表達重組dsbc並具有降低的tsp活性的細菌宿主菌株的製作方法

2023-10-05 12:35:54 6

表達重組dsbc並具有降低的tsp活性的細菌宿主菌株的製作方法
【專利摘要】本發明提供一種重組革蘭氏陰性細菌細胞，細胞特徵在於：a.包含編碼DsbC的重組多核苷酸；以及b.與野生型細胞相比其具有降低的Tsp蛋白質活性。
【專利說明】表達重組DSBC並具有降低的TSP活性的細菌宿主菌株
[0001] 本申請是申請日為2011年1月13日、申請號為201180005978. 1、發明名稱為"表 達重組DSBC並具有降低的TSP活性的細菌宿主菌株"的發明專利申請的分案申請。
[0002] 本本發明涉及重組細菌宿主菌株，特別是大腸桿菌（E.Coli)。本發明還涉及在此 細胞中產生目的蛋白質的方法。
[0003] 發明背景
[0004] 通常將細菌細胞，如大腸桿菌，用於生產重組蛋白質。使用細菌細胞如大腸桿菌生 產重組蛋白質有很多優勢，具體而言是因為細菌細胞作為宿主細胞可以使得基因通過質粒 插入而具有多樣的屬性。大腸桿菌已經用於很多重組蛋白質的生產，包括人胰島素。
[0005] 儘管使用細菌細胞產生重組蛋白質有很多優勢，但是仍然有顯著的局限性，包括 難以生產蛋白酶敏感型蛋白質。蛋白酶在大腸桿菌細胞周質和細胞質中轉換老舊、損壞或 摺疊錯誤的蛋白質上起到重要作用。細菌蛋白酶起降解目的重組蛋白質的作用，因此常常 顯著降低活性蛋白質的產量。
[0006] 已經鑑定出大量的細菌蛋白酶。大腸桿菌中的蛋白酶包括蛋白酶III(ptr)、DegP、 OmpT、Tsp、prlC、ptrA、ptrB、pepA-T、tsh、espc、eatA、clpP和lon〇
[0007]Tsp(也稱為Prc)為一種60kDa的細胞周質蛋白酶。第一個已知的Tsp底物 為青黴素結合蛋白質 _3(PBP3)(Determinationofthecleavagesiteinvolvedin C-terminalprocessingofpenicillin-bindingprotein3ofEscherichiacoli； NagasawaH,SakagamiY,SuzukiA,SuzukiH,HaraH,HirotaY.JBacteriol. 1989Nov； 171 (11):5890-3 和Cloning,mappingandcharacterizationoftheEscherichiacoli TspgenewhichisinvolvedinC-terminalprocessingofpenicillin-binding protein3；HaraH,YamamotoY,HigashitaniA,SuzukiH,NishimuraY.J Bacteriol. 1991Aug;173 (15) :4799-813)，但後來發現Tsp還能夠裂解噬菌體尾巴蛋白 質，因此將其改名為尾特異性蛋白酶（TailSpecificProtease,Tsp) (5;[]^61'等人，？1'〇(3. Natl.Acad.Sci.USA, 89:295-299(1992))。Silber等人（Deletionoftheprc(tsp) geneprovidesevidenceforadditionaltail-specificproteolyticactivityin EscherichiacoliK-12;Silber，K.R.，Sauer,R.T.;MolGenGenet1994242:237-240)描 述了一種prc刪除菌株（KS1000)，其中的突變是通過將包含Kanr標記物的片段取代prc基 因的片段而形成的。
[0008]Tsp(prC)活性降低對降低目的蛋白的蛋白水解是可取的。然而，發現 缺少蛋白酶prc的細胞在低滲透壓下顯示出熱敏感生長概況。Hara等人分離了 含有基因外抑制子（spr)突變的耐熱性回復突變株（Hara等人，MicrobialDrug Resistance, 2:63-72(1996))。spr為18kDa的膜結合細胞周質蛋白酶，spr的底物為Tsp 以及外膜中參與細胞分裂中細胞壁水解的肽聚糖。spr基因標記為UniProtKB/Swiss-Prot P0AFV4(SPR_EC0LI) 〇
