膠體金層析法肝病檢測試紙及其製備方法

2023-10-24 04:30:47 1

專利名稱：膠體金層析法肝病檢測試紙及其製備方法
技術領域：
本發明屬於醫學免疫應用領域，具體涉及到利用膠體金免疫層析技術檢測肝病的 試紙及其製備方法。
背景技術：
原發性膽汁性肝硬化(Primary biliary cirrh0SiS，PBC)是以破壞肝內小及中等 大小膽管為主的器官特異性自身免疫性肝病，表現為肝門脈區炎症導致纖維化，肝硬化甚 至功能性衰竭。肝炎、肝硬化病人各種病原檢測指標呈陰性，需要考慮原發性膽汁性肝硬化 或自身免疫性肝炎。早期運用藥物治療可控制疾病的進展，而PBC的治療關鍵在於早期治 療，而早期治療的前提是早期診斷，早期診斷就成為大家所關注的焦點。在PBC患者體內可檢出多種自身抗體，如抗核抗體(ANA)、抗線粒體抗體(AMA)、抗平滑肌抗體(SMA)、抗肝腎微粒體抗體(LKM)等，其中最主要 的抗體是AMA，PBC常伴有高滴度的AMA，病程早期就出現AMA是本病的特點。AMA於1965 年由WalRer等在PBC患者血清中用間接免疫螢光法首次發現，其後的研究顯示，PBC患者的 AMA陽性率可高達90%，此項檢測已成為PBC診斷的主要檢查項目。(Neuberger J，Thomson R.PBC and ΑΜΑ—what is theconnection[J]. Hepatology,1999,29(1)265-271)近年研究發現，AMA存在若干亞型，迄今已發現的亞型共有9種(Ml M9)，與PBC 有關的有4種，即M2、M4、M8、M9，其中M2亞型抗體(AMA-M2)為PBC的特異性抗體，對本病 有確診意義。AMA-M2線粒體抗體對PBC檢測的敏感性達93%以上，特異性幾乎達95%。 (LeungP S,Van de water J,Coppel R L.et al. Molecular aspects andthe pathoh)gi (al basis of primary biliary cirrhosis[J]Autoimnlun,1996,9(2) :119-128.)PBC病人在出現臨床症狀和組織學特徵變化之前幾年甚至十幾年就可出現M2型 抗線粒體抗體(姜小華，仲人前，孔憲濤.原發性膽汁肝硬化發病機制研究進展.中國免疫 學雜誌，2002,18 =586-588) 0因此M2型抗線粒體抗體即時檢出對PBC早期檢出及輔助診斷 有非常重要的意義。2000年美國肝病學會(AASLD)在發表的《PBC診斷指南》中，其中有一 很重要的一項為M2亞型抗線粒體抗體(AMA-M2)陽性。隨著對M2靶抗原的研究深入，鑑定出M2的靶抗原為線粒體上的2-氧酸脫氫酶復 合體〔2-0ADC〕的一些組分丙酮酸脫氫酶(PDC-E2)、2-氧酸脫氫酶(BC0ADC-E2)、2_氧戊 二酸脫氫酶(0GDC-E2)、X蛋白等，而其中PDC的抗原表位主要位於內酯醯區和部分外酯醯 區，在PBC病人血清中的陽性率為95%。BC0ADC，0GDC的抗原表位位於內酯醯區，陽性率分 別為53 % 55 %，39 % 88 %。三抗原間無交叉反應，PBC病人血清中M2型抗線粒體抗體 能與一種或一種以上抗原反應。三個靶抗原聯合檢測，其陽性率可達95% 99%，而且特 異性也很高，正常人陽性僅為0. 5% (賈繼東自身抗體檢測在自身免疫性肝病診斷中的應 用[J].中華檢驗醫學雜誌，2003, ) 116-120)。本產品採用基因工程方法(定康，陳燕等人源M2 二聯體靶抗原P0-E2融合蛋白的克隆表達與鑑定· [J]臨床軍醫雜誌· 2007，636 (3) :323 :325.)成功克隆、原核表達全部為人源的M2三個靶抗原，即丙酮酸脫氫酶(PDC)、2_氧酸脫氫酶 (BCOADC)、2_氧戊二酸脫氫酶(OOTC)，且成功連接形成抗原蛋白三聯體即為本產品的檢測 抗原。目前M2型抗線粒體抗體的檢測方法有間接免疫螢光 Indirectmmunofluorescence, IIF)禾口酶聯免疫吸附試驗(Enzyme-linked Immunosorbent Assay, ELISA)。目前市場上商品化M2型抗線粒體抗體檢測試劑盒主要為ELISA試劑盒。ELISA法 操作程序煩瑣，完成整個實驗過程需三小時左右，亦需要專業免疫學技術人員在實驗室中 進行實驗操作，並且需經酶標儀檢測後讀取實驗結果，這在基層醫療機構的實驗室和小型 門診中較難實現該項目的實驗檢測，同時基於ELISA方法學易受各種溫度和孵育時間等環 境條件因素的影響，對試驗帶來諸多不便。間接免疫螢光，觀察結果需要專業人員操作特殊的儀器設備，間接免疫螢光法存 在檢測時間長但須有螢光顯微鏡觀察結果，並有一定的主觀人為判斷誤差，另外易受其他 幹擾產生假陽性，標準化困難，也不適合高通量標本的檢測。