一種重組豬白細胞介素2-Fc融合蛋白及其編碼基因和表達方法
2023-10-17 15:34:44 2
專利名稱：一種重組豬白細胞介素2-Fc融合蛋白及其編碼基因和表達方法
技術領域：
本發明屬於生物工程基因領域，涉及一種重組豬白細胞介素2-FC融合蛋白及其編碼基因，以及其表達、純化和包涵體復性方法。
背景技術：
白細胞介素2(Interleukin-2，簡稱IL-2)是由活化的T淋巴細胞產生的一種重要的細胞因子，能激活T細胞和促進B細胞分化和分泌抗體，誘導產生幹擾素，增強單核細胞以及自然殺傷細胞(natural killer cell，簡稱NK)的殺傷活性，在機體的免疫反應中具有重要的調節作用，是一類天然的免疫增強劑。在醫學治療領域，商品化的重組人白細胞介素2已經用於腫瘤、愛滋病、B型肝炎等疾病的輔助治療。在獸藥中，由於白細胞介素2能提高疫苗的免疫應答、減少疾病的發生，也展現出廣闊的應用前景。目前，對雞、牛白細胞介素2基因的研究較多，兩者均已在原核和真核表達系統中表達。研究顯示，雞的重組白細胞介素2與多種病原疫苗聯合使用，可顯著提高免疫水平，減少應激，降低疫苗的副作用，從而達到更強的治療作用。我國是世界上養豬大國，豬的疾病種類繁多，特別是病毒性傳染病造成的發病率和死亡率最高，每年給養豬業造成巨大的經濟損失，因此對這些病毒性疾病的治療和預防成為養豬業的首要任務。白細胞介素2增強免疫、抵禦病毒的性質使得其在豬的病毒性疾病方面顯示出廣闊的應用前景，但是針對豬白細胞介素2的研究卻並不多見。另一方面,作為小分子量蛋白，豬白細胞介素2也與其他白細胞介素2 —樣,存在血漿清除速度較快的缺陷，從 而導致在臨床治療中需要重複多次用藥才能達到治療效果。同樣，半衰期短及用藥的頻繁也將成為使用豬白細胞介素2治療豬病毒性疾病的瓶頸。IgG免疫球蛋白是人和動物體內的主要抗體，它在體內的半衰期約為20天。其穩定性是由於IgG的Fe片段可與新生Fe受體(FcRn)結合，避免IgG進入溶酶體中被降解。由此可見，可以考慮在豬白細胞介素2上增加IgG的Fe片段來構成融合蛋白，以提高豬白細胞介素2體內半衰期，達到長效的目的。由此，本發明提供一種既能保留豬白細胞介素2原有活性，又可以延長體內半衰期的豬白細胞介素2與Fe片段的融合蛋白。然而，通過大腸桿菌表達的重組蛋白多為不溶解、無活性的細胞內聚集物，即包涵體。包涵體的復性是一個非常複雜的過程，如果復性條件不適宜將會出現分子內二硫鍵的錯配，分子間共價結合或疏水結合形成聚合體，一方面降低重組蛋白的比活率，造成產品質量不合格，同時又產生沉澱析出，影響得率。因此，本發明所要解決的另一個技術問題是採用合適的方法將大腸桿菌表達的蛋白包涵體進行復性。
發明內容
本發明的目的是克服現有技術的不足之處，通過密碼子優化的方式，提供一種可在大腸桿菌內高效表達的重組豬白細胞介素2-Fc融合蛋白以及其基因和表達、純化、復性方法。本發明提供了重組豬白細胞介素2-Fc融合蛋白，所述融合蛋白包括豬白細胞介素2部分和Fe片段部分，其中，豬白細胞介素2部分為豬白細胞介素2胞外區的全部序列，Fe片段部分包括鉸鏈區、CH2區和CH3區，豬白細胞介素2與Fe片段部分之間為直接融合。其中的Fe片段選自人或動物的免疫球蛋白Fe，是Fe全長或是部分序列，Fe選自IgG、IgM、IgD、IgA,每種免疫球蛋白類型包括各亞型,如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4。