一種疏水蛋白及其組成的藥物製劑的製作方法

2023-06-13 20:30:06

一種疏水蛋白及其組成的藥物製劑的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種疏水蛋白及其組成的藥物製劑，而提供一種能與極性藥物形成複合物的疏水蛋白及應用，以增加藥物對生物體內降解因素的穩定性，延長其在體內的半衰期。該疏水蛋白具有如下所示的胺基酸殘基序列：QQCTTGQLQCCESTSTANDPATSXLLGLIGVVISDVDALVGLTCSPISVIGVGSGSACTANPVC?CDSSPIGGLVSIGCVPVNV，其中，X為Glu或Lys。本發明的疏水蛋白能夠自發形成空腔結構，能夠通過極性相互作用與所載的極性較大的藥物形成穩定、均一的藥物複合物。由於極性藥物被包合在疏水蛋白空腔內，大大降低了藥物的水解和酶解速度，能夠增加藥物對生物體內降解因素的穩定性，從而提高藥物的半衰期，延長藥物在體內的濃度持續時間，提供了緩釋的功能。
【專利說明】一種疏水蛋白及其組成的藥物製劑
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物【技術領域】，特別是涉及一種疏水蛋白或其藥學上可接受的鹽、酯、醚、醯胺或其混合物，以及所述疏水蛋白或其藥學上可接受的鹽、酯、醚、醯胺或其混合物組成的藥物製劑及其製備方法。
【背景技術】
[0002]生物技術藥物(特別是核酸分子、蛋白質、多肽)作為藥物的研究取得了快速發展，在2009年的一份調查報告中，324種生物技術藥物(包括臨床試驗或者正在接受管理部門審查的藥物)幾乎覆蓋了 150種疾病，包括癌症、自身免疫性疾病以及愛滋病等傳染病。但是核酸分子、蛋白質和多肽也存在突出的問題，如給藥系統的不完善，穩定性差，在體內半衰期短，生物利用率低等。通過修飾來優化生物藥物的代謝動力學特性，以延長其半衰期是經常採用的方法，而修改過程中一些生物藥物會部分或全部失活。所以，尋找一種簡便的、穩定的藥物載體將具有重要的意義。

【發明內容】

[0003]本發明的目的是針對現有技術中存在的技術缺陷，而提供一種能與極性藥物形成複合物的疏水蛋白或其藥學上可接受的鹽、酯、醚、醯胺或其混合物及其應用，以增加藥物對生物體內降解因素的穩定性，延長其在體內的半衰期。
[0004]本發明的另一個目的是提供一種含有能夠與極性藥物形成複合物的疏水蛋白的藥物製劑。
[0005]本發明的再一個目的是提供一種藥物製劑的製備方法。
[0006]為實現本發明的目的所採用的技術方案是:
[0007]—種疏水蛋白或其藥學上可接受的鹽、酯、醚、醯胺或其混合物，所述疏水蛋白具有如下所示的胺基酸殘基序列:
[0008]QQCTTGQLQCCESTSTANDPATSXLLGLIGVVISDVDALVGLTCSPISVIGVGSGSACTANPVCCDSSPIGGLVSIGCVPVNV，其中，X 為 Glu 或 Lys。
[0009]一種含有上述疏水蛋白或其藥學上可接受的鹽、酯、醚或醯胺的藥物製劑，包括載劑和極性藥物，所述載劑為上述的疏水蛋白或其藥學上可接受的鹽、酯、醚、醯胺或其混合物，所述載劑與所述極性藥物的分子摩爾比為25:1— 1:100。
[0010]根據劑型的不同還包括藥學上可接受的輔料，包括常規的載體材料、賦形劑、穩定劑或稀釋劑等等。
[0011]所述極性藥物為小分子藥物、多肽藥物、核酸藥物或者蛋白類藥物。
[0012]所述極性藥物選自青黴素類、頭孢黴素類、GLP-1多肽、Exendin-4多肽、PKA競爭型多肽抑制劑、EGFR的siRNA和單克隆抗體藥物中的任一種。 [0013]所述載劑以多肽計，所述載劑與所述極性藥物的分子摩爾比為10:1~1:50。
[0014]一種上述疏水蛋白或其藥學上可接受的鹽、酯、醚、醯胺或其混合物在作為藥物緩釋載體中的應用。
[0015]一種藥物製劑的製備方法，包括下述步驟:
[0016](I)將所述載劑溶於磷酸緩衝液中，得到載劑溶液；
