一種檢測口蹄疫病毒基因組rna的單細胞實時螢光定量rt-pcr的方法

2023-07-18 20:23:26 1

專利名稱：：一種檢測口蹄疫病毒基因組rna的單細胞實時螢光定量rt-pcr的方法
技術領域：
：本發明涉及一種檢測口蹄疫病毒基因組RNA的單細胞實時螢光定量RT-PCR的方法，適用於在單細胞水平上研究口蹄疫病毒的複製，進而分析病毒的急性感染與持續性感染的機理，探究在感染過程中病毒與宿主細胞的關係。
背景技術：
：口蹄疫病毒(Foot-and-mouthdiseasevirus:FMDV)屬小RNA病毒科口蹄疫病毒屬，其所在的RNA病毒科在醫學和獸醫學上具有重要地位，該病毒主要引發偶蹄動物發生口蹄疫。基因組由一條正義的RNA鏈組成，約含8500個核苷酸，其複製經由一條互補的負鏈RNA作為模板。病毒感染其敏感細胞系(如倉鼠腎細胞系BHK-21或豬腎細胞系IB-RS-2)，宿主細胞會發生致細胞病變效應(CPE),表現為細胞變圓，內細胞膜重排等。除急性感染外，口蹄疫病毒還能在動物和細胞中建立持續性感染。基於口蹄疫病毒基因組的特點，現已建立了許多相關的檢測方法包括雜交實驗(Verheyden,B,Lauwers,S,etal.QuantitativeRT-PCRELISAtodeterminetheamountandratioofpositive-andnegative-strandviralRNAsynthesisandtheeffectofguanidineinpoliovirusinfectedcells.J.Pharm.Biomed.Anal[J],2003,33:303-308.)、常規RT-PCR(Hofmann,MA，Thiir，B,etal.Rescueofinfectiousclassicalswinefeverandfoot-and-mouthdiseasevirusbyRNAtransfectionandvirusdetectionbyRT-PCRafterextendedstorageofsamplesinTrizol[J].J.Virol.Methods,2000,87:29-39.)以及近年建立的實時螢光定量RT-PCR(King,DP,Ferris,NP,etal.Detectionoffoot-and-mouthdiseasevirus:comparativediagnosticsensitivityoftwoindependentreal-timereversetranscriptionpolymerasechainreactionassays[J].J.VetDiagn.Invest"2006,18:93-97;Horsington,J,Zhang,Z.Analysisoffoot-and-mouthdiseasevimsreplicationusingstrand-specificquantitativeRT-PCR[J].J.Virol.Methods,2007,144:149-155.)。與其他的檢測方法相比，螢光定量RT-PCR技術優勢明顯，如靈敏度高、速度快、特異性強，可減少交叉汙染等。然而所有的這些檢測方法都是基於群體細胞的檢測(組織塊或細胞系)，所獲得是群體細胞中病毒複製的數據，只能反映群體細胞中的病毒量而不能獲悉單個細胞中病毒的感染及其複製情況。從上個世紀80年代末，生物學家們開始探索單細胞PCR和單細胞RT-PCR的可行性。1988年，Jeffrey等從單個人體細胞中擴增出了微衛星DNA，標誌著單細胞PCR技術的建立(Jeffreys,AJ，Wilson,V，etal.Amplificationofhumanminisatellitesbythepolymerasechainreaction:towardsDNAfingerprintingofsinglecells[J].Nucleic.Acids.Res.，1988，16:10953-10971.)。近幾年螢光定量PCR技術又被成功的用於檢測單個神經元細胞中的基因以及研究胚胎發育細胞(Rice，JE,Sanchez,JA,etal.Real-timePCRwithmolecularbeaconsprovidesahighlyaccurateassayfordetectionofTay-Sachsallelesinsinglecells[J].Prenat.Diagn.,2002,22:1130-1134;Pierce,KE,Rice,JE,etal.Detectionofcysticfibrosisallelesfromsinglecellsusingmolecularbeaconsandanovelmethodofasymmetricreal-timePCR[J],Mol.Hum.Reprod.