本發明的融合蛋白中的Fe片段部分特別優選來自豬的IgGl。優選地，本發明的重組豬白細胞介素2-Fc融合蛋白具有SEQ ID NO:2所示的胺基酸序列，其中第1-134位胺基酸殘基為豬白細胞介素2的胞外區序列，第135-334位胺基酸殘基為豬IgGl序列。本發明提供了編碼上述所述重組豬白細胞介素2-Fc融合蛋白的基因，其鹼基序列如SEQID NO:1所示。該序列是專為大腸桿菌表達系統進行密碼子優化得到的序列，相比之下能顯著提高異源基因在宿主菌中的表達。
本發明還提供了包含了上述所述編碼重組豬白細胞介素2-Fc融合蛋白的基因的質粒，所述的質粒優選為原核表達質粒，最優選為pET21b載體。本發明還提供了包含有上述所述質粒的大腸桿菌菌株，優選地，所述菌株選自大腸桿菌BL21 (DE3)菌株。本發明還提供了重組豬白細胞介素2-FC融合蛋白在大腸桿菌表達方法，包括如下步驟:該方法的步驟為:1.挑取I個或多個含有上述所述重組豬白細胞介素2-Fc融合蛋白的大腸桿菌菌落，接入LB培養液，於37 °C培養過夜；2.取適量過夜培養物，接入於所述過夜培養物的100倍量的LB培養液中，於37°C震蕩培養至對數中期0D_=1.0 ；3.在培養物中加入IPTG至lmmol/L，於37°C，誘導表達4h後，於4°C以轉速5000rpm,離心處理15min,收集含有重組豬白細胞介素2_Fc融合蛋白的大腸桿菌菌體。所述LB培養液中均含有氨苄青黴素50-100 μ g/ml。本發明的上述所述表達方法是經過發明人反覆多次實驗摸索和驗證得到的用於表達重組豬白細胞介素2-Fc融合蛋白的最為有效的方法，該方法的表達量高，且表達得到包涵體復性後活性更高。本發明還提供了重組豬白細胞介素2-Fc融合蛋白的包涵體純化方法，包括如下步驟:1.將收集得到的上述含有誘導重組豬白細胞介素2-Fc融合蛋白大腸桿菌沉澱，用預冷的PBS重懸，並於4°C高速離心處理；重複一次。2.吸去上清，稱菌體沉澱重量，每克(溼重)加入裂解緩衝液Buffer A3_10mL，用磨光玻璃棒攪動，使菌體懸起。3.每克(溼重)菌體加入3-10yL濃度為100mmol/L的PMSF，3-100yL濃度為100mg/mL的溶菌酶，於冰上攪動。4.破碎菌體，樣品置於冰上，超聲，並於4°C高速離心處理。
5.沉澱用洗滌緩衝液Buffer B洗滌，並於4°C高速離心處理，沉澱包涵體，重複一次。6.包涵體沉澱用變性緩衝液Buffer C溶解，室溫下攪拌30_60min。7.充分混勻後室溫高速離心處理，棄沉澱，取上清，即得到重組豬白細胞介素2-Fc融合蛋白變性溶液。該純化方法優選步驟如下:1.將收集得到的上述含有誘導重組豬白細胞介素2-Fc融合蛋白大腸桿菌沉澱，用預冷的PBS重懸，於4°C，以12000rpm的轉速離心15min ;重複一次。2.吸去上清，稱菌體沉澱重量，每克(溼重)加入裂解緩衝液Buffer A5mL，用磨光玻璃棒攪動，使菌體懸起。3.每克(溼重) 菌體加入5μ L濃度為100mmol/L的PMSF，5y L濃度為100mg/mL的溶菌酶，冰上攪動20min。4.用探針型超聲波儀破碎菌體，樣品置於冰上，超聲120次，每次5s間隔5s，循環三次，每次循環至冷卻樣品之間等待2min,等待樣品冷卻。於4°C,以12000rpm的轉速離心15min,棄上清。5.沉澱用洗漆緩衝液Buffer B洗漆,於4 ,以12000rpm的轉速離心15min,沉澱
