一種物質在pns中的新用途的製作方法

2023-09-22 05:48:05

專利名稱：一種物質在pns中的新用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種表現出CCK-8活性的物質用於製備治療外周神經系統神經病的藥物的用途。它還涉及一種含有至少一種表現出CCK-8活性的物質的藥物組合物。
背景技術：
外周神經病包括外周運動和感覺神經元的結構和功能的異常，並可能涉及整個神經元及它的部分。例如，外周神經系統神經病可以由手術誘發，作為受傷結果的損害，和作為與神經毒性化合物接觸後或化學或放射性癌治療後的副作用。而且，糖尿病患者經常遭受導致感覺神經元損害的外周神經病的痛苦，這種疾病可導致皮膚感染和傷口癒合受損。
神經生長因子(NGF)是最具特徵性的神經營養因子。它通過調節神經肽的表達而在外周感覺和交感神經神經元的生長和分化中起作用。NGF的外源性給藥已表現為促進神經肽合成並恢復選擇性化學損害後的神經功能(Donnerer J.1996，Neurosci Lett 22133-36；Donnerer J.等人，1996，Brain Res 741103-108)。因此，NGF可以用於治療外周神經病症。
但是，NGF的系統給藥仍存在一些問題NGF-分子在被注射至血液循環時表現的半衰期短，並且在需要使用高藥學劑量時表現出副作用。而且局部應用可能具有局部作用，但它一般不可能作用於外周神經系統的系統性異常。而且，NGF的外源性給藥有不純的問題，它可能導致變態反應。NGF的局部給藥還表現出對患者的毒性，而NGF難以滲透進入外周神經系統。已在糖尿病神經病的臨床試驗中測試了NGF的人體局部給藥(Apfel SC，等人，1998，Neurology 51695-702)。觀察到的不良事件是注射部位的痛覺過敏、擴散性肌痛以及在某些情況下的內臟疼痛。在被組織器官覆蓋的粘液膜上的局部應用也可能導致疼痛。
為了克服這些問題，適宜的是能夠通過給予具有NGF誘導活性的物質而誘導產生NGF。這些物質的一些實例是存在的(Riaz SS，等人，1996，Prog.Neurobiol，49125-143)。這些物質作為NGF誘導劑的大部分作用已採用體外模型加以描述，尤其是神經膠質細胞。雖然已知這些細胞產生NGF，但在外周NGF主要由神經支配靶體組織產生，因此由此考慮的證據並不支持所述的物質可以調節外周NGF表達的假設。
而且，還不清楚在觀察到的細胞培養物中繁殖的NGF是所用藥物的特異性和選擇性作用還是一般性的、非特異性的合成代謝作用。少數描述某些NGF誘導劑-兒茶酚胺的體內作用的研究限於對某些外周神經病模型的運動功能的恢復(Hanaoka Y，等人，1992，Exp.Neurol.，115(2)292-296；J.Neurol Sci.，1994，122(1)28-32；SaitaK，等人，1995，Neurotoxicology，16(3)403-412。
EP-A2-0239716證明了物質CCK-8影響表明CNS調節機理的動脈壓力。但是，該文獻並沒有表明任何涉及生長因子，包括NGF，如CCK-8的可能性。
Tirassa P.等人(Br J Pharmacol，1998，123(6)，1230-1236)證明CCK-8誘導腦中NGF水平的增長。該效果的部分是通過感覺傳入來調節的。
最近，本發明者發現使用已知用作中樞神經系統的神經遞質或表現出CCK-8活性的CCK-8的衍生物的神經肽CCK-8(Asp-Tyr(SO3H)-Met-Gly-Trp-Met-Asp-PheNH2)，(CCK-8為33個胺基酸長度的肽縮膽囊素(CCK)的第26-33個八肽)可以避免上述問題的方式在外周神經系統中產生神經生長因子。例如，CCK-8對外周器官的NGF刺激和隨後的恢復外周神經損害並不要求激活感覺傳入(參見實施例部分)。這顯示了在CNS和PNS中CCK-8誘導的NGF表達的另一種不同的機理。
發明簡述因此，本發明涉及表現出CCK-8活性的物質用於製備治療外周神經系統神經病的藥物的用途。在一個實施方案中，該物質為CCK-8，而在另一實施方案中，該物質為表現出CCK-8活性的CCK-8的衍生物。本發明還涉及一種含有上述物質的藥物組合物。
本發明者還表明CCK-8似乎作用於NGF的轉換率，而不是mRNA的合成。他們還表明CCK-8在正常劑量時似平不具有任何副作用。CCK-8是非常有效的，因此只需低劑量的給藥便可以實現期望的作用。CCK-8還具有對患者的鎮靜作用。
發明詳述如本文所公開的，表現出CCK-8活性的物質意指具有基本CCK-8樣神經營養素誘導活性的物質。它指在被外源性給予時，能夠以基本上與CCK-8一樣的方式誘導細胞產生神經營養素，尤其是神經生長因子(NGF)的CCK-8活性的物質。可以根據本文的實施例部分所述的方法測定CCK-8的活性。可以根據實施例部分所述的方法測定神經營養素，尤其是NGF的活性。
