核酸擴增方法
2023-10-24 11:08:57 2
專利名稱：核酸擴增方法
技術領域：
本發明涉及核酸擴增方法，特別是使用經化學修飾的引物和環狀單鏈DNA的組合的核酸擴增方法、利用上述方法檢測是否存在目標基因的方法以及在上述方法中使用的檢測用試劑盒。
背景技術：
現在，在研究機構、醫療機構、檢查機構及其它各種現場，基於目標基因的特異性鹼基序列的分析方法和檢測方法被廣泛使用。例如，在分析和檢測人和動物等生物體來源的試樣(體液或細胞片)或來源於環境的試樣中所含的病原菌、黴菌、蟎等過敏原等病原性的微生物和微小動物、病毒和花粉等的存在時，也採用了檢測這些檢測對象所具有的目標基因的特異性鹼基序列的方法。檢測這些核酸(DNA、RNA)的方法與檢測蛋白質的方法相比，能夠在短時間內以高靈敏度進行。而且，即使試樣中原本所含的核酸量在檢出限 (detection limit)以下，也可以使用無細胞系較為簡單且特異性地擴增。由於這些優點， 利用擴增核酸的方法或與擴增核酸的方法組合來檢測目標基因中的特異性鹼基序列的方法被廣泛開發。目前，作為最常用的核酸擴增方法，可以列舉利用溫度循環進行數十次的模板的變性、引物與模板的退火、DNA聚合酶延伸反應的循環，從而擴增夾在引物對之間區域的核酸的PCR法。但是，在利用溫度循環擴增核酸的方法中，存在用於控制溫度循環的機器(熱循環儀等)價格高、需要對核酸擴增的最佳溫度循環進行研究和設定等問題，因此近年來開始考慮不利用溫度循環而在一定溫度條件下進行DNA聚合酶延伸反應的核酸擴增方法。其代表性的方法可列舉LAMP(環介導等溫擴增，Loop-Mediated Isothermal Amplification)法(專利文獻1)，除此之外，為了克服成本、檢測方法的設計和操作、檢測靈敏度等問題，還正在開發利用與環狀單鏈DNA的組合的核酸擴增方法(專利文獻2)。但是，即使利用上述方法，在試樣中所含有的檢測對象核酸為微量的情況下，也存在檢測靈敏度未必充分的情況。因此，需要擴增效率和檢測靈敏度進一步提高的新的核酸擴增方法和檢測方法。現有技術文獻專利文獻專利文獻1 國際公開第2000/28082號小冊子專利文獻2 國際公開第2008/(^6719號小冊子
發明內容
發明要解決的問題本發明的目的在於提供一種基於新原理的核酸擴增方法，該方法能夠簡便地且在短時間內高效擴增具有特定鹼基序列的核酸；另外提供利用了該方法的核酸檢測方法。用於解決問題的方案
本發明人發現，對具有特異性鹼基序列的模板核酸分子，通過使用具有與上述鹼基序列的3』端側相鄰的區域的互補鹼基序列且3』端經化學修飾的引物以及含有上述特異性鹼基序列的環狀單鏈DNA的組合，連鎖地進行DNA聚合酶延伸反應，能夠解決上述課題， 由此完成了本申請發明。S卩，本發明提供一種核酸擴增方法，其特徵在於，包括(a)使用含有擴增對象鹼基序列的模板DNA、和包含具有與上述鹼基序列的3』端側相鄰的區域的互補鹼基序列且3』端經化學修飾的引物的引物對來進行DNA聚合酶延伸反應，得到直鏈狀DNA片段；和(b)以含有擴增對象鹼基序列的環狀單鏈DNA作為模板，以由(a)得到的直鏈狀 DNA片段的3』端作為複製起點，進行鏈取代型DNA聚合酶延伸反應。另外，本發明提供一種核酸擴增用試劑盒，其含有(i)包含具有與擴增對象鹼基序列的3』端側相鄰的區域的互補鹼基序列且3』端經化學修飾的引物的引物對；(ii)含有擴增對象鹼基序列的環狀單鏈DNA ；(iii)鏈取代型DNA聚合酶；(iv)dNTP。