包涵體，重複一次。6.包涵體沉澱用變性緩衝液Buffer C溶解，室溫下攪拌30min。7.充分混勻後室溫下以12000rpm的轉速離心15min，棄沉澱，取上清，即得到重組豬白細胞介素2-Fc融合蛋白變性溶液。本發明還提供了優化後的重組豬白細胞介素2-Fc融合蛋白的包涵體復性方法，包括如下步驟:取適量用變性緩衝液Buffer C溶解的重組豬白細胞介素2_Fc融合蛋白變性溶液，用復性緩衝液Buffer D將蛋白濃度稀釋到0.2mg/mL，4°C復性至24h時，將復性後重組蛋白溶液用0.45 μ m濾膜過濾，即得到低濃度的重組豬白細胞介素2-Fc融合蛋白溶液。用截留分子量IOKDa的超濾管脫鹽、濃縮，低溫真空乾燥，即獲得重組豬白細胞介素2-Fc融合
蛋白粉末。各緩衝液的成分及其含量如下表所示:
緩衝液成分及其含量
Tris-HCl (含量為20mmol/L) , NaCl (介量為0.15mol/L)，EDTA (itBufferA量為lmmol/L),以及PMSF (介量為0.1mmol/L)。溶液基質為蒸
__餾水』 pH為7.5。_
Tris-HCl (介量為20mmol/L): NaCl ( fT量為0.01mol/L) , EDTA ( it BufferB量為lmmol/L) ,TritonX-100 (含S為0.5% (v/v)),以及尿素(含
__量為0.5mol/L),溶液基質為蒸餾水，pH為7.5。_
Tris-HCl (介量為20mmol/L) , NaCl (含量為0.01mol/L) , EDTA (介Buffer C量為lmmol/L), PMSFC 含量為0.1mmol/L),尿素 C含量為8mo丨/L)，
__以及DTT (含為20mmol/L) ο溶液基質為蒸餾水，pH為7.8。
Tris-HCl (含量為20mmol/L) , EDTA (/含量為lmmol/L), GSH: GSSG (mol/mol:10:l)。溶液k質為蒸餾水，pH為7.5。_本發明還提供了重組豬白細胞介素2-Fc融合蛋白在製備治療和預防豬繁殖與呼吸症候群、豬流感以及豬藍耳病疾病的藥物中的用途。在動物醫療中，由於白細胞介素2能提高疫苗的免疫應答和減少疾病的發生率，重組豬白細胞介素2-Fc融合蛋白與多種病原疫苗聯合使用，可顯著提高免疫水平，減少應激，降低疫苗的副作用，從而達到較強的治療作用。重組豬白細胞介素2-Fc融合蛋白也可作為新型免疫佐劑使用，不僅能避免常規佐劑的不良反應，還可以顯著增強機體對病毒、細菌和寄生蟲疫苗的免疫效力，提高抗體整齊度和延長抗體持續時間，並且還可以降低某些疫苗的副作用。本發明的經優化過的重組豬白細胞介素2-Fc融合蛋白重組基因序列，更適於大腸桿菌表達系統的表達，所表達的重組豬白細胞介素2-Fc融合蛋白遠高於豬白細胞介素2-Fc融合蛋白天然基因序列在大腸桿菌表達系統的表達量，並且，與豬白細胞介素2相比，本發明的重組豬白細胞介素2-Fc融合蛋白在保證了豬白細胞介素2活性的基礎上較大程度上延長了其在生物體內的半衰期，實現了長效和避免反覆用藥的目的。同時，本發明所提供的是一種豬源型融合蛋白，更適於用針對豬類病毒性疾病獸藥的製備，而本發明所提供的該融合蛋白的原核細胞表達、純化和復性方法也極大的控制了其製備成本，為其產業化提供了保障。
