一種用於細胞和顆粒分離的分選儀及分選方法

2023-10-05 04:46:39

專利名稱：一種用於細胞和顆粒分離的分選儀及分選方法
技術領域：
本發明涉及一種用於細胞和顆粒分離的分選儀及分選方法，尤其涉及一種用於 納米-微米尺度細胞和顆粒分離的分選儀及分選方法，屬於生物技術領域。
背景技術：
合成生物學通過分子生物學手段，對細胞軟體(以DNA為代表的遺傳物質)和 硬體(以核糖體為代表的細胞器)進行系統改造，使之具備特定功能。這些活體細胞能 自我複製並作為「合成工廠」，將簡單和低價的能量和物質(例如陽光與二氧化碳)轉化 為具有高附加值的藥物、材料和生物能源，或用於消除難降解汙染物。正如2009年英國 皇家工程學會報告所言，合成生物學帶來的突破和效益「必將成為國家財富的重要組成 部分」。但是，合成生物學技術的發展首先取決於具有創新功能的生命組分(基因、蛋 白、細胞、群落等)的獲得，而在此領域現有研究面臨三大技術瓶頸。
首先，微生物大約佔據了全球生物量的一半，其中蘊含著大量未知的功能基 因，而自然環境中超過99%的微生物為不可培養微生物，不能通過傳統的培養方法分離 和研究。例如，Craig Venter在百慕達Sargasso海域研究中，僅在數百升海水中就發現了 148種新的微生物和大約120萬個未知基因。另有研究表明，1克土壤中就含有超過18000 種微生物，超過已知原核生物總數(16177種)。基於此，人們逐漸認識到不可培養微生 物作為一種尚未被開發的生物資源，在生物能源、工業生物催化、環境修復、醫藥等領 域具有難以估量的價值。因此，建立單細胞水平(微米尺度)或納米尺度顆粒的識別與 分選平臺，對於探究不可培養微生物中所蘊含的基因資源具有重大意義。
其次，傳統的基於細胞群體水平性狀測量的信息並不能真實反映細胞內部的生 物過程及機制。傳統微生物學對微生物細胞表徵的研究基於群體細胞水平，而最近研究 表明，同一種群內具有相同基因型的細胞可展現出顯著表現型差異性，這在很大程度上 歸結於胞內分子碰撞所導致的基因表達隨機性。這種分子水平上所存在的DNA表達與調 控的時間和空間隨機性，產生了群體內細胞的表徵存在個體差異性。對單細胞個體差異 性機制的研究，可以揭示癌症發病機制，理解細胞分化與組織發育原理，識別基因表達 特性與細胞特徵。現有單細胞研究技術主要基於宏基因組焦磷酸測序和螢光活化細胞分 選。前者是研究基因表達和不可培養微生物的主要手段，但顯著依賴DNA測序分析， 不僅不能直接揭示基因表達機制，而且不能分離具有特定功能基因的微生物。後者是分 離細胞的有效手段，然而由於絕大多數活體細胞本身螢光效應較弱或沒有螢光，外加熒 光標記過程會導致細胞死亡，因此該方法無法用於活體細胞篩選。尤為重要的是，無論 是宏基因組測序還是螢光活化細胞分選方法，都不能有效地建立在不同環境條件下基因 表達與環境因素之間的關係，進而無法獲得不可培養微生物與其生態功能之間的聯繫。 因此，只有通過在活體單細胞水平實現性狀識別和分選，才可以真正了解和改進細胞功 能。
最後，現有活體細胞分選技術主要基於流式細胞儀，而其核心技術在於細胞信息的識別。在信息識別過程中，由於掃描時間與所獲得信息量成正比，即長時間的信 號掃描可以獲得高信息量和解析度，短時間的信號掃描可以獲得高識別效率和通量。因 此，選擇合適的信號掃描時間以獲得足夠的信息量和較高的識別效率，是信息識別的技 術核心。現有傳統流式細胞儀中，細胞和顆粒信息的識別主要採用普通光信號，單位 時間對目標的信息獲得率較低，因此在滿足工程應用的識別效率前提下，缺乏足夠信息 量，只能對細胞/顆粒的形態、折光率、反射率或螢光強度等有限指標進行區分。拉曼 光譜作為一種高效、高通量的信息識別技術，可在細胞/顆粒分選技術領域帶來一系列 變革。