為了克服上述檢測方法的不足，我們將膠體金層析法應用到M2型抗線粒體抗 體的檢測中。膠體金免疫層析法(gold-immunochromatography assay, GICA)是應用 膠體金標記技術，以膠體金作為示蹤物，以條狀纖維層析材料為固相，通過毛細效應使樣 品溶液在層析條上泳動，使樣品中的待測物與結合墊上針對待測物的受體(如抗原或抗 體)發生免疫反應，並與條狀纖維層析材料上的抗原(或抗體)發生免疫反應而被截留， 進而形成肉眼可見的紫紅色條帶，得到直觀的實驗結果，達到快速檢測的目的(Sikowicz Getal. One-step chromatographic immunoassay for qualitativedetermination of choricogonadotropin in urine. Clin Chem. 1990 (36) 1579-1586.)。使用時只將樣品加樣 到樣品墊上，數分鐘就根據檢測線上紫紅色條帶出現情況來判斷陰陽性結果。與其他檢測 方法相比，檢測時間短，只需要5 10分鐘，操作人員無需培訓，操作簡便、快速，無需低溫 保存，儲運方便等優勢。在自身免疫性疾病方面，目前國外市場上出現了一些檢測自身免疫疾病的試紙條 產品，但M2型抗線粒體抗體的膠體金免疫試紙在國內外市場上仍沒有問世。本發明將基因 工程菌表達的抗原蛋白首次引入到試紙條中，實現了高特異性、高靈敏度、高準確度的檢測 性能。目前市面上也出現了商品化ELISA試劑盒，但金標層析試紙與之相比，仍有諸多不同 之處，不受場地人員之限，檢測時間短即5-10分鐘，判讀結果簡便。此外該試紙具有高特異 性、高靈敏度、高準確度，能滿足市場的快速篩選PBC，為病人及早診斷治療提供條件，同時， 也能滿足基層實驗室、即時檢測、床邊檢測的需求。

發明內容
本發明為了克服以上方法學的不足，將膠體金層析法應用到M2型抗線粒體抗體 的檢測中，同時首次將M2型線粒體抗原蛋白應用到膠體金層析法中，採用間接法來實現血 液中的M2型抗線粒體抗體檢測，實現高特異、高靈敏度、高準確性的檢測性能，快速篩選出 M2型抗線粒體抗體的陽性樣本，能快速、便捷地輔助診斷原發性膽汁肝硬化。本發明目的之一在於提供一種膠體金層析法肝病檢測試紙。
本發明目的之二在於提供一種膠體金層析法肝病檢測試紙的製備方法。一種膠體金層析法肝病檢測試紙，包括有硝酸纖維素包被膜(3)、結合墊⑵、樣 品墊(1)、吸水墊(6)，它們依次粘貼在底板上，其特徵在於所述的結合墊包被有金標抗體(a)和金標抗體(b)，所述的硝酸纖維素包被膜( 上有檢測線(4)和質控線(5)，其中檢測線包被有M2型線粒體抗原蛋白，其中的質控線(5)包被有抗體(C)。進一步，所述的抗體(a)為抗人IgG單克隆抗體或抗人IgG多克隆抗體，或葡萄球 菌A蛋白(SPA)或鏈球菌G蛋白(Protein G)中的一種或多種。所述的抗體(a)中的多克隆抗體為鼠源、馬源、羊源、兔源或豚鼠源中的一種，抗 體(a)中的單克隆抗體為鼠源或兔源中的一種。所述的抗體(b)和抗體(C)均為單克隆抗體或多克隆抗體中的一種，其中(b)和 (C)可發生特異性結合形成免疫複合物。所述的抗體(b)和抗體(C)中的多克隆抗體為鼠源、馬源、羊源、兔源或豚鼠源中 的一種，單克隆抗體為鼠源或兔源中的一種。所述的檢測線上包被的蛋白為通過原核表達克隆化基因獲得的M2型線粒體抗原 蛋白。所述檢測是定性檢測人血清中M2型抗線粒體抗體，輔助診斷早期原發性膽汁肝 炎。所述M2型線粒體抗原蛋白是針對M2的靶抗原即線粒體的2_氧酸脫氫酶複合體〔 2-0ADC〕的一些組分丙酮酸脫氫酶(PDC-E》、2_氧酸脫氫酶複合體E2 (BC0ADC-E2)、2_氧 戊二酸脫氫酶複合體E2 (0GDC-E2)，通過基因克隆技術構建重組基因，然後採用原核表達技 術成功表達出全部為人源的M2三個靶抗原蛋白，且成功連接形成抗原蛋白三聯體(姜小 華，仲人前等.M2自身抗原及其三聯體的克隆表達和初步鑑定.中華消化雜誌，2001(21) 530-533)。所述樣本來自人血清、血漿、全血樣本。根據本發明應用的單克隆抗體可通過由Kohler等(Continuouscultures of fused cells secreting antibody of predefinedspecificity[J]. Nature,1975 (256) 495-497)首先描述的雜交瘤法進行製備，或者可通過重組DNA法進行製備(見美國專 禾Ij 4816567)。"單克隆抗體，，由 Clackson 等(Making antibody fragments usingphage display libraries[J]. Nature, 1991 :624-628)禾口 Marks 等(By-passing immunization Human antibodies from V-genelibraries displayed on phage[J]. Journal of MolecularBiology, 1991 :581-597)所述技術從噬菌體抗體文庫中分離。