圖1表示重組豬白細胞介素2-Fc融合蛋白密碼子優化前後核苷酸序列比較其中，奇數行(即「原始序列」對應的行)為豬白細胞介素2-Fc融合蛋白天然基因核苷酸序列，即密碼子優化前的序列；偶數行(即「優化序列」對應的行)為本發明的重組豬白細胞介素2-Fc融合蛋白的基因核苷酸序列，即密碼子優化後的序列。圖2-a、圖2-b為重組豬白細胞介素2_Fc融合蛋白密碼子優化前後在大腸桿菌表達宿主中CAI指數。其中，圖2-a表示重組豬白細胞介素2-Fc融合蛋白密碼子優化前在大腸桿菌表達宿主中CAI指數為0.64 ;圖2-b表示重組豬白細胞介素2-Fc融合蛋白密碼子優化後在大腸桿菌表達宿主中CAI指數為0.87。圖3-a、圖3-b為重組豬白細胞介素2_Fc融合蛋白密碼子在大腸桿菌表達宿主中最優密碼子頻率分布區域圖。其中，圖3-a表示重組豬白細胞介素2-Fc融合蛋白密碼子優化前在大腸桿菌表達宿主中最優密碼子頻率分布區域圖，從圖中可以看出:重組豬白細胞介素2-Fc融合蛋白密碼子優化前序列的低利用率密碼子(〈30%)出現百分比為9%;圖3-b表示重組豬白細胞介素2-Fc融合蛋白密碼子優化後在大腸桿菌表達宿主中最優密碼子頻率分布區域圖，重組豬白細胞介素2-Fc融合蛋白密碼子優化前序列的低利用率密碼子(〈30%)出現百分比為O。圖4-a、圖4-b為重組豬白細胞介素2_Fc融合蛋白密碼子中在大腸桿菌表達宿主中平均GC鹼基含量分布區域圖。
其中，圖4-a表示重組豬白細胞介素2-Fc融合蛋白密碼子優化前在大腸桿菌表達宿主中平均GC鹼基含量為:51.19%;圖4-b表示重組豬白細胞介素2-Fc融合蛋白密碼子優化後在大腸桿菌表達宿主中平均GC鹼基含量為:51.34%。圖5-a、圖5-b為豬白細胞介素2-Fc融合蛋白密碼子優化前後mRNA的二級結構預測圖。圖5-a豬白細胞介素2-Fc融合蛋白密碼子優化前mRNA的二級結構預測圖，圖5_b為豬白細胞介素2-Fc融合蛋白密碼子優化後mRNA的二級結構預測圖。圖6為重組豬白細胞介素2-Fc融合蛋白表達質粒構建過程圖。圖7為重組豬白細胞介素2-Fc融合蛋白優化基因瓊脂糖凝膠電泳圖。其中，泳道I為500bp DNA Ladder ;泳道2為NdeI和XhoI雙酶切後的pET21b載體；泳道3為兩端含有NdeI和XhoI酶切位點的重組豬白細胞介素2-Fc融合蛋白基因PCR產物。圖8為重組豬白細胞介素2-Fc融合蛋白的SDS-PAGE凝膠電泳圖及相應的免疫印跡圖。圖8-a為重組豬白細胞介素2-Fc融合蛋白SDS-PAGE凝膠電泳圖。其中，泳道I為(10-230kDa)寬範圍的預染的蛋白上樣Marker ;泳道2為未加入IPTG誘導的重組豬白細胞介 素2-Fc融合蛋白大腸桿菌裂解液；泳道3為加入IPTG誘導的重組豬白細胞介素2-Fc融合蛋白大腸桿菌裂解液。圖8-b為重組豬白細胞介素2-Fc融合蛋白免疫印跡圖。其中，泳道l(10_230KDa)寬範圍的預染的蛋白上樣Marker，泳道2為未加入IPTG誘導的重組豬白細胞介素2-Fc融合蛋白大腸桿菌裂解液:泳道3為加入IPTG誘導的重組豬白細胞介素2-Fc融合蛋白大腸桿菌裂解液。圖9重組豬白細胞介素2-Fc融合蛋白高效表達誘導條件優化SDS-PAGE凝膠電泳圖。