通過對特定入射光線對化合物的非彈性散射譜線分析，拉曼顯微光譜可以直接檢 測化合物分子振動或轉動能級，通過對拉曼特徵譜線的分析，可以獲得化合物分子構成 和結構的信息，具有如下三大優點首先，拉曼顯微光譜在獲得整個單細胞的化學物質 指紋圖譜時並不需要任何標記，提供細胞內包括核酸、蛋白質、糖類和脂類等大量化合 物的信息，因此可以幫助我們識別活體細胞的細胞類型、生理特性和表徵變化；其次， 最新研究表明結合拉曼光譜和共聚焦顯微拉曼技術，可以構建拉曼光鉗進行單細胞分 析，不僅可以識別單細胞水平的同位素標記拉曼位移而且可以與原位螢光雜交技術相結 合，對微生物群落的結構和功能進行分析；最後，拉曼光譜信號識別速度較快，在微秒 至毫秒水平即可獲得足夠強度的目標拉曼光譜，滿足高通量快速檢測的需求。基於此， 拉曼光鉗篩選技術可以提供納米-微米級細胞/顆粒的高通量信息快速識別技術，這種不 基於外源標記的觀測技術，可以對活體細胞內代謝產物和細胞外細胞和顆粒之間相互作 用進行有效分析，提供單細胞水平的基因表達、細胞代謝功能和細胞間相互作用等重要 fn息ο
綜上所述，針對合成生物學研究所存在的瓶頸問題，構建單細胞水平(納米-微 米級)的細胞/顆粒分選系統，可以將把現代合成生物學思路和系統生物學手段拓展到單 細胞層面和不可培養微生物體系層面，不僅適用於細胞(包括病毒、微生物細胞、真菌 細胞、植物細胞和動物細胞)，也適用於其他納米材料、顆粒和細胞內含物的分選，對於 材料學、環境微生物學、醫學、分子生物學、生物工程學和生物能源開發等領域具有重 大的科研與工程意義。發明內容
本發明針對合成生物學研究的所存在的瓶頸問題，即不能對單細胞水平納 米-微米級的細胞/顆粒進行分選，使得現代合成生物學思路和系統生物學手段還不能拓 展到單細胞層面和不可培養微生物體系層面的不足，提供一種用於納米-微米尺度細胞 和顆粒分離的分選儀及分選方法。
本發明解決上述技術問題的技術方案如下一種用於細胞和顆粒分離的分選儀 包括拉曼光譜採集分析系統、微流控制系統和細胞/顆粒分選系統；所述微流控制系 統和拉曼光譜採集分析系統相連，用於使目標細胞/顆粒在拉曼雷射激發下產生拉曼信 號，以及對目標細胞/顆粒進行分選；所述拉曼光譜採集分析系統和細胞/顆粒分選系統 相連，用於接收目標細胞/顆粒的拉曼信號並產生目標細胞/顆粒的拉曼光譜信號；所述 細胞/顆粒分選系統和微流控制系統相連，用於根據接收的拉曼光譜信號控制所述微流 控制系統對目標細胞/顆粒進行分選。
在上述技術方案的基礎上，本發明還可以做如下改進。
進一步，所述拉曼光譜採集分析系統包括拉曼光譜儀，所述微流控制系統包括 載物臺、微流控器件和微流控制泵，所述細胞/顆粒分選系統包括控制終端、場力控制 器和場力發生器；所述拉曼光譜儀分別與微流控器件和控制終端相連；所述載物臺和微 流控器件相連，所述微流控器件和微流控制泵相連，所述控制終端和場力控制器相連， 所述場力控制器和場力發生器相連，所述場力發生器和微流控器件相連；所述載物臺用 於向微流控器件輸送目標細胞/顆粒和保護液；所述微流控制泵用於調控所述載物臺向 所述微流控器件輸送目標細胞/顆粒和保護液的速度；所述控制終端用於對生成的拉曼 光譜信號進行特異性識別同時生成並發送狀態信號；所述場力控制器用於根據接收的狀 態信號，生成控制信號，並將所述控制信號發送給所述場力發生器；所述場力發生器用 於根據接收到的控制信號，執行關閉或開啟操作。
所述微流控制泵根據樣品特徵，將目標細胞/顆粒和保護液的流動狀態保持在 層流狀態，流速範圍為O.lmm/s 100mm/s。
進一步，所述微流控器件包括注入通道、檢測與分選區域和收集通道；所述注 入通道和檢測與分選區域相連，用於將目標細胞/顆粒和保護液注入並進行混合；所述 檢測與分選區域和收集通道相連；所述檢測與分選區域包括拉曼光譜分析區域和細胞分 選區域，所述拉曼光譜分析區域用於使混合後的目標細胞/顆粒和保護液在拉曼雷射激 發下產生拉曼信號，所述細胞分選區域用於對目標細胞/顆粒進行分選；所述收集通道 用於將分選後的目標細胞/顆粒進行收集。
所述細胞分選區域內的目標細胞/顆粒被受調控的可變光學、磁場或電場控 制，不同類型的細胞/顆粒產生運動路徑差異。
進一步，所述保護液為pH = 5 10的緩衝溶液。
使用保護液的目的在於能夠使待分選的細胞或顆粒持續處於穩定的pH條件下， 同時在雙通道保護液混合和運移過程中，待分選的細胞或顆粒可以穩定在通道中間運 動，便於後續拉曼光譜識別與分選。因此，任何pH範圍在5 10之間的緩衝溶液均 可在本發明所涉及的拉曼流式分選儀中使用，例如通過將KXSeilgNa2HPO4 · 2H20和 6.0860gNaH2P04 · 2H20溶解於IOOmL純水中，振蕩至晶體全部溶解，再加入純水定容 至1.0L製成保護液。