，2003,9:815-820)等。Wagatsuma等(Wagatsuma,A,Sadamoto,H，etal.DeterminationoftheexactcopynumbersofparticularmRNAsinasinglecellbyquantitativereal-timeRT-PCR[J].J.Exp.Biol"2005,208:2389-2398.)利用實時螢光定量RT-PCR技術檢測單個蛇腦巨細胞中環AMP應答元件結合蛋白(英文名稱CREB)的量，成功解決單細胞RT-PCR的兩大難題。首先，他們用雷射切割術分離體細胞後用膜片鉗吸液術將細胞內含物吸出，並成功地從單個細胞中提出mRNAs;其次，選用高靈敏度的螢光定量RT-PCR技術代替核酸雜交和競爭性PCR進行基因檢測，能夠檢測微量的目標基因，特別適合於單細胞的定量分析。但是其分離單細胞技術存在一定的問題，因為膜片鉗技術不能保證完全能把細胞內含物吸出而雷射切割術也不能避免周圍其他非巨細胞的汙染。Parhar等(Parhar,IS,Ogawa,S,etal.Single-cellreal-timequantitativepolymerasechainreactionofimmunofluorescentlyidentifiedneuronsofgonadotropin陽releasinghormonesubtypesincichlidfish[J].Endocrinology,2003,144:3297-3300)利用實時螢光定量方法同時檢測單個魚神經元細胞中的促性腺激素釋放激素的三個亞型首先他們用連接在螢光顯微鏡上的顯微操縱儀分離單個神經元細胞，利用負壓將單個細胞轉入裝有50nl細胞裂解液的1.5ml離心管中，凍入-8(TC;再將分離出來的單細胞樣品進行蛋白消化和DnaseI酶解，用ISOGEN和RNA提取試劑盒提取細胞總RNA;最後將提取的細胞RNA分步進行RT與PCR。用連接在顯微鏡上的顯微操縱儀分離細胞具有可監控性、快速、易操作等優點，可以完全監控整個分離的過程，而其裂解細胞的過程確保無細胞蛋白和DNA汙染，並且能完全釋放細胞RNA，使得後續的反轉錄和擴增反應有高純度的模板。該技術缺點也比較明顯，即裂解細胞歩驟較多並且從分離單細胞到進行定量PCR反應之間操作步驟繁瑣，會造成RNA的降解從而非真實地反應原細胞目的基因的拷貝數。另外，兩步法(two-step)實時螢光定量RT-PCR也在一定程度上增加了反應時間和誤差機率。總而言之，迄今單細胞螢光定量PCR技術還未被應用於檢測感染細胞中的病毒的基因拷貝數，因此能否將之用於檢測感染細胞中攜帶的病毒量是我們所關注的科學問題。
發明內容本發明的目的在於提供了一種檢測口蹄疫病毒基因組RNA的單細胞實時螢光定量RT-PCR方法，包括了分離和裂解單細胞技術以及實時螢光定量RT-PCR技術，該方法能實現單細胞水平上的病毒複製及其與宿主細胞關係的研究，為闡明病毒複製機制及探究病毒持續感染的成因等提供了一種新的技術手段。該方法還具有操作簡便、快速、穩定性高、靈敏度高等特點，為研究病毒與宿主細胞關係提供了新的技術支持。另外，分離細胞和裂解細胞的技術具有廣泛適用性、能用於任何其他細胞(懸浮細胞與貼壁細胞)的分離與預處理，為在單細胞水平上進行的各種研究奠定基礎。為了實現上述目的，本發明採用以下技術措施一種檢測口蹄疫病毒基因組RNA的單細胞實時螢光定量RT-PCR的方法，其歩驟是A、單細胞的分離與裂解a、病毒感染用50100PFU滴度的口蹄疫病毒感染單層BHK-21細胞，1836h後，用胰酶將細胞消化，加入610倍於胰酶量的新鮮MEM生長培養基滅活胰酶，充分分散細胞，調整細胞濃度至104106個/1111，最後，取lml細胞懸液於直徑6cm的無菌培養皿中，進行單細胞分離；b、分離單細胞分離單細胞需用到以下技術措施a)拉針器，b)磨針儀，c)顯微注射儀，d)細胞儲液，其特徵是用拉針器和磨針儀製作精細的細胞挑針，通過與顯微注射儀連接的倒置顯微鏡可直接觀察到待分離的細胞並能隨時監控整個分離挑取單細胞的過程，準確快速地獲得所需的單細胞樣品(60min內約可挑選分離3565個單細胞樣品)。具體實施步驟是首先將細胞挑針與顯微操縱儀的右導管相連，調節顯微注射儀的平衡(balance)旋鈕使提供的平衡壓減小(即表現為毛細管向內吸液)，然後再將挑針前端伸入培養皿中至液面下，在顯微鏡下挑取單個細胞。