[0009] 包含有突變spr基因的蛋白酶缺陷菌株已有描述。Chenetal(ChenC,Snedecor B,NishiharaJC,JolyJC,McFarlandN,AndersenDC,BattersbyJE,Champion KM.BiotechnolBioeng. 2004Mar5 ;85 (5) :463-74)描述了攜帶prc(Tsp)及另一種蛋白酶DegP的不同突變組合的大腸桿菌菌株的構建，是通過擴增基因上遊及下遊區域並將其一起 連接於包含選擇性標記物及sprW174R突變的載體上而產生的（重組抗體片段在大腸埃希 式桿菌的細胞周質中高水平積累需要三重突變體（ADegPAprcSprW174R)宿主菌株。發現 ADegP、Aprc和sprW174R突變的組合提供最高水平的抗體輕鏈、抗體重鏈及F(ab'）2-LZ。 EP1341899公開了在編碼蛋白酶DegP和Prc的染色體DegP和prc分別有缺陷的大腸桿菌 菌株，此菌株還具有突變spr基因，其編碼的蛋白質抑制了包含prc突變體的菌株表現出的 生長表型。
[0010] 蛋白質-硫鍵異構酶為在蛋白質折置時，"[隹化其中半胱；氣fe殘基見-硫鍵形成和 斷裂的酶。已知其與催化二硫鍵形成的蛋白質共表達而改善宿主細胞中的蛋白質表達。 W098/56930公開了一種在細菌中產生含二硫鍵的異源多肽的方法，其中原核二硫鍵異構酶 如DsbC或DsbG與真核多肽共表達。US6673569公開了包含編碼DsbA、DsbB、DsbC和DsbD 中每種的多肽的人工操縱子，用於產生外源蛋白質。EP0786009公開了用於在細菌中生產異 源多肽的過程，其中在誘導編碼異源多肽的核酸表達之前誘導編碼DsbA或DsbC的核酸表 達。
[0011]DsbC是一種發現於大腸桿菌細胞周質中的原核蛋白質，其催化大腸桿菌中二硫 鍵的形成。DsbC的胺基酸序列長度為236(包括信號肽），分子量為25.6KDa(UniProt No.POAEGGhDsbC於 1994年首次發現（Missiakas等人TheEscherichiacolidsbC(xprA) geneencodesaperiplasmicproteininvolvedindisulfidebondformation,TheEMB0 Journalvol13,no8,p2013-2020, 1994 以及Shevchik等人CharacterizationofDsbC,a periplasmicproteinofErwiniachrysanthemiandEscherichiacoliwithdisulfide isomeraseactivity,TheEMB0Jounralvol13,no8,p2007-2012, 1994)〇
[0012] 出乎意料地發現在革蘭氏陰性細菌細胞中由重組DsbC過表達DsbC改善了缺乏蛋 白酶Tsp的細胞的細胞裂解表型。因此，本發明提供了新菌株，其具有用於產生目的蛋白質 的優勢特性。
[0013] 發明概述
[0014] 本發明提供了重組革蘭氏陰性細菌細胞，細胞的特徵在於：
[0015]a)包含編碼DsbC的重組多核苷酸；以及
[0016]b)與野生型細胞相比，具有降低的Tsp蛋白質活性。
[0017] 在一個實施方式中，細胞包含野生型spr基因。在此實施方式中，優選地，除了降 低Tsp蛋白質活性所需的修飾之外，細胞基因組與野生型細菌細胞是同基因的。
[0018] 在一個進一步的實施方式中，根據本發明的細胞與野生型細胞相比具有降低的 Tsp蛋白質活性，並包含編碼DsbC的重組多核苷酸以及突變spr基因。在此實施方式中，優 選地，除了突變spr基因以及相比野生型細胞降低Tsp蛋白質活性所需的修飾之外，細胞基 因組與野生型細菌細胞是同基因的。
[0019] 具有上述特定遺傳修飾特定組合的革蘭氏陰性細菌細胞顯示出優勢的生長以及 蛋白質生產表型。
[0020] 本發明還提供了用於生產目的蛋白質的方法，包括在如上文限定的重組革蘭氏陰 性細菌細胞中表達目的蛋白質。所述方法包括在能夠有效表達目的蛋白質及編碼DsbC的 重組多核苷酸的條件下，在培養基中培養如上文限定的重組革蘭氏陰性細菌細胞；以及從 重組革蘭氏陰性細菌細胞的細胞周質和/或培養基中回收目的蛋白質。
[0021] 附圖簡述
[0022] 圖1顯示了表達抗-TNFFab'的菌株MXE001、MXE008以及表達抗-TNFaFab'和 重組DsbC的菌株MXE001和MXE008的生長概況。
[0023] 圖2顯示了表達抗-TNFFab'和重組DsbC的大腸桿菌菌株MXE001、MXE008和 MXE009的細胞周質（陰影圖標）及上清（空的非陰影圖標）中抗-TNFFab'產量。
[0024] 圖3顯示了表達抗-TNFFab'的大腸桿菌菌株MXE001和MXE008以及表達抗-TNF Fab'和重組DsbC的大腸桿菌菌株MXE001和MXE008的細胞周質（陰影圖標）及上清（空 的非陰影圖標）中抗-TNFFab'產量。
[0025] 圖4顯示表達FabA和FabB的大腸桿菌菌株W3110以及表達FabA和重組DsbC 或FabB和重組DsbC的大腸桿菌菌株MXE008的細胞周質的抗-TNFFab'產量。