進一步，所述注入通道包括目標細胞/顆粒通道、第一分選保護液通道和第二 分選保護液通道，所述第一分選保護液通道和第二分選保護液通道位於目標細胞/顆粒 通道的兩側並和目標細胞/顆粒通道相連通；所述檢測與分選區域包括檢測與分選通 道，所述檢測與分選通道和目標細胞/顆粒通道、第一分選保護液通道以及第二分選保 護液通道相連通；所述收集通道包括第一收集通道和第二收集通道，所述第一收集通道 和第二收集通道均和檢測與分選通道相連通。
所述分選保護液通道為兩個可以保證樣品溶液在與保護液匯合後，受到兩個方 向的保護液平衡作用，樣品溶液可以在保護液層內保持層流狀態，以保證樣品溶液中待 分選的細胞或顆粒均勻、逐個、穩定地在通道中央運動，可以有效提高分選效率與準確率。
進一步，所述場力控制器為聲光調製器，所述場力發生器為光學場力發生器。
優選地，所述光學場力發生器使用400nm 1500nm精確時間延遲TTL脈衝雷射。
進一步，所述場力控制器為電場調製器，所述場力發生器為電場力發生器。
優選地，所述電場力發生器使用延遲脈衝單穩態觸發器。
進一步，所述場力控制器為電磁鐵控制器，所述場力發生器為磁場力發生器。
優選地，所述場力發生器使用電磁耦合器。
本發明還提供一種解決上述技術問題的技術方案如下一種用於細胞和顆粒分 離的分選方法包括
1)將細胞/顆粒樣品和分選保護液混合形成混合液；
2)將所述混合液在拉曼雷射激發下產生拉曼信號；
3)根據所述拉曼信號生成相應的拉曼光譜信號；
4)對所述拉曼光譜信號進行特異性識別，並根據識別結果生成且發送狀態信 號；
5)接收所述狀態信號，並根據所述狀態信號生成且發送控制信號；
6)根據接收到的控制信號控制不同類型的細胞/顆粒樣品的運動軌跡，從而對 不同類型的細胞/顆粒樣品進行分選。
進一步，所述步驟1)具體包括
11)準備目標細胞/顆粒樣品以及配製分選保護液；
對於活體細胞樣品，在經過細胞培養過程後，需經離心分離，最終轉移至液體 礦物質培養基中，以避免不同培養基的背景光譜對分選結果產生影響；
所述離心分離的次數以及轉數由活體細胞樣品的具體種類和用量來決定，優選 地，所述離心分離的次數為3次，轉數為3000rpm;
對於納米材料、顆粒和細胞內含物，需將樣品溶解於液體礦物質培養基或純水 中，以避免不同溶液的背景光譜對分選結果產生影響；
根據緩衝液pH值與緩衝液對離子用量的關係製成的表格計算出配製緩衝液所需 固態化學成分的量，再將稱量後的固態化學成分溶解於純水中，振蕩至固態化學成分全 部溶解，再加入純水進行定容，即可獲得分選保護液；
12)注入目標細胞/顆粒溶液以及分選保護液；
將步驟(11)中獲得的目標細胞/顆粒溶液和分選保護液分別加入至微流控器件 特定位置，在微流控制泵的驅動下分別以層流方式流經微流控器件內部目標細胞/顆粒 注入通道、第一分選保護液通道和第二分選保護液通道，所述目標細胞/顆粒溶液和分 選保護液的流速分別為O.lmm/s 100mm/s。
進一步所述步驟2、和步驟幻具體包括微流控器件內目標細胞/顆粒溶液和 分選保護液混合後，流經檢測與分選區域中的拉曼光譜分析區域，在拉曼雷射激發下， 產生拉曼信號，拉曼光譜儀接收拉曼信號，並根據所述拉曼信號生成相應的拉曼光譜信 號。
進一步，所述拉曼雷射的掃描步長為0.1毫秒 10毫秒，拉曼信號的捕獲頻率 為 IOOHz 10000Hz。
進一步，所述步驟4)具體包括控制終端內的信息識別軟體對獲得的拉曼光譜信號的信息進行特異性識別，並根據識別結果生成且發送狀態信號。
進一步，所述步驟幻具體包括場力控制器接收控制終端內信息識別軟體生成 的狀態信號，對場力發生器進行關閉或者開啟的控制，場力發生器在關閉狀態時，檢測 與分選區域中的細胞分選區域無拉曼激發雷射場力、磁場力或電場力，目標細胞/顆粒 運動狀態不受影響，最終進入第一收集通道，場力發生器在開啟狀態時，檢測與分選區 域中的細胞分選區域存在拉曼激發雷射場力、磁場力或電場力，目標細胞/顆粒運動狀 態受到影響，運動軌跡產生偏移，最終進入第二收集通道。