[0017](2)將極性藥物直接與步驟(1)所得的載劑溶液混合，或者將所述極性藥物溶於溶劑中，得到極性藥物溶液，所述極性藥物溶液與所述載劑溶液混合；
[0018](3)在0_5°C下混合均勻，乾燥後得到藥物製劑。
[0019]一種藥物製劑的製備 方法，包括下述步驟:
[0020](I)將所述載劑溶於磷酸緩衝液中，得到載劑溶液；
[0021](3)將極性藥物直接與步驟(1)所得的載劑溶液混合，或者將所述極性藥物溶於溶劑中，得到極性藥物溶液，所述極性藥物溶液與所述載劑溶液混合；
[0022](3)在0_5°C下混合均勻，直接加入藥學上可接受的輔料製成製劑，或者，冷凍乾燥後加入藥學上可接受的輔料製成製劑。
[0023]一種劑型為凍乾粉的藥物製劑的製備方法，包括下述步驟:
[0024](I)將所述載劑製成溶液；
[0025](2)將所述極性藥物與所述載劑的溶液混合，加入所述藥學上可接受的輔料和注射用水，調節PH值為3-7，使所述極性藥物溶解，加水稀釋，再加入活性炭，於0-10°C攪拌均勻，去除活性炭，採用微孔濾膜過濾除菌，濾液冷凍乾燥，得到凍乾粉劑型的藥物製劑。
[0026]極性藥物溶液與載劑溶液混合或者極性藥物與載劑溶液混合的方法可以採用超聲混合I 一 15分鐘，或者攪拌I 一 3小時，或者放置過夜。
[0027]用於溶解極性藥物的溶劑可以選自生理鹽水、純水、PBS緩衝液，或含20%以下的有機溶劑的上述液體中。
[0028]與現有技術相比，本發明的有益效果是:
[0029]1、從本專利涉及的疏水蛋白的胺基酸序列分析，本發明的疏水蛋白能夠通過大量的疏水胺基酸自發形成空腔結構，此空腔結構內部為極性基團。而且本專利涉及的包合藥物為極性結構，這樣極性藥物與疏水蛋白就能夠通過相互作用形成穩定、均一的藥物複合物。由於極性藥物被包合在疏水蛋白空腔內，大大降低了藥物的水解和酶解速度，能夠增加藥物對生物體內降解因素的穩定性，從而提高藥物的半衰期，從而能延長藥物在體內的濃度持續時間，提供了緩釋的功能。
[0030]2，採用本發明的疏水蛋白製備的藥物製劑有助於減少藥物攝取，從而降低醫療成本。
[0031]3、本發明的藥物製劑的製備方法簡單，易於實現。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0032]圖1所示為GLP-1多肽與疏水蛋白組合後有效延長其降血糖功能時間。
[0033]圖2所示為GLP-1多肽分子與疏水蛋白組合物的長期血糖調控能力。
【具體實施方式】
[0034]以下結合具體實施例對本發明作進一步詳細說明。
[0035]本發明的疏水蛋白具有如下所不的氣基酸殘基序列:[0036]QQCTTGQLQCCESTSTANDPATSXLLGLIGVVISDVDALVGLTCSPISVIGVGSGSACTANPVCCDSSPIGGLVSIGCVPVNV，其中，X為Glu或Lys，當X為Glu時記為疏水蛋白I，序列如SEQ ID No:1所示，當X為Lys時記為疏水蛋白II，序列如SEQ ID No:2所示。
[0037]實施例1
[0038]採用本領域內常用的超濾法提取II型真菌疏水蛋白的方法製備疏水蛋白I，具體方法為:
[0039]對真菌菌絲進行40% SDS的處理後，離心獲得蛋白粗提液。然後使用2M的KCl對蛋白粗提液進行處理後離心。將KCl處理後的蛋白液通過3000-10000膜孔徑的中空纖維超濾膜進行超濾純化，得到疏水蛋白I，序列如SEQ ID No:1所示。
[0040]實施例2
[0041]採用本領域內常用的超濾法提取II型真菌疏水蛋白的方法製備疏水蛋白II。具體方法為:
[0042]對真菌菌絲進行60% SDS的處理後，離心獲得蛋白粗提液。然後使用2M的KCl對蛋白粗提液進行處理後離心。將KCl處理後的蛋白液通過3000-10000膜孔徑的中空纖維超濾膜進行超濾純化，得到疏水蛋白II，序列如SEQ ID No:2所示。
[0043]實施例3