[0026] 圖5a顯示了野生型ptr(蛋白酶III)和敲除突變的ptr(蛋白酶III)的蛋白質 及基因序列的5'末端。
[0027] 圖5b顯示了野生型Tsp和敲除突變的Tsp的蛋白質及基因序列的5'末端。
[0028] 圖5c顯示了野生型DegP及突變DegP蛋白質和基因序列的區域。
[0029] 圖6顯示了用於產生根據本發明實施方式的細胞的載體的構建。
[0030] 圖7顯示了表達抗-TNFFab'及重組DsbC的大腸桿菌菌株MXE008的5L和200L 發酵物的生長概況比較。
[0031] 圖8顯示了表達抗-TNFFab'及重組DsbC的大腸桿菌菌株MXE008哦5L和200L 發酵物的Fab'滴度比較。
[0032] 圖9顯示了表達抗-TNFFab'及重組DsbC的大腸桿菌菌株MXE008和MXE009的 發酵物的生長概況的比較。
[0033] 圖10顯示了表達抗-TNFFab'及重組DsbC的大腸桿菌菌株MXE008和MXE009的 發酵物的Fab'滴度的比較。
[0034] 序列簡述
[0035]SEQIDNO: 1是野生型Tsp基因的DNA序列，包括起始密碼子上遊的6個核苷酸 ATGAAC。
[0036] SEQIDN0:2是野生型Tsp蛋白質的胺基酸序列。
[0037]SEQIDN0:3是突變的敲除Tsp基因的DNA序列，包括起始密碼子上遊的6個核苷 酸ATGAAT。
[0038]SEQIDN0:4是野生型蛋白酶III基因的DNA序列。
[0039]SEQIDN0:5是野生型蛋白酶III蛋白質的胺基酸序列。
[0040]SEQIDN0:6是突變的敲除蛋白酶III基因的DNA序列
[0041]SEQIDN0:7是野生型DegP基因的DNA序列。
[0042] SEQIDN0:8是野生型DegP蛋白質的胺基酸序列。
[0043]SEQIDN0:9是突變DegP基因的DNA序列。
[0044]SEQIDN0:10是突變DegP蛋白質的胺基酸序列。
[0045]SEQIDN0:11是抗-TNF抗體輕鏈可變區的胺基酸序列。
[0046]SEQIDNO: 12是抗-TNF抗體重鏈可變區的胺基酸序列。
[0047]SEQIDNO: 13是抗-TNF抗體輕鏈的胺基酸序列。
[0048]SEQIDN0:14是抗-TNF抗體重鏈的胺基酸序列。
[0049] 3￡〇10勵:15是用於突變!'鄧基因區域的3'寡核苷酸引物的序列，包含4此1限 制性位點。
[0050] 3￡〇10勵:16是用於突變!'鄧基因區域的5'寡核苷酸引物的序列，包含4此1限 制性位點。
[0051] SEQIDN0:17是用於突變蛋白酶III基因區域的3'寡核苷酸引物的序列，包含 AseI限制性位點。
[0052]SEQIDN0:18是用於突變蛋白酶III基因區域的5'寡核苷酸引物的序列，包含 AseI限制性位點。
[0053] SEQIDN0:19是用於突變DegP基因區域的5'寡核苷酸引物的序列，包含AseI 限制性位點。
[0054] SEQIDN0:20是用於突變DegP基因區域的3'寡核苷酸引物的序列，包含AseI 限制性位點。
[0055] SEQIDN0:21是野生型spr基因的序列，包括信號序列，S卩，前26個胺基酸殘基。
[0056] SEQIDN0:22是野生型的spr基因序列，不包括信號序列。
[0057] SEQIDN0:23是突變OmpT序列的核苷酸序列，包括D210A和H212A突變。
[0058] SEQIDN0:24是突變OmpT序列的胺基酸序列，包括D210A和H212A突變。
[0059]SEQIDN0:25是突變敲除OmpT序列的核苷酸序列。
[0060]SEQIDN0:26是帶his標籤的DsbC的核苷酸序列。
[0061]SEQIDN0:27是帶his標籤的DsbC的胺基酸序列。
[0062]SEQIDN0:28 顯示了hTNF40 的CDRH1 胺基酸序列。
[0063]SEQIDN0:29顯示了hTNF40的CDRH2的胺基酸序列，其為雜合CDR，其中C-端六 個胺基酸來自人亞群3種系抗體（humansubgroup3)的H2⑶R序列，且由此雜合產生的序 列中胺基酸變化由下劃線標出，如下：WINITIGEPIYAD^XKG。
[0064]SEQIDN0:30 顯示了 hTNF40 的CDRH3 胺基酸序列。
[0065]SEQIDN0:31 顯示了 hTNF40 的CDRL1 胺基酸序列。
[0066]SEQIDN0:32 顯示了 hTNF40 的CDRL2 胺基酸序列。
[0067]SEQIDN0:33 顯示了 hTNF40 的CDRL3 胺基酸序列。
[0068] SEQIDN0:34 顯示了 hTNF40 的CDRH2 胺基酸序列。