本發明的一個目的是表現出CCK-8活性的物質用於製備治療外周神經系統神經病的藥物的用途。可以在US-A-5631230中找到本發明可用的CCK-8的類似物的實例。其它表現出CCK-8活性的物質的實例如下胃泌素、變藍菌素、鈴蟾肽、藍肽、五肽胃泌素(及其類似物3-亮氨酸五肽胃泌素(3-leu-PG)、4-AspOBzl-五肽胃泌素(4-AspOBzl-PG))、GRP(胃泌素釋放肽)、CCK-8和CCK-4的環類似物、Sue-Try-N-(Me)-Hle-Asp-Phe-NH2、BC264、A71263、U67827E、苯二氮類，D-Tyr-Gly[(Nle28，31)CCK-26-33]、Suc-Trp-N(Me)-Nle-Asp-Phe-NH2、ARL 15849XX、ARL 16935XX、ARL 15745XX、Asp-Tyr-D-Phe-Gly-Trp-(N-Me)Nle-Asp-Phe-NH2(SNF 9007)、CCK-4(及其類似物CCK-4(Phet))、H-Tyr-環(D-Pen-Gly-Trp-L/D-3-反巰基脯氨酸)-Asp-Phe-NH2序列的環肽、H-Tyr-D-Val-Gly-Trp-L/D-3-反甲基巰基脯氨酸-Asp-Phe-NH2序列的線性肽、SNF 8702、環縮膽囊素肽類似物JMV-320、琥珀醯-Tyr-(SO3H)-Met-Gly-Trp-Met-苯乙醯胺、Boc-Trp-(N-Me)Nle-Asp-Phe-NH2和Boc-Trp-(N-Me)Phe-Asp-Phe-NH2、硫酸鹽化CCK-8(CCK-8S)和D-Tyr25-(Nle28，31)-CCK 25-33S、A71378、假胃泌素[(Glu)5-Ala-Tyr-Nle-Gly-Trp-Nle-Asp-Phe-NH2]、(脫NH2)Tyr(SO3-)-Nle-Gly-Trp-Nle-Asp-Phe-NH2、曲林菌素(asperlicin)、A71623、苯乙酯類似物OPE、U-67827E、Ac[X27，Nle28，Nle31]-CCK27-33，其中X為(L，D)Phe(對CH2CO2H)或(L，D)Phe(p-CH2CONHOH)、Ac[Phe(對CH2SO3H)27、Nle28，Nle31]-CCK27-33、Boc[Nle28，Nle31]-CCK27-33(BDNL)、作為CCK8中的Boc-Tyr(SO3H)的取代物Boc-Phe(對CH2)SO3H、乙醯基CCK-7、Ac-Phe(4CH2CO2H)-Met-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-NH2(28)、Ac-Phe[4-(四唑-5-基)]-Met-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-NH2(34)、3-[4-(羧甲基)-苯基]丙醯基-Met-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-NH2(50)、MK 329、L-364，718、Thr28NlE31CCK25-33(CCK9)、D-Tyr25(Nle28，31)-CCK(25-33)、[N-MeNle28，31]CCK26-33、環CCK類似物，其中28和31位已被賴氨酸殘基取代且其側鏈被琥珀酸部分橋連、Boc-[Nle28，31]-CCK-7、Boc-Trp-Leu-Asp-Phe-NH2、替氟朵、2-(氨基甲基)-和3-(氨基甲基)-1，4-苯二氮類、JMV 236(Boc-Tyr(SO3)-Nle-Gly-Trp-Nle-Asp-Phe-NH2)、CCK-JMV-180(BOC-Tyr(SO3)Ahx-Gly-Trp-Ahx-Asp2苯基乙基酯)、BOC(Nle28；Nle31)CCK27-33(BDNL-CCK7)、BC-197(BOC-D.Asp-Tyr(SO3H)-Nle-D.Lys-Trp-Nle-Asp-Phe-NH2)、Boc[Nle28，Nle31]CCK27-33、Boc[DTyr(SO3Na)27，Nle28，Nle31]CCK27-33、Ac[L-Phe(pCH2SO3Na)27，Nle28，Nle31]CCK27-33、Ac[D-Phe(pCH2SO3Na)27，Nle28，Nle31]CCK27-33、Thr28 Nle31-CCK 25-33(CCK-9)、叔丁氧基羰基-Tyr(SO3H)-Nle psi(COCH2)Gly-Trp-Nle-Asp-Phe-NH2、叔丁氧基羰基-[Nle28，31]CCK-8、脫氨基-縮膽囊素-八肽(CCK 7)、GE 