挑起一個單細胞後，將帶有單細胞的挑針提起伸入PCR管液面下，增大平衡壓，將細胞送入PCR管內的細胞儲液中。c、細胞裂解每30min60min處理一批單細胞樣品，以在裂解細胞前最大限度維持細胞原狀(60min內約可挑選分離3565個單細胞樣品)。單細胞樣品於94T:98'C熱變性28min(可在水浴中變性也可在PCR儀中變性)後，迅速浸入液氮中，用蛋白酶K於53'C消化40或44或48或53或57或62或67或71或75min為避免病毒衣殼蛋白和細胞蛋白對逆轉錄的影響，蛋白酶解後立刻凍入液氮中直至進行螢光定量RT-PCR反應。B、螢光定量RT-PCR:螢光定量RT-PCR採用一步法擴增(One-stepRT-PCR)，即在cDNA合成和擴增之間不需要打開管蓋一步完成，減少加樣誤差和交叉汙染，特別是對單細胞樣品而言減少操作步驟無疑有利於精確定量。另外用已知濃度的體外轉錄RNA作為標準品建立標準曲線，使定量結果更準確、直接，避免了用DNA為標準品時逆轉錄效率不穩定，而影響定量的準確性。其具體步驟如下首先是一步法螢光定量反應液(反應總體積是50)il):2Xbuffer25^1,正義引物FP和反義引物RT各2pl(25(imol/L)，25pmol/L的螢光探針0.5nl，反轉錄和熱啟動TaqDNA聚合酶lpl，RNA酶抑制劑(40U/pl)1^1，牛血清蛋白(10mg/ml)0.5^1，標準品或待測的單細胞樣品均為5pl，無RNase的滅菌雙蒸水13pl組成。螢光探針5'端標記的螢光報告基團是FAM，3'端標記螢光淬滅基團TAMRA。其次是反應條件如下cDNA合成50°C30minPCR:95。C5min94°C30s，60°C90s}45cycles在每個循環第二步結束時進行螢光檢測(即6(TC90s後採集螢光信號)。對口蹄疫病毒的定量可通過與標準品的循環域值(Ct，ThresholdCycle)相比較以標準曲線計算出待測樣品的起始拷貝數。第三是細胞總RNA的提取，將感染FMDV1836h後的BHK-21細胞離心收集起來，加入裂解液(Trizol，購自Invi加gen)400pl充分混勻，室溫(20-25。C以下相同)靜置10min，加80pl氯仿，室溫靜置3min，於4。C12000g/min離心15min，上清液轉移到另一個離心管中，力B200nl異丙醇，室溫沉澱10min，4'C12000g/min離心10min，棄上清，力卩lml75X乙醇充分洗滌沉澱，於4。C7500g/min離心5min，棄上清，沉澱RNA並在室溫下自然乾燥，加無RNase水10[il於6(TC10min溶解，置-7(TC保存。該RNA作為單細胞螢光定量PCR的陽性對照。第四是取48個不同稀釋度的標準品，12個第三步所提的RNA作為陽性對照，若干個單細胞樣品，24個陰性對照按照第一步所列出的配製反應液，而後進行螢光定量PCR反應。採用單細胞實時螢光定量方法檢測，可以獲得有關病毒感染與複製的數據並解釋說明其中一部分現象，例如在病毒感染過程中是否每個細胞都被感染上了(即檢測為陽性的細胞)；在病毒感染過程中每個細胞中所攜帶的病毒量是否相同或差異顯著；細胞中攜帶的病毒量是否存在極限等等。這些直觀的數據進一步揭示病毒與宿主細胞的關係以及病毒感染機制等。在本發明的一個具體方案中，配套使用拉針器與磨針儀製備分離單細胞所需的精細細胞挑針，所述的細胞挑針用拉針器和磨針儀製作的步驟是將無芯的外徑為1.0mm的玻璃管置於拉針器的中間部，溫度調至6064'C，使用一步法加熱(旋鈕調至"一步法"鍵)，打開開始鍵，由於重力作用，可使加熱的吸管拉長變細成兩根吸管，即製成粗細胞吸管；粗細胞挑針經磨針儀打磨至尖端部直徑略大於細胞直徑(20~100nm)，即製成分離單細胞所需的精細細胞挑針。在本發明的一個具體方案中，採用與顯微注射儀連接的顯微操縱儀半手動進行單細胞分離工作，整個分離過程都是在顯微鏡視野下觀測完成的，以避免分離單細胞不成功或分離出多於一個細胞等類似情況的出現，準確而快速地分離所需細胞，挑取出的單個細胞直接轉入裝有細胞儲液的PCR管中，半個小時內完成單細胞的裂解。在本發明的一個具體方案中，細胞儲液選用0.9。/。NaCl(加入2U/ialRNase抑制劑)，0.9%NaCl(與水相比較)可增加細胞的滲透壓便於在熱變性的過程中細胞膜破裂完全，加入RNase抑制劑抑制RNase的活性，儘可能減少在分離和預處理過程中RNA的降解。在本發明的一個具體方案中，採用直接裂解法，熱變性使細胞膜破裂蛋白質變性，再用蛋白酶消化除去蛋白對逆轉錄反應的影響，避免加入任何的化學試劑(如裂解液、鹼等)裂解細胞以增加反應步驟和汙染、降解RNA的機率。