其中，泳道I為(10_230kDa)寬範圍的預染的蛋白上樣Marker ;泳道2為0.5mmol/L IPTG誘導Ih重組豬白細胞介素2-Fc融合蛋白大腸桿菌裂解液；泳道3為0.5mmol/LIPTG誘導2h重組豬白細胞介素2-Fc融合蛋白大腸桿菌裂解液；泳道4為0.5mmol/L IPTG誘導3h重組豬白細胞介素2-Fc融合蛋白大腸桿菌裂解液；泳道5為0.5mmol/L IPTG誘導4h重組豬白細胞介素2-Fc融合蛋白大腸桿菌裂解液；泳道6為lmmol/L IPTG誘導Ih重組豬白細胞介素2-Fc融合蛋白大腸桿菌裂解液；泳道7為lmmol/L IPTG誘導2h重組豬白細胞介素2-Fc融合蛋白大腸桿菌裂解液；泳道8為lmmol/L IPTG誘導3h重組豬白細胞介素2-Fc融合蛋白大腸桿菌裂解液；泳道9為lmmol/L IPTG誘導4h重組豬白細胞介素2_Fc融合蛋白大腸桿菌裂解液；泳道10為1.5mmol/L IPTG誘導Ih重組豬白細胞介素2_Fc融合蛋白大腸桿菌裂解液；泳道11為1.5mmol/L IPTG誘導2h重組豬白細胞介素2_Fc融合蛋白大腸桿菌裂解液；泳道12為1.5mmol/L IPTG誘導3h重組豬白細胞介素2_Fc融合蛋白大腸桿菌裂解液；泳道13為1.5mmol/L IPTG誘導4h重組豬白細胞介素2_Fc融合蛋白大腸桿菌裂解液。圖10為復性後的豬白細胞介素2-Fc融合蛋白包涵體SDS-PAGE電泳圖其中，泳道I為(10_230kDa)寬範圍的預染的蛋白上樣Marker ;泳道2為超聲裂解含有重組豬白細胞介素2-Fc融合蛋白的全菌裂解液；泳道3為用Buffer B第一次清洗後重組豬白細胞介素2-Fc融合蛋白包涵體沉澱；泳道4為Buffer B第二次清洗後重組豬白細胞介素2-Fc融合蛋白包涵體沉澱。圖11為重組白細胞介素2-Fc在豬血清中穩定性免疫印跡圖。
其中，泳道I為(10_230kDa)寬範圍的預染的蛋白上樣Marker ;泳道2為未加豬白細胞介素2和重組豬白細胞介素2-Fc融合蛋白豬血清樣品；泳道3為加入I μ mol/mL豬白細胞介素2和I μ mol/mL重組豬白細胞介素2_Fc融合蛋白Oh的豬血清樣品；泳道4為加入I μ mol/mL豬白細胞介素2和I μ mol/mL重組豬白細胞介素2_Fc融合蛋白0.25h的豬血清樣品；泳道5為加入I μ mol/mL豬白細胞介素2和I μ mol/mL重組豬白細胞介素2_Fc融合蛋白0.5h的豬血清樣品；泳道6為加入I μ mol/mL豬白細胞介素2和I μ mol/mL重組豬白細胞介素2-Fc融合蛋白1.5h的豬血清樣品；泳道7為加入I μ mol/mL豬白細胞介素2和I μ mol/mL重組豬白細胞介素2_Fc融合蛋白3h的豬血清樣品；泳道8為加入I μ mol/mL豬白細胞介素2和I μ mol/mL重組豬白細胞介素2_Fc融合蛋白6h的豬血清樣品；泳道9為加入I μ mol/mL豬白細胞介素2和I μ mol/mL重組豬白細胞介素2_Fc融合蛋白24h的豬血清樣品；泳道10為加入I μ mol/mL豬白細胞介素2和I μ mol/mL重組豬白細胞介素2-Fc融合蛋白48h的豬血清樣品；泳道11為加入I μ mo I/ml豬白細胞介素2和I μ mol/mL重組豬白細胞介素2-Fc融合蛋白72h的豬血清樣品；泳道12為加入I μ mol/mL豬白細胞介素2和I μ mol/mL重組豬白細胞介素2_Fc融合蛋白120h的豬血清樣品。