根據本發明應用的多克隆抗體可通過陳學清等(免疫學常用實驗方法.[M]， 2000 :15-26)通過免疫動物來製備。本發明的SPAlrotein G通過原核表達克隆化重組基因，由J.薩姆布魯克等(分 子克隆實驗指南.[M]，2002 =1228-1232)描述的大腸桿菌原核表達克隆化基因。一種膠體金層析法肝病檢測試紙的製備方法，該試紙由樣品墊、結合墊、包被膜、 吸水墊和底板共同組成，其特徵在於該方法包括有以下步驟步驟1，抗原的製備，是通過原核表達克隆化基因獲得M2線粒體抗原蛋白，
以及包被膜的製備，是用包被膜緩衝液稀釋抗原蛋白至濃度為1. 0 1. 5mg/mL, 將抗體(c)稀釋到0. 8 1. 5mg/mL,以1 10 μ 1/cm硝酸纖維素膜上，置放於37°C烘乾備 用，以及金標抗體的製備，是用0. IM碳酸鉀調節膠體金pH 7. 0 9. 0，按每毫升膠體 金溶液緩慢加入4 25 μ g蛋白，攪拌10 30min，然後加入BSA至終濃度0. 5 5%，攪 拌10 30min，離心，棄上清，將沉澱用洗滌液洗滌2 3次，末次用十分之一初始體積的保
存液將沉澱重懸，置4°C備用，以及結合墊的製備，是經處理液浸漬處理的聚脂膜，烘乾後，將金標抗體(a)和金 標抗體(b)混合後，以0. 5 4μ 1/cm的用量噴塗在預處理的聚脂膜上，25 °C 30°C乾燥 後，置於2°C 8°C的環境下備用，以及樣品墊的製備，是經處理液浸漬處理的玻璃纖維膜，於37°C烘乾後備用；步驟2，在底板上順次相互搭接粘貼經前述步驟1所製作完成的硝酸纖維素包被 膜、結合墊、樣品墊、吸水墊；步驟3，對步驟2所製作完成的材料，切割成試紙條。所述的步驟1中，金標抗體的製備方法為用0. IM碳酸鉀調節膠體金pH值至8. 0 9. 0，按每毫升膠體金溶液緩慢加入8 12 μ g羊抗人IgG，攪拌10 30min，然後加入BSA 至終濃度0. 5 1 %，攪拌10 30min，離心，棄上清，將沉澱用洗滌液洗滌2 3次，末次 用十分之一初始體積的保存液將沉澱重懸，置4°C備用。所述的步驟1中，金標抗體的製備方法為用0. IM碳酸鉀調節膠體金pH值至7. 0 8. 0，按每毫升膠體金溶液緩慢加入8 12 μ g兔IgG，攪拌10 30min，然後加入BSA至終 濃度0. 5 1 %，攪拌10 30min，離心，棄上清，將沉澱用洗滌液洗滌2 3次，末次用十 分之一初始體積的保存液將沉澱重懸，置4°C備用。所述的步驟1中，金標SPA的製備方法為用0. IM碳酸鉀調節膠體金pH值至5. 0 6. 5，按每毫升膠體金溶液緩慢加入10 15 μ g SPA,攪拌10 30min，然後加入BSA至終 濃度0. 5 1 %，攪拌10 30min，離心，棄上清，將沉澱用洗滌液洗滌2 3次，末次用十 分之一初始體積的保存液將沉澱重懸，置4°C備用。然後將金標SPA OD 20 2 4μ 1/cm噴 塗於結合墊，乾燥後備用。所述的步驟1中，金標SPA的製備方法為用0. IM碳酸鉀調節膠體金pH值至7. 0 8. 0，按每毫升膠體金溶液緩慢加入8 12 μ g鼠抗人IgG，攪拌10 30min，然後加入BSA 至終濃度0. 5 1 %，攪拌10 30min，離心，棄上清，將沉澱用洗滌液洗滌2 3次，末次 用十分之一初始體積的保存液將沉澱重懸，置4°C備用。然後將金標SPAOD 302 4μ 1/cm 噴塗於結合墊，乾燥後備用。所述的步驟1中，將製備好的金標抗體(a)和金標兔IgG按20 40/15 20比 例混合，用ΒΙΟ-Dot噴膜機以2. 0 4μ 1/cm噴於預處理的聚脂膜上，25°C 37°C乾燥，封 袋，置2 °C 8 °C備組裝粘板用。所述的步驟3中，切割成的試紙的寬度優選為4mm和3mm兩種。本發明的檢測原理具體為選用親和層析純化的M2抗原蛋白，金標抗體(a)和金標 兔IgG作為膠體金標記複合物，噴塗於結合墊，利用間接法來檢測血清樣品中是否含有M2 型抗線粒體抗體。檢測時，樣本隨著層析泳動到結合墊並浸潤金標複合物，其中的人IgG和金標抗體(a)結合形成人IgG-金標抗體(a)複合物，由於毛細效應，此複合物沿包被膜泳 動向前，若血清樣品中有M2型抗線粒體抗體，此複合物與包被於硝酸纖維素膜上的抗原蛋 白髮生特異性免疫結合反應，形成金標抗體(a)_人IgG_M2抗原蛋白三聯體複合物而被截 留在檢測線上，逐漸富集形成較深的紫紅色條帶；由於毛細效應繼續泳動向前，金標兔IgG 與包被在質控線上的羊抗兔IgG發生特異的免疫反應被截留，逐漸富集在質控線上形成較 深的紫紅色條帶，多餘的未結合的物質繼續層析到吸水墊上，因此在檢測線和質控線都出 現條帶的判為陽性結果；若血清樣品中不含有M2型抗線粒體抗體，金標抗體(a)到達檢測 線時，不與包被在檢測線上的抗原蛋白發生免疫反應，因此在檢測線處沒有出現紫紅色條 帶，金標抗體(a)繼續泳動向前到達吸水墊，而金標兔IgG繼續泳動向前與包被於質控線處 羊抗兔IgG發生特異的免疫反應而被截留，逐漸富集在質控線上形成紫紅色條帶，因此僅 在質控上出現條帶判為陰性結果。