[0069]SEQIDNO: 35顯示了OmpA寡核苷酸轉接子的序列。
[0070]SEQIDN0:36顯示了編碼用於大腸桿菌Fab表達的基因間序列1(IGS1)的寡核苷 酸盒。
[0071]SEQIDN0:37顯示了編碼用於大腸桿菌Fab表達的基因間序列2 (IGS2)的寡核苷 酸盒。
[0072]SEQIDN0:38顯示了編碼用於大腸桿菌Fab表達的基因間序列3 (IGS3)的寡核苷 酸盒。
[0073]SEQIDN0:39顯示了編碼用於大腸桿菌Fab表達的基因間序列4 (IGS4)的寡核苷 酸盒。
[0074] 本發明優選實施方式詳述
[0075] 現在將以更詳細的方式描述本發明。
[0076]除非上下文另有說明，術語"蛋白質"和"多肽"在本文交換使用。"肽"意欲指代 10或更少的胺基酸。
[0077] 除非上下文另有說明，術語"多核苷酸"包括基因、DNA、cDNA、RNA、mRNA等。
[0078] 如本文所使用的，術語"包含"在本說明書的上下文中應解釋為"包括"。
[0079] 在本發明的上下文中，非突變的細胞或對照細胞指的是與本發明重組革蘭氏陰性 細胞相同類型的細胞，其中所述細胞未修飾以降低Tsp蛋白質活性或攜帶重組DsbC基因和 任選的突變spr基因。例如，非突變細胞可為野生型細胞，並可與本發明細胞進行修飾引入 任何所述突變之前衍生自相同的宿主細胞群體。
[0080] 詞句"細胞"、"細胞系"、"細胞培養物"及"菌株"可交換使用。
[0081] 詞句"包含突變Tsp基因的細胞的表型"在本發明上下文中指的是帶有突變Tsp基 因的細胞表現出的表型。一般地，包含突變Tsp基因的細胞會裂解，尤其是在高細胞密度下 裂解。這些細胞的裂解引起任何重組蛋白質滲漏入上清。攜帶突變Tsp基因的細胞還可以 顯示出低滲透壓下的熱敏型生長。例如，細胞顯示不出生長速率或生長速率降低，或在高溫 (如40°C或更高）下，細胞在低滲培養基中死亡。
[0082]術語"同基因的"在本發明的上下文中指的是與所述細胞來源的野生型細胞相比， 本發明細胞的基因組除了與野生型細胞相比降低Tsp蛋白質活性所需的修飾和任選的突 變spr基因外具有幾乎相同或相同的核算序列。在此實施方式中，細胞基因組不包含其他 非天然發生的或遺傳工程改造的突變。在一個實施方式中，與野生型細胞相比，本發明的細 胞的基因組除了與野生型細胞相比降低Tsp蛋白質活性所需的修飾和任選的突變spr基因 外具有基本上相同或相同的基因組序列。在一個實施方式中，考慮到任何可以天然發生的 突變，根據本發明的細胞與野生型細胞相比除了與野生型細胞相比降低Tsp蛋白質活性所 需的修飾和任選的突變spr基因外有幾乎相同的基因組序列，包含任何可以發生的天然發 生的突變。在一個實施方式中，與野生型細胞相比，根據本發明的細胞除了與野生型細胞相 比降低Tsp蛋白質活性所需的修飾（任選地為突變spr基因）外可以具有完全相同的基因 組序列。
[0083]編碼DsbC的重組多核苷酸可存在於轉化入細胞和/或整合入宿主細胞基因組的 合適的表達載體上。在編碼DsbC的重組多核苷酸插入到宿主基因組的實施方式中，由於 具有插入的編碼DsbC的重組多核苷酸，本發明的細胞也與野生型細胞不同。優選地，編碼 DsbC的重組多核苷酸是在細胞內表達載體上，因此對宿主細胞基因組造成破壞最小。
[0084]在一個實施方式中，本發明的細胞包含編碼目的蛋白質的多核苷酸。在此實施方 式中，編碼目的蛋白質的多核苷酸可包含於轉化入細胞和/或整合入宿主細胞基因組的合 適的表達載體內。在編碼目的蛋白質的多核苷酸插入宿主基因組的實施方式中，由於插入 的編碼目的蛋白質的多核苷酸，本發明的細胞也與野生型細胞不同。優選地，編碼目的蛋白 質的多核苷酸是在細胞內表達載體上，因此對宿主細胞基因組造成破壞最小。
[0085]術語"野生型"在本發明的上下文中指的是可以在自然中發生或可分離自環境 而不攜帶任何遺傳工程改造突變的革蘭氏陰性細胞菌株。大腸桿菌野生型菌株的實例為 W3110,如W3110K-12 菌株。
[0086] 本發明的
【發明者】提供了適合於表達目的蛋白質的重組革蘭氏陰性細菌細胞，其與 野生型細胞相比具有降低的Tsp蛋白質活性並包含編碼DsbC的重組多核苷酸。
[0087] 根據本發明的細胞包括編碼DsbC的重組多核苷酸。如本文所使用的，"重組多肽" 指的是使用重組DNA技術構建或產生的蛋白質。編碼DsbC的多核苷酸序列可與細菌細胞中 發現的編碼DsbC的內源序列同一。備選地，編碼DsbC的重組多核苷酸序列為野生型DsbC 序列的突變形式，例如，其有移除的限制性位點，如EcoRI位點，和/或具有編碼his標籤的 序列。用於本發明的修飾DsbC核苷酸序列的一個實例顯不於SEQIDN0:26,其編碼帶his 標籤的DsbC胺基酸序列，顯示於SEQIDNO: 27。