本發明的有益效果是本發明用於細胞和顆粒分離的分選儀可有效識別和分選 納米-微米尺度的細胞、納米材料、顆粒和細胞內含物，由於拉曼光譜具有快速、非侵 害性和高信息含量等特點，因此在同樣的時間內，比螢光或放射性同位素標記等方法提 供更為豐富的細胞或顆粒的特徵信息，適用於材料學、環境微生物學、醫學、分子生物 學、生物工程學和生物能源開發等領域對細胞/顆粒樣品的高效分析和分選。


圖1為本發明實施例用於細胞和顆粒分離的拉曼流式分選儀的結構示意圖2為本發明用於細胞和顆粒分離的拉曼流式分選儀第一實施例的結構示意 圖3為本發明用於細胞和顆粒分離的拉曼流式分選儀第二實施例的結構示意 圖4為本發明用於細胞和顆粒分離的拉曼流式分選儀第三實施例的結構示意 圖5為本發明實施例微流控器件的結構示意圖6為本發明實施例用於細胞和顆粒分離的拉曼流式分選儀的拉曼光譜信號識 別圖7為本發明實施例目標細胞/顆粒溶液以及分選保護液注入的結構圖8為本發明實施例目標細胞/顆粒溶液和保護液混合的結構圖9為本發明實施例混合的目標細胞/顆粒溶液和保護液在拉曼雷射激發下產生 拉曼信號的結構圖10為本發明實施例不同類型的目標細胞/顆粒分選的結構圖。
具體實施方式
以下結合附圖對本發明的原理和特徵進行描述，所舉實例只用於解釋本發明， 並非用於限定本發明的範圍。
本發明目標檢測物即目標細胞/顆粒，包括細胞、納米材料、顆粒和細胞內含 物。所述細胞包括病毒、微生物細胞、真菌細胞、植物細胞和動物細胞等；所述納米材 料包括納米金顆粒、納米銀顆粒和納米磁性顆粒等；所述顆粒包括尺寸在納米至微米尺 度的花粉、粉塵、土壤粒子、海鹽粒子和煤塵粒子等；所述細胞內含物包括脫氧核糖核 酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、蛋白質、脂類、多糖和細胞器等。
圖1為本發明實施例用於細胞和顆粒分離的拉曼流式分選儀的結構示意圖。如圖1所示，所述用於細胞和顆粒分離的拉曼流式分選儀包括拉曼光譜採集分析系統10、 微流控制系統11和細胞/顆粒分選系統12 ；所述微流控制系統11和拉曼光譜採集分析 系統10相連，用於使目標細胞/顆粒在波長為400納米 800納米的拉曼激發雷射激發 下產生拉曼信號，以及對目標細胞/顆粒進行分選；所述拉曼光譜採集分析系統10和細 胞/顆粒分選系統12相連，用於接收目標細胞/顆粒的拉曼信號並產生目標細胞/顆粒 的拉曼光譜信號；所述細胞/顆粒分選系統12和微流控制系統11相連，用於根據接收的 拉曼光譜信號控制微流控制系統對目標細胞/顆粒進行分選。
所述拉曼光譜採集分析系統主要包括拉曼光譜儀，通過波長為400nm SOOnm 的拉曼激發雷射的激發，獲得目標細胞/顆粒的拉曼光譜。採用表面增強拉曼技術，可 以將拉曼光譜信號增強6個數量級，使其對納米-微米級細胞/顆粒的有效響應時間縮短 至1毫秒之內，以實現快速高通量檢測的目的。將拉曼光譜儀與共聚焦光子鉗技術和落 射螢光技術相結合，能夠在單細胞水平上鑑定和分離細胞，也可以對納米尺度顆粒物進 行有效識別。
本發明用於細胞和顆粒分離的拉曼流式分選儀的基本工作原理是通過拉曼光 譜特徵對目標細胞/顆粒信息進行分析識別，計算機自動分析拉曼光譜學數據並控制細 胞分選切換裝置，使用光學、磁場或電場技術手段對特定細胞/顆粒進行操控，通過微 流控器件實現細胞/顆粒分離至不同微流通道的目的。
本發明用於細胞和顆粒分離的拉曼流式分選儀可以用於分選未經前處理或經過 前處理的細胞或者顆粒，細胞或者顆粒的前處理過程可以包括表面拉曼增強標記處理、 磁性納米顆粒標記處理、穩定同位素標記處理和免疫標記處理等，對於不同的細胞或者 顆粒樣品，或者同一樣品的不同分選指標，可以對該系統做相應的設置，以達到最大化 分選通量等目的。