410，Nα-羥基磺醯基-[Nle28，31]CCK26-33，其中C末端L-Phe33殘基已被L-Leu、D-Phe或N-甲基-L-Phe取代，在縮膽囊素CCK26-33的31位的蛋氨酸-31被胺基酸苯基丙氨酸、丙氨酸、穀氨酸和鳥氨酸取代、以及它的具有被苄氧基羰基保護的ε-氨基的類似物、D-Tyr-Gly[(Nle28，31)CCK-26-33]、縮膽囊素的C-末端七肽的假肽類似物Z-Tyr(SO3-)-Nle-Gly-Trp-Nle-Asppsi-(CH2NH)Phe-NH2(1)、Z-Tyr(SO3-)-Nle-Gly-Trp-Nlepsi-(CH2NH)Asp-Phe-NH2(2)、Z-Tyr(SO3-)-Nle-Gly-Trp psi-(CH2NH)Nle-Asp-Phe-NH2(3)、Z-Tyr(SO3-)-Nle-Gly psi(CH2NH)Trp-Nle-Asp-Phe-NH2(4)、Z-Tyr(SO3-)-Nle psi-(CH2NH)Gly-Trp-Nle-Asp-Phe-NH2(5)、Z-Tyr(SO3-)-Met-Gly-Trp-Nle-Asp psi(CH2NH)-Phe-NH2(6)、Z-Tyr-(SO3-)-Met-Gly-Trp-Nlepsi(CH2NH)Asp-Phe-NH2(7)和Z-Tyr(SO3-)-Met-Gly-Trp psi(CH2NH)Nle-Asp-Phe-NH2(8)、Boc-Asp-Tyr(SO3-)-Nle-Gly-Tip-Nle-Asp-Phe-NH2、CCK-(27-32)-NH2、乙醯CCK七肽的類似物(Ac-Tyr(SO3H)2-Met3-Gly4-Trp5-Met6-Asp7-Phe8-NH2)，其中Asp7殘基被羥基胺基酸硫酸酯取代，Gly4被D-Ala取代，而Trp5和Met6被它們的D對映體取代、藍肽(CER)類似物Nle8-CER-(4-10)、苯酯基-L-酪氨醯(O-硫酸酯)-L-甲二磺醯甘氨醯基-L-色氨醯-L-甲二磺醯-L-門冬氨醯-β-L-苯基丙氨酸胺(Z-32-β-Asp-CCK-27-33)、[28-蘇氨酸，31-正亮氨酸]-和[28-蘇氨酸，31-白氨酸]縮膽囊素-促胰酶素-(25-33)-九肽、Z-Arg(Z2)Asp(OBut)-Tyr-(SO3Bal/2)-Thr(But)-Gly-Trp-Leu-Asp(OBut)-Phe-NH2和Z-Arg(Z2)-Asp(OBut)-Tyr(SO3-Bal/2)-Thr(But)-Gly-Trp-Nle-Asp(OBut)-Phe-NH2、Ser(SO3H)-Met-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-NH2(J Biol Chem1998 May 22；273(21)12988-93；Pancreas 1997 Aug；15(2)160-7；J Clin Psychopharmacol 1996 Dec；16(6)440-5；Pharmacol Biochem Behav 1996 May；54(1)255-9；J PharmBiomed Anal 1996 Mar；14(5)593-600；J Med Chem 1996 Sep27；39(20)4120-4；Psychopharmacology(Berl)1996 Aug；126(4)339-44；Pharmacol Biochem Behav 1996 May；54(1)255-9；J Pharm Biomed Anal 1996 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還可以使用其它表現出CCK-8活性的物質如天然產生的或人工修飾的CCK-8變體、類似物及其衍生物。這些物質可以通過加成、插入、消除或取代至少一種CCK-8中的胺基酸而得到。而且將表現出CCK-8活性的物質理解為前體、代謝產物如代謝衍生物如代謝的降解產物、激動劑或表現出相同性質的本文所述物質的類似物。代謝衍生物或代謝降解產物可以是如具有八個胺基酸CCK-8樣肽，如已從其分子的一端或兩端除去一或多個胺基酸的CCK-8。可以確定這些變體為CCK-8的免疫學方法類似物，這些免疫學方法如RIA(放射免疫分析)、IRMA(放射方法)、RIST(放射免疫吸著作用試驗)、RAST(放射變應性吸著作用試驗)。
還可以通過計算機模擬法產生表現出CCK-8活性的新化合物。計算機模擬法為本領域技術人員已知，如在EP0660 210 A2中所述。
上述的物質可以通過常規的技術製備，如直接從胺基酸構件合成或直接提取和純化生物組織和細胞系或者通過生物工程方法如重組DNA技術而獲得，或常規地從這類物質的生產者或銷售者那裡購買。
優選使用CCK-8，由此可將D-和L-形式的CCK-8用於本發明。
外周神經系統神經病意指各種症狀，包括與外周運動和感覺神經元的結構和功能異常有關的症狀。外周神經病可能涉及整個神經元或其部分。可以將病症、異常、損害和疾病的實例認為外周神經病並可以用本發明治療，這些實例選自與糖尿病患者有關的神經病、乙醇誘導的神經病、與癌治療如細胞抑制劑或放射治療有關的神經病、聽覺損害如聾，耳鳴、視覺障礙如視網膜損害、傷口癒合受損、手術誘發的損害、受傷結果的損害、作為與神經毒性化合物如抗腫瘤藥接觸後的副作用的損害、營養不良、先天性和自身免疫神經病；或者與其它主要疾病相關的症狀。外周神經病(PN)是在臨床實踐中的一個主要問題，並可能與痛疼有關。