具體實施例方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發明，應理解，引用實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。實施例1重組豬白細胞介素2-Fc融合蛋白基因優化設計1.密碼子優化遺傳密碼子有64種，但是絕大多數生物傾向於利用這些密碼子中的一部分。那些被最頻繁利用的稱為最佳密碼子(op timal codons)，那些不被經常利用的稱為稀有或利用率低的密碼子(rare or low-usage codons)。實際上,常用做蛋白表達或生產的每種生物(包括大腸桿菌，酵母，哺乳動物細胞，植物細胞和昆蟲細胞)都表現出某種程度的密碼子利用的差異或偏愛。大腸桿菌、酵母和果蠅中對含最佳密碼子的基因的表達效率明顯高於含低利用率的密碼子的基因的表達效率。因此，在異源表達系統中，密碼子的偏愛性很大程度上影響了重組蛋白的表達。利用偏愛密碼子(preferred codons)並避免利用稀有的密碼子進行基因合成，這種基因的重新設計叫密碼子優化。優化過程充分考慮到蛋白表達不同階段可能遇到的多種複雜因素，如:密碼子適應性、mRNA結構以及轉錄和翻譯過程中不同的順式元件。因此，本發明對豬白細胞介素2-Fc融合蛋白的基因設計不僅包括密碼子優化，還包括mRNA結構修正、翻譯起始位點的優化等。2.密碼子偏愛性優化密碼子偏愛性在原核基因表達中已經被證實是一個很重要的影響因素，它引起了同一密碼子在不同生物體之間，蛋白的表達水平之間以及同一操縱子的不同部位間利用率的改變。引起這種偏愛性差異的主要原因是不同細胞內可用的tRNAs量的差異。因此優化翻譯系統最佳的方法就是保持密碼子的使用頻率與同源tRNA之間的平衡。在大腸桿菌中表達哺乳動物基因是不可預測和具有挑戰的，如在大腸桿菌中，AGG和AGA所對應的tRNA分子就很少，這種差異很明顯會影響基因的表達。3.將低利用率的密碼子替換成宿主常用密碼子
通常基因中包含的密碼子在特定宿主中的利用率越低，該種蛋白的表達量也就越少，甚至當這種密碼子存在與蛋白簇間或者N末端的時候表達量會更少。在不改變胺基酸序列的前提下將低利用率的密碼子替換為宿主常用密碼子能提高功能蛋白的表達水平。任何來源的密碼子如果在宿主生物體內的利用率低於5%到10%時，就會出現表達抑制，當這些低利用率密碼子臨近或相連時，對蛋白表達的影響更大。成簇的低利用率的密碼子抑制了核糖體的運動，這是基因不能以合適水平表達的一個明顯機制。核糖體翻譯由九個密碼子組成的信使(含幾個低利用率密碼子或全部為低利用率密碼子)時的運動速度要比翻譯不含低利用率密碼子的同樣長的信使的速度慢。即使低利用率密碼子簇位於3』端，信使最後也會被核糖體「擁擠」而損害，核糖體又回到5』端。3』端低利用率密碼子簇的抑制效應可以和全部信使都由低利用率密碼子組成的抑制效應一樣大。如果低利用率密碼子簇位於5』端，其效應是起始核糖體數目的全面減少，導致蛋白合成中信使的低效率。去除低利用率的密碼子或者容易被誤讀為終止信號的密碼子能夠防止低表達或者不表達。4.表達載體和轉錄啟動子雖然密碼子偏愛在基因表達中起著重要的作用，但表達載體和轉錄啟動子的選擇同樣重要，N端核苷酸序列的蛋白表達對於低利用率密碼子和接近起始位點的密碼子AUG非常敏感。翻譯與mRNA的穩定性間也存在著相互的影響，雖然降低翻譯效率會使mRNA由於缺少了核糖體的保護而更容易被endo-RNAses分解，但目前還沒有它們之間影響的完整解釋。