與現有的檢測方法相比，本發明優點1.該測定方法的獨特性在於基因重組表達的三聯體抗原蛋白首次應用於膠體金 層析試紙，大大提高了其檢測靈敏度，通過膠體金試紙可快速篩選出M2型抗線粒體抗體所 有陽性樣本(能檢出大於25RU/ml的樣本)。2.本發明的優點是生產成本低。本發明所提供的M2型抗線粒體抗體檢測試紙所需的核心試劑是抗體(a)即抗人IgG或SPA或PROTEIN G、抗體(c)、抗體 (b)、抗原蛋白，其單條試紙所用試劑量少，且可通過購買商品化試劑或自製，抗原蛋白來源 於商品化的純化基因工程抗原蛋白，或者自行製備。3.與已公開的用於M2型抗線粒體抗體檢測的其他方法相比，本發明的試紙具有 許多其他方法所不能比擬的優點，如檢測時間短(5 IOmin)；不需要任何特殊儀器，可實 現床邊檢測和門診即時檢測；操作簡便，只需一步反應，操作人員無需培訓，檢測成本低； 對溫度無特殊要求，無需冷凍，儲存運輸方便，室溫可保存M個月。


圖1為本發明的側面結構示意圖。圖1所示，該試紙是在支撐膠板(7)上順次相 互搭接地粘貼硝酸纖維素包被膜(3)、結合墊O)、樣品墊(1)、吸水墊(6)。結合墊( 上包被有金標抗體(a)和金標抗體(b)；硝酸纖維素包被膜( 有檢 測線⑷和質控線(5)，其中，檢測線⑷包被有M2型線粒體抗原蛋白，質控線(5)包被有 抗體(c)。圖2為本發明的檢測結果示意圖。圖加所示為加樣後，反應3 5min即可看到檢測區4⑴和控制區5 (C)相應位 置上出現紫紅色條帶；圖2b所示為當C區5和T區4均出現紫紅色條帶，結果為陽性，說明血清中含有 M2型抗線粒體抗體；圖2c所示為如只在C區5出現一條紫紅色條帶，T區4不出現紫紅色條帶，結果 為陰性，說明血清中不含M2型抗線粒體抗體；圖2dJe所示為如C區5不出現紫紅色條帶，無論T區4是否有條帶出現，都說 明試紙失效。
具體實施例方式本發明所述的膠體金免疫層析法肝病檢測試紙，如圖1所示，該試紙是在支撐膠 板(7)上順次相互搭接地粘貼硝酸纖維素包被膜(3)、結合墊O)、樣品墊(1)、吸水墊(6)。 所述的結合墊( 上包被有金標抗體(a)和金標兔IgG。所述的硝酸纖維素包被膜(3)有 檢測線(4)和質控線(5)，檢測線(4)包被有M2型線粒體抗原蛋白，質控線(5)包被有羊抗 兔 IgG。如圖2所示，加樣後，反應3 5min即可看到檢測區4⑴和控制區5(C)相應位 置上出現紫紅色條帶，如圖加所示；當C區5和T區4均出現紫紅色條帶(如圖2b所示)， 結果為陽性，說明血清中含有M2型抗線粒體抗體；如只在C區5出現一條紫紅色條帶，T區 4不出現紫紅色條帶(如圖2c所示)，結果為陰性，說明血清中不含M2型抗線粒體抗體；如 C區5不出現紫紅色條帶，無論T區4是否有條帶出現(如圖2dde所示)，都說明試紙失 效。下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。實施例一抗原組成應用於本試紙的抗原蛋白是針對M2的靶抗原即線粒體的2-氧酸脫氫酶複合體〔 2-0ADC〕的一些組分丙酮酸脫氫酶(PDC-E》、2_氧酸脫氫酶複合體E2 (BC0ADC-E2)、2_氧 戊二酸脫氫酶複合體E2 (0GDC-E2)，通過基因克隆技術構建重組基因，然後採用原核表達技 術成功表達出全部為人源的M2三個靶抗原蛋白，且成功連接形成抗原蛋白三聯體。實施例二抗體製備抗體(a)及抗體(c)、抗體(b)用下述方法來實現膠體金層析法肝病檢測試紙的 製備。其中抗人IgG、抗體(c)及抗體(b) —般可通過在動物上經多次皮下(sc)或腹膜內 (ip)注射純化的免疫原和佐劑而產生。通過將0. 05mg Img免疫製劑(分別針對山羊或小鼠)與3倍體積的Freund’s 完全佐劑混合，將該溶液在皮內多部位注射，一個月後將動物用1/5至1/10原初量的人IgG 的Freund』 s完全佐劑混合液經多部位皮下注射而加強免疫。7 14天後將動物放血，測 定血清抗人IgG滴度。對動物加強免疫直至滴度達到平臺期。在許多免疫學教科書中描 述了生產多克隆抗體的方法，例如，陳學清等《免疫學常用實驗方法》。通過從被免疫的動 物回收脾細胞並使細胞永生化，例如通過與骨髓瘤細胞融合或通過Epstein-Ban·病毒轉 化，並且篩選能表達目的抗體的單克隆抗體(Kohler，Milstein. Derivation ofspecific antibody-producing tissue culture and tumor lines bycell fusion[J]. European Journal of Immunology, 1976 :501-511)。