外周神經系統包括感覺(傳入)和運動(傳出)部分。感覺部分包括軀體和內臟感覺神經元。運動部分包括植物神經系統(無意識的)和體幹神經系統(有意識的)。本發明可以用於治療整個外周神經系統的神經病。
本發明的另一目的是一種治療外周神經系統神經病的藥物組合物，包括以混合物的形式或與至少一種藥學上可接受的載體或賦形劑結合的有效濃度的至少一種表現出CCK-8活性的物質。表現出CCK-8活性的物質的實例為CCK-8和上述的其它物質。
優選使用CCK-8。
該藥物組合物可以藥學技術人員已知的方式製備。其載體或賦形劑可以是可用於活性成分的賦形劑或介質的固體、半固體或液體材料。適宜的載體或賦形劑在本技術中是已知的。可以使該藥物組合物適於口服或腸道外使用並可以作為片劑、膠囊、栓劑、溶液、懸液等等給藥患者。
該藥物組合物可以與惰性稀釋劑或可食載體一起口服給藥。可以將它們封閉在凝膠膠囊中或壓成片劑。為口服給藥，本發明的化合物可以結合賦形劑並作成片劑、錠劑、膠囊劑、酏劑、懸液、糖漿、糯米紙囊劑、口香糖等。這些製劑應含有至少4％重量的本發明化合物活性成分，但可以根據特定的劑型而變化，並可以適宜為4-70％重量單元。組合物中所含的活性成分的數量可以高到得到適於給藥的單元劑量。
片劑、丸劑、膠囊、錠劑等還可以含有至少一種以下助劑粘合劑如微晶纖維素、黃芪膠或凝膠，賦形劑如澱粉或乳糖，分散劑如海藻酸、原生膠、玉米澱粉等等，潤滑劑如硬脂酸鎂或Sterotex，滑動劑如膠態二氧化矽，並可以加入甜味劑如蔗糖或糖精或調味料如薄荷、水楊酸甲酯或橙調味劑。如果該單元劑型為膠囊，則除了上述類型以外它可以含有液體載體如聚乙二醇或脂肪油。其它的單元劑型可以含有其它不同的改變單元劑型物理形式的材料如包衣。因此，片劑或丸劑可以用糖、蟲膠或其它腸衣試劑包衣。糖漿可以在活性成分之外含有蔗糖作為甜味劑和某些防腐劑、染料和調味劑。用於製備這些不同的組合物的材料應該是藥學上純的和在使用劑量無毒的。
為了腸道外給藥，可以將本發明化合物結合到溶液或懸浮液中。腸道外給藥指給藥不經過營養管道而通過其它途徑如皮下、肌內、口內、囊內、脊柱內、胸骨內、靜脈內、鼻內、肺內的注射，通過尿道，通過家畜的輸乳管進入器官如骨髓等。還可以體內治療骨髓。這些製劑可以含有至少0.1％重量的本發明活性化合物，但可以在其重量的約0.1-50％的範圍內變化。這些組合物中所含的活性成分的數量高到得到適宜的劑量。
溶液或懸浮液還可以包括至少一種以下的助劑無菌稀釋劑如注射用水、鹽水、脂肪油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶劑，抗菌劑如苄醇或對羥基苯甲酸甲酯，抗氧劑如抗壞血酸或重亞硫酸鈉，螫合劑如乙二胺四乙酸，緩衝劑如乙酸鹽、檸檬酸或磷酸鹽，和用於調節肌肉彈性的試劑如氯化鈉或右旋糖。腸道外製劑可以封閉在安瓿、可任意處理的注射器或由下玻璃或塑料制的多劑量容器。
為了局部給藥，可以將本發明化合物結合到溶液、懸浮液或軟膏中。這些製劑可以含有至少0.1％重量的本發明化合物，但可以在其重量的約0.1-50％的範圍內變化。該組合物中所含的活性成分可高至獲得到適宜的劑量。可以通過在皮膚上應用接觸、壓迫、按摩或加熱、溫暖或紫外光線而提高皮膚的滲透性。Hirvonen，J.，Kalia，YN，and Guy，RH.Transdermal delivery of peptides by iontophoresis，NatBiotechnol 1996 Dec；14(13)1710-1713描述了如何採用應用電場的驅動力而提高藥物透皮轉運。優選在弱鹼性PH下進行離子電滲療法。
其它的給藥形式為通過肺的吸入、通過口的口腔給藥和通過小腸的腸內給藥，它們可以本領域技術人員已知的方法進行。
例如，這種組合物可以用於治療外周神經系統神經病。
本發明的另一目的是一種治療外周神經系統神經病的方法，包括藥學劑量的對患者表現出CCK-8活性的物質。
患者意指任何哺乳動物，包括人。優選為人。
藥物意指用於人或獸醫學的藥劑。
CCK-8是廣泛分布在CNS和PNS中的腸神經肽。最近本發明者已證明腹膜內給予與生理循環CCK水平接近的神經肽(Linden A等人，1989)，促進了腦NGF水平和在正常小鼠的前腦膽鹼能神經元中的膽鹼乙醯轉移酶(CHAT)的增加(Tirassa等人，1998，Tirassa等人，1999)，並可以抵抗nix-橫切的小鼠散的膽鹼能不足。在該項工作中，採用外周神經病模型和通過給予神經毒性化合物而引起的交感神經切除術，本發明者證明CCK-8恢復了功能和由於CAP和6-OHDA的處理而引起的生物化學損害。這些結果表明CCK-8可能涉及PNS中的受損神經細胞的恢復。
