一種複合納米膠體金殼聚糖免疫載體及其製備方法
2023-10-18 03:10:29
專利名稱：一種複合納米膠體金殼聚糖免疫載體及其製備方法
技術領域：
本發明屬於生物材料領域，特別涉及一種複合納米膠體金殼聚糖載體及其製備方法和用途。
背景技術：
膠體金免疫層析法是20世紀90年代在美國興起的一種基於免疫膠體金技術的快速診斷技術，是在現代單克隆抗體技術、膠體金免疫技術和新材料技術基礎上發展起來的新型檢測技術。膠體金溶液是指分散相粒子直徑在1 150 nm之間的金溶膠，屬於多相不均勻體系，顏色呈桔紅色到紫紅色。1971年Faulk和Taylor將膠體金引入免疫化學中，開始作為一種免疫標記技術使用，膠體金在免疫化學中的這種應用，又被稱為免疫金，近年來膠體金標記已經發展為一項重要的免疫標記技術中，開始作為一種免疫標記技術使用，膠體金在免疫化學中的這種應用，又被稱為免疫金，近年來膠體金標記已經發展為一項重要的免疫標記技術。免疫膠體金技術是一種新型的免疫標記技術，以膠體金作為示蹤標記物應用於特異性抗原抗體反應。氯金酸(HAuCh)水溶液在檸檬酸鈉、鞣酸、白磷、抗壞血酸、硼氰化鈉等還原劑的作用下，聚合成特定大小的金顆粒，帶負電且疏水，並且由於靜電作用成為一種穩定的膠體狀態，稱為膠體金。膠體金以金顆粒為核，表面吸附了 AuCL-和H雙離子層。膠體金顆粒在弱鹼性環境中帶負電荷，可與蛋白質分子的正電荷基團因靜電吸附而形成牢固結合，即免疫膠體金。由於這種結合是靜電結合，所以不影響蛋白質的生物特性。膠體金除了與蛋白質結合以外，還可以與許多其他生物大分子非共價結合，可以與葡萄球菌A蛋白、 免疫球蛋白、毒素、糖蛋白、酶、抗生素、激素、牛血清白蛋白多肽綴合物等非共價結合。膠體金標記技術實質上就是蛋白質分子被吸附到膠體金顆粒表面的包被過程，由於膠體金顆粒本身呈紅色，所以當免疫膠體金顆粒遇到相應的抗原或抗體時會發生反應產生聚集，在適宜條件下達到一定的密度，出現肉眼可見的紅色，因而在定性或半定量的快速免疫檢測方法中得到了廣泛的應用。免疫膠體金經過幾十年的發展，作為一門成熟的技術被廣泛應用於生物醫學等領域，特別是膠體金免疫層析試紙條被廣泛應用醫學檢測和臨床診斷，成為目前進行快速診斷的主要方法之一。膠體金的製備方法一般採用還原法，常見的有硼氫化鈉還原法Onm)、白磷還原法(5nm)、抗壞血酸還原法(8-12nm)、檸檬酸-鞣酸還原法 (3-15nm)、檸檬酸三鈉還原法(10-150nm)，其中檸檬酸三鈉法是最經典的方法，其基本原理是向一定濃度的金溶液內加入一定量的檸檬酸三鈉使金離子還原變成金原子。由於膠體金對抗原和抗體的吸附能力有限，有時為了達到一定的靈敏度，要增加膠體金的用量，這大大增加了成本，浪費了寶貴的黃金資源。
發明內容
本發明將殼聚糖對抗原和抗體有很好親合性的特性應用於膠體金，提高膠體金對抗原抗體的吸附能力，降低膠體金的用量。本發明的目的通過以下技術方案得以實現。一種複合納米膠體金殼聚糖載體，其中膠體金均勻分布於殼聚糖中。本發明所述複合納米膠體金殼聚糖載體採用脫乙醯度大於90%的殼聚糖。本發明所述複合納米膠體金殼聚糖載體其膠體金與納米殼聚糖的比例為 1:0. 1 1:1。本發明還提供了一種複合納米膠體金殼聚糖載體的製備方法，包括以下步驟
