一株枯草芽孢桿菌及其培養方法與應用的製作方法

2023-10-27 13:50:57

專利名稱：一株枯草芽孢桿菌及其培養方法與應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一株枯草芽孢桿菌及其培養方法與應用，屬於微生物技術領域。
背景技術：
枯草芽孢桿菌，是芽孢桿菌屬的一種，單個細胞，0.7 0.8X2 3微米，著色均勻。無莢膜，周生鞭毛，能運動。革蘭氏陽性菌，芽孢0.6 0.9X1.0 1.5微米，橢圓到柱狀，位於菌體中央或稍偏，芽孢形成後菌體不膨大。菌落表面粗糙不透明，汙白色或微黃色，在液體培養基中生長時，常 形成皺醭。需氧菌。可利用蛋白質、多種糖及澱粉，分解色氨酸形成吲哚。在遺傳學研究中應用廣泛，對此菌的嘌呤核苷酸的合成途徑與其調節機制研究較清楚。廣泛分布在土壤及腐敗的有機物中，易在枯草浸汁中繁殖。目前對枯草芽孢桿菌的研究報導非常多。如中國專利文獻CN1554744A(申請號200310104195.6)公開了一種枯草芽孢桿菌菌株，將其命名為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)B9601-Y2,保藏單位:中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏H:2003年6月18日，保藏號:CGMCC N0.0954。該枯草芽孢桿菌B9601-Y2，可用於防治植物不同類型病害及食用菌汙染，並能有效地促進植物生長和生根，對許多土傳植物病原物具有較好的控制作用、兼顧月季切花保鮮作用，能耐貯藏、抗逆性好，重新施入環境中也不會導致環境汙染。中國專利文獻CN102517235A (申請號201110443948.0)公開了枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)CH-001，已於2011年4月8日保藏於中國典型培養物保藏中心。保藏編號為=CCTCC NO:M2011111o該菌株具有廣譜降解角蛋白的特性，產酶活性高，穩定性好。不僅能產生高活性角蛋白酶，同時可降解膠原蛋白，對金黃色葡萄球菌等致病菌有拮抗作用，具有益生菌特性，適用於動物蛋白飼料添加劑、角蛋白酶發酵生產等。中國專利文獻CN102515891A (申請號201210003711.5)公開了一種微生物肥料，包含下列比例的微生物發酵液:光合細菌、乳酸菌、放線菌、康寧木黴菌、枯草芽孢桿菌發酵液體積比為1: 0.8 1: 1.2 1.4:0.6 0.8:1 1.2。該發明製備的肥料，可以提高肥料的利用效率，並且還能夠起到防治植物枯死、病害的作用。因此研究枯草芽孢桿菌新菌株對於開發新的微生物肥料具有重要意義。

發明內容
本發明針對現有技術的不足，提供一株枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)JUffEIOOl及培養方法與應用。本發明技術方案如下:一株枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)JUWE1001已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏號為CGMCC N0.7034，保藏時間為2012年12月24日，保藏地址為北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所。枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) JUffEIOOl為革蘭氏陽性菌，細胞杆狀，0.8 1.0X 1.2 1.8 μ m，30 35°C培養24 48h可形成大量芽孢，無伴胞晶體，芽孢大小為