可通過大腸桿菌原核表達克隆化基因來製備重組葡萄球菌A蛋白和鏈球菌G蛋 白，具體操作方法參見J.薩姆布魯克等(分子克隆實驗指南.[M]，2002 1228-1232)，或購 買商品化的SPA或ftOtein G。實施例三羊抗人IgG標記羊抗人IgG的標記用0. IM碳酸鉀調節膠體金pH 8. 0 9. 0，按每毫升膠體金溶 液緩慢加入8 12 μ g羊抗人IgG，攪拌10 30min，然後加入BSA至終濃度0. 5 1 %，攪 拌10 30min，離心，棄上清，將沉澱用洗滌液洗滌2 3次，末次用十分之一初始體積的保存液將沉澱重懸，置4°C備用。實施例四兔IgG標記兔IgG的標記用0. IM碳酸鉀調節膠體金pH值至7. 0 8. 0，按每毫升膠體金溶 液緩慢加入8 12 μ g兔IgG，攪拌10 30min，然後加入BSA至終濃度0. 5 1 %，攪拌 10 30min，離心，棄上清，將沉澱用洗滌液洗滌2 3次，末次用十分之一初始體積的保存 液將沉澱重懸，置4°C備用。實施例五葡萄球菌A蛋白(SPA)的標記SPA蛋白的標記用0. IM碳酸鉀調節膠體金pH值至5. 0 6. 5，按每毫升膠體金 溶液緩慢加入10 15 μ gSPA蛋白，攪拌10 30min，然後加入BSA至終濃度0. 5 1 %， 攪拌10 30min，離心，棄上清，將沉澱用洗滌液洗滌2 3次，末次用十分之一初始體積的 保存液將沉澱重懸，置4°C備用。實施例六鼠抗人IgG的標記鼠抗人IgG的標記用0. IM碳酸鉀調節膠體金pH值至7. 0 8. 0，按每毫升膠體 金溶液緩慢加入8 12 μ g鼠抗人IgG，攪拌10 30min，然後加入BSA至終濃度0. 5 1 %，攪拌10 30min，離心，棄上清，將沉澱用洗滌液洗滌2 3次，末次用十分之一初始體 積的保存液將沉澱重懸，置4°C備用。實施例七本發明所述膠體金層析法肝病檢測試紙的製備方法步驟1，包被膜的製備用包被緩衝液將M2蛋白稀釋到1. 0 1. 5mg/mL,調整ΒΙΟ-Dot儀器，噴塗檢測線 (T)，靠近結合墊端，距結合墊端約9. 5mm ；用包被緩衝液將羊抗兔IgG稀釋到0. 8 1. 5mg/ mL，用ΒΙΟ-Dot儀器噴塗羊抗兔IgG於質控線(C)靠近吸水墊，距吸水墊約9mm。兩線距離 約5 8mm，噴線應粗細均勻。37°C烘乾，封裝備用。其中的包被緩衝液可以是硼酸鹽，碳酸鹽，磷酸鹽，Tris-HCl或Tris-磷酸鹽，醋 酸鹽，巴比妥，等等，其緩衝液的目的為提供一定pH和離子強度使蛋白包被並牢固包被於 NC膜，其緩衝液pH值一般約為6 9. 5範圍內，優選為6. 5 7. 5的中性緩衝範圍內，且最 優選緩衝液的PH值為7. 0 7. 4範圍內。緩衝液優選為磷酸鹽。其中的NC膜可以為任何商品化硝酸纖維素膜，S&S AE99、whatman 8 μ m、 millipore M135,sartorius CN140等。使用的具體的NC膜不是本發明的關鍵，但是在每次 測定中，上述幾種NC膜可以作為優選。不同廠家使用的含不同表面活性劑的不同緩衝液處 理的膜，與所用檢測線抗體溶液親和力有不同程度的差距，也會很大程度造成線條不均勻， 拖帶或是彌散的現象，因此運用組裝試紙來選擇優選的NC膜。2.膠體金溶液製備將0. 01 %的HAuCl4溶液加熱至沸騰，迅速加入每IOOmL HAuCl4溶液加入還原劑 溶液，開始有些藍色，然後淺藍、藍色，再加熱出現紅色，煮沸7 IOmin出現透明的橙紅色。 再用超濾或微孔濾膜(0.45μπι)過濾，以除去其中的聚合物和其它可能混入的雜質。製備 好的膠體金外觀應純淨、透亮、無沉澱和漂浮物，液面出現油狀物和大量黑色顆粒狀沉澱物 時棄用。其中所使用的還原劑可以為檸檬酸三鈉(Frens 1973)、鞣酸-檸檬酸三鈉(Slot與Gueeze 1985年)、白磷，優選使用檸檬酸三鈉，更優選地使用檸檬酸三鈉。其中所用玻璃容器應絕對清潔，用前需經酸洗、矽化。其水應為去離子超純水，電 阻率達18. 2ΜΩ。3.金標抗體的製備參見實施例3、實施例4、實施例5、實施例6。其中所述洗滌液也即保存液為含0.2 大分子蛋白的硼酸鹽，碳酸鹽，磷酸 鹽，Tris-HCl或Tris-磷酸鹽，醋酸鹽，巴比妥，等等，大分子蛋白可以為牛血清白蛋白、 PEG20000、酪蛋白等，緩衝液優選為磷酸鹽緩衝液，更優選為0. 2% BSA pH7. 2磷酸鹽緩衝液。4.結合墊的預處理用緩衝液將聚脂膜浸泡30分鐘，37°C烘乾。可以用於此目的的緩衝液包括(a)含有 1% PVA,0. 71% Na3PO4U% BSA,0. 05% NaN3>0. 