圖2為本發明用於細胞和顆粒分離的拉曼流式分選儀第一實施例的結構示意 圖。如圖2所示，在本實施例中，所述拉曼光譜採集分析系統20包括拉曼光譜儀201， 所述微流控制系統21包括載物臺211、與載物臺211相連的微流控器件212以及與微流控 器件212相連的微流控制泵213，所述細胞/顆粒分選系統22包括控制終端221、與控制 終端221相連的聲光調製器222，以及與聲光調製器222相連的光學場力發生器，所述光 學場力發生器包括紅外雷射2M和低孔徑值凸透鏡223，所述聲光調製器222分別與紅外 雷射2 和低孔徑值凸透鏡223(數值孔徑在0.18 0.23範圍內)相連，所述低孔徑值凸 透鏡223和微流控器件212相連，所述微流控器件212和拉曼光譜儀201相連，所述拉曼 光譜儀201和控制終端221相連。
圖3為本發明用於細胞和顆粒分離的拉曼流式分選儀第二實施例的結構示意 圖。如圖3所示，在本實施例中，所述拉曼光譜採集分析系統30包括拉曼光譜儀301， 所述微流控制系統31包括載物臺311、與載物臺311相連的微流控器件312以及與微流 控器件312相連的微流控制泵313，所述細胞/顆粒分選系統32包括控制終端321、與 控制終端321相連的電磁鐵控制器322，以及與電磁鐵控制器322相連的磁場力發生器， 所述磁場力發生器為電磁鐵323，所述電磁體控制器322和電磁鐵323相連，所述電磁鐵 323和微流控器件312相連，所述微流控器件312和拉曼光譜儀301相連，所述拉曼光譜 儀301和控制終端321相連。
圖4為本發明用於細胞和顆粒分離的拉曼流式分選儀第三實施例的結構示意 圖。如圖4所示，在本實施例中，所述拉曼光譜採集分析系統40包括拉曼光譜儀401， 所述微流控制系統41包括載物臺411、與載物臺411相連的微流控器件412以及與微流 控器件412相連的微流控制泵413，所述細胞/顆粒分選系統42包括控制終端421、與控 制終端421相連的電場調製器422，以及與電場調製器422相連的電場力發生器，所述電 場力發生器為延遲脈衝單穩態觸發器423，所述電場調製器422和延遲脈衝單穩態觸發器 423相連，所述延遲脈衝單穩態觸發器423和微流控器件412相連，所述微流控器件412 和拉曼光譜儀401相連，所述拉曼光譜儀401和控制終端421相連。
圖5為本發明實施例微流控器件的結構示意圖。如圖5所示，所述微流控器件 包括注入通道、檢測與分選區域和收集通道。所述檢測與分選區域包括拉曼光譜分析區 域56和細胞分選區域57。所述注入通道包括目標細胞/顆粒通道50、第一分選保護液 通道51和第二分選保護液通道52，所述第一分選保護液通道51和第二分選保護液通道 52位於目標細胞/顆粒通道50的兩側並和目標細胞/顆粒通道50相連通；所述檢測與 分選區域包括檢測與分選通道53，所述檢測與分選通道53和目標細胞/顆粒通道50、第 一分選保護液通道51以及第二分選保護液通道52相連通；所述收集通道包括第一收集通 道M和第二收集通道55，所述第一收集通道M和第二收集通道55均和檢測與分選通道 53相連通。該圖中目標細胞/顆粒包含兩種不同類型的細胞/顆粒，分別用黑色橢圓和 白色橢圓表示，在通過拉曼激發雷射對拉曼光譜分析區域56的目標細胞/顆粒進行激發 產生拉曼信號，以及細胞分選區域57對兩種不同類型的細胞/顆粒進行分選，一種類型 的細胞/顆粒通過第一收集通道M進行採集，另一種類型的細胞/顆粒通過第二收集通 道55進行採集。
所述目標細胞/顆粒通道50的內徑5μιη 300μιη，長度為Imm 50mm; 第一分選保護液通道51和第二分選保護液通道52的內徑為10 μ m 300 μ m,長度為 Imm 50mm;檢測與分選通道53的內徑為10 μ m 400 μ m，長度為5mm 100mm ； 第一收集通道M和第二收集通道55的內徑為5 μ m 300 μ m，長度為Imm 50mm。
下面以具體的兩個實施例分別對用於細胞和顆粒分離的拉曼流式分選儀以及分 選方法做進一步詳細的描述。
實施例1用於細胞和顆粒分離的拉曼流式分選儀的構建
1)拉曼光譜採集分析系統
本實例所構建的用於細胞和顆粒分離的拉曼流式分選儀，其拉曼光譜採集分析 系統中拉曼光譜儀使用共聚焦顯微拉曼光譜儀(Princetonlnstrument，US),激發波長為 514.5nm (Coherent, Innova 90-5 Ar-ion)。納米-微米尺度顯微鏡使用萊卡DM-IRB顯微 鏡，採用63倍物鏡(Leica，HCXPL APO)。拉曼光譜信號採集與分析軟體採用Labs pec 5.0。