0.7 0.9 X 1.0 1.5 μ m，不膨大，長圓形或圓柱形；在營養瓊脂上30 35°C培養I 3d可大量形成菌落，呈汙白色，粗糙有皺褶，不透明，不閃光，蔓延，邊緣不規則；在肉湯培養基中30 35°C培養24 48h，可在液面形成菌膜，液體內部渾濁；營養瓊脂穿刺培養時菌體在表面生長，底部不生長；接觸酶反應、甲基紅實驗、VP實驗均呈陽性，氧化酶反應與厭氧培養實驗呈陰性，可發酵葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖，可利用檸檬酸鹽、液化明膠、水解澱粉與酪素，硝酸鹽還原反應陽性。上述枯草芽孢桿菌JUWE1001的培養方法，步驟如下:①將枯草芽孢桿菌JUWE1001接種於牛肉膏蛋白腖斜面培養基，在35°C 39°C條件下，培養45 50h ；②挑取菌體接種於玉米粉液體培養基，培養溫度35°C 39°C，180 200rpm，培養時間22 26h,製得枯草芽孢桿菌培養液；③以I 5% (w/w)的接種量將步驟②製得的枯草芽孢桿菌JUWEI培養液接種於玉米粉發酵培養基中，發酵條件為:35 38°C,罐壓:0.05Mpa,通風0.8 lvvm,攪拌速度180 200rpm，培養時間為2 3天，即得。根據本發明優選的，所述步驟①中的牛肉膏蛋白腖培養基每百毫升組分如下:牛肉膏0.3g、蛋白腖lg、氯化鈉0.5g、瓊脂2g、pH7.0 7.2 ;根據本發明優選的，所述步驟②中的玉米粉液體培養基每百毫升組分如下:玉米粉 1.5g，豆柏粉 0.9g，磷酸氫二鈉 0.4g，磷酸二氫鉀 0.03g, MgSO40.1%，ρΗ6.8 7.0 ;根據本發明優選的，所述步驟③中的玉米粉發酵培養基，組分如下，均為重量百分比:玉米粉2.00% (w/w),豆柏粉7.00% (w/w),磷酸氫二鈉0.40% (w/w),磷酸二氫鉀0.03%(w/w), MgSO40.1% (w/w),消泡劑 0.02 0.05% (w/w), ρΗ6.8 7.0。上述試劑如無特別說明，均為本領域常規市售產品。上述枯草芽孢桿菌JUWE1001在製備微生物有機肥中的應用。有益效果本發明篩選的枯草芽孢桿菌JUWE1001抗逆性強，在生長過程中可產生豐富的具有高活力和植物病害防治功能的生理活性物質，具有促進土壤有機質分解，提高土壤控肥能力和土壤酶活性，改善土壤中微生物菌群結構，促進植物根系生長，抑制有害真菌、細菌、病毒和菌原體等作用。
具體實施例方式下面結合實施例對本發明的技術方案做進一步說明，但本發明所保護範圍不限於此。枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) JUWE1001已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏號為CGMCC N0.7034，保藏時間為2012年12月24日，保藏地址為北京市朝陽區北辰西路I號院3號， 中國科學院微生物研究所。實施例1枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) JUWE1001已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏號為CGMCC N0.7034，保藏時間為2012年12月24日，保藏地址為北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所。上述枯草芽孢桿菌JUWE1001由植株根際土壤中分離出的枯草芽孢桿菌原始菌株，經過紫外線誘變(I X IO7個/ml的菌懸液放於直徑9cm的培養皿內，紫外燈預熱20min,將培養皿至於磁力攪拌器上並使培養皿在20W紫外燈垂直距離30cm左右，照射150S)篩選出生長速度快、β-甘露聚糖酶、β葡聚糖酶、蛋白酶和抑菌活性較高的菌株經過平板試驗、拮抗試驗，篩選出生長速度快、產酶能力高、抑菌活性較強的菌株。枯草芽孢桿菌JUWE1001為革蘭氏陽性菌，細胞杆狀，0.8 1.0X1.2- 1.8ym,30 35°C培養24 48h可形成大量芽孢，無伴胞晶體，芽孢大小為0.7 0.9 X 1.0