另外，本發明提供一種檢測雙鏈的目標核酸分子的方法，其包括(a)在檢測對象試樣中添加包含具有與目標核酸分子的目標鹼基序列的3』端側相鄰的區域的互補鹼基序列且3』端經化學修飾的引物的引物對、含有目標鹼基序列的環狀單鏈DNA、鏈取代型DNA聚合酶和dNTP，在上述鏈取代型DNA聚合酶具有活性的溫度下進行酶反應；(b)確認在進行了酶反應的試樣中核酸是否被擴增；和(c)在核酸被擴增時，確定檢測對象試樣中存在雙鏈的目標核酸分子。另外，本發明提供一種檢測單鏈的目標核酸分子的方法，其包括(a)在檢測對象試樣中添加具有與目標核酸分子的目標鹼基序列的3』端側相鄰的區域的互補鹼基序列且3』端經化學修飾的引物、具有與目標核酸分子的上述目標鹼基序列的區域不同區域的目標鹼基序列的3』端側相鄰的區域的鹼基序列且3』端經化學修飾的引物、含有上述目標鹼基序列的環狀單鏈DNA、鏈取代型DNA聚合酶和dNTP，在上述鏈取代型DNA聚合酶具有活性的溫度下進行酶反應；(b)確認在進行了酶反應的試樣中核酸是否被擴增；和(d)在核酸被擴增時，確定檢測對象試樣中存在單鏈的目標核酸分子。另外，本發明提供一種雙鏈的目標核酸分子的檢測用試劑盒，其含有(i)包含具有與雙鏈的目標核酸分子的目標鹼基序列的3』端側相鄰的區域的互補鹼基序列且3』端經化學修飾的引物的引物對；(ii)含有目標鹼基序列的環狀單鏈DNA ；(iii)鏈取代型DNA聚合酶；和(iν) dNTP。另外，本發明提供一種單鏈的目標核酸分子的檢測用試劑盒，其含有(i)具有與單鏈的目標核酸分子的目標鹼基序列的3』端側相鄰的區域的互補鹼基序列且3』端經化學修飾的引物；(ii)具有與目標核酸分子的上述目標鹼基序列的區域不同區域的3』端側相鄰的區域的鹼基序列且3』端經化學修飾的引物；(iii)含有目標鹼基序列的環狀單鏈DNA ；(iv)鏈取代型DNA聚合酶；和(v)dNTP。發明的效果通過本發明，得到能夠在短時間內且特異性地擴增核酸的核酸擴增方法，通過利用該方法，能夠提高核酸的檢測靈敏度。
圖1示出本發明的核酸擴增方法的原理(第一階段)。圖2示出由第一階段生成的直鏈狀單鏈DNA和環狀單鏈DNA的對應。圖3示出本發明的核酸擴增方法的原理(第二階段)。圖4示出以λ DNA作為模板時的引物F_in、R_in、F_out、R-out的對應區域和目標序列的區域A和B。圖5示出實驗1 實驗3的結果。圖6示出實驗4 實驗6的結果。圖7示出實驗7 實驗9的結果。圖8示出實驗10 實驗13的結果。圖9示出比較實驗1 比較實驗4的結果。圖10示出實驗14 實驗15的結果。圖11示出實驗16 實驗17的結果。圖12示出實驗18 實驗21的結果。圖13示出實驗22 實驗25的結果。圖14示出表5的實驗3的樣品的電泳結果。
具體實施例方式在本發明的核酸擴增方法中，通過DNA聚合酶延伸反應，可獲得含有一個作為擴增對象的鹼基序列或含有作為擴增對象的鹼基序列多次重複而成的多種鏈長的擴增產物， 連鎖進行這些擴增產物發揮模板或複製起點作用的進一步的DNA聚合酶延伸反應，能夠高效擴增作為擴增對象的鹼基序列。本發明的含有擴增對象鹼基序列(本說明書中也稱為「目標鹼基序列」)的模板 DNA為單鏈或雙鏈的直鏈狀或環狀的DNA，包含於該模板DNA中的擴增對象鹼基序列是模板 DNA中特異性區域中的鹼基序列。而且，本發明的方法還可以使用cDNA作為模板DNA而進行，所述cDNA是採用逆轉錄酶合成的與RNA分子互補的鹼基序列。此時，本發明的擴增對象鹼基序列是RNA分子中的尿嘧啶(U)鹼基換成胸腺嘧啶(T)的鹼基序列。在本發明的擴增方法中使用的引物對包含具有與模板DNA中的作為擴增對象的目標鹼基序列的3』端側相鄰的區域的互補鹼基序列的引物，只要是能夠基於模板DNA獲得作為直鏈狀DNA片段的夾在引物對之間的區域即可。