在本發明的一個具體方案中，採用94°C~98°C熱變性28min熱變性使宿主細胞膜破裂，釋放出其內含物，隨後立即浸入液氮中降低RNA降解的可能性，最後選用蛋白酶K在53°。消化蛋白40或44或48或53或57或62或67或71或75min以避免病毒衣殼蛋白和細胞蛋白對逆轉錄的影響。在本發明的一個優選方案中，採用一步法螢光定量RT-PCR，即在cDNA合成和擴增之間不需要打開管蓋使反應一步完成，對於處理大量單細胞樣品而言，一歩法省時且易於操縱，更可減少加樣誤差和交叉汙染；螢光定量反應的引物序列分別為正義引物(FP)5，-GAACACATTCTTTACACCAGGAT-3'，反義引物(RT)5'-CATATCTTTGCCAATCAACATCAG-3'，擴增子大小為121bp，螢光探針序列為5，FAM-ACAACCTACCGCCGAGCCAATTC-TAMRA-3，。在本發明的一個優選方案中，標準陽性RNA模板由含有插入目的片段的pGEM-Teasy(購自PROMEGA公司)載體體外轉錄製備，轉錄後RNA於紫外分光光度計測A26o定量並10倍梯度稀釋。檢測所用的標準品製備過程如下PCR產物電泳後切下含有目的片段的凝膠，用Omega公司的凝膠回收試劑盒回收純化，與pGEM-Teasy載體4'C過夜連接，轉化感受態細胞，轉化產物塗平板培養，挑取白斑PCR鑑定陽性後送博亞生物工程有限公司測序，根據測序結果將篩選的陽性克隆菌接種到含氨苄青黴素的LB培養基培養過夜，用Omega公司的質粒提取試劑盒製備質粒DNA，Qiagen公司的純化試劑盒純化後，NcoI酶切後，並利用SP6啟動子(根據測序結果)體外轉錄製備RNA模板，乙醇沉澱純化後於紫外分光光度計測A26o定量，並稀釋至梯度10^10i拷貝/1(^1，-7(TC保存，轉錄所用一切物品均需無RNA酶處理。在本發明的一個具體方案中，螢光定量反應液由2Xbuffer溶液25pl，25nmol/LiH義(FP)、反義(RT)引物各2nl，25pmol/L螢光探針0.5^1,反轉錄和熱啟動TaqDNA聚合酶lnl，RNA酶抑制劑lpl，牛血清蛋白(10mg/ml)0.5pl，無RNA酶的滅菌雙蒸水13pl組成。其中螢光探針5'端標記的螢光報告基團是FAM，3'端標記以螢光淬滅基團TAMRA。在本發明提供的製作精細細胞挑針的方法中，針對顯微注射儀和BHK-21細胞的特點進行了一系列的優化，反覆實驗，以及與傳統的製作玻璃管的方法相比較，建立了一套製作精細細胞挑針的方法。具體如下外徑1.0mm的無芯管與顯微操縱儀相配套，採用半自動的拉針器代替手動拉制毛細管，選用6064'C的加熱溫度恰好能拉斷玻璃管又不至於使玻璃管前端部過短，製作出均勻細長並有一定彎度的吸管，再經磨針儀微微打磨成直徑略大於細胞直徑的精細細胞挑針。與傳統的酒精噴燈手動拉制相比，拉針器半自動製作能更快更均一地拉製品質等同的毛細管，避免出現毛細管拉不斷，溫度不均一造成毛細管使用不便等情況。此外，拉針器還具有操作簡便，易上手等特點，便於使用。在本發明提供的分離單細胞的方法中，基於現有的一些分離方法的比較和優化，採用與顯微注射儀連接的顯微操縱儀半手動分離單細胞，使用顯微注射儀平衡壓的功能，利用微毛細管內的壓差吸入或排出液體從而實現分離單個細胞的目的。本發明提供的檢測口蹄疫病毒基因組RNA的單細胞螢光定量RT-PCR的方法是首次將單細胞螢光定量PCR技術與檢測病毒基因組RNA相結合，將在單細胞水平上研究病毒的複製及其與宿主細胞的關係變為可能，為病毒基因組複製、轉錄的研究提供了一種新的手段，並進一步完善了病毒學研究的方法。與現有一些單細胞分離處理技術和螢光定量PCR相比具有以下的優點和效果1.與現有的一些分離單細胞的方法(流式細胞儀分選，膜片鉗技術等)相比，本發明中提供的顯微操縱儀分離法具有可視化操作、快速、高效、適用性廣等特點，分離後即轉入細胞儲液當中進行預處理，大大減少操作步驟，最大限度地維持細胞原狀(減少細胞核酸降解)使得定量結果更為準確可靠。2.與現有的一些細胞裂解法(鹼裂解法、反覆凍融法、加入裂解試劑法等)相比，本發明中提供的細胞裂解法具有操作步驟少而簡單、無須加入額外試劑或需中和裂解等優點，並且經實驗證實裂解過程既不會造成RNA降解又能使細胞完全裂解致RNA釋放。3.與兩步法螢光定量RT-PCR相比，本實驗採用的一步法擴增，在處理大量重複樣品時易於操作，在cDNA合成和擴增之間不需要打開管蓋，因而有助於減少交叉汙染、加樣誤差和小量樣品的損失，便於進行單細胞水平的樣品檢測與定量。靈敏度高，最低可檢測至10copies，檢測範圍更可以達到九個數量級，是很多其他的定量方法所不能比擬的。