2)微流控制系統
本實例所構建的用於細胞和顆粒分離的拉曼流式分選儀微流控制系統中，微流 控器件樣品注入通道內徑100 μ m，長度20mm;保護液通道內徑100 μ m，長度20mm ； 檢測與分選區域內徑300 μ m，長度0mm;第一收集通道內徑200 μ m，長度20mm ；第 二收集通道內徑100 μ m，長度20mm。微流控制泵採用200 Series(Kd Scientific, US)，流速範圍為O.l-lOOmm/s，保持樣品流動保持層流狀態。
3)細胞/顆粒分選系統
本實例所構建的用於細胞和顆粒分離的拉曼流式分選儀分選儀細胞/顆粒分選 系統中計算機軟體採用Labspec 5.0。場力控制器由聲光調製器和光學場力發生器構成， 其中聲光調製器採用AOM ATD_274HD6(IntraAction，Bellwood, IL)，光學場力發生器 採用 1064nm 精確時間延遲 TTL 脈衝雷射(LCS-DTL-322，Laser 2000 Ltd, US)。
實施例2用於細胞和顆粒分離的拉曼流式分選儀對同位素標記細胞的分選
(1)準備目標細胞/顆粒樣品以及製備分選保護液
使用液體礦物質培養基作為細胞培養基，1升液體礦物質培養基含有2. Na2HPO4^ 2.5g KH2PO4^ 1.Og NH4Cl、(XlgMgSO4 · 7H20、10 μ L 飽禾口 CaCl2 溶液、 10 μ L 飽和 FeSO4 溶液和 ImL Bauchop & Elsden。其中，IL 的 Bauchop& Elsden solution 含有 10.75g MgS04、4.5g FeSO4 · 7H20、2.0g CaC03、1.44gZnS04 · 7H20、1.12g MnSO4 · 4H20、0.25g CuSO4 · 5H20、0.28g CoSO4 · 7H20、0.06g H3BO3 和 51.3mL 飽 和HCl溶液。
將100 μ L海水樣品，加入到IOmL液體礦質培養基中，同時加入1.70mg碳13 標記的NaHCOdt為唯一碳源，其濃度為2mM。30°C條件下震蕩培養14天，獲得待分 選的細胞溶液。
^ 10.86105g Na2HPO4 · 2H20 和 6.08595g NaH2PO4 · 2H20 溶解於 IOOmL 純水中，振蕩至晶體全部溶解，加入純水定容至1.0L，獲得分選保護液。
(2)注入目標細胞/顆粒溶液以及分選保護液
分別將步驟(1)中獲得的15 μ L樣品溶液和150 μ L分選保護液加入至微流控器 件特定位置，在微流控制泵的驅動下分別以層流方式流經微流控器件內部樣品注入通道 和保護液注入通道，流速分別為lmm/s，如圖7所示。
(3)產生拉曼光譜
微流控器件內樣品溶液和分選保護液混合後如圖8所示，流經拉曼光譜分析區 域，受532nm波長拉曼激發雷射照射，產生拉曼信號，如圖8所示。該步驟中，拉曼激 發雷射掃描步長為1ms，拉曼光譜信號捕獲頻率為1000Hz。
(4)信息識別不同類型的目標細胞/顆粒
信息識別軟體對獲得的拉曼信號信息自動運算分析，判斷目標細胞類型。在細 胞溶液中，可以利用碳13標記的NaHCOdt為碳源生長的微生物細胞，由於其細胞內含 物含有碳13，因此其細胞拉曼光譜信號與不能利用碳13標記的NaHCO3作為碳源生長的 微生物細胞有所不同。如圖6所示，黑色無標記曲線部分表示該段溶液中無微生物細胞 拉曼光譜信號，軟體自動將該部分溶液標記為O狀態； 標記曲線部分表示該段溶液中 有無碳13標記的微生物細胞拉曼光譜信號，軟體自動將該部分溶液標記為O狀態； 標 記曲線部分表示該段溶液中有碳13標記的微生物細胞拉曼光譜信號，軟體自動將該部分 溶液標記為1狀態。
(5)分選不同類型的目標細胞/顆粒