因此，模板DNA為雙鏈DNA時，引物對的各引物具有各個鏈上的目標鹼基序列。模板DNA為單鏈DNA時，引物對中的一條引物具有與存在於模板DNA鏈上的擴增對象鹼基序列不同區域的目標鹼基序列。這裡，本發明的上述引物對包含3』端經化學修飾的引物。在以3』端經化學修飾的引物作為起點進行DNA聚合酶延伸反應時，生成在途中含有經化學修飾的鹼基殘基的DNA 片段。若以上述DNA片段作為模板進一步進行DNA聚合酶延伸反應，則DNA聚合酶無法追加與上述經化學修飾的鹼基的部分對應的鹼基，因此DNA的延伸在即將到經化學修飾的鹼基之前停止(參照附圖，在後文中說明)。如上所述，本發明中能夠使用的化學修飾只要能夠使以包含其的DNA片段作為模板的DNA聚合酶延伸反應停止則沒有特別限定，本領域技術人員可以適當選擇。本發明中， 通過將引物上的3』端的鹼基變更為RNA殘基、LNA(鎖核酸=Locked Nucleic Acid)殘基或ENAQ' -0,4' -C-Ethylene Bridged Nucleic Acid，乙烯橋接核酸)殘基，或者變更為肌苷殘基，從而能夠進行上述化學修飾。進行化學修飾的3』端的鹼基數目沒有特別制限， 從3』端起例如能夠對1個、2個或3個鹼基進行化學修飾，通常只要僅對3』端的最末端的 1個鹼基進行化學修飾即能夠實施本發明。本發明中使用的引物對中只要對構成引物對的2種引物中的至少一種進行了化學修飾即可，但優選對2種引物均進行了化學修飾。本發明的方法可以使用至少一個引物對進行，使用多個引物對時，其數目並沒有上限，例如還可以設計為嵌套式來使用。例如為1 5對，優選為1 3對，更優選為2 3對，特別優選為2對。各引物與配對的引物和其它引物對的引物間優選不具有相同的序列或互補序列。配對的引物所結合的區域之間的相對距離(鹼基數)只要能夠進行本發明的反應即可，沒有特別限制，但優選最內側引物對的引物所結合的區域間的相對距離更小者，並且優選其外側的引物對與鄰接的內側引物對所結合的區域間的相對距離更小者。上述相對距離(鹼基數)優選為釙 11Λ，更優選為10 100b。作為本發明中使用的引物，只要能夠形成與模板DNA互補的雙鏈即可，沒有特別限制，優選8 40mer的引物，更優選16 25mer的引物。而且，模板DNA(目標鹼基序列) 或引物的GC含量、二級結構形成的容易程度等以及其它在引物設計中一般考慮的性質也都包含在本領域技術人員的技術常識範圍之內。這種引物的設計和合成可以使用本技術領域中通常使用的設計程序等手法來進行。以採用逆轉錄酶合成RNA分子中的鹼基序列而得的cDNA作為模板DNA使用時，同樣，可以根據該RNA分子是雙鏈還是單鏈而如上述那樣設計引物對。在本發明的方法中使用的環狀單鏈DNA含有上述擴增對象鹼基序列。環狀單鏈DNA可以設計為以一定間隔反覆含有多個上述擴增對象鹼基序列(即目標鹼基序列)，另外在對引物對的兩個引物均進行了化學修飾時，還可以含有一個各自的擴增對象鹼基序列或反覆含有多個各自的擴增對象鹼基序列。環狀單鏈DNA中，目標序列以外的區域的鹼基序列只要是本發明特異性反應即可，沒有特別限定，但優選較小者。另外，使用不具有3』 一5』核酸外切酶活性的鏈取代型 DNA聚合酶時，優選在與引物相同的鹼基序列的5』側上添加1個胸腺嘧啶(T)。