圖l螢光定量RT-PCR反應所獲得的標準曲線，表明該定量檢測的範圍為101109，且線性非常好。線性方程為copynumber=10(—，CT+11629)，其斜率為-3.497，112值為0.9999。圖2單細胞常規RT-PCR的凝膠電泳圖。(具體說明見實例3)M，Marker,泳道14為一個單細胞樣品的不同稀釋度結果；泳道l:五分之一的細胞量；泳道2為五十分之一的細胞量；泳道3為五百分之一的細胞量；泳道4為五千分之一的細胞量，泳道5為陰性對照。具體實施例方式下面結合附圖對本發明作進一步闡述。應當理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明要求保護的範圍，下列實施例中未註明具體實驗條件和方法，通常按照常規條件如J.薩姆布魯克等主編，科學出版社，2002，分子克隆實驗指南(第三版)；D丄.斯佩克特等主編，科學出版社，2001，細胞實驗指南；F.M.奧斯伯等主編，科學出版社，2005，精編分子生物學實驗指南，或按照製造廠商建議的條件。實施例l單細胞螢光定量RT-PCR檢測急性感染細胞中口蹄疫病毒基因組RNA的拷貝數一、實驗試劑與儀器A)試劑a)胰酶、MEM培養基、胎牛血清(均購自Invitrogen公司)b)細胞儲液每管含有5~10pl0.9%NaCl，分裝於PCR管中c)液氮d)蛋白酶K和RNase抑制劑(分別購自Amesco和TAKARA公司)e)—步法反應試劑盒(包括反轉錄酶和熱啟動TaqDNA聚合酶以及buffer)、牛血清蛋白、RNase抑制劑、無RNase的水。前兩者購自Invitrogen公司，後兩者購自TAKARA公司。f)RT、FP引物，探針(Invitrogen公司合成)g)Trizol細胞裂解液(購自Invitrogen公司)B)儀器a)顯微注射儀(購自Narashige公司)b)螢光定量PCR儀(購自Eppendorf公司)c)PCR儀(購自Biometra公司)d)冷凍離心機(購自Eppendorf公司)二、具體實施步驟如下A)單細胞的分離與裂解a)病毒感染用50100PFU(PFU:蝕斑形成單位)滴度的口蹄疫病毒感染單層BHK-21細胞，約18或20或24或26或29或32或34或36h後，用胰酶將細胞消化下來，加入IO倍於胰酶量的新鮮MEM生長培養基滅活胰酶，調整細胞量至約104106個/1111。最後，取lml至直徑6cm的培養皿中(市售)，即可進行單細胞分離。b)分離單細胞將精細細胞挑針與顯微操縱儀的右導管相連，調節顯微注射儀的平衡(balance)旋鈕使提供的平衡壓減小(即表現為毛細管向內吸液)，再將挑針前端伸入培養皿中至液面下，用操作儀控制，在顯微鏡下挑取單個細胞。挑起一個單細胞後，將帶有單細胞的挑針提起伸入PCR管液面下，增大平衡壓，將細胞送入PCR管內的細胞儲液中。c)細胞裂解每30或34或38或42或47或50或53或57或60min處理一批單細胞樣品，以在裂解細胞前最大限度維持細胞原狀。單細胞樣品於94'C98'C熱變性2或4或6或8min後，迅速浸入液氮中，用lpg的蛋白酶K(加入2U4aRNase抑制劑)於53。C消化40或45或49或54或58或63或68或72或75min以避免病毒衣殼蛋白和細胞蛋白對逆轉錄的影響，蛋白酶解後立刻凍入液氮中直至進行螢光定量RT-PCR反應。B)螢光定量RT-PCR首先是一步法螢光定量反應液(反應總體積是50nl):2Xbuffer25^1，正義引物FP和反義引物RT各2pl(25pmol/L)，25^imol/L的螢光探針0.5pl，反轉錄和熱啟動TaqDNA聚合酶lpl,RNA酶抑制劑(40U爾l)lpl，牛血清蛋白(10mg/ml)0.5^1，標準品或待測的單細胞樣品均為5pl，無RNase的滅菌雙蒸水13pl組成。螢光探針5'端標記的螢光報告基團是FAM，3'端標記螢光淬滅基團TAMRA。其次是反應條件如下cDNA合成50°C30minPCR:95。C5min94°C30s，60°C90s}45cycles在每個循環第二步結束時進行螢光檢測(即60'C90s後採集螢光信號)。對口蹄疫病毒的定量可通過與標準品的循環域值(Ct，ThresholdCycle)相比較，並根據標準曲線計算出待測樣品的起始拷貝數。第三是細胞總RNA的提取將感染FMDV18或21或25或28或32或34或36h後的BHK-21細胞離心收集起來，加入裂解液(Trizol，購自Invitrogen)400pl充分混勻，室溫靜置10min，加80pl氯仿，室溫靜置3min，於4。