1% TritonX-IOO ；(b) 1% PVAU% BSA,0. 05% PR0CLIN 300、0. 1% TritonX-100, ρΗ7· OPBS ；(c) 1% PVAU% BSA、0. 05% PR0CLIN 300, ρΗ7· 0 PBS ；(d)含有 1% PVA,0. 71% Na3PO4U% BSA,0. 05% NaN3>0. 1% Tween-20 ；(e)含有 PVA、0. 71 % Na3PO4U% BSA.0. 05% NaN3、0. 1 % Tween-20,pH7. OPBS ； 本文所述測定法優選的緩衝液是緩衝液(a)，因為它具有區別陰陽性樣品的最大解析度。 PR0CLIN 300和NaN3起防腐作用，而Tween-20具有去汙和親水作用。5.結合墊的製備將金標抗人IgG (a)和金標抗體(b)按一定比例混合，用BIO-Dot儀器0. 5 4 μ 1/ cm噴塗在預處理的聚脂膜上，25°C 30°C乾燥，待乾燥完畢之後，封袋，置2°C 8°C備用。6.樣品墊的處理將樣品墊按45mL/片用處理液均勻灑塗於樣品墊上，於37°C烘乾後，用鋁箔袋封
裝 備用ο可以用於此目的的緩衝液包括(a)0.05M Borax,0. OlMPBS(pH7. 0) ,0. 1% Sodium CaseinU % PEG20000、2 % BSA、0. 05 % NaN3 ； (b)0. 05M Borax,0. 01MPBS (pH 7. 0)、0. 1 % Sodium CaseinU % PEG20000、2 % Casein,0. 05 % NaN3 ； (c) 0. 05M Tris-cl(pH 7.0)、 0. 01MPBS、0. 1% Sodium CaseinU% PEG20000,2% Casein,0. 05% Na 。本文所述測定法 優選的緩衝液是緩衝液(a)，因為它具有區別陰陽性樣品的最大解析度，NaN3起防腐作用。7.原材料預裁剪玻璃纖維膜的裁切用裁切機將玻璃纖維膜切成與PVC膠板等長度即長^cm，寬 2. km，置乾燥房間備用。吸水紙的裁切用裁紙機將吸水紙切成與PVC板等長度即長^cm,寬3cm，置乾燥 房間備用。聚脂膜的裁切用裁紙機將其切成與PVC板等長度即長^cm,寬1cm，置乾燥房備用。將硝酸纖維素膜、吸水紙、聚脂膜、玻璃纖維膜按圖1所示依次層疊在PVC塑料底 板上，組成大板。組裝車間溫度應控制在25°C 37°C，溼度20% 30%。
8.切條用切條機將大板切成單人份，每人份寬度按照一定要求切成2. 5mm 4mm的寬度， 隨機抽檢，靈敏度能檢出室內質控樣品(即弱陽性樣本)，條帶顯色程度達到如圖2d，且無 非特異性條帶，則產品通過質控規定成為合格產品。9.組裝、包裝將1人份已切好的試紙組裝在備好的試紙卡裡，使加樣窗對應試紙的樣品墊，結 果顯示窗對應檢測區和控制區，組裝車間溫度應控制在25°C 37°C，溼度20 % 30 %。再 與一包幹燥劑、說明書、樣品加樣器封裝在外包袋裡，於4 25°C避光保存。實施例八確定金標抗體(a)和金標抗體(b)的混合比例以金標羊抗人IgG和兔IgG為例來說明比例的確定，其他抗體如鼠抗人IgG和兔 IgG、葡萄球菌A蛋白和兔IgG、鏈球菌G蛋白和兔IgG也可據此方法來確定。1.在實施例7的步驟3中，所述兩者混合比例確定具體為通過預實驗基本確定 金標兔IgG的0D20，用ΒΙΟ-Dot噴量1 μ 1/cm噴於結合墊上，用0. OlMPBS為上樣緩衝液，即 能得到預期的顏色強度的條帶，確定兔IgG的應用OD噴量為1 μ 1。2.隨後將金標羊抗人IgG進行梯度稀釋到終濃度0D100、80、60、40、20，然後將金 標兔IgG稀釋到終濃度0D20，用ΒΙΟ-Dot將以上金標羊抗人IgG和金標兔IgG混合物噴量 為3μ 1/cm噴於處理好的聚酯膜，將製備的包被膜、結合墊、樣本墊、吸水墊依次粘貼於塑 料底板上，用陽性血清、臨界參考值血清、陰性血清為調試對象。判定依據陽性血清的檢測 線(T)和質控線(C)兩者的條帶顏色強度一致為依據，臨界參考值血清能出現，陰性血清無 條帶出現的那個OD值，即為這批的應用量。通過本試驗得出0D20 40較為符合要求。實施例九試紙組成及試劑配製本發明提供的一種膠體金層析法肝病檢測試紙的組成是在支撐塑料PVC板(7) 上順次相互搭接地粘貼硝酸纖維素包被膜(3)、結合墊O)、樣品墊(1)、吸水墊G)。所述 的結合墊( 上包被有金標抗體(a)和金標抗體(b)，所述硝酸纖維素包被膜( 有檢測線 和質控線，檢測線(T)包被有M2型線粒體抗原蛋白(5)，質控線處(C)包被有抗體(c)，其 中，M2型線粒體抗原蛋白來源於商品化的純化基因工程抗原蛋白，或者自行製備。將重組表達的M2型線粒體抗原蛋白引入到膠體金層析法肝病檢測試紙，能實現 血液樣本中的M2型抗線粒體抗體的檢測，能快速、便捷地輔助診斷原發性膽汁肝硬化。