最後，採用感覺PN動物模型，本研究第一次證明了外周神經肽可以影響NGF和外周組織中感覺與交感神經肽水平的合成和表達。結合這些發現表明腹膜內注射低劑量的CCK-8代表了一種促進恢復帽於手術和化學損害或與上述的其它主要疾病或症狀相關的PN中正常PNS功能可能有用的替代療法。
現在用以下的實施例描述本發明。這些實施例只是例舉的目的，而不是以任何方式限定本發明。
附圖的詳細說明

圖1用辣椒鹼(CAP)處理三天的成年小鼠的熱板反應。在最後一次注射辣椒鹼的10天以後開始用CCK-8對一組CAP治療的小鼠和一組對照小鼠治療10天。在整個觀察期CAP治療的小鼠對有毒刺激物的反應潛伏期保持比對照組高，而用CCK-8的治療導致CAP-處理的小鼠反應潛伏期的縮短，這可由重複測定的ANOVA在8-10天的治療後至達基線值來表明。垂直線表示匯集的來自ANOVA的適宜誤差的平均平方的SEM’s。*p＜0.05。
圖2.正常(A)、接受鹽水(B)或CCK-8(C)10天的6-OHDA處理的小鼠虹膜的交感神經纖維。通過乙醛酸引起的螢光(GAIF)目測檢驗交感神經的分布。在6-OHDA處理後觀察到交感神經分布顯著減小，而在CCK-8治療後觀察到部分復原，如圖D所示。
圖3.辣椒鹼和CCK-8對後爪皮膚NGF水平的影響。ANGF，表示為pg/gr淨重，它在CAP處理後迅速升高，在注射神經毒性化合物的4天後到達更高的水平。然後在CAP治療結束後的10和20天後測得神經營養素的數量緩慢降至低於對照組的水平。B用生理學數量的CCK-8治療10天提高了正常小鼠身上的NGF水平，並能夠進一步提高CAP損害的小鼠上的神經營養素的表達。
圖4.辣椒鹼和CAP+CCK處理對成年小鼠後爪的NGFmRNA表達的影響。現場雜交表明NGFmRNA通常在皮膚的基本表皮層(B)表達。通過包括在雜交前採用核糖核酸酶-A消化mRNA和採用感覺NGF探針雜交的特異性試驗證明特異性NGFmRNA，其結果是造成雜交信號(A)的缺乏。用CCK-8(D)治療使在用CAP(C)治療後觀察到的降低的NGFmRNA表達完全逆轉。在RT-PCR(E-F)後採用測光密度分析進行NGFmRNA的定量評價而證明該組織學數據。垂直線表示匯集的來自ANOVA的適宜誤差的平均平方的SEM’s。*p＜0.05。
圖5.正常和接受鹽水或CCK-8 10天的6-OHDA處理的小鼠眼睛中的NGF水平。在6-OHDA和CCK-8組中NGF水平升高。採用CCK-8處理進一步促進了6-OHDA處理的小鼠上NGF的上調。
圖6.在CCK-8給藥前後辣椒鹼對成年小鼠後爪SP和CGRP水平的影響。腸神經肽只增加CAP治療的小鼠後爪皮膚兩種感覺神經肽的水平。垂直線表示匯集的來自ANOVA的適宜誤差的平均平方的SEM’s。*p＜0.05。
圖7.6-OHDA和/或CCK-8處理對成年小鼠外周組織的神經肽Y(NPY)濃度的影響。用6-OHDA處理顯著地降低了眼睛、心臟和脾臟中NPY的濃度，同時在腸內沒有觀察變化。用CCK-8治療增加了正常小鼠的眼和腸中NPY的含量並恢復了6-OHDA誘發的心臟和眼睛中NPY的減少。
實施例1動物在12-12小時亮-暗循環下每籠飼養4-5隻購自C.River，Calco，Italy的成年三周齡CD-1品系雄性小鼠，同時隨意給予水和食物。依照符合國內和內際法(EEC council directive(歐洲經濟共同體議會指令)86/609，OJ L358，1，December 12，1987)的內部委員會和學會指南進行動物護理和操作。
用辣椒鹼和CCK處理為了誘發感覺神經經病，在輕度麻醉下用50mg/kg辣椒鹼對成年小鼠(n＝48)進行皮下注射，或不作處理而作為對照，持續兩天。系統地給予成年動物辣椒鹼使感覺神經一般性地減少敏感度或喪失(Holzer P，1991)。5天後，將這些小鼠分成四組，按照以下用和不用CCK-8治療(i)CAP-處理，注射CCK(n＝12)；(ii)CAP-處理，注射載體(n＝12)；(iii)未處理並注射CCK(n＝12)；(iv)未處理並注射載體(n＝12)。從最後一次CAP處理的10天後開始皮下注射CCK-8(8nmol kg-1)或載體(鹽水)連續10天，然後處死小鼠並除去外周組織，立即冷卻，然後用於NGF或神經肽測定。
行為研究為了評價感覺性去神經的結果，採用熱板反應。用熱板容器測定疼痛反應性(Socrel Hot-plate model DS37，Ugo Basile，Italy)。將溫度設置在50±0.3℃，切斷時間為60秒。通過記錄到第一次熱覺感受傷害發作(跳躍的、舔前爪和後爪)的潛伏期來測定疼痛反應。採用數字計時錶測定潛伏時間。所有組的小鼠試驗起始於第二次注射神經毒性化合物的2天後，且每兩天進行測試直至進行最後一次CCK注射。