C12000g/min離心15min，上清液轉移到另一個離心管，力B200(il異丙醇，室溫沉澱10min，4'C12000g/min離心10min，棄上清，力口lml75X乙醇充分洗滌沉澱，於4。C7500g/min離心5min，棄上清，沉澱RNA並在室溫下自然乾燥，加無RNase水10^於6(TC10min溶解，即放入-70°C保存。將該RNA作為單細胞螢光定量PCR的陽性對照。第四是取4個不同稀釋度的標準品，一個第三步所提的RNA作為陽性對照，48個單細胞樣品，2個水作為陰性對照按照第一步所列出的配製反應液，而後進行螢光定量PCR反應。反應結果如下表:tableseeoriginaldocumentpage13tableseeoriginaldocumentpage14tableseeoriginaldocumentpage15以上結果表明在口蹄疫病毒急性感染過程中，並不是每個細胞都被病毒感染(即檢測結果為陽性細胞)，細胞的陽性率為83.33%，且細胞中的病毒RNA拷貝數差異較大(從十幾到幾十萬拷貝數不等)。該實例很好的證實了單細胞螢光定量RT-PCR可以成功地應用於檢測細胞內病毒量，且靈敏度可檢測1Ocopies。注螢光定量RT-PCR在10、10^/r有極好的線性關係，R2=0.9998，其檢測範圍可以達到九個數量級，靈敏度可檢測至10copies，且重複性很好。實施例2單細胞螢光定量RT-PCR檢測持續性感染細胞中口蹄疫病毒基因組RNA的拷貝數一、材料A)持續性感染口蹄疫病毒的BHK-21細胞的獲得用弱鹼法建立持續性感染細胞(口蹄疫病毒持續性感染細胞系的快速選擇及其特性研究顧潮江，中國病毒學，第18巻第5期2003)。B)試劑與儀器a)胰酶、MEM培養基、胎牛血清(均購自Invitrogen公司)b)細胞儲液每管裝有510i^l0.9y。NaCl，分裝於PCR管中c)液氮d)蛋白酶K和RNase抑制劑(分別購自Amesco和TAKARA公司)e)—步法反應試劑盒(包括反轉錄酶和熱啟動TaqDNA聚合酶以及buffer)、牛血清蛋白、RNase抑制劑、無RNase的水。前兩者購自Invitrogen公司，後兩者購自TAKARA公司。f)RT、FP引物，探針(Invitrogen公司合成)g)Trizol細胞裂解液(購自Invitrogen公司)h)顯微注射儀(購自Narashige公司)i)螢光定量PCR儀(購自Eppendorf公司)j)PCR儀(購自Biometra公司)k)冷凍離心機(購自Eppendorf公司)二、實驗方法及具體步驟A)單細胞的分離與裂解持感細胞傳代至第25代，加入胰酶消化3或4或5或6min，再加入610倍於胰酶量的新鮮MEM生長培養基滅活胰酶，調整細胞濃度至約104106個/1111。取lml至直徑6cm的培養皿中，立刻進行單細胞分離。將細胞挑針與顯微操縱儀的右導管相連，調節顯微注射儀的平衡(balance)旋鈕使平衡壓減小(即表現為毛細管向內吸液)，再將挑針前端伸入培養皿中至液面下，用操作儀控制，在顯微鏡下進行單細胞分離。挑起一個單細胞後，將挑針提起伸入PCR管液面中，增大平衡壓，將細胞轉入PCR管內的細胞儲液中。每30或32或37或41或45或49或52或56或60min處理一批單細胞樣品，以在裂解細胞前最大限度維持細胞原狀。單細胞樣品於94'C98'C熱變性2或4或6或8min後，迅速浸入液氮中，用lpg的蛋白酶K(加入2U爾1RNase抑制劑)於53'C消化40或44或48或53或57或62或67或71或75min以避免病毒衣殼蛋白和細胞蛋白對逆轉錄的影響，蛋白酶解後立刻凍入液氮中直至進行後續螢光定量RT-PCR反應。B)螢光定量RT-PCR首先是一步法螢光定量反應液(反應總體積是50pl):2Xbuffer25ul，正義引物FP和反義引物RT各2ul(25umol/L)，25umol/L的螢光探針0.5ul，反轉錄和熱啟動TaqDNA聚合酶lul，RNA酶抑制劑(40U4d)1ul，牛血清蛋白(10mg/ml)0.5ul，標準品或待測的單細胞樣品均為5ul，無RNase的滅菌雙蒸水13ul組成。螢光探針5'端標記的螢光報告基團是FAM,3'端標記螢光淬滅基團TAMRA。其次是反應條件如下cDNA合成50°C30minPCR:95°C5min94°C30s，60°C90s》45cycles在每個循環第二步結束時進行螢光檢測(即60'C90s後採集螢光信號)。對口蹄疫病毒的定量可通過與標準品的循環域值(Ct，ThresholdCycle)相比較，並根據標準曲線計算出待測樣品的起始拷貝數。