[0044]極性小分子藥物選擇青黴素類藥物羥氨苄青黴素，按照分子摩爾比羥氨苄青黴素與疏水蛋白I的比例為10 :1。
[0045](I)稱取羥氨苄青黴素溶於生理鹽水充分混勻後形成lmmol/L的極性藥物溶液。
[0046](2)稱取0.1mmol的實施例1的疏水蛋白I溶於pH值為3的磷酸緩衝液(濃度為IOmM)中充分混勻後得到載劑溶液。
[0047](3)將極性藥物溶液與載劑溶液在4°C溫度下超聲混合5分鐘(或者攪拌1-3小時，或者靜置過夜)，混合溶液冷凍乾燥，得到羥氨苄青黴素與疏水蛋白I複合物。
[0048]實施例4
[0049]極性小分子藥物選擇青黴素類藥物羥氨苄青黴素，按照分子摩爾比羥氨苄青黴素與疏水蛋白II的比例為10:1。
[0050](I)稱取羥氨苄青黴素溶於生理鹽水充分混勻後形成lmmol/L的極性藥物溶液。[0051 ] (2)稱取0.1mmol的實施例2的疏水蛋白II溶於pH值為7的磷酸緩衝液(濃度為IOmM)中，充分混勻後得到載劑溶液。
[0052](3)將極性藥物溶液與載劑溶液在4°C溫度下超聲混合5分鐘，得到的混合溶液冷凍乾燥，得到羥氨苄青黴素與疏水蛋白II的複合物。
[0053]實施例5
[0054](I)實施例1中得到的疏水蛋白I於_85°C下冷凍乾燥得到疏水蛋白I凍乾粉。
[0055](2)稱取90mg疏水蛋白I凍乾粉溶於Iml ρΗ3.0的磷酸緩衝液(濃度為IOmM)中，得到疏水蛋白I的溶液。
[0056](3)稱取0.3mg的GLP-1多肽凍乾粉，加入上述疏水蛋白I的溶液中，在4°C溫度下攪拌3小時，冷凍乾燥得到GLP-1多肽與疏水蛋白I複合的固體粉末。
[0057]採用與步驟(1)-(3)相同的方法分別製備GLP-1多肽與疏水蛋白I的摩爾比例分別為1:5，1:10，1:20及1:50的GLP-1多肽與疏水蛋白I複合的固體粉末備用。[0058]實施例6
[0059]稱取90mg疏水蛋白I凍乾粉溶於Iml pH7.0的磷酸緩衝液(濃度為IOmM)中，然後稱取0.42mg的Exendin-4多肽凍乾粉，加入到上述疏水蛋白I的溶液中，在4°C下攪拌3小時，_85°C冷凍乾燥得到Exendin-4多肽與疏水蛋白I複合的固體粉末。
[0060]實施例7
[0061]稱取3nmol 的 EGFR 的 siRNA 凍乾粉(購自 Santa Cruz Biotechnology 公司，sc29301)，溶於Iml pH值為3.0的磷酸緩衝液(濃度為IOmM)中，充分混勻後，稱取9mg疏水蛋白I凍乾粉溶於上述含EGFR的siRNA凍乾粉的磷酸緩衝液中，在4°C下攪拌I小時，_85°C冷凍乾燥得到EGFR的siRNA與疏水蛋白I複合的固體粉末。
[0062]實施例8 [0063](I)將加泊洛沙姆0.05g,甘露醇0.2g、乳糖0.lg、注射用水3ml置於IOml的容器中，攪拌使溶解，加lmol/L的枸櫞酸或氫氧化鈉調節pH值至3.0，冷卻至5°C。
[0064](2)稱取羥氨苄青黴素溶於生理鹽水充分混勻後形成lmmol/L的極性藥物溶液。稱取0.1mmol的疏水蛋白II溶於pH值為7的磷酸緩衝液(濃度為IOmM)中，充分混勻後得到載劑溶液。將極性藥物溶液與載劑溶液在4°C溫度下超聲混合5分鐘，得到混合溶液。
[0065](3)取步驟⑵得到的混合溶液5ml加入步驟⑴的溶液中，繼續調補pH值至
3.0，加水至10ml。加入IOmg活性碳，在5°C下攪拌20分鐘，過濾除去活性炭，採用微孔濾膜過濾除菌，濾液按每支0.2ml進行分裝，_80°C預凍2小時後，_85°C冷凍下減壓乾燥12小時，至樣品溫度到5°C後，再乾燥2小時，製得白色疏鬆塊狀物，封口即得凍乾粉劑型的藥物製劑，置於預充式的注射器中，規格為IOOug/支，4°C以下保存，注射前以200ul注射用水溶解，後給藥。
[0066]實施例9
[0067](l)NaC120mg,枸櫞酸IOmg,注射用水7ml置於IOml的容器中，攪拌使溶解，加lmol/L的枸櫞酸或氫氧化鈉調節pH值至7.0,冷卻至0°C。