用6-OHDA和CCK處理為了誘發交感神經神經病，給小鼠注射100mg/kg的溶於生理鹽水(0,85％NaCl)並加入抗壞血酸以阻止藥物氧化的6-羥基多巴胺(6-OHDA)。對照小鼠只接受載體溶液的注射。對動物(n＝48)連續治療2天，並在5天後將動物分成以下組(i)6-OHDA處理兩次並用CCK注射(n＝12)；(ii)6-OHDA處理並用載體注射(n＝12)；(iii)未處理並用CCK注射(n＝12)；(iv)未處理並用載體注射(n＝12)。從最後一次6-OHDA處理10天後開始連續10天皮下注射CCK-8(8nmol kg-1)或載體(鹽水)，然後處死小鼠並除去外周組織，立即冷凍，隨後用於NGF或神經肽測定。
評價交感神經分布在戊巴比妥麻醉下將6-OHDA-處理的和對照的小鼠處死，將移出的虹膜全部製備和處理以評價去甲腎上腺素神經分布，並採用乙醛酸誘導的螢光(GAIF)來形態測定軸突的數量和密度(Hokfelt et al，1972)。在配有激發和屏障過濾器的傳輸切面為470和500nm的螢光顯微鏡下分別檢查這些製劑。為定評價交感神經分布，讓無意的觀察者計算在各實驗組的GAIF處理的虹膜的三個不同區域的去甲腎上腺素軸突的數量(n＝8虹膜每組)，並統計學評價處理和未處理的小鼠的差別。
NGF測定然後用過量的戊巴比妥將所有的小鼠處死，移出外周組織並將其用於評價外周神經分布、神經肽含量和NGF水平。
通過高敏感度雙部位免疫酶法分析來測定NGF的水平(Weskampand Otten，1987)，這種分析識別人和鼠的NGF並且不和衍生的神經營養因子交叉反應(Bracci-Laudiero等人，1992)。簡言之，用親合力純化的不與在0.05M碳酸鹽緩衝劑(PH9.6)中稀釋的來源於腦的神經營養因子交叉反應的多系山羊抗-NGF抗體塗布聚苯乙烯96-孔免疫平板(Nunc)。用純化的山羊IgG(Zymed，San Francisco，CA，USA)塗布平行的孔以評價非特異性信號。在室溫下溫育過夜和用阻斷緩衝劑(0,05M碳酸鹽緩衝劑，pH9，5，1％BSA)溫育2小時後，用Tris-HCl，pH7，4，50mM、NaCl 200mM、0,5％明膠、0,1％Triton X-100洗滌平板三次。在廣泛地洗滌平板以後，用試樣緩衝劑(0,1％，TritonX-100，100mM Tris-HCl，pH7，2，400mM NaCl，4mM EDTA，0,2mM PMSF，0,2mM苄索氯銨，2mM苄脒，40U/ml抑肽酶，0,05％疊氮化鈉，2％BSA和0.5％明膠)稀釋試樣和NGF標準溶液，將其分配到這些孔中在置於室溫下過夜。然後將平板洗滌三次並在37℃下用4mU/孔的抗-P-NGF-半乳糖苷酶(Boehringer Mannheim，Germany)溫育2小時，進一步洗滌，然後往每一孔中加入100μl的反應物溶液(4mg/ml氯酚紅，Boehringer Mannheim，Germany，反應物緩衝劑100mM HEPES，150mM NaCl，2mM MgCl2，0.1％疊氮化鈉和1％BSA)。在37℃下溫育2小時後，在275nm處用ELISA閱讀器(Dynatech)測定光密度，並通過將非特異性結合考慮在內而校正標準溶液和試樣的值。往試樣或作為內部對照的均化的緩衝劑加入已知數量的高純度NGF來評價分析過程中的NGF的恢復。從內源性加外源性數值中扣除內源性NGF中的數量而計算外源性NGF的產率。在這些條件下，NGF的回收率大於90％。數據表示為pg/g淨組織，且所有的分析以三份進行。
神經肽分析採用高度特異性的競爭性放射免疫分析(RIA)(檢測限度1，5fmol＝2pg每一溫育物；可檢測的濃度15fmol/1＝20pg每ml)。
簡言之，將組織試樣在冷凍狀態下切割成小片，在1mol 1-1的乙酸中煮沸10分鐘並均化，在10000g下離心10分鐘，然後凍幹上清液並在分析前在-20℃下儲存。採用C-末端指導的抗血清SP2(Brodin等人1986)和125I-[Tyr8]-SP作為放射配體和而合成的SP作為標準品分析物質P樣免疫反應性(SP-LI)的組織濃度。採用在兔抗成對大鼠CGRP中產生的抗血清CGRP-8和125I-histydil-大鼠CGRP作為放射配體而大鼠CGRP作為標準品來分析與降鈣素基因相關肽樣的免疫反應性(CGRP-LI)的組織濃度。採用與0.1％的鳥胰腺多肽交叉反應但不與其它肽交叉反應的抗血清N1分析神經肽Y樣免疫反應性(NPY-LI)的組織濃度。該分析的檢測限度為1lpmol 1-1。
現場雜交NGF mRNA由低溫恆溫器切下來自鳥爪皮膚的14微米切片並將其安置在聚-L-白血黴素塗布的玻片上。在處於0.1M PBS(pH7.4)中的4％的低聚甲醛固定該切片10分鐘，然後重複用0.1M PBS洗滌並用70、80、95％乙醇脫水。乙醯化(在0.1M TEA PH8.0中的25％乙酸酐)以後，在42℃下在含有地高辛配基標記的NGF探針(與序列5』TCCTGTTGAGAGTGGTGCCGGGGCATCGA3』互補)的雜交混合物中，在30ng/ml的雜交緩衝劑(50％甲醯胺，2XSSC，0.1％SDS，250mg/ml變性的剪切鮭試驗DNA)溫育16小時。洗滌後，在室溫下用1.5U/ml的羊抗地高辛配基POD結合的抗體(多克隆Fab片斷；BoheringerMannheim)將該切片溫育2小時。採用標準DAB法(0.6mg/ml DAB和0.015％H2O)檢測免疫過氧化酶反應。