(1)取質量濃度為0.01%氯金酸水溶液加熱至沸，攪拌加入預熱的質量濃度為檸檬酸三鈉水溶液，至氯金酸水溶液由金黃色變為灰色再變為酒紅色，繼續攪拌煮沸至溶液呈透亮的紅色，4°C避光保存，得到膠體金溶液；
(2)將殼聚糖用0.1-1%的有機弱酸溶解成質量濃度為0. 01-0. 1%的殼聚糖溶液，過濾得到殼聚糖溶液；
(3)將步驟(1)和(2)製備的膠體金和殼聚糖溶液按質量比1:0.1 1:1比例混合，高速攪拌後，緩慢滴加0. 05mol/L的碳酸鉀溶液調節混合液的pH值至7. 0，得到複合納米膠體金殼聚糖載體混合溶液。本發明還提供了一種複合納米膠體金殼聚糖載體標記抗原或抗體的製備方法，包括以下步驟
(1)用0.05mol/L的碳酸鉀溶液調節複合納米膠體金殼聚糖載體溶液的pH值至8. 0或者適合抗原抗體的PH值；
(2)按照每毫升步驟(1)所述混合液中10-30yg抗原或抗體的量加入所需抗原或抗體，穩定後再加入5%BSA和1%的PEG20000，離心後棄上清，將沉澱溶於含有1%BSA和 0. 05%NaN3的pH8. 2的TBS溶液，4°C保存備用。本發明中所述溶液濃度，溶質為固體的，是指質量體積分數，即每100毫升溶液中含溶質的質量克數；溶質為液體的，是指體積百分數，即每100毫升溶液中含溶質的體積毫升數。本發明所述複合納米膠體金殼聚糖載體免疫膠體金可以廣泛應用於生物醫藥或農業等領域免疫檢測或免疫診斷。採用掃描電鏡對本發明所述複合納米膠體金殼聚糖載體進行研究，該複合載體粒徑分布為20nm-200nm，平均直徑為80nm。
具體實施例實施例1
按照以下步驟製備複合納米膠體金殼聚糖載體
(1)膠體金的製備取質量濃度0.01%氯金酸水溶液IOOmL加熱至沸，攪拌下加入預熱的質量濃度檸檬酸三鈉水溶液4mL，金黃色的氯金酸水溶液在2min內變為灰色， 然後由灰色變為酒紅色，繼續攪拌煮沸，直至溶液呈透亮的紅色，冷卻後用雙蒸水定容至 100 mL，4°C冰箱中避光保存；
(2)殼聚糖溶液的製備將殼聚糖用0.1-1%的檸檬酸溶解成0. 1%的殼聚糖溶液，溶解一夜後過濾，得透明的殼聚糖溶液；(3)複合納米膠體金殼聚糖免疫載體的製備將上述膠體金和殼聚糖溶液按質量比為1 1混合，然後在高速攪拌下，緩慢滴加0. 05mol/L的碳酸鉀溶液調節混合液的pH值至 7. 0，並繼續攪拌，得到複合納米膠體金殼聚糖載體溶液。實施例2
按照以下步驟製備複合納米膠體金殼聚糖載體
(1)膠體金的製備取質量濃度0.01 %氯金酸水溶液IOOmL加熱至沸，攪拌下加入預熱的質量濃度檸檬酸三鈉水溶液4mL，金黃色的氯金酸水溶液在ailin內變為灰色，然後由灰色變為酒紅色，繼續攪拌煮沸，直至溶液呈透亮的紅色，冷卻後用雙蒸水定容至100 mL，4°C冰箱中避光保存；
(2)殼聚糖溶液的製備將脫乙醯度大於90%的殼聚糖用0.1-1%的檸檬酸溶解成 0. 01%的殼聚糖溶液，溶解一夜後過濾，得透明的殼聚糖溶液；
(3)複合納米膠體金殼聚糖免疫載體的製備將上述膠體金和殼聚糖溶液按質量比為 1:0.1混合，然後在高速攪拌下，緩慢滴加0. 05mol/L的碳酸鉀溶液調節混合液的pH值至 7. 0，並繼續攪拌，得到複合納米膠體金殼聚糖載體溶液。實施例3
(1)膠體金的製備取質量濃度0.01%氯金酸水溶液IOOmL加熱至沸，攪拌下加入預熱的質量濃度檸檬酸三鈉水溶液4mL，金黃色的氯金酸水溶液在aiiin內變為灰色，然後由灰色變為酒紅色，繼續攪拌煮沸，直至溶液呈透亮的紅色，冷卻後用雙蒸水定容至100 mL，4°C冰箱中避光保存；