[0068](2)取以實施例5的方法製得的GLP-1多肽與疏水蛋白I複合的固體粉末加入步驟⑴的溶液中，繼續攪拌溶解，調補pH值至7.0，加水至10ml。加入IOmg活性碳，在O —4°C下攪拌20分鐘，過濾除去活性炭，採用微孔濾膜過濾除菌，濾液按每支IOOul分裝入預充式注射器，樣品溫度到5°C以下保存，規格為50ug/支。
[0069]實施例10疏水蛋白I與小分子藥物複合物的血漿穩定性測定
[0070]以實施例3的羥氨苄青黴素與疏水蛋白I的複合物(折合Img羥氨苄青黴素)，溶在IOml大鼠血漿中，在37°C下放置不同時間(0、0.5、1、4小時)，以HPLC法測定血中藥物含量，計算穩定性。以相同濃度的藥物在水溶液中的穩定性進行比較。結果如下表1所示。
[0071]表1疏水蛋白I與羥氨苄青黴素複合物的血漿穩定性
[0072]
WfiiI沒有形成複合物時羥氨苄青黴素 I實施例3的複合物
O小時100%100%
0.5 小時90%98%
【權利要求】
1.一種疏水蛋白或其藥學上可接受的鹽、酯、醚、醯胺或其混合物，所述疏水蛋白具有如下所示的胺基酸殘基序列: QQCTTGQLQCCESTSTANDPATSXLLGLIGVVISDVDALVGLTCSPISVIGVGSGSACTANPVCCDSSPIGGLVSIGCVPVNV，其中，X 為 Glu 或 Lys。
2.一種含有權利要求1所述疏水蛋白或其藥學上可接受的鹽、酯、醚或醯胺的藥物製劑，其特徵在於，包括載劑和極性藥物，所述載劑為權利要求1所述的疏水蛋白或其藥學上可接受的鹽、酯、醚、醯胺或其混合物，所述載劑與所述極性藥物的分子摩爾比為25:1—1:100。
3.根據權利要求2所述的藥物製劑，其特徵在於，還包括藥學上可接受的輔料。
4.根據權利要求2或3所述的藥物製劑，其特徵在於，所述極性藥物為小分子藥物、多肽藥物、核酸藥物或者蛋白類藥物。
5.根據權利要求4所述的藥物製劑，其特徵在於，所述極性藥物為青黴素類、頭孢黴素類、GLP-1多肽、Exendin-4多肽、PKA競爭型多肽抑制劑、EGFR的siRNA和單克隆抗體藥物中的任一種。
6.根據權利要求4所述的藥物製劑，其特徵在於，所述載劑以多肽計，所述載劑與所述極性藥物的分子摩爾比為10:1~1:50。
7.—種權利要求1所述的疏水蛋白或其藥學上可接受的鹽、酯、醚、醯胺或其混合物在作為藥物緩釋載體中 的應用。
8.—種權利要求2所述的藥物製劑的製備方法，其特徵在於，包括下述步驟: (1)將所述載劑溶於磷酸緩衝液中，得到載劑溶液； (2)將極性藥物直接與步驟(1)所得的載劑溶液混合，或者將所述極性藥物溶於溶劑中，得到極性藥物溶液，所述極性藥物溶液與所述載劑溶液混合； (3)在0-5°C下混合均勻，乾燥後得到藥物製劑。
9.一種權利要求3所述的藥物製劑的製備方法，其特徵在於，包括下述步驟: (I)將所述載劑溶於磷酸緩衝液中，得到載劑溶液； (3)將極性藥物直接與步驟(1)所得的載劑溶液混合，或者將所述極性藥物溶於溶劑中，得到極性藥物溶液，所述極性藥物溶液與所述載劑溶液混合； (3)在0-5°C下混合均勻，直接加入所述藥學上可接受的輔料製成製劑，或者，冷凍乾燥後加入所述藥學上可接受的輔料製成製劑。
10.一種劑型為凍乾粉的權利要求3所述的藥物製劑的製備方法，其特徵在於，包括下述步驟: (1)將所述載劑製成溶液； (2)將所述極性藥物與所述載劑的溶液混合，加入所述藥學上可接受的輔料和注射用水，調節pH值為3-7，使所述極性藥物溶解，加水稀釋，再加入活性炭，於0-10°C攪拌均勻，去除活性炭，採用微孔濾膜過濾除菌，濾液冷凍乾燥，得到凍乾粉劑型的藥物製劑。
【文檔編號】A61K45/00GK103980353SQ201410214053
【公開日】2014年8月13日 申請日期:2014年5月21日 優先權日:2014年5月21日
【發明者】徐海津, 高井珍, 趙立強, 白豔玲, 張秀明 申請人:喬明強