RT-PCR根據製造商的說明採用TRIZOL試劑盒(Gibco)提取總RNA。在TRIZOL反應劑中omogenysed該組織，在4℃下溫育15分鐘，然後離心(10000g，4℃，15min)。將0.2ml氯仿每0.75ml TRIZOL反應劑加到上清液，在4℃下溫育15分鐘，然後在4℃下將試樣旋轉進行液相分離。加入0.1體積的3M乙酸鈉和等體積的異丙醇使RNA從上層含水相中沉澱出來。在-20℃下溫育60分鐘以後，通過離心將沉澱物顆粒化，用75％的乙醇洗滌一次並溶於50ml不含RNase的水中。採用250ng低聚(dT)15引子、200單位的MLV-RT(Promega)和0.5U的RNasin核糖核酸酶抑制劑(Promega)將一體積(最大10ml)的含有1mg的RNA的RNA溶液逆轉錄到總反應體積為20ml的具有逆轉錄系統(Promega)的單鏈cDNA上。在42℃下溫育60分鐘以後，加入50ml的水終止反應。為了補償試樣大小的相對差異，用鼠科NGF同時擴增各個RNA試樣和逆轉錄中的變體的完整性、甘油醛-3-磷酸鹽脫氫酶(GAPDH)。在50ml含有5ml試樣cDNA、5ml 10X Taq聚合酶緩衝劑(Promega)、2.5mM的MgCl2，0.2mM每一dNTP(Pharmacia)、5pmol各引物(NGF5』CAGGACTCACAGGAGCAAGC3』；5』GCCTTCCTGCTGAGCACACA3』；GAPDH5』CACCACCATGGAGAAGGCC3』；5』CACCACCATGGAGAAGGCC3』)和在GeneAmp PCR系統9600熱周期計(Perkin Elmer)上的2U Taq聚合酶(Promega)進行PCR反應30次循環(95℃60秒，55℃60秒和72℃下120秒)。NGF的PCR產物為343個鹼基長度的片斷，而GAPDH為190個鹼基長度片斷。在PCR之後，將10ml未稀釋的反應產物裝載2％的含有1mg/ml的溴化乙錠的瓊脂糖MP(Boehringer Mannheim)凝膠上。以1V/cm處理該凝膠15分鐘，然後以5V/cm處理該凝膠3小時。採用紫外透照器(圖4-C)拍攝含有DNA色譜帶。通過比較以瓊脂糖凝膠上DNA序列的已知長度為基礎的正確尺度和採用Southern印跡法(未顯示數據)來證明所有PCR產物的身份。
由自動圖像分析儀(Vidas System；Kontron Electronics)進行以任意單位的灰水平表示的色譜帶測光密度評價，該儀器採用灰度閾操作確定溴化乙錠染色帶。GAPDH帶的光密度用作標準化因子。圖4中顯示的數據代表從五種不同的PT-PCR上獲得的NGF的標準化的測光密度值的平均值±SE。
統計分析採用Macintosh的SuperANOVA程序包(Abacus Concepts Inc.，Berkeley，CA，USA)，考慮將用鹽水、CAP、CCK和CAP+CCK處理作為變量，通過方差分析獲得數據。對於熱板反應，考慮重複的測定(10次測試)和處理(四種水平載體、CAP、CCK、CAP+CCK)分析CAP和/或CCK的作用。通過Tukey-Kramer比較確定組間的差異；認為p＜0.05為統計學上顯著。
結果熱板反應為了評價感覺神經分布，測試小鼠的熱板反應。如圖1所示，用CAP處理的小鼠與對照小組相比表現出對外周毒性刺激物的反應延遲。CAP增加了熱板反應的潛伏時間，而這種改變的反應在治療後持續至少一個月，表明在爪上的感覺性外周神經分布的缺乏。對CAP處理的小鼠皮下給予CCK-8導致感覺功能的不斷恢復，並且似乎在CCK-8治療的10天後恢復(見圖1)。未發現載體和載體+CCK小鼠之間的潛伏時間存在差異，因此痛覺過敏作用不是由我們的實驗條件下的CCK的引起。而且在我們的實驗條件下的CCK-8給藥沒有導致體重的損失(未顯示數據)。
在6-OHDA/CCK處理的小鼠上評價虹膜交感神經分布在GAIF處理的虹膜上進行的形態學觀察表明6-OHDA導致外周交感神經末梢的大量變性。如圖2所示，對照小鼠(2A)的虹膜表現了濃密的交感神經，兒茶酚胺組織螢光纖維網絡，而6-OHDA處理的小鼠的虹膜完全缺乏這些纖維(2B)。在CCK處理後，接受交感神經切除術的小鼠(2C)虹膜中的外周神經分布與用鹽水處理的接受交感神經切除術的小鼠的虹膜相比顯著提高。通過定量評價各實驗組的接受GAIF處理的虹膜去甲腎上腺素(noradrenergic)軸突的數量來證明交感神經切除術和CCK治療對虹膜神經分布的影響(見圖2D)。
