一種基於寡聚核苷酸-非標記的納米金檢測三聚氰胺的方法
2023-10-25 09:02:52 3
專利名稱：一種基於寡聚核苷酸-非標記的納米金檢測三聚氰胺的方法
技術領域：
本發明涉及生物學、醫學、食品學、化學等學科的交叉學科領域。更具體涉及一種
基於寡聚核苷酸-非標記的納米金檢測三聚氰胺的方法。
背景技術：
三聚氰胺(Melamine)對人和動物造成的危害已引起人們的廣泛關注，液態奶及 奶粉的假蛋白事件主要是由於一些不法人員在牛奶或奶粉中添加三聚氰胺，提高奶製品的 含氮量，以此冒充蛋白質。然而三聚氰胺進入人體後，發生取代反應(水解)，生成三聚氰 酸，三聚氰酸和三聚氰胺形成大的網狀結構，並與尿液形成難溶性鹽造成結石，對健康構成 嚴重威脅。2008年10月7日衛生部、工信部、農業部、國家工商總局以及國家質檢總局聯合 發布《關於乳與乳製品中三聚氰胺臨時管理限量值規定的公告》，公告規定嬰幼兒配方乳 粉中三聚氰胺的限量值為lmg/kg;液態奶(包括原料乳)、奶粉、其他配方乳粉中三聚氰胺 的限量值為2. 5mg/kg。目前三聚氰胺的檢測方法主要有液相色譜法(HPLC)、液相色譜-質 譜法(HPLC-MS)、氣相色譜-質譜法(GC-MS)等。但上述檢測方法均需使用大型儀器，操作 繁瑣，費時費力，成本高，無法在原料及產品現場直接對三聚氰胺進行快速檢測。
納米金顆粒的分散與團聚狀態有明顯的顏色變化，這一現象近年來已被廣泛應 用於蛋白質、DNA等的比色法檢測中，以納米金為探針檢測三聚氰胺的方法正是建立在 此原理的基礎上。雖然前不久有人利用此原理報導了一個相似的檢測方法(Kelong Ai， Yanlan Liu，and Lehui Ui，Journal of the American ChemicalSociety 2009,131(27)， 9496-9497.)，但他們報導的方法不僅需要用巰基試劑標記納米金，且該試劑沒有商品化， 需要自己合成，不僅勞動強度大，費時費力，且其純度直接影響檢測靈敏度和選擇性。
發明內容
本發明的目的是在於提供了一種基於寡聚核苷酸_非標記的納米金檢測三聚氰 胺的方法，以納米金為探針檢測三聚氰胺，簡便快速，靈敏度高，選擇性好，成本低，無需大 型儀器設備即可達到國家關於乳與乳製品中三聚氰胺臨時管理限量值規定的要求，可實現 原料及產品中三聚氰胺的快速檢測。 為了實現上述目的，本發明採用以下技術措施 —種基於寡聚核苷酸_非標記的納米金檢測三聚氰胺的方法，其步驟如下
1)納米金的合成以氯金酸(HAuCl4 *4H20)、擰檬酸三鈉、超純水為原料，通過磁力 攪拌、加熱(100°C )、回流、冷卻操作技術，製備粒徑為10nm 40nm、濃度為10—"M 10—8M 反應液A，所述的反應液A為納米金溶膠，所述的氯金酸與檸檬酸三鈉的摩爾比為1 : l 1 : 5，較佳的反應溫度為80°C IO(TC，反應時間為25 60min。 2)將特定序列寡聚核苷酸溶於緩衝溶液中，得反應液B。所述的特定序列寡聚核 苷酸為單鏈寡聚核苷酸(上海生工)，其中的鹼基均為T鹼基或是含不同個數T鹼基的寡聚核苷酸，鹼基個數為1 200，其濃度為10—6M 10—4M ;所述的緩衝溶液為常規的Tris、 PBS 緩衝溶液，其濃度為5 20mM ;所述的緩衝溶液中含有氯化鈉，其濃度為0. 05 0. 5M。
3)在反應液B中加入三聚氰胺或經過預先處理的被測樣品，充分混勻，靜置。所述 的反應液B為步驟2)中的特定序列寡聚核苷酸的緩衝溶液；所述的預先處理的被測樣品為 經過標準方法預處理的樣品；所述的三聚氰胺濃度為10—9M 10—6M ;靜置時間為1 10min。
4)以反應液A作為探針，通過比色法，即可檢測三聚氰胺。所述的反應液A為步驟 1)中的納米金溶膠，所述的反應液A與特定序列寡聚核苷酸(上海生工)的較佳摩爾比為
i : ioo i : iooo;所述的比色法為目視比色法或可見分光光度法，可見分光光度法檢測
波長為400 750nm。 本檢測方法用於原料奶、液態奶製品、奶粉、飼料等樣品中三聚氰胺的檢測，可在 IO分鐘內完成。 本發明與現有技術相比，具有以下優點和效果 與液相色譜法(HPLC)、液相色譜_質譜法(HPLC-MS)、氣相色譜_質譜法(GC-MS) 等技術相比，無需大型儀器設備，檢測人員無需專門培訓，僅憑裸眼即可判斷結果；可用於 現場檢測；直接採用商品化的寡聚核苷酸，即可實現對三聚氰胺的比色檢測，其檢測靈敏度 可達到了國家標準，具有簡便快速、靈敏度高、選擇性好、成本低，無需大型儀器，可對原料 及產品進行三聚氰胺的現場檢測。 此法檢測快速(10分鐘內)，操作簡易，靈敏度高，選擇性好，通用性強。