第三是細胞總RNA的提取將25代的持感細胞離心收集起來，加入裂解液(Trizol，購自Invitrogen)400(xl充分混勻，室溫靜置10min，加80nl氯仿，室溫靜置3min，於4。C12000g/min離心15min,上清液轉移到另一個離心管，力卩200pl異丙醇，室溫沉澱10min，4。C12000g/min離心10min，棄上清，力Blml75%乙醇充分洗滌沉澱，於4。C7500g/min離心5min,棄上清，沉澱RNA並在室溫下自然乾燥，加無RNase水10pl於60。C10min溶解RNA，即放入-70。C保存。將此RNA作為單細胞螢光定量RT-PCR的陽性對照。第四是取4個不同稀釋度的標準品，一個第三步所提的RNA作為陽性對照，26個單細胞樣品，2個水作為陰性對照按照第一步所列出的配製反應液，而後進行螢光定量PCR反應。反應結果如下:tableseeoriginaldocumentpage17以上數據表明持續感染細胞中所攜帶的病毒量大大低於急性感染細胞中的病毒量，這也許是病毒能與細胞共存的原因。該實例證明了單細胞螢光定量PCR技術可以被應用於檢測少量目的片段，具備了很高的靈敏度，並且便於操作。注螢光定量RT-PCR在10、10k/r有極好的線性關係，R2=0.9999，其檢測範圍可以達到九個數量級，靈敏度可檢測至10copies,且重複性很好。其它實施步驟與實施例l相同。實施例3分離與裂解單細胞技術在單細胞RT-PCR中的應用一、試劑與儀器a)胰酶、MEM培養基、胎牛血清(均購自Invitrogen公司)b)細胞儲液每管裝有510nl0.9n/。NaCl，分裝於PCR管中c)液氮d)蛋白酶K和RNase抑制劑(分別購自Amesco和TAKARA公司)e)RT反應液M-MLV反轉錄酶、5X緩衝液、dNTP、RNase抑制劑。前兩者購自Promega公司，後兩者購自TAKARA公司。f)PCR反應液PremixTaq酶，無菌水。購自TAKARA公司。g)RT、FP引物(Invitrogen公司合成)h)顯微注射儀(購自Narashige公司)i)PCR儀(購自Biometra公司)二、實驗方法及具體步驟A)單細胞的分離與裂解將培養在T-25瓶中的BHK-21細胞消化下來，即加入胰酶消化3或4或5或6min，再加入610倍於胰酶量的新鮮MEM生長培養基滅活胰酶，調整細胞濃度至約10"10MVml。最後，取lml至直徑6cm的培養皿中，立刻進行單細胞分離。將細胞挑針與顯微操縱儀的右導管相連，調節顯微注射儀的平衡(balance)旋鈕使平衡壓減小(即表現為毛細管向內吸液)，再將挑針前端伸入培養皿液面下，用操作儀控制，在顯微鏡下進行單細胞分離。挑起一個單細胞後，將挑針提起伸入PCR管液面中，增大平衡壓，細胞轉入PCR管內的細胞儲液中。每30或33或37或41或46或49或52或56或60min處理一批單細胞樣品，以在裂解細胞前最大限度維持細胞原狀。單細胞樣品於94'C98'C熱變性28min後，迅速浸入液氮中，用1嗎的蛋白酶K(加入2U/nlRNase抑制劑)於53T:消化40或44或48或53或57或62或67或71或75min以避免病毒衣殼蛋白和細胞蛋白對逆轉錄的影響，蛋白酶解後立刻凍入液氮中直至進行RT-PCR反應。B)常規RT-PCR將單細胞的分離與裂解技術應用於常規RT-PCR，該反應的耙基因為持家基因甘油醛-3-磷酸脫氫酶(英文簡稱GAPDH)的mRNA，引物序列為正義引物是5'-TGGCAAGTTCAAAGGCACA-3，，反義引物是5，-AGATCCACGACGGACACG-3，，擴增子大小為576bp。反應為兩步法，第一步是反轉錄反轉錄反應液包括5Xbuffer5^1，反義引物RTl[il(25拜ol/L)，反轉錄酶lpl，RNA酶抑制劑(40，)ljil，10mMdNTP1^1，待測的單細胞樣品為lnl，無RNase的滅菌雙蒸水15pl組成。反轉錄的條件如下42'C溫育反應50min，98'C滅活反轉錄酶1530min。第二步是PCR，PCR的反應體系為50W由2Xbuffer25W，正義引物FP和反義引物RT各lpl(25pmol/L)，反轉錄產物2pl，無菌水21pl組成。PCR條件如下95。C2min95°C40s，55°C30s^45cycles72。C2min_J72°ClOtnin將A)中分離裂解的單細胞樣品進行10倍稀釋(從2xl0"至2x10—4)共四個樣品，將水作為陰性對照，進行RT-PCR，反應結果如附圖2。其它實施步驟與實施例l相同。以上結果表明單細胞RT-PCR反應的靈敏度高達五百分之一的細胞量，也就是說能完全應用於檢測一個細胞基因組中的mRNA。