其他因素也可以影響蛋白表達，包括使mRNA去穩定的序列。穩定mRNA 二級結構和接近5』端的分子也對基因表達有重要的影響。利用翻譯時目的基因上遊的開放式閱讀框能夠成功提高難度基因的表達效率。發明人根據GenBank已公開的豬白細胞介素2 (Sus scrofa interleukin2)的cDNA 序列(GenBank 登錄號:NM_213861.1)和豬 IgG Fe 片段(Sus scrofa IgG heavychain)的cDNA序列(GenBank登錄號:NM_213828.1)中鉸鏈區、CH2區和CH3區，對這2個基因直接融合併進行密碼子優化得到本發明的重組豬白細胞介素2-Fc融合蛋白的基因，如 SEQ ID No:1 所示。下面是對重組豬白細胞介素2-Fc融合蛋白基因進行密碼子優化具體步驟:對該基因進行密碼子優化後得到本發明的重組豬白細胞介素2-Fc融合蛋白基因，如SEQID No:1所示。下面是對重組豬白細胞介素2-Fc融合蛋白進行密碼子優化，優化前後各參數對比如下:1.密碼子適應指數(CAI)由圖2-a可知，密碼子沒有優化前，重組豬白細胞介素2-Fc融合蛋白基因在大腸桿菌中密碼子適應指數(codon adaptation index, CAI)為0.64。由圖2_b可知,通過密碼子優化後，使得重組豬白細胞介素2-Fc融合蛋白基因在大腸桿菌中CAI指數為0.87。通常CAI=I時被認為該基因在該表達系統中是最理想的高效表達狀態，CAI指數越低表明該基因在該宿主中表達水平越 差，因此可以看出經過了密碼子優化後得到的基因序列可以提高重組豬白細胞介素2-Fc融合蛋白基因在大腸桿菌中的表達水平。2.最優密碼子使用頻率(FOP)
由圖3-a可知，基於大腸桿菌表達載體，密碼子沒有優化前，豬白細胞介素2-Fc融合蛋白基因序列的低利用率密碼子出現百分比為9%。這條未進行優化的基因採用串聯稀有密碼子，這些密碼子可能降低翻譯效率，甚至能夠解散翻譯裝配物。由圖3-b可知，通過密碼子優化後，重組豬白細胞介素2-Fc融合蛋白基因在大腸桿菌系統中出現低利用率密碼子的頻率為O。3.GC 喊基含量(GC curve)GC含量理想分布區域為30%_70%，在這個區域外的出現任何峰都會不同程度地影響轉錄和翻譯效率。由圖4-a、圖4-b的豬白細胞介素2-Fc融合蛋白基因的GC鹼基平均含量分布區域圖對比可知，由圖4-a中顯示豬白細胞介素2-Fc融合蛋白基因中在優化前GC鹼基平均含量為51.19%，由圖4-b中顯示出優化後的序列消除了 GC含量在30%_70%區域外的60個鹼基，最終得到優化後重組豬白細胞介素2-Fc融合蛋白的GC鹼基平均含量為51.34%ο3.順式作用元件
權利要求
1.一種重組豬白細胞介素2 -Fe融合蛋白，其特徵在於，所述融合蛋白包括豬白細胞介素2部分和Fe片段部分，所述豬白細胞介素2部分為豬白細胞介素2胞外區的全部序列，所述Fe片段部分包括鉸鏈區、CH2區和CH3區，豬白細胞介素2與Fe片段部分之間為直接融合。
2.如權利要求1所述的融合蛋白，其特徵在於，所述融合蛋白的胺基酸序列如SEQIDNO:2所示。
3.—種編碼權利要求2中所述的融合蛋白的基因，其鹼基序列如SEQ ID N0:1所示。
4.一種載體,所述載體含有權利要求3的基因。
5.如權利要求4所述的載體，所述載體為pET21b。
6.一種大腸桿菌，所述大腸桿菌具有權利要求4或5的載體。