[0088] 我們已經發現，在與野生型細胞相比具有降低的Tsp蛋白質活性的細菌細胞中表 達編碼DsbC的重組多核苷酸這樣的特定組合和在在優選的實施方式中再組合突變spr基 因，提供了用於表達目的蛋白質的改良的宿主。上述遺傳突變的特定組合提供了新菌株，其 相比於攜帶敲除突變Tsp基因的細胞具有改善的細胞健康和生長表型。攜帶突變Tsp基因 的細胞可以具有良好的細胞生長速率，但是這些細胞的一個限制在於其易於裂解，尤其是 在高的細胞密度下。因此，包含突變Tsp基因的細胞表型為易於裂解，尤其在高的細胞密度 下。然而，本發明細胞中DsbC的表達抑制了Tsp降低的表型，因此細胞顯示出降低的裂解 情況。
[0089] 根據本發明的細胞相比於攜帶敲除突變Tsp基因的細胞顯示出提高的蛋白質生 產產量。提高的蛋白質產量可以為細胞中蛋白質生產速率和/或蛋白質生產的持續時間。 所述提高的蛋白質產量可以為細胞周質蛋白質產量和/或上清蛋白質產量。在一個實施方 式中，由於從細胞的滲漏減少，相比於攜帶突變Tsp基因的細胞，本發明的細胞顯示出提高 的細胞周質蛋白質產量。所述重組細菌細胞可以能夠以更快的速率產生目的蛋白質，因此， 相比於包含突變Tsp基因的細胞，相同量的目的蛋白質可在更短的時間內產生。所述產生 目的蛋白質的更快速率可以在細胞生長的起始階段內表現尤其顯著，例如在誘導蛋白質表 達後的前5、10、20或30小時內。
[0090] 根據本發明的細胞優選地在細胞周質和/或培養基中表達目的蛋白質的最大產 量為大約 1. 〇g/L、l. 5g/L、l. 8g/L、2. 0g/L、2. 4g/L、2. 5g/L、3. 0g/L、3. 5g/L或 4.Og/L。
[0091] 與野生型細胞相比，本發明提供的細胞具有降低的蛋白酶活性，其可降低目的重 組蛋白質的蛋白質裂解，尤其對於對Tsp蛋白酶具有蛋白質裂解敏感型的目的蛋白質。因 此，與野生型細菌細胞相比，由本發明提供的細胞提供了完整蛋白質優選目的蛋白質的更 高產量以及蛋白質優選目的蛋白質的的更低產量或優選地不產生蛋白質裂解片段。
[0092] 本領域技術人員能夠使用本領域熟知的方法容易地測試候選的細胞克隆以確 定其是否具有想要的目的蛋白產量，所述方法包括發酵方法、ELISA以及蛋白質GHPLC。 合適的發酵方法描述於HumphreysDP等人（1997)。FormationofdimericFabsin E.coli:effectofhingesizeandisotype,presenceofinterchaindisulphide bond,Fab,expressionlevels,tailpiecesequencesandgrowthconditions. J.IMMUNOL.METH. 209:193-202;BacklundE.ReeksD.MarklandK.WeirN.Bowering L.LarssonG.FedbatchdesignforperiplasmicproductretentioninEscherichia coli,JournalArticle.ResearchSupport,Non-U.S.Gov'tJournalofBiotechnology. 1 35 (4) : 358-65, 2008Jul31；ChampionKM.NishiharaJC.JolyJC.ArnottD.Similarity oftheEscherichiacoliproteomeuponcompletionofdifferentbiopharmaceutical fermentationprocesses.[JournalArticle]Proteomics. 1 (9):1133-48,2001Sep；and HornU.StrittmatterW.KrebberA.KnupferU.KujauM.WenderothR.MullerK.Matzku S.PluckthunA.RiesenbergD.Highvolumetricyieldsoffunctionaldimeric miniantibodiesinEscherichiacoli，usinganoptimizedexpressionvectorand high-cell-densityfermentationundernon-limitedgrowthconditions,Journal Article.ResearchSupport,Non-U.S.Gov'tAppliedMicrobiology&Biotechnology. 46(5 -6) :524-32, 1996Dec。技術人員還可容易地使用本領域熟知方法，如蛋白質GHPLC、圓二色 譜、匪R、X-光晶體成像及表位親和力測量方法，測試分泌蛋白質以確定蛋白質是否正確折 疊。