本發明所述的膠體金層析法肝病檢測試紙，所用的試劑配製如下1.包被緩衝液的配製9gNacl、l. 15gNa2HP04,0. 23g NaH2P04、IOgSucrose、 0. 5gEDTA溶於IL超純水中，過濾置於4°C備用。2. HAuCl4的配製用超純水溶解氯金酸，配成溶液，置4°C備用，有效期四個 月。IOOOmL HAuCl4溶液配方IOg HAuCl4、超純水定容至1000mL。3.1%檸檬酸三鈉(Sodium Citrate)的配製用超純水溶解Sodium Citrate，配 成1 %溶液，0. 22 μ m膜濾過，現配現用。4.0. IMK2CO3的配製用超純水配製，0. 22 μ m膜濾過，置4°C備用，有效期一個月。 IOOOmL 0. IM K2CO3 溶液配方:13. 8g K2CO3 ；超純水定容至 IOOOmL05. 10% BSA的配製用超純水配製，0. 05%疊氮鈉(NaN3)，0. 22 μ m膜濾過，置4°C 備用，有效期兩周。IOOOmL 10% BSA溶液配方100gBSA，0. 5g NaN3 ；超純水定容至lOOOmL。
6.洗滌液也即保存液的配製2% BSA,0. 05% (NaN3) >0. OlM pH 7. 2PBS，0. 22 μ m 膜濾過，置 4°C備用，有效期兩 周。IOOOmL 標記洗滌保存液配方:20g BSA,0. 5g NaN3、0. OlM pH 7. 2 PBS 定容至 IOOOmL07.金標稀釋液的配製IOOOmL 稀釋液的配製2. 423g tris，lOgBSA，0. 2gNaN3 溶於超純水中，調 pH 8.0， 定容到1000mL。用稀釋液將金標稀釋到工作濃度後，加入20% Sucrose和5%的海藻糖。實施例十樣本處理取全血1 5ml,自然凝集5分鐘後，3000 5000g/5min lOmin，取上清即得到 待測樣品溶液，至少有100 μ 1以上待測樣品溶液。用微量加樣器吸取以上血清50 70 μ 1樣本於樣品墊，緩慢加樣。或者用吸管將 血清樣本緩慢滴加3 5滴於樣品墊上，5 IOmin觀察結果，根據條帶出現情況來判讀陰 陽性結果。實施例十一試劑盒的檢測和臨床性能評估1.穩定性試驗1. 1 37 °C加速穩定性將試紙置於37°C進行加速實驗，每天取出用室內質控品進行測試，通過陰陽性參 考品(各10份)的陰陽性符合率的批內精密度來判斷試紙的穩定性。4個月後結果顯示， 質控品的檢測結果符合預期，各個陰陽性參考品的陰陽性符合率為100%。陰陽性參考品為 10份M2型抗線粒體抗體陽性血清和10份M2型抗線粒體抗體陰性血清。1.2 4°C穩定性實驗將試紙置於4°C進行常規穩定性實驗，每月取出用室內質控品測試，同樣通過陰陽 性參考品(各10份)的陰陽性符合率的批內精密度來判斷試紙的穩定性。12個月後結果 顯示，質控品檢測結果符合預期，各個陰陽性參考品的陰陽性符合率為100%。18個月後結 果顯示，各個陰陽性參考品的陰陽性符合率仍為100%。M個月後檢測結果顯示，出現一例 假陰性。綜合以上結果說明試紙在2 8°C貯存，2年內是穩定的。2.診斷靈敏度從臨床中收集到100份確診為原發性膽汁肝炎(PBC)病人的血清，用自製的膠體 金試紙按照說明書上的操作步驟對上面收集到的PBC病人血清進行檢測。5min後統計結果 如下
權利要求
1.一種膠體金層析法肝病檢測試紙，包括有硝酸纖維素包被膜、結合墊、樣品墊、吸水 墊，它們依次粘貼在底板上，其特徵在於所述的結合墊包被有金標抗體(a)和金標抗體(b)，所述的硝酸纖維素包被膜上有檢測線(T)和質控線(C)，其中的檢測線包被有M2型線粒體抗原蛋白，其中的質控線(C)包被有抗體(C)。
2.根據權利要求1所述的膠體金層析法肝病檢測試紙，其特徵在於抗體(a)為抗人 IgG單克隆抗體或抗人IgG多克隆抗體，或葡萄球菌A蛋白(SPA)或鏈球菌G蛋白(Protein G)中的一種或多種。
3.根據權利要求2所述的膠體金層析法肝病檢測試紙，其特徵在於抗體(a)中的多 克隆抗體為鼠源、馬源、羊源、兔源或豚鼠源中的一種，抗體(a)中的單克隆抗體為鼠源或 兔源中的一種。
4.根據權利要求1所述的膠體金層析法肝病檢測試紙，其特徵在於抗體(b)和抗體 (c)均為單克隆抗體或多克隆抗體中的一種，其中(b)和(c)可發生特異性結合形成免疫復 合物。
5.根據權利要求4所述的膠體金層析法肝病檢測試紙，其特徵在於抗體(b)和抗體 (c)中的多克隆抗體為鼠源、馬源、羊源、兔源或豚鼠源中的一種，單克隆抗體為鼠源或兔源 中的一種。
6.根據權利要求1所述的膠體金層析法肝病檢測試紙，其特徵在於檢測線上包被的 蛋白為通過原核表達克隆化基因獲得的M2型線粒體抗原蛋白。