1.5 μ m,不膨大,長圓形或圓柱形；在營養瓊脂上30 35°C培養I 3d可大量形成菌落，呈汙白色，粗糙有皺褶，不透明，不閃光，蔓延，邊緣不規則；在肉湯培養基中30 35°C培養24 48h，可在液面形成菌膜，液體內部渾濁；營養瓊脂穿刺培養時菌體在表面生長，底部不生長；接觸酶反應、甲基紅實驗、VP實驗均呈陽性，氧化酶反應與厭氧培養實驗呈陰性，可發酵葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖，可利用檸檬酸鹽、液化明膠、水解澱粉與酪素，硝酸鹽還原反應陽性。將篩選出的該菌株連續轉接10代，其優良性狀遺傳穩定。原始菌株和突變菌株搖瓶培養24h後，發酵液(8000r/min，離心20min)中的β -甘露聚糖酶、β -葡聚糖酶、蛋白酶活性，結果如表I所示。由表I可知，突變株(枯草芽孢桿菌JUWE1001)在生長過程中比原始菌株具有更強的促進土壤有機質分解，提高土壤控肥能力和土壤酶活性的效果。盆栽實驗中枯草芽孢桿菌JUWE1001對黃瓜黃萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum)、西瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.niveum)的防治效果如表I所不。

表I枯草芽孢桿菌誘變結果
權利要求
1.一株枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)JUWE1001已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏號為CGMCC N0.7034，保藏時間為2012年12月24日，保藏地址為北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所。
2.如權利要求1所述的枯草芽孢桿菌JUWE1001的培養方法，其特徵在於，步驟如下: ①將枯草芽孢桿菌JUWE1001接種於牛肉膏蛋白腖斜面培養基，在35°C 39 °C條件下，培養45 50h ； ②挑取菌體接種於玉米粉液體培養基，培養溫度35°C 39°C，180 200rpm，培養時間22 26h，製得枯草芽孢桿菌培養液； ③以I 5%(w/w)的接種量將步驟②製得的枯草芽孢桿菌JUWEI培養液接種於玉米粉發酵培養基中，發酵條件為:35 38°C，罐壓:0.05Mpa,通風0.8 lvvm，攪拌速度180 200rpm，培養時間為2 3天，即得。
3.如權利要求1所述的培養方法，其特徵在於，所述步驟①中的牛肉膏蛋白腖培養基每百毫升組分如下:牛肉膏0.3g、蛋白腖lg、氯化鈉0.5g、瓊脂2g、pH7.0 7.2。
4.如權利要求1所述的培養方法，其特徵在於，所述步驟②中的玉米粉液體培養基每百毫升組分如下:玉米粉1.5g，豆柏粉0.9g，磷酸氫二鈉0.4g，磷酸二氫鉀0.03g,MgSO40.1%，ρΗ6.8 7.0。
5.如權利要求1所述的培養方法，其特徵在於，所述步驟③中的玉米粉發酵培養基，組分如下，均為重量百分比:玉米粉2.00% (w/w)，豆柏粉7.00% (w/w)，磷酸氫二鈉0.40%(w/w),憐酸二氫鉀 0.03% (w/w), MgSO40.1% (w/w),消泡劑 0.02 0.05% (w/w), ρΗ6.8 7.0。
6.權利要求1所述枯草芽孢桿菌JUWE1001在製備微生物有機肥中的應用。
全文摘要
本發明涉及一株枯草芽孢桿菌及其培養方法與應用，枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)JUWEI001已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏號為CGMCC NO.7034，保藏時間為2012年12月24日。本發明還涉及該枯草芽孢桿菌的培養方法與應用。本發明篩選的枯草芽孢桿菌JUWEI001抗逆性強，在生長過程中可產生豐富的具有高活力和植物病害防治功能的生理活性物質，具有促進土壤有機質分解，提高土壤控肥能力和土壤酶活性，改善土壤中微生物菌群結構，促進植物根系生長，抑制有害真菌、細菌、病毒和菌原體等作用。
文檔編號C12R1/125GK103146617SQ201310086488
公開日2013年6月12日 申請日期2013年3月18日 優先權日2013年3月18日
發明者趙欽剛, 孫中濤 申請人:濟南巨微生物技術有限公司