[0093] 在一個實施方式中，根據本發明的細胞還表達如下的一種或多種蛋白質：
[0094] ?一種或多種能夠促進細胞摺疊的蛋白質，如FkpA、Skp、SurA、PPiA和PPiD;和/ 或
[0095] ?-種或多種能夠促進蛋白質分泌或易位的蛋白質，如SecY、SecE、SecG、SecYEG、 SecA、SecB、FtsY和Lep;和 / 或
[0096] ?-種或多種能夠促進二硫鍵形成的蛋白質，如DsbA、DsbB、DsbD、DsbG。
[0097] 可將一種或多種以上蛋白質整合入細胞基因組和/或插入表達載體。
[0098] 在一個實施方式中，根據本發明的細胞包含編碼以下一種或多種其他蛋白質的重 組多核苷酸：
[0099] ?一種或多種能夠促進細胞摺疊的蛋白質，如？1^^、51^、511^、？?14和？?10;和
[0100] ?-種或多種能夠促進蛋白質分泌或易位的蛋白質，如SecY、SecE、SecG、SecYEG、 SecA、SecB、FtsY和Lep;和
[0101] ?-種或多種能夠促進二硫鍵形成的蛋白質，如DsbA、DsbB、DsbD、DsbG。
[0102] 在本發明的實施方式中，細胞還包含突變spr基因。Spr蛋白質為大腸桿菌膜結合 細胞周質蛋白酶。
[0103]spr蛋白質的野生型胺基酸序列顯示於SEQIDN0:21 (包含N-端信號序列）及 SEQIDN0:22 (不含26個胺基酸的信號序列）（根據UniProt登記號P0AFV4)。本發明中 Spr蛋白質序列的胺基酸編號包括信號序列。因此，spr蛋白質的1號胺基酸為顯不於SEQ IDN0:21中的第一個胺基酸（Met)。
[0104] 在根據本發明的細胞包含突變spr基因的實施方式中，突變spr基因優選地為細 胞的染色體spr基因。突變spr基因編碼能夠抑制包含突變Tsp基因的細胞表型的spr蛋 白質。攜帶突變Tsp基因的細胞可以具有良好的細胞生長速率，但是這些細胞的一個限制 在於其易於裂解，尤其是在高的細胞密度下。因此，包含突變Tsp基因的細胞表型為易於裂 解，尤其在高的細胞密度下。攜帶突變Tsp基因的細胞還顯示出在低滲條件下的熱敏感型 生長。然而，本發明細胞攜帶的spr突變在引入具有降低的Tsp活性的細胞中抑制了Tsp 降低的表型，因此細胞顯示出降低的裂解情況，尤其在高的細胞密度下。細胞生長表型可由 本領域技術人員在搖瓶培養或高細胞密度發酵技術中容易地進行測量。對細胞裂解表型的 抑制可見於改善的生長速率和/或重組蛋白質生產尤其是細胞周質中，由攜帶spr突變體 並具有降低Tsp活性的細胞相比於攜帶Tsp突變體及野生型spr的細胞所表現出的。
[0105] 根據本發明的細胞優選地包含編碼spr蛋白質的突變spr基因，其在選自N31、 R62、170、Q73、C94、S95、V98、Q99、R100、L108、Y115、D133、V135、L136、G140、R144、H145、G147、H157和W174的一個或多個胺基酸處具有突變，優選地，在選自C94、S95、V98、Y115、 D133、V135、H145、G147、H157和W174的一個或多個胺基酸處具有突變。優選地，突變spr基 因編碼的spr蛋白質在選自N31、R62、I70、Q73、C94、S95、V98、Q99、R100、L108、Y115、D133、 V135、L136、G140、R144、H145、G147和H157的一個或多個胺基酸處具有突變，優選地，在選 自C94、S95、V98、Y115、D133、V135、H145、G147和H157的一個或多個胺基酸處具有突變。 在此實施方式中，spr蛋白質優選地不具有任何其他突變。優選地，突變spr基因編碼的spr 蛋白質選自N31、R62、170、Q73、S95、V98、Q99、R100、L108、Y115、D133、V135、L136、G140、 R144和G147的在一個或多個胺基酸處具有突變，優選地，在選自S95、V98、Y115、D133、V135 和G147的一個或多個胺基酸處具有突變。在此實施方式中，spr蛋白質優選地不具有任何 其他突變。
[0106] 本發明的
【發明者】已鑑定出能夠抑制包含突變Tsp基因的細胞的生長表型的spr突 變。
[0107] 出乎意料地，本
【發明者】發現相比相比於包含突變Tsp基因的細胞，攜帶重組DsbC 基因、新的突變spr基因並與野生型細胞具有降低的Tsp蛋白質活性的細胞顯示出增加的 細胞生長速率及增加的細胞存活時間。具體地，相比於攜帶突變Tsp基因的細胞，攜帶重組 DsbC基因、spr突變以及具有降低的Tsp蛋白質活性的細胞顯示出降低的細胞裂解表型。