圖1以非標記的納米金為探針，結合寡聚核苷酸檢測三聚氰胺原理示意圖
圖2鹼基T與三聚氰胺形成氫鍵示意圖
圖3A合成的納米金溶膠電鏡圖 圖3B以反應液A為探針，加入三聚氰胺後剛剛開始團聚的納米金電鏡圖
圖3C以反應液A為探針，加入稍過量三聚氰胺後團聚的納米金電鏡圖
圖4A寡聚核苷酸_非標記的納米金檢測三聚氰胺的紫外光譜及線性關係圖
圖4B寡聚核苷酸_非標記的納米金檢測三聚氰胺目視比色法示意圖
具體實施方式
實施例1 : 以原料奶中三聚氰胺的檢測為例具體說明檢測方法，其步驟如下 1)合成納米金所用的儀器均需用新配製的王水(1 : 3， V濃硝酸/V濃鹽酸)浸泡24h
後，超純水洗淨備用。 2)將lOOmL超純水加熱煮沸，加入1.88mL氯金酸(2%， w/w)，沸騰後在加熱 (IO(TC )及攪拌條件下加入10. OmL檸檬酸三鈉(檸檬酸三鈉質量為0. 1141g) 。 10. 0分鐘 後停止加熱，繼續攪拌15. 0分鐘，自然冷卻至室溫(20-25°C )。所述的氯金酸與檸檬酸三 鈉的摩爾比為l : 3.88。製備得納米金溶膠粒徑為13nm、濃度為4.86X10—9M。
3)將特定序列寡聚核苷酸溶於緩衝溶液中，得反應液B。所述的特定序列寡聚核 苷酸為單鏈寡聚核苷酸，其中的鹼基均為T鹼基或是含T鹼基較多的寡聚核苷酸，其濃度為
410—5M ;所述的緩衝溶液為PBS緩衝溶液，其濃度為10mM ;所述的緩衝溶液中含氯化鈉，其濃 度為0. 3M。 4)在反應液B中加入經過預先處理的原料奶樣品，充分混勻，靜置。所述的反應 液B為步驟3)中的特定序列寡聚核苷酸緩衝溶液；所述的預先處理的原料奶樣品須先經 過三氯乙酸或乙腈沉澱蛋白質，然後經過自製固相萃取整體柱預處理的樣品；靜置時間為 5min。 5)以反應液A作為探針，通過比色法，即可檢測原料奶中三聚氰胺。所述的反應 液A為步驟2)中的納米金溶膠，所述的反應液A與特定序列寡聚核苷酸的較佳摩爾比為 1 : IOO;所述的比色法為目視比色法或可見分光光度法，可見分光光度法檢測波長範圍 400 700nm。
結果 以520nm處的吸光度值表徵三聚氰胺的濃度變化，其線性範圍是4. 17X10—8 4. 17X10—7] ，檢測限為41. 7nM。
權利要求
一種基於寡聚核苷酸-非標記的納米金檢測三聚氰胺的方法，其步驟是1)納米金的合成以氯金酸、檸檬酸三鈉、超純水為原料，通過磁力攪拌、加熱100℃、回流、冷卻操作，製備粒徑為10nm～40nm、濃度為10-11M～10-8M反應液A，所述的反應液A為納米金溶膠，所述的氯金酸與檸檬酸三鈉的摩爾比為1∶1～1∶5，反應溫度為80℃～100℃，反應時間為25～60min；2)將特定序列寡聚核苷酸溶於緩衝溶液中，得反應液B，所述的特定序列寡聚核苷酸為單鏈寡聚核苷酸，其中的鹼基均為T鹼基或是含不同個數T鹼基的寡聚核苷酸，鹼基個數為1～200，其濃度為10-6M～10-4M；所述的緩衝溶液為Tris或PBS緩衝溶液，其濃度為5～20mM；所述的緩衝溶液中含有氯化鈉，其濃度為0.05～0.5M；3)在反應液B中加入三聚氰胺標準溶液或經過預先處理的被測樣品，混勻，靜置，所述的反應液B為步驟2)中的特定序列寡聚核苷酸的緩衝溶液；所述的預先處理的被測樣品為經過標準方法預處理的樣品；所述的三聚氰胺濃度為10-9M～10-6M；靜置時間為1～10min；4)以反應液A作為探針，通過目視比色法或紫外-可見分光光度法，檢測三聚氰胺，所述的反應液A為步驟1)中的納米金溶膠，所述的反應液A與特定序列寡聚核苷酸的摩爾比為1∶100～1∶1000；紫外-可見分光光度法檢測波長為400～750nm。
全文摘要
本發明公開了一種基於寡聚核苷酸-非標記的納米金檢測三聚氰胺的方法。依次包括以下步驟1)製備一定粒徑的納米金溶膠，即反應液A；2)將特定序列寡聚核苷酸溶於緩衝溶液中，得反應液B；3)在反應液B中加入待測溶液進行反應；4)在步驟3)的反應液中加入反應液A，通過比色法，檢測三聚氰胺。本發明的檢測方法簡便快速(檢測過程不超過10min)、靈敏度高、選擇性好、成本低、無需大型儀器設備即可達到國家關於乳及乳製品中三聚氰胺臨時管理限量值規定的檢測要求，可實現對原料及產品的現場快速檢測。
文檔編號G01N21/31GK101701260SQ20091027245
公開日2010年5月5日 申請日期2009年10月20日 優先權日2009年10月20日
發明者何治柯, 李麗, 黃暉 申請人:武漢大學