(2)殼聚糖溶液的製備將脫乙醯度大於90%的殼聚糖用0.1-1%的檸檬酸溶解成0. 1% 的殼聚糖溶液，溶解一夜後過濾，得透明的殼聚糖溶液；
(3)複合納米膠體金殼聚糖免疫載體的製備將上述膠體金和殼聚糖溶液按質量比為 1:0.5混合，然後在高速攪拌下，緩慢滴加0. 05mol/L的碳酸鉀溶液調節混合液的pH值至 7. 0，並繼續攪拌，得到複合納米膠體金殼聚糖載體溶液。實施例4
複合納米膠體金殼聚糖載體標記HBsAg的製備
用0. 05mol/L的碳酸鉀溶液調節複合納米膠體金殼聚糖載體溶液的pH值至8. 2，加入 HBsAg使其終濃度為30 μ g/mL,穩定10-30分鐘後，再加入5%BSA和1%的PEG20000，穩定 30-60分鐘以後，於12000rpm離心30分鐘，棄上清，沉澱溶於ρΗ8· 2的TBS溶液(含1%BSA 和0. 05%NaN3)，4°C保存備用。
權利要求
1.一種複合納米膠體金殼聚糖載體，膠體金均勻分散於殼聚糖中。
2.如權利要求1所述複合納米膠體金殼聚糖載體，其特徵在於所述殼聚糖為脫乙醯度大於90%的殼聚糖。
3.如權利要求1所述複合納米膠體金殼聚糖載體，其特徵在於膠體金與納米殼聚糖的質量比為1:0. 1 1:1。
4 一種如權利要求1所述複合納米膠體金殼聚糖載體的製備方法，包括以下步驟(1)取質量濃度為0.01%氯金酸水溶液加熱至沸，攪拌加入預熱的質量濃度為檸檬酸三鈉水溶液，至氯金酸水溶液由金黃色變為灰色再變為酒紅色，繼續攪拌煮沸至溶液呈透亮的紅色，4°C避光保存，得到膠體金溶液；(2)將殼聚糖用0.1-1%的有機弱酸溶解成質量濃度為0. 01-0. 1%的殼聚糖溶液，過濾得到殼聚糖溶液；(3)將步驟(1)和(2)製備的膠體金和殼聚糖溶液按質量比1:0.1 1:1比例混合，高速攪拌後，緩慢滴加0. 05mol/L的碳酸鉀溶液調節混合液的pH值至7. 0，得到複合納米膠體金殼聚糖載體混合溶液。
5.如權利要求4所述製備方法，其特徵在於所述步驟(2)所述有機弱酸為檸檬酸或醋酸或草酸中的任意一種。
6.一種如權利要求1所述複合納米膠體金殼聚糖載體標記抗原或抗體的製備方法，包括以下步驟(1)用0.05mol/L的碳酸鉀溶液調節複合納米膠體金殼聚糖載體溶液的pH值至8. 0或者適合抗原或抗體的PH值；(2)向步驟(1)溶液加入所需抗原或抗體使其終濃度為10-30μ g/mL，穩定後再加入為 5%BSA和1%的PEG20000，離心後棄上清，將沉澱溶於含有1%BSA和0. 05%NaN3的pH8. 2的 TBS溶液，4°C保存備用。
全文摘要
本發明提供了一種複合納米膠體金殼聚糖載體，膠體金均勻分散於殼聚糖中。本發明還提供了一種複合納米膠體金殼聚糖載體及標記抗原抗體的製備方法。本發明將殼聚糖對抗原和抗體有很好親合性的特性應用於膠體金，提高了膠體金對抗原抗體的吸附能力，降低膠體金的用量。本發明所述複合納米膠體金殼聚糖載體可以廣泛應用於生物醫藥或農業等領域免疫檢測或免疫診斷。
文檔編號B01J20/30GK102430392SQ20111027142
公開日2012年5月2日 申請日期2011年9月14日 優先權日2011年9月14日
發明者張添, 楊宇民 申請人:江蘇益通生物科技有限公司