[0108] 對一個或多個以上spr胺基酸的突變可為對編碼所述胺基酸的一個、兩個或三個 核苷酸的任何合適的錯義突變。突變將胺基酸殘基變成任何合適的胺基酸，產生能夠抑制 包含突變Tsp基因表型的突變spr蛋白質。錯義突變可將胺基酸變為相比於野生型胺基酸 不同大小和/或具有不同化學特性的胺基酸。
[0109] 在一個實施方式中，突變是對C94、H145和H157構成的催化三分子中的一個、兩 個或三個胺基酸殘基進行的突變（SolutionNMRStructureoftheNlpC/P60Domainof LipoproteinSprfromEscherichiacoliStructuralEvidenceforaNovelCysteine PeptidaseCatalyticTriad,Biochemistry, 2008, 47, 9715-9717)〇
[0110] 因此，突變spr基因可包含：
[0111] ?對C94的突變；或
[0112] ?對H145的突變；或
[0113] ?對H157的突變；或
[0114] ?對C94和H145的突變；或
[0115] ?對C94和H157的突變；或
[0116] ?對H145和H157的突變；或
[0117] ?對C94、H145 和H157 的突變。
[0118] 在此實施方式中，spr蛋白質優選地不具有任何其他突變。
[0119]C94、H145和H157中的一個、兩個或三個可突變為任何合適的胺基酸，產生能夠抑 制包含突變Tsp基因的細胞的表型的spr蛋白質。例如，C94、H145和H157中的一個、兩個 或三個可突變為小胺基酸如Gly或Ala。因此，spr蛋白質可具有C94A、H145A和H157A突 變中的一個、兩個或三個。優選地，spr基因包含錯義突變H145A、已經發現其產生能夠抑制 包含突變Tsp基因的細胞的表型的spr蛋白質。
[0120] 對本文的置換突變體的標記由字母+數字+字母構成。第一個字母標記野生型蛋 白質中的胺基酸。數字指的是進行胺基酸置換的位置，第二個字母標記用於置換野生型氨 基酸的胺基酸。
[0121] 在一個優選的實施方式中，突變spr蛋白質包含在選自N31、R62、170、Q73、S95、 V98、Q99、R100、L108、Y115、D133、V135、L136、G140、R144 和G147 的一個或多個胺基酸處 的突變，優選地為選自S95、V98、Y115、D133、V135和G147的一個或多個胺基酸處的突變。 在此實施方式中，spr蛋白質優選地不具有任何其他突變。因此，突變spr基因可包含：
[0122] ?對N31的突變；或
[0123] ?對R62的突變；或
[0124] ?對170的突變；或
[0125] ?對Q73的突變；或
[0126] ?對S95的突變；或
[0127] ?對V98的突變；或
[0128] ?對Q99的突變；或
[0129] ?對R100的突變；或
[0130] ?對L108的突變；或
[0131] ?對Y115的突變；或
[0132] ?對D133的突變；或
[0133] ?對V135的突變；或
[0134] ?對L136的突變；或
[0135] ?對G140的突變；或
[0136] ?對R144的突變；或
[0137] ?對G147的突變。
[0138] 在一個實施方式中，突變spr蛋白質包含胺基酸的多重突變：
[0139] .595和丫115;
[0140] ?N31、Q73、R100 和G140;
[0141] ?Q73、R100 和G140;
[0142].RIOO和G140;
[0143] .Q73 和G140;或
[0144] .Q73 和R100;或
[0145] ?R62、Q99 和R144;或
[0146] .Q99 和R144。
[0147] 胺基酸N31、R62、170、Q73、S95、V98、Q99、R100、L108、Y115、D133、V135、L136、 G140、R144和G147中的一個或多個可突變為任何合適的胺基酸，產生能夠抑制包含突變 Tsp基因的細胞的表型的spr蛋白質。例如，N31、R62、I70、Q73、S95、V98、Q99、R100、L108、 Y115、D133、V135、L136、G140和R144中的一個或多個可突變為小胺基酸如Gly或Ala。
[0148] 在一個優選的實施方式中，spr蛋白質包含以下突變中的一個或多個：N31Y、 R62C、I70T、Q73R、S95F、V98E、Q99P、R100G、L108S、Y115F、D133A、V135D或V135G、L136P、G140C、R144C和G147C。優選地，spr蛋白質包含以下突變中的一個或多個：S95F、V98E、 Y115F、D133A、V13?或V135G和G147C。在此實施方式中，spr蛋白質優選地不含有任何其 他突變。