同時，也證實了單細胞分離與裂解技術成功應用於正常BHK-21細胞中mRNA的定性檢測。權利要求1、一種檢測口蹄疫病毒基因組RNA的單細胞實時螢光定量RT-PCR方法，其步驟是A、單細胞的分離與裂解a、病毒感染用50～100PFU滴度的口蹄疫病毒感染單層BHK-21細胞，18～36h後，用胰酶將細胞消化，加入6～10倍於胰酶量的新鮮MEM生長培養基滅活胰酶，分散細胞，調整細胞濃度至104～106個/ml，最後，取1ml細胞懸液於直徑6cm的無菌培養皿中，進行單細胞分離；b、分離單細胞分離單細胞採用a)拉針器，b)磨針儀，c)顯微注射儀，d)細胞儲液，用拉針器和磨針儀製作細胞挑針，通過與顯微注射儀連接的倒置顯微鏡直接觀察待分離的細胞並能隨時監控整個分離挑取單細胞的過程，用細胞挑針挑起單細胞後，直接提起伸入PCR管液面下，完成將單細胞送入PCR管內的細胞儲液全過程；c、細胞裂解每30～60min處理單細胞樣品，單細胞樣品於94℃～98℃熱變性2～8min後，浸入液氮中，用蛋白酶K於53℃酶解40-75min，隨後凍入液氮中直至進行螢光定量RT-PCR反應；B、螢光定量RT-PCR一步法螢光定量反應液，反應總體積是50μl，2×buffer25μl，正義引物FP和反義引物RT各2μl，25μmol/L的螢光探針0.5μl，反轉錄和熱啟動TaqDNA聚合酶1μl，RNA酶抑制劑1μl，牛血清蛋白0.5μl，標準品或待測的單細胞樣品5μl，無RNase的滅菌雙蒸水13μl組成，螢光探針5』端標記的螢光報告基團是FAM，3』端標記螢光淬滅基團TAMRA；反應條件如下cDNA合成50℃30minPCR95℃5min細胞總RNA的提取，將感染口蹄疫病毒18～36h後的BHK-21細胞離心收集，加入裂解液400μl混勻，室溫靜置10min，加80μl氯仿，室溫靜置3min，於4℃12000g/min離心15min，上清液轉移到另一個離心管內，加200μl異丙醇，室溫沉澱10min，4℃12000g/min離心10min，棄上清，加1ml75％乙醇充分洗滌沉澱，於4℃7500g/min離心5min，棄上清，沉澱RNA並在室溫下自然乾燥，加無RNase水10μl於60℃10min溶解，放入-70℃保存；取4～8個不同稀釋度的標準品，1～2個細胞總RNA作為陽性對照，2～4個陰性對照按照前面所列出的配製反應液，進行螢光定量PCR反應。2、根據權利要求1所述的一種檢測口蹄疫病毒基因組RNA的單細胞實時螢光定量RT-PCR方法，其特徵是所述的正義引物5'-GAACACATTCTTTACACCAGGAT-3，，反義引物5'-CATATCTTTGCCAATCAACATCAG-3'，擴增子大小為121bp，螢光探針序列為5，FAM-ACAACCTACCGCCGAGCCAATTC-TAMRA-3，，探針的5'端標記螢光發射基團FAM，靠近3'端標以螢光淬滅基團TAMRA，標準陽性RNA模板由己插入口蹄疫病毒基因組3D區121bp基因片段的pGEM-T載體轉化大腸桿菌DH5ct，增殖後提取質粒進行體外轉錄製備RNA，並於紫外分光光度計測A260值定量並10倍梯度稀釋。3、根據權利要求1所述的一種檢測口蹄疫病毒基因組RNA的單細胞實時螢光定量RT-PCR方法，其特徵是所述的細胞挑針用拉針器和磨針儀製作的步驟是將無芯的外徑為1.0mm的玻璃管置於拉針器的中間部，溫度調至6064'C，使用一步法加熱，打開開始鍵，重力作用，使加熱的玻璃管拉長成兩根均勻細長吸管，即製成粗細胞挑針；粗細胞挑針經磨針儀打磨呈彎度且尖端部直徑大於細胞直徑20100pm。全文摘要本發明公開了一種檢測口蹄疫病毒基因組RNA的單細胞實時螢光定量RT-PCR方法。該方法利用顯微注射儀分離感染口蹄疫病毒的單個細胞，裂解後即用螢光定量RT-PCR進行定量分析。顯微注射儀的可視化操作能快速準確地分離單個細胞，與高靈敏度的螢光定量RT-PCR相結合可實現檢測單個細胞內病毒基因組RNA的量。該方法可用於在單細胞水平上研究病毒的複製及其與宿主細胞的關係，為病毒感染細胞生物學的深入研究提供一種新的方法。且分離與裂解細胞的技術具有廣泛適用性，可直接應用於其它種類病毒感染的細胞或正常細胞的分離預處理，使得本發明的方法也能用於其它RNA病毒基因組檢測和正常細胞基因組複製及轉錄的分子機制研究。文檔編號C12Q1/70GK101386893SQ20081019741公開日2009年3月18日申請日期2008年10月28日優先權日2008年10月28日發明者屈三甫,勇李,鄭從義,璇黃申請人:武漢大學