聲光控制器接收信息識別軟體產生的0/1標記信號。在O狀態下，聲光控制器 保持細胞/顆粒分選子系統處於關閉狀態，1064nm精確時間延遲TTL脈衝雷射場力發生器(DG535，Stanford Research System, Palo Alto, CA)無雷射脈衝，細胞分選區域無紅外雷射場力，無碳13標記的微生物細胞運動狀態不受影響，最終進入第一收集通道。在 1狀態下，聲光控制器保持細胞/顆粒分選子系統處於啟動狀態，1064nm精確時間延遲 TTL脈衝雷射場力發生器產生，雷射脈衝細胞分選區域存在紅外雷射場力，碳13標記的 微生物細胞運動狀態受到影響，運動軌跡產生偏移，最終進入第二收集通道。該過程如 圖10所示。
(6)回收分選後的目標細胞/顆粒
第一收集通道和第二收集通道中分別獲得的無碳13標記的微生物和碳13標記 的微生物細胞，被收集在相應回收瓶內。其中碳13標記的微生物可以利用碳13標記的 NaHCOJt為碳源生長，可以對這些細胞進行進一步培養、物種分類學鑑定、宏基因組研 究和功能基因克隆等等分子生物學操作。
以上所述僅為本發明的較佳實施例，並不用以限制本發明，凡在本發明的精神 和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護範圍之 內。
權利要求
1.一種用於細胞和顆粒分離的分選儀，其特徵在於，所述分選儀包括拉曼光譜採集 分析系統、微流控制系統和細胞/顆粒分選系統；所述微流控制系統和拉曼光譜採集分 析系統相連，用於使目標細胞/顆粒在拉曼雷射激發下產生拉曼信號，以及對目標細胞/ 顆粒進行分選；所述拉曼光譜採集分析系統和細胞/顆粒分選系統相連，用於接收目標 細胞/顆粒的拉曼信號並產生目標細胞/顆粒的拉曼光譜信號；所述細胞/顆粒分選系統 和微流控制系統相連，用於根據接收的拉曼光譜信號控制所述微流控制系統對目標細胞/ 顆粒進行分選。
2.根據權利要求1所述的用於細胞和顆粒分離的分選儀，其特徵在於，所述拉曼光 譜採集分析系統包括拉曼光譜儀，所述微流控制系統包括載物臺、微流控器件和微流控 制泵，所述細胞/顆粒分選系統包括控制終端、場力控制器和場力發生器；所述拉曼光 譜儀分別與微流控器件和控制終端相連；所述載物臺和微流控器件相連，所述微流控器 件和微流控制泵相連，所述控制終端和場力控制器相連，所述場力控制器和場力發生器 相連，所述場力發生器和微流控器件相連；所述載物臺用於向微流控器件輸送目標細胞 /顆粒和保護液；所述微流控制泵用於調控所述載物臺向所述微流控器件輸送目標細胞/ 顆粒和保護液的速度；所述控制終端用於對拉曼光譜信號進行特異性識別同時生成並發 送狀態信號；所述場力控制器用於根據接收的狀態信號，生成控制信號，並將所述控制 信號發送給所述場力發生器；所述場力發生器用於根據接收到的控制信號，執行關閉或 開啟操作。
3.根據權利要求2所述的用於細胞和顆粒分離的分選儀，其特徵在於，所述微流控器 件包括注入通道、檢測與分選區域和收集通道；所述注入通道和檢測與分選區域相連， 用於將目標細胞/顆粒和保護液注入並進行混合；所述檢測與分選區域和收集通道相 連；所述檢測與分選區域包括拉曼光譜分析區域和細胞分選區域，所述拉曼光譜分析區 域用於使混合後的目標細胞/顆粒和保護液在拉曼雷射激發下產生拉曼信號，所述細胞 分選區域用於對目標細胞/顆粒進行分選；所述收集通道用於將分選後的目標細胞/顆粒 進行收集。
4.根據權利要求3所述的用於細胞和顆粒分離的分選儀，其特徵在於，所述保護液為 pH = 5 10的緩衝溶液。
5.根據權利要求4所述的用於細胞和顆粒分離的分選儀，其特徵在於，所述注入通道 包括目標細胞/顆粒通道、第一分選保護液通道和第二分選保護液通道，所述第一分選 保護液通道和第二分選保護液通道位於目標細胞/顆粒通道的兩側並和目標細胞/顆粒通 道相連通；所述檢測與分選區域包括檢測與分選通道，所述檢測與分選通道和目標細胞 /顆粒通道、第一分選保護液通道以及第二分選保護液通道相連通；所述收集通道包括 第一收集通道和第二收集通道，所述第一收集通道和第二收集通道均和檢測與分選通道 相連通。
6.根據權利要求2所述的用於細胞和顆粒分離的分選儀，其特徵在於，所述場力控制 器為聲光調製器，所述場力發生器為光學場力發生器。