關於環狀單鏈DNA的鏈長，只要使本發明特異性反應即可，沒有特別限定，但優選為16b 1001Λ，更優選為20 100b。這種環狀單鏈DNA的設計和合成可以使用本技術領域中通常使用的設計程序等手法而進行。而且，環狀單鏈DNA還可以通過國際公開第 2008/026719號小冊子的圖6中所示的環狀單鏈DNA的製造方法來製造。本發明的方法中使用的DNA聚合酶優選具有鏈取代型5』 一 3』 DNA聚合酶活性， 正確合成鹼基對的互補鏈。而且，所述DNA聚合酶可以具有3』 一5』核酸外切酶活性，但優選不具有此活性，而且也優選不具有5』 一3』核酸外切酶活性。DNA聚合酶的最適溫度優選為50 90°C，更優選為60 72°C。作為這種DNA聚合酶，例如可以單獨或以試劑盒的形式獲得嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilus)來源的Bst DNA聚合酶大片段、火球菌(Pyrococcus)屬細菌來源的De印VentK (exo-)DNA聚合酶、嗜熱球菌(Thermococcus)屬細菌來源的 9degrees North DNA 聚合酶(New England Biolabs Incorporation 制)、HerculasewII Fusion DNA 聚合酶(STRATAGENE 公司制)、嗜熱球菌(Thermococcus)屬來源的 VentK (exo-) DNA 聚合酶、Therminator DNA 聚合酶、 Therminator II DNA M^B (New England Biolabs Incorporation M ) > KOD Dash DNA 聚合酶(東洋紡公司制)等。只要不抑制相互的酶活性，還可以同時使用兩種以上DNA聚合酶。利用DNA聚合酶進行的延伸反應還可以使用在一般的核酸擴增中使用的緩衝液 (含有Tris-HCl、KC1、(NH4) 2SO4、MgSO4等鹽類)，例如所使用的DNA聚合酶附帶的優化組成的緩衝液。在上述這種合適的緩衝液中添加模板DNA、本發明的引物對、本發明的環狀單鏈 DNA、鏈取代型DNA聚合酶和作為底物的4種脫氧核糖核苷三磷酸(dNTP :dATP、dCTP、dGTP、 dTTP)，將該反應溶液保持在鏈取代型DNA聚合酶具有該酶活性的溫度例如50 90°C、優選60 72°C，則不用進行溫度循環控制即可在同一容器中通過1次操作來高效擴增核酸。 而且，使用多個引物對時，能夠將本發明的反應溫度條件進一步設定在更低的條件，例如 30 50°C。DNA聚合酶延伸反應的溫度條件依賴於使用的鏈取代型DNA聚合酶具有活性的溫度。只要在使用的鏈取代型DNA聚合酶具有該酶活性的溫度範圍內即可，擴增反應整個過程不必都保持在相同溫度(等溫)亦可，但優選擴增反應整個過程保持在相同溫度(等溫)(同一溫度條件下)。核酸的擴增可以通過DNA聚合酶延伸反應中核酸被擴增時反應溶液中生成的焦磷酸鎂的沉澱來確認(國際公開第2001/083817號小冊子)。另外，還可以使用本技術領域中通常使用的核酸染色螢光染料等例如溴化乙錠、STOR Green I (Lonza公司制)等，按照常規方法根據螢光的有無和強度來確認核酸擴增。接著，用附圖具體說明本發明的核酸擴增方法的方式。首先，在第一階段，通過含作為擴增對象的特異性鹼基序列的模板DNA與引物對的DNA聚合酶延伸反應，獲得直鏈狀DNA片段(圖1)。以雙鏈的模板DNA中的兩個特異性鹼基序列區域A、B作為擴增對象時，將各區域在其中一條鏈上的序列設定為Al和Bi，另一條鏈上的序列設定為A2和B2 (圖1、(i))。引物對中，將一條引物Pl設計為具有與Al的3』端側相鄰的區域的互補鹼基序列，另一條引物P2設計為具有與B2的3』端側相鄰的區域的互補鹼基序列。圖1中，引物Pl和P2的3』端經修飾的情況以圓形符號表示。