NO.9重組質粒為探針，與固定於硝酸纖維素薄膜上經過變性處理的轉化子DNA進行原位雜交，從中挑選出陽性雜交結果的克隆菌株，因此，獲得克隆有丙醯化酶基因的螺旋黴素鏈黴菌。
2.按照權利要求1所說的構建方法，其特徵在於對在e步驟中挑選出陽性雜交結果的克隆菌株後再進行Southern分子雜交，其中，以NO.9重組質粒為探針，將BglⅡ酶切過的螺旋黴素鏈黴菌受體菌總DNA和NO.61克隆轉化子總DNA雜交，獲得NO.61克隆菌株。
3.按照權利要求1所說的構建方法，其特徵在於在a步驟的鳥槍克隆方法中，BglⅡ酶切過的生米卡鏈黴菌DNA與BglⅡ酶切過的PIJ702連接時，其濃度比為5∶1。
4.按照權利要求1所說的構建方法，其特徵在於在a步驟的鳥槍克隆操作中，在生米卡鏈黴菌無活性變株總DNA的分離方法中採用反覆快速冷凍和解凍法，其中，當將離心後的溼菌絲加入含溶黴菌的Saline-EDTA緩衝液後，35～37℃保溫後立即於-20℃凍結，加入Tris-SDS緩衝液後於60℃化凍，再置於-20℃凍結並再度於60℃化凍，隨後進行振蕩抽提。
5.按照權利要求1所說的構建方法，其特徵在於在b步驟轉化操作中，50微升變鉛青鏈黴菌TK54原生質體與已連接的DNA混合進行轉化時，該已連接的DNA濃度在1微克以下。
6.按照權利要求4所說的構建方法，其特徵在於在b步驟轉化操作中，50微升變鉛青鏈黴菌TK54原生質體與已連接的DNA混合進行轉化時，該已連接的DNA濃度為0.5微克。
7.按照權利要求1所說的構建方法，其特徵在於在d步驟NO.9重組質粒轉化過程中，在加入適量玻璃珠的可溶性培養基中，在28～30℃下，一級培養40～48小時，再以10～15%接種於新鮮相同的可溶性培養基中在28～30℃下二級培養24～30小時，用以製備螺旋黴素鏈黴菌原生質體。
8.按照權利要求1所說的構建方法，其特徵在於在d步驟NO.9重組質粒轉化過程中，所用溶菌酶量為5～15毫克/毫升，在26～28℃下放置1.5～3小時，形成螺旋黴素鏈黴菌原生質體成球率達90%。
9.克隆有丙醯化酶基因的包括NO.61在內的螺旋黴素鏈黴菌用於製造丙醯螺旋黴素。
全文摘要
本發明涉及微生物領域，特別是克隆有丙醯化酶基因的螺旋黴素鏈黴菌的構建方法。本發明採用基因工程方法，其中包括採用質粒PIJ702為載體對生米卡鏈黴菌總DNA進行鳥槍克隆，轉化至變鉛青鏈黴菌TK54，挑選轉化子和提取重組質粒，得到№9轉化子，將自№9轉化子提取得到的№9重組質粒轉化至螺旋黴素鏈黴菌，挑選克隆有№9重組質粒的轉化子，得到克隆有丙醯化酶基因的包括№61在內的螺旋黴素鏈黴菌，將該螺旋黴素鏈黴菌進行發酵即可工業生產丙醯螺旋黴素，丙醯螺旋黴素在總產物中含量在20％以上，菌種遺傳性穩定。
文檔編號C12N1/21GK1052507SQ9110002
公開日1991年6月26日 申請日期1991年1月9日 優先權日1991年1月9日
發明者李元, 李煥婁, 石蓮英, 劉伯英, 李曉平 申請人:中國醫學科學院醫藥生物技術研究所