[0149] 在一個實施方式中，spr蛋白質具有選自N31Y、R62C、I70T、Q73R、S95F、V98E、 Q99P、R100G、L108S、Y115F、D133A、V135D或V135G、L136P、G140C、R144C和G147C的一個突 變。在此實施方式中，spr蛋白質優選地不具有任何其他突變。
[0150] 在一個進一步的實施方式中，spr蛋白質具有多重突變，選自：
【權利要求】
1. 重組革蘭氏陰性細菌細胞，特徵在於所述細胞： a. 包含含有編碼DsbC的重組多核苷酸的表達載體； b. 具有突變的Tsp基因，其編碼與野生型非突變Tsp相比，具有50%或更低蛋白酶活 性的Tsp蛋白質；並且 c. 具有除了突變的Tsp基因外，與野生型大腸桿菌W3110菌株同基因的基因組。
2. 根據權利要求1的細胞，其中所述細胞進一步包含編碼突變spr蛋白質的突變spr 基因，所述突變 spr 蛋白質具有選自 H157A、N31Y、R62C、I70T、Q73R、C94A、S95F、V98E、Q99P、 R100G、L108S、Y115F、D133A、V135D、V135G、L136P、G140C、R144C、H145A 和 G147C 的一個或 多個突變。
3. 根據權利要求2的細胞，其中所述spr蛋白質的一個或多個突變選自S95F、V98E、 Y115F、D133A、V135D、V135G 和 G147C。
4. 根據權利要求3的細胞，其中所述突變spr基因編碼的spr蛋白質具有突變S95F和 Y115F。
5. 根據權利要求2的細胞，其中所述突變spr基因編碼的spr蛋白質具有選自C94A、 D133A、H145A 和 H157A 的突變。
6. 根據權利要求1的細胞，其中所述細胞進一步包含一種或多種以下突變基因： a. 編碼具有分子伴侶活性和降低的蛋白酶活性的DegP蛋白質的突變DegP基因； b. 突變ptr基因，其中所述突變ptr基因編碼具有降低的蛋白酶活性的蛋白酶III或 其為敲除突變ptr基因；以及 c. 突變OmpT基因，其中所述突變OmpT基因編碼具有降低的蛋白酶活性的OmpT蛋白質 或其為敲除突變OmpT基因。
7. 根據權利要求1的細胞，其中所述細胞包含的突變Tsp基因編碼與野生型非突變 Tsp相比，具有50%或更低的蛋白酶活性的Tsp蛋白質或為敲除突變Tsp基因。
8. 根據權利要求6的細胞，其中所述細胞包含的突變Tsp基因編碼與野生型蛋白質 Tsp相比，具有50%或更低的蛋白酶活性的Tsp蛋白質或為敲除突變Tsp基因。
9. 根據權利要求7或權利要求9的細胞，其中所述細胞具有敲除突變基因，其包含對基 因起始密碼子的突變和/或位於基因起始密碼子下遊和基因終止密碼子上遊的一個或多 個終止密碼子。
10. 根據權利要求7或權利要求9的細胞，其中所述敲除突變Tsp基因包含由對基因起 始密碼子的錯義突變和任選地一個或多個其它點突變產生的限制性標記物位點。
11. 根據權利要求7或權利要求9的細胞，其中所述敲除突變Tsp基因包含SEQ ID N0:3。
12. 根據權利要求1或6的細胞，其中所述細胞包含編碼目的蛋白質的多核苷酸序列。
13. 根據權利要求1的細胞，其中所述細胞包含含有編碼DsbC的重組多核苷酸以及編 碼目的蛋白質的多核苷酸序列的載體。
14. 根據權利要求13的細胞，其中所述載體包含控制編碼DsbC的重組多核苷酸以及編 碼目的蛋白質的多核苷酸序列的表達的啟動子。
15. 根據權利要求14的細胞，其中所述目的蛋白質為抗體或其抗原結合片段。
16. 根據權利要求15的細胞，其中所述抗體或其抗原結合片段對TNF具有特異性。
17. 用於產生目的蛋白質的方法，其包括： a. 在能夠有效表達目的重組蛋白質及編碼DsbC的重組多核苷酸的條件下，在培養基 中培養根據權利要求1-16中任何一項限定的重組革蘭氏陰性細菌細胞；以及 b. 從重組革蘭氏陰性細菌細胞的細胞周質和/或培養基中回收目的蛋白質。
18. 根據權利要求17的方法，其中編碼目的蛋白質的多核苷酸序列與編碼DsbC的重組 多核苷酸的表達是通過向培養基中添加誘導子而進行誘導的。
19. 根據權利要求17或18的方法，其中所述方法進一步包括將目的蛋白質與DsbC分 離。
【文檔編號】C12N1/21GK104328079SQ201410591520
【公開日】2015年2月4日 申請日期:2011年1月13日 優先權日:2010年1月14日
【發明者】M·埃裡斯, D·P·哈姆費雷斯 申請人:Ucb醫藥有限公司