7.根據權利要求2所述的用於細胞和顆粒分離的分選儀，其特徵在於，所述場力控制 器為電場調製器，所述場力發生器為電場力發生器。
8.根據權利要求2所述的用於細胞和顆粒分離的分選儀，其特徵在於，所述場力控制器為電磁鐵控制器，所述場力發生器為磁場力發生器。
9.一種用於細胞和顆粒分離的分選方法，其特徵在於，所述分選方法包括1)將細胞/顆粒樣品和分選保護液混合形成混合液；2)將所述混合液在拉曼雷射激發下產生拉曼信號；3)根據所述拉曼信號生成相應的拉曼光譜信號；4)對所述拉曼光譜信號進行特異性識別，並根據識別結果生成且發送狀態信號；5)接收所述狀態信號，並根據所述狀態信號生成且發送控制信號；6)根據接收到的控制信號控制不同類型的細胞/顆粒樣品的運動軌跡，從而對不同 類型的細胞/顆粒樣品進行分選。
10.根據權利要求9所述的用於細胞和顆粒分離的分選方法，其特徵在於，所述步驟1)具體包括11)準備目標細胞/顆粒樣品以及配製分選保護液；對於活體細胞樣品，在經過細胞培養過程後，需經離心分離，最終轉移至液體礦物 質培養基中，以避免不同培養基的背景光譜對分選結果產生影響；對於納米材料、顆粒和細胞內含物，需將樣品溶解於液體礦物質培養基或純水中， 以避免不同溶液的背景光譜對分選結果產生影響；根據緩衝液pH值與緩衝液對離子用量的關係製成的表格計算出配製緩衝液所需固態 化學成分的量，再將稱量後的固態化學成分溶解於純水中，振蕩至固態化學成分全部溶 解，再加入純水進行定容，即可獲得分選保護液；12)注入目標細胞/顆粒溶液以及分選保護液；將步驟(11)中獲得的目標細胞/顆粒溶液和分選保護液分別加入至微流控器件特定 位置，在微流控制泵的驅動下分別以層流方式流經微流控器件內部目標細胞/顆粒注入 通道、第一分選保護液通道和第二分選保護液通道，所述目標細胞/顆粒溶液和分選保 護液的流速分別為0.1mm/s 100mm/s。
11.根據權利要求10所述的用於細胞和顆粒分離的分選方法，其特徵在於，所述步驟2)和步驟3)具體包括微流控器件內目標細胞/顆粒溶液和分選保護液混合後，流經檢 測與分選區域中的拉曼光譜分析區域，在拉曼雷射激發下，產生拉曼信號，拉曼光譜儀 接收拉曼信號，並根據所述拉曼信號生成相應的拉曼光譜信號。
12.根據權利要求11所述的用於細胞和顆粒分離的分選方法，其特徵在於，所述拉曼 雷射的掃描步長為0.1毫秒 10毫秒，拉曼信號的捕獲頻率為IOOHz 10000Hz。
13.根據權利要求11或12所述的用於細胞和顆粒分離的分選方法，其特徵在於，所 述步驟4)具體包括控制終端內的信息識別軟體對獲得的拉曼光譜信號的信息進行特異 性識別，並根據識別結果生成且發送狀態信號。
14.根據權利要求13所述的用於細胞和顆粒分離的分選方法，其特徵在於，所述步驟 5)具體包括場力控制器接收控制終端內信息識別軟體生成的狀態信號，對場力發生器 進行關閉或者開啟的控制，場力發生器在關閉狀態時，檢測與分選區域中的細胞分選區 域無拉曼激發雷射場力、磁場力或電場力，目標細胞/顆粒運動狀態不受影響，最終進 入第一收集通道，場力發生器在開啟狀態時，檢測與分選區域中的細胞分選區域存在拉 曼激發雷射場力、磁場力或電場力，目標細胞/顆粒運動狀態受到影響，運動軌跡產生偏移，最終進入第二收集通道。
全文摘要
本發明涉及一種用於細胞和顆粒分離的分選儀及分選方法。所述分選儀包括拉曼光譜採集分析系統、微流控制系統和細胞/顆粒分選系統；所述微流控制系統和拉曼光譜採集分析系統相連，所述拉曼光譜採集分析系統和細胞/顆粒分選系統相連，所述細胞/顆粒分選系統和微流控制系統相連。本發明還提供了一種用於細胞和顆粒分離的分選方法。本發明分選儀可有效識別和分選納米-微米尺度的細胞、納米材料、顆粒和細胞內含物，由於拉曼光譜具有快速、非侵害性和高信息含量等特點，因此在同樣的時間內，比螢光或放射性同位素標記等方法提供更為豐富的細胞或顆粒的特徵信息。
文檔編號G01N21/65GK102019277SQ201010526320
公開日2011年4月20日 申請日期2010年10月29日 優先權日2010年10月29日
發明者張大奕, 曾雨, 李夢秋, 黃巍 申請人:北京惟馨雨生物科技有限公司