NGF的表達為了確定CCK治療是否能誘導用辣椒鹼處理後的外周組織的NGF表達，通過ELISA測定爪皮膚的NGF水平。如圖3所示，爪皮膚上的NGF水平在CAP處理後升高。同樣地，CCK-8治療與CAP處理一樣增加了神經營養素的水平。而在CAP處理的小鼠上進行CCK-8治療則進一步提高了NGF蛋白表達的上調。
為了確定在NGF上調中涉及的細胞並確定CCK是否還影響NGFmRNA的合成，我們通過現場雜交和RT-PCR的方法分析了爪皮膚上的NGFmRNA表達。如圖4B所示，定位在基本表皮層的細胞表達NGFmRNA。通過CCK-8(D)的治療完全恢復了在用辣椒鹼(C)處理後觀察到的降低的NGFmRNA表達。通過RT-PCR進行的定量評價證明了CAP處理的小鼠的爪皮膚上的NGFmRNA降低，而採用CCK的治療促進了CAP處理小鼠上的NGF基因轉錄的上調(圖4E-F)。
為了確定交感神經切除術和CCK-8治療是否影響NGF表達，在連續接受鹽水或CCK-8注射10天的6-OHDA處理的小鼠的眼睛上測定NGF的水平。如圖5所示，6-OHDA組和CCK-8組的眼睛中NGF水平升高。在6-OHDA處理的小鼠上進行的CCK-8治療則進一步促進了NGF蛋白表達水平的上調。
神經肽水平已經證明採用CAP和6-OHDA處理影響外周組織中神經肽表達，而NGF能夠恢復神經肽含量的降低(Donnerer J.1996，NeurosciLett 22133-36；Donnerer J.等人，1996，Brain Res 741103-108)。由於我們的結果表明CCK-8能夠升高外周組織中NGF的表達，我們研究了是否還可能影響CAP處理的小鼠的爪皮膚和6-OHDA處理的小鼠的不同組織(心、腸、脾和眼)上的神經肽水平。如圖6所報導，我們數據表明在CAP和CCK組中的感覺神經肽SP和CGRP的數量在30天後與對照組的值沒有差別，而在CAP+CCK組中增加，這表明可以由CCK促進恢復CAP感覺受損小鼠上感覺神經分布，而這與感覺功能的恢復和NGF基因轉錄的提高有關。如在圖7中所報導的，6-OHDA治療減少眼、心和脾中的NPY濃度，而在腸在中未觀察到變化。每日用CCK-8注射對照小鼠10天顯著地影響外周組織中的NPY水平，導致腸和眼而非心和脾中的NPY水平的提高。在交感神經切除術小鼠上進行CCK-8治療則能恢復心和眼中6-OHDA誘發的NPY短缺。
討論上述的發現表明成年小鼠上注射CAP導致外周感覺神經分布的喪失(Holzer P，1991)，與此相一致的是本發明者的研究結果表明這種治療導致感覺反應的受損，這如在熱板測試中所揭示。本發明者的結果表明給予10天低劑量的CCK-8能促進CAP處理的小鼠上感覺功能的恢復。但是，6-OHDA的給藥已表明有損於去甲腎上腺素交感神經系統的後神經節末梢(Hoeldtke R等人，1974)。本發明者的數據證明的CCK-8給藥能恢復虹膜上6-OHDA破環的交感神經分布。雖然已知CCK-8作用於行為功能(Woodruff GN等人，1991)，但在接受生理劑量的CCK-8的小鼠上沒有觀察到痛覺過敏作用和體重減小。因此本發明的數據與先前的證明CCK-8給藥作用是高度劑量依賴性的研究一致，且容許耐受結果，如在長期給予CCK-8時食物攝入不變(Crawley JN等人，1983)。本研究證明用CCK-8治療導致誘發外周組織中NGF的表達和化學損傷的感覺和交感神經分布的恢復。
權利要求
1.表現出CCK-8活性的物質用於製備治療外周神經系統神經病的藥物的用途。
2.根據權利要求1的用途，其特徵在於所治療的神經病為醇誘發的神經病。
3.根據權利要求1的用途，其特徵在於所治療的神經病與糖尿病患者有關。
4.根據權利要求1的用途，其特徵在於它所治療的神經病與癌治療如細胞抑制劑有關。
5.根據權利要求1的用途，其特徵在於所治療的神經病為聽覺損害和/或視覺障礙。
6.根據權利要求1的用途，其特徵在於所治療的神經病為手術誘發的損害。
7.根據權利要求1的用途，其特徵在於所治療的神經病為營養不良。
8.根據權利要求1-7之任一的用途，其特徵在於該物質為CCK-8。
9.用於治療外周神經系統神經病的藥物組合物，其特徵在於它包括至少一種以混合物的形式或與至少一種藥學上可接受的載體或賦形劑結合的表現出CCK-8活性的物質，特別是CCK-8。
10.治療外周神經系統神經病受試者的方法，包括給予該受試者藥學劑量的表現出CCK-8活性的物質。
全文摘要
外周神經病包括外周運動和感覺神經元的結構和功能的異常,並可能涉及整個神經元及它的部分。CCK－8及其類似物的外源性給藥已表現出誘導細胞產生神經營養因子,尤其是NGF,它可以治療外周神經系統神經病症。因此,本發明涉及表現CCK－8活性的物質用於治療外周神經系統神經病的用途,以及含有表現出CCK－8活性的物質的藥物組合物。
文檔編號A61K38/08GK1353616SQ0080828
公開日2002年6月12日 申請日期2000年5月3日 優先權日1999年5月3日
發明者託馬斯·倫德伯格, 魯吉·馬尼 申請人:託馬斯·倫德伯格