使用該引物對與上述模板DNA來進行DNA聚合酶延伸反應。以下，為了簡化說明， 僅著眼於包含區域Al和Bl的鏈(圖1的雙鏈的模板DNA的上側的鏈)上的反應進行說明。 首先，引物Pl與序列Al的3端側的區域結合(圖1、(ii))。然後，通過延伸反應，生成片段Cl，該片段Cl接著Pl的序列合成與A2相同的鹼基序列，然後隔開間隔合成與B2相同的鹼基序列(圖1、(iii))。所生成的片段還可以通過酶的作用而在延伸反應條件下自然地從模板DNA離開，解離成雙鏈(參照例如國際公開第2008/(^6719號小冊子的例1)，但通過在引物Pl的外側(5』端側)進一步設計引物Pl-out並使其退火而同樣地進行延伸，從而將由引物Pl合成的DNA片段從模板DNA剝離，能夠高效地解離成單鏈(圖1、(iv))。接著，將如上擴增的片段Cl作為模板，引物P2退火而進行反向的DNA延伸反應 (圖l、(v))。這裡，作為模板的DNA片段在A2的序列的5』端側含有化學修飾，因此該部分的延伸不進行，DNA的延伸在即將到含有化學修飾的鹼基之前停止(圖1、(vi))，生成DNA 片段C2。如對圖1的(iv)所說明的那樣，所生成的DNA片段C2還可以在延伸反應條件下自然地從模板DNA離開，解離成雙鏈，但與(iv)同樣地通過在反應中同時加入外側的引物 P2-out，從而將由引物P2合成的DNA片段從模板DNA剝離，能夠高效地解離成單鏈(圖1、 (vii))ο通過上述反應，得到5』端具有引物P2的序列、連續地具有與Bl相同的序列、然後隔開間隔具有與Al相同的序列、且延伸在此中斷的直鏈狀DNA片段。如上所述，這示出了將圖1的(i)的上側的鏈作為模板的情況，對於將下側的鏈作為模板的情況，也同樣地首先將引物P2作為模板而生成片段Dl (未圖示)，以該片段Dl作為模板，得到DNA延伸在途中停止而生成的直鏈狀DNA片段D2。由作為模板的雙鏈DNA的兩個鏈生成直鏈狀DNA片段C2 和D2，其在後述的第二階段與環狀單鏈DNA結合，該情況示於圖2。該所獲得的直鏈狀DNA 片段C2和D2成為第二階段的擴增反應開始時的複製起點。在第二階段作為模板的環狀單鏈DNA被設計為含有目標鹼基序列A2和/或Bl (圖 3、(i))。若使用這樣的環狀單鏈DNA，則在第一階段得到的直鏈狀DNA片段C2和D2均在環狀DNA上退火(參照圖2)，能夠進行以環狀單鏈DNA為起點的連鎖擴增反應。以下，為了簡化說明，僅對將直鏈狀DNA片段C2作為複製起點的情況進行說明。圖3中示出了含有與 A2、Bl和P2分別相同的鹼基序列的環狀單鏈DNA。如上所述，由於在第一階段獲得的直鏈狀DNA片段C2在3』端各自具有與目標序列互補的鹼基序列(Al)，因此該直鏈狀DNA片段的3』端區域(Al)與環狀單鏈DNA中的3』端部分的鹼基序列(A2)區域退火，成為複製起點，以環狀單鏈DNA作為模板發生DNA聚合酶延伸反應(圖3、(i))。合成的DNA鏈通過鏈取代型DNA聚合酶而剝離，與此同時呈滾環式延伸(圖3、(ii))。存在於反應溶液中的引物P2與該剝離延伸的DNA鏈發生退火，從而成為複製起點，發生DNA聚合酶延伸反應，以上述引物作為複製起點進行合成並剝離的DNA鏈與存在於反應溶液中的引物或環狀單鏈DNA 發生退火，從而發生DNA聚合酶延伸反應(圖3、(iii))。一旦作為第二階段開始的誘因的直鏈狀DNA片段被合成後，以上說明的第一階段的過程和第二階段的過程就平行地同時進行。而且，這樣進行連鎖的擴增反應，其結果是合成了含有1個作為擴增對象的特異性鹼基序列或含有作為擴增對象的特異性鹼基序列多次重複而成的多種鏈長的DNA鏈。