7.一種膠體金層析法肝病檢測試紙的製備方法，該試紙如前述的權項1-6所述，該試 紙由硝酸纖維素包被膜、結合墊、樣品墊、吸水墊和底板共同組成，其特徵在於該方法包括 有以下步驟步驟1，抗原的製備，是通過原核表達克隆化基因獲得M2線粒體抗原蛋白， 以及包被膜的製備，是用包被膜緩衝液稀釋抗原蛋白至濃度為1. 0 1. 5mg/mL，將抗 體(c)稀釋到0. 8 1. 5mg/mL,以1 10 μ 1/cm硝酸纖維素膜上，置放於37°C烘乾備用， 以及金標抗體的製備，是用0. IM碳酸鉀調節膠體金pH 7.0 9. 0，按每毫升膠體金 溶液緩慢加入4 25 μ g蛋白，攪拌10 30min，然後加入BSA至終濃度0. 5 5%，攪拌 10 30min，離心，棄上清，將沉澱用洗滌液洗滌2 3次，末次用十分之一初始體積的保存 液將沉澱重懸，置4°C備用，以及結合墊的製備，是經處理液浸漬處理的聚脂膜，烘乾後，將金標抗體(a)和金標抗 體(b)混合後，以0. 5 4μ 1/cm的用量噴塗在預處理的聚脂膜上，25°C 30°C乾燥後，置 於2°C 8°C的環境下備用，以及樣品墊的製備，是經處理液浸漬處理的玻璃纖維膜，於37°C烘乾後備用； 步驟2，在底板上順次相互搭接粘貼經前述步驟1所製作完成的硝酸纖維素包被膜、結 合墊、樣品墊、吸水墊；步驟3，對步驟2所製作完成的材料，切割成試紙條。
8.根據權利要求7所述的膠體金層析法肝病檢測試紙的製備方法，其特徵在於所述 的步驟1中，金標抗體的製備方法為用0. IM碳酸鉀調節膠體金pH值至8. 0 9. 0，按每毫 升膠體金溶液緩慢加入8 12 μ g羊抗人IgG，攪拌10 30min，然後加入BSA至終濃度/0. 5 1 %，攪拌10 30min，離心，棄上清，將沉澱用洗滌液洗滌2 3次，末次用十分之一 初始體積的保存液將沉澱重懸，置4°C備用。
9.根據權利要求7所述的膠體金層析法肝病檢測試紙條的製備方法，其特徵在於所 述的步驟1中，金標抗體的製備方法為用0. IM碳酸鉀調節膠體金pH值至7. 0 8. /0，按每毫 升膠體金溶液緩慢加入8 12 μ g兔IgG，攪拌10 30min，然後加入BSA至終濃度0. 5 1 %，攪拌10 30min，離心，棄上清，將沉澱用洗滌液洗滌2 3次，末次用十分之一初始體 積的保存液將沉澱重懸，置4°C備用。
10.根據權利要求7所述的膠體金層析法肝病檢測試紙的製備方法，其特徵在於所述 的步驟1中，金標SPA的製備方法為用0. IM碳酸鉀調節膠體金pH值至5. 0 6. /5，按每毫 升膠體金溶液緩慢加入10 15 μ g SPA,攪拌10 30min，然後加入BSA至終濃度0. 5 1 %，攪拌10 30min，離心，棄上清，將沉澱用洗滌液洗滌2 3次，末次用十分之一初始體 積的保存液將沉澱重懸，置4°C備用。然後將金標SPA OD 20 2 4μ 1/cm噴塗於結合墊， 乾燥後備用。
11.根據權利要求7所述的膠體金層析法肝病檢測試紙的製備方法，其特徵在於所述 的步驟1中，金標SPA的製備方法為用0. IM碳酸鉀調節膠體金pH值至7. 0 8. /0，按每毫 升膠體金溶液緩慢加入8 12 μ g鼠抗人IgG，攪拌10 30min，然後加入BSA至終濃度 0. 5 1 %，攪拌10 30min，離心，棄上清，將沉澱用洗滌液洗滌2 3次，末次用十分之一 初始體積的保存液將沉澱重懸，置4°C備用。然後將金標SPA OD 30 2 4μ 1/cm噴塗於結 合墊，乾燥後備用。
12.根據權利要求7所述的膠體金層析法肝病檢測試紙的製備方法，其特徵在於所 述的步驟1中，將製備好的金標抗體(a)和金標兔IgG按20 40/15 20比例混合，用 ΒΙΟ-Dot噴膜機以2. 0 4 μ 1/cm噴於預處理的聚脂膜上，25°C 37°C乾燥，封袋，置2°C 8 °C備組裝粘板用。
13.根據權利要求7所述的膠體金層析法肝病檢測試紙的製備方法，其特徵在於所述 的步驟3中，切割成的試紙條的寬度優選為4mm和3mm兩種。
全文摘要
本發明公開了膠體金層析法肝病檢測試紙，以及製備方法。本發明所述的膠體金層析法肝病檢測試紙，是在PVC塑料底板上順次相互搭接地粘貼硝酸纖維素包被膜、結合墊、樣品墊、吸水墊而形成的膜條，硝酸纖維素膜有檢測線和質控線，檢測線包被M2型線粒體抗原蛋白，質控線包被抗體(c)，結合墊包被金標抗體(a)和金標抗體(b)。本發明所述的試紙條引入M2型線粒體抗原蛋白，並對結合墊和樣品墊進行了工藝優化，實現了對M2型抗線粒體抗體的高靈敏度、高特異、高準確性的檢測性能。
文檔編號G01N33/577GK102062777SQ20091019870
公開日2011年5月18日 申請日期2009年11月12日 優先權日2009年11月12日
發明者孫宏彬, 孫瀟, 張宇婷, 張玥, 楊超文, 錢傑, 韓永俊, 高成秀 申請人:上海科新生物技術股份有限公司