7.如權利要求6所述的大腸桿菌，所述大腸桿菌為BL21(DE3)菌株。
8.—種重組豬白細胞介素2 - Fe融合蛋白的原核細胞表達方法，包括如下步驟: (1)在合適的條件下於培養基中培育權利要求6或7中所述的大腸桿菌； (2)從大腸桿菌和/或培養基中分離重組豬白細胞介素2- Fe融合蛋白。
9.如權利要求8所述的表 達方法，包括如下步驟: (O挑取一個或多個含有權利要求6或7中所述的大腸桿菌菌落，接入含抗生素的LB培養液，培養過夜； (2)取過夜培養物轉接入於含抗生素的新鮮LB培養液中，於37°C震蕩培養至對數中期OD600=L O ； (3)在培養物中加入濃度為Immo I/L的IPTG，37°C，誘導表達4h後，離心處理收集含有重組豬白細胞介素2 - Fe融合蛋白的大腸桿菌菌體沉澱。
10.一種重組豬白細胞介素2 - Fe融合蛋白的純化和復性方法，其特徵在於，包含如下步驟: (1)將收集得到的如權利要求9所述的含有誘導重組豬白細胞介素2- Fe融合蛋白大腸桿菌沉澱，用預冷的PBS重懸，並於4°C高速離心處理，重複一次； (2)吸去上清，稱菌體沉澱重量，每克(溼重)加入裂解緩衝液BufferA3 -10mL，用磨光玻璃棒攪動，使菌體懸起； (3)每克(溼重)菌體加入3-10 μ L濃度為100mmol/L的PMSF，3 -100μ L濃度為IOOmg/mL的溶菌酶,於冰上攪動； (4)破碎菌體，樣品置於冰上，超聲，並於4°C高速離心處理； (5)沉澱用洗滌緩衝液BufferB洗滌，並於4°C高速離心處理，沉澱包涵體，重複一次； (6)包涵體沉澱用變性緩衝液BufferC溶解,室溫下攪拌30 - 60min ； (7)充分混勻後室溫高速離心處理，棄沉澱，取上清，即得到重組豬白細胞介素2-Fe融合蛋白變性溶液； (8)取適量用變性緩衝液BufferC溶解的重組豬白細胞介素2 - Fe融合蛋白變性溶液，用變性緩衝液Buffer D將重組豬白細胞介素2 - Fe融合蛋白變性溶液的濃度稀釋至·0.2mg/mL，4°C透析復性24h，將復性後重組蛋白溶液用0.45 μ m濾膜過濾，即得到重組豬白細胞介素2 - Fe融合蛋白復性溶液； 所述重組豬白細胞介素2 -Fe融合蛋白復性溶液可進一步用截留分子量IOKDa的超濾濃縮、脫鹽至最小體 積，低溫真空乾燥，即獲得重組豬白細胞介素2粉末。
全文摘要
本發明提供了一種重組豬IL2-Fc融合蛋白及其編碼基因、表達、純化和包涵體復性方法，屬於生物基因工程領域。IL2在疾病發生過程中起到十分重要的免疫調節作用，但其也存在血漿中清除速度較快、產業化成本高的缺陷。為大量獲取半衰期較長的豬IL2，本發明採用大腸桿菌原核表達體系提供了一種重組豬IL2-Fc融合蛋白。其中，豬IL2部分為豬IL2胞外區的全部序列，Fc片段部分包括抗體的鉸鏈區、CH2區和CH3區，豬IL2與Fc片段部分之間為直接融合。本發明提供的重組豬IL2-Fc融合蛋白，不僅保存了IL-2的大部分生物活性，而且極大的延長了其半衰期，為低成本大量表達及其產業化提供了保障。
文檔編號C12N15/62GK103193887SQ201310117299
公開日2013年7月10日 申請日期2013年4月3日 優先權日2013年4月3日
發明者馬永, 王安良, 章成昌, 徐春林, 陳晨, 王耀方 申請人:江蘇眾紅生物工程創藥研究院有限公司, 常州京森生物醫藥研究所有限公司