本發明的另一種方式是利用上述核酸擴增方法的原理的目標基因的檢測方法。本檢測方法可以根據檢測目標、檢測對象試樣的來源、目標基因等，在多種產業中的各種情況下進行。作為檢測目標基因的試樣，例如可以從人以及動物來源的體液或組織片來製備， 也可以從環境來源的土壤、海水、植物來製備，還可以是在工廠製造加工的飲料或食品、藥品等。它們直接或根據需要採用適當的操作製備出核酸(DNA、RNA)提取液，這種提取液可作為檢測對象試樣用於本發明的檢測方法中。這種試樣的製備可以按照一般的核酸檢測方法中使用的常規方法進行。目標基因可以為微生物(細菌、黴菌等)、過敏原(例如蟎、花粉等)、病毒中特異性的遺傳物質，而且也可以是人以及其它動物的基因組中的野生型或突變型基因。本檢測方法中，將上述核酸擴增方法的「模板DNA」和「擴增對象鹼基序列」分別替換為本檢測方法的「目標核酸分子(即目標基因)」和「目標基因中的目標鹼基序列」，該方法利用的是試樣中存在目標核酸分子(即目標基因)時，根據與上述核酸擴增方法相同的原理來擴增目標基因中的目標鹼基序列的核酸。在目標核酸分子為RNA時，通過在本發明的檢測方法的工序(a)的酶反應的工序中，在試樣中進一步添加逆轉錄酶(RNA依賴性DNA聚合酶)進行酶反應，可與上述核酸擴增方法同樣確認是否發生了以基於試樣中的RNA分子合成的cDNA鏈作為模板的核酸擴增， 在核酸被擴增時，確定為存在目標RNA分子，由此可以檢測目標RNA分子的存在。核酸擴增可與上述同樣地採用焦磷酸鎂的沉澱、或本技術領域中通常使用的核酸染色螢光染料等，以沉澱或螢光的有無作為指標進行確認。而且，還可以以焦磷酸鎂的生成量或螢光的強度作為指標，來比較作為檢測對象的試樣中存在的目標基因的核酸量的多少。這樣一來，通過使用本檢測方法，即使試樣中存在的目標基因的核酸極為微量，也可以在同一反應容器中通過一次操作高效擴增並檢測出目標基因中的特異性鹼基序列。本檢測方法還可以在例如微管、微孔板、微晶片(microchip)等反應容器中進行，而且還可以使用 HTS (高通量篩選，High-Throughput Screening)等技術。以下，通過實施例對本發明進行更具體的說明。實施例以下，通過實施例對本發明進行更具體的說明。需要說明的是，藥品名稱後沒有註明公司名的物質均為和光純藥工業公司製造。而且，只要沒有特別的說明，則溶劑為水。TE緩衝液^imol/Wris-HCl (三羥甲基氨基甲烷)鹽酸lmmol/1乙二胺四乙酸二鈉二水合物(EDTA)調整到pH8. 01.5% TAE 電泳用膠1.5% 瓊脂糖4mmol/lTris-HClImmol/IEDTAlmmol/1 醋酸
LB培養基蛋白腖1.0%酵母浸膏0.5%氯化鈉1.0%溶解後將pH調整到7.0[環狀單鏈DNA的合成]以下示出的酶製品、試劑盒製品只要沒有特別說明均按照使用說明書。將環狀單鏈DNA的合成中使用的引物記於下述表1和2。表1 環狀單鏈DNA的合成中使用的引物序列
權利要求
1.一種核酸擴增方法，其特徵在於，包括(a)使用含有擴增對象鹼基序列的模板DNA、和包含具有與上述鹼基序列的3』端側相鄰的區域的互補鹼基序列且3』端經化學修飾的引物的引物對來進行DNA聚合酶延伸反應， 得到直鏈狀DNA片段；和(b)以含有擴增對象鹼基序列的環狀單鏈DNA作為模板，以由(a)得到的直鏈狀DNA片段的3』端作為複製起點，進行鏈取代型DNA聚合酶延伸反應。
2.根據權利要求1所述的方法，其中，化學修飾為向RNA殘基、LNA殘基或ENA殘基的變更或者向肌苷殘基的變更。
3.根據權利要求1或2所述的方法，其中，對構成引物對的2種引物均進行了化學修飾。
4.根據權利要求1 3中任一項所述的方法，其中，進一步添加第二引物對來進行工序(a)，該第二引物對由在構成工序(a)中使用的引物對的各引物的5』端側分別進行了設計的2種引物構成。
5.根據權利要求1 4中任一項所述的方法，其中，在同一溫度條件下進行(a)和(b)。
6.根據權利要求1 5中任一項所述的方法，其中，含有擴增對象鹼基序列的模板DNA 含有由以RNA為模板的逆轉錄所得到的DNA鏈。
7.—種核酸擴增用試劑盒，其含有(i)包含具有與擴增對象鹼基序列的3』端側相鄰的區域的互補鹼基序列且3』端經化學修飾的引物的引物對；( )含有擴增對象鹼基序列的環狀單鏈DNA;(iii)鏈取代型DNA聚合酶；(iv)dNTPo
8.—種檢測雙鏈的目標核酸分子的方法，其包括(a)在檢測對象試樣中添加包含具有與目標核酸分子的目標鹼基序列的3』端側相鄰的區域的互補鹼基序列且3』端經化學修飾的引物的引物對、含有目標鹼基序列的環狀單鏈 DNA、鏈取代型DNA聚合酶和dNTP，在上述鏈取代型DNA聚合酶具有活性的溫度下進行酶反應；(b)確認在進行了酶反應的試樣中核酸是否被擴增；和(c)在核酸被擴增時，確定檢測對象試樣中存在雙鏈的目標核酸分子。
9.一種檢測單鏈的目標核酸分子的方法，其包括(a)在檢測對象試樣中添加具有與目標核酸分子的目標鹼基序列的3』端側相鄰的區域的互補鹼基序列且3』端經化學修飾的引物、具有與目標核酸分子的上述目標鹼基序列的區域不同區域的目標鹼基序列的3』端側相鄰的區域的鹼基序列且3』端經化學修飾的引物、含有上述目標鹼基序列的環狀單鏈DNA、鏈取代型DNA聚合酶和dNTP，在上述鏈取代型 DNA聚合酶具有活性的溫度下進行酶反應；(b)確認在進行了酶反應的試樣中核酸是否被擴增；和(d)在核酸被擴增時，確定檢測對象試樣中存在單鏈的目標核酸分子。
10.一種雙鏈的目標核酸分子的檢測用試劑盒，其含有(i)包含具有與雙鏈的目標核酸分子的目標鹼基序列的3』端側相鄰的區域的互補鹼基序列且3』端經化學修飾的引物的引物對； ( )含有目標鹼基序列的環狀單鏈DNA;(iii)鏈取代型DNA聚合酶；和(iv)dNTPo
11.一種單鏈的目標核酸分子的檢測用試劑盒，其含有(i)具有與單鏈的目標核酸分子的目標鹼基序列的3』端側相鄰的區域的互補鹼基序列且3』端經化學修飾的引物；( )具有與目標核酸分子的上述目標鹼基序列的區域不同區域的3』端側相鄰的區域的鹼基序列且3』端經化學修飾的引物；(iii)含有目標鹼基序列的環狀單鏈DNA;(iv)鏈取代型DNA聚合酶；和(v)dNTPo
12.根據權利要求10或11所述的檢測用試劑盒，其還含有(vi)逆轉錄酶。
全文摘要
本發明的目的在於提供一種基於新原理的核酸擴增方法，該方法能夠簡便地且在短時間內高效擴增具有特定鹼基序列的核酸；另外提供利用了該方法的核酸檢測方法。本發明提供一種核酸擴增方法，其特徵在於，包括(a)使用含有擴增對象鹼基序列的模板DNA、和包含具有與上述鹼基序列的3』端側相鄰的區域的互補鹼基序列且3』端經化學修飾的引物的引物對來進行DNA聚合酶延伸反應，得到直鏈狀DNA片段；和(b)以含有擴增對象鹼基序列的環狀單鏈DNA作為模板，以由(a)得到的直鏈狀DNA片段的3』端作為複製起點，進行鏈取代型DNA聚合酶延伸反應。
文檔編號C12N15/09GK102549154SQ201080041390
公開日2012年7月4日 申請日期2010年7月20日 優先權日2009年7月17日
發明者遠山將史 申請人:東洋制罐株式會社