牛PDHB基因過表達重組腺病毒載體構建及包裝方法與流程
2023-10-22 05:23:12
本發明屬於重組腺病毒載體技術領域，尤其涉及一種牛pdhb基因過表達重組腺病毒載體構建方法。
背景技術：
牛丙酮酸脫氫酶β亞基(pyruvatedehydrogenaseβsubunit，pdhb)基因催化丙酮酸成為乙醯輔酶a(acetyl-coa)，是將糖酵解和三羧酸循環代謝途徑連接起來的關鍵酶。研究表明pdhb基因的表達水平與肌內脂肪(imf)含量成正相關。而對基因的功能研究，主要採用過表達技術。目前，將外源基因導入真核細胞表達的載體主要有兩類。一類是非病毒表達載體系統，常見的為pcdna3.1(±)非融合性真核細胞表達載體，其優點是安全性高、毒性小、外源基因長度不受限制，缺點為效率較低，在細胞中屬於瞬時表達，表達時間較短。另一類是病毒表達載體系統，常見的有慢病毒(屬於逆轉錄病毒)表達載體系統和腺病毒表達載體系統。慢病毒表達載體系統的優點是可將外源基因整合到靶細胞基因組，持久穩定地表達外源基因，缺點為可引起人獲得性免疫缺陷症，因此對實驗室的安全級別要求較高。腺病毒表達載體系統的優點是產生的病毒顆粒比較穩定，裝載量大(可插入約10kb的外源基因)，對人的致病性低，且能將外源基因在靶細胞中持續表達10d以上。本發明中使用的adeasy腺病毒表達載體已在基因的功能研究中廣泛應用。秦川牛pdhb基因過表達重組腺病毒載體的構建及其包裝對進一步在牛肌內前體脂肪細胞分化過程中的作用機制具有重要意義。
綜上所述，現有技術存在的問題是：瞬時表達載體構建容易，但存在在原代細胞中轉染難度大，表達時間短等問題。
技術實現要素：
針對現有技術存在的問題，本發明提供了一種牛pdhb基因過表達重組腺病毒載體構建方法。
本發明是這樣實現的，一種秦川牛pdhb基因重組腺病毒載體，所述秦川牛pdhb基因重組腺病毒載體的序列為：genbank:ay370909.2(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/ay370909.2)。
本發明的另一目的在於提供一種所述牛pdhb基因過表達重組腺病毒載體構建方法，所述牛pdhb基因過表達重組腺病毒載體構建方法包括以下步驟：
步驟一，根據牛pdhb基因mrna序列設計引物，克隆該基因的編碼區序列；
步驟二，測序驗證後將其重組到穿梭載體padtrack-cmv上，經pmeⅰ線性化後，轉化到含有padeasy-1腺病毒骨架載體的e.colibj5183感受態細胞中進行同源重組，以獲得重組質粒pad-pdhb；
步驟三，再將經pacⅰ酶切線性化的pad-pdhb轉染到hek293a細胞中，進行病毒包裝並擴增高滴度病毒ad-pdhb，綠色螢光蛋白標記法測定病毒滴度；
步驟四，將高濃度的ad-pdhb病毒感染牛肌內前體脂肪細胞，實時螢光定量pcr檢測pdhb的表達量。
進一步，所述引物序列為pdhb-f：agatggcggtggttgctgtg；pdhb-r：attaaaaggtcttatgggat，pcr產物大小為1166bp。
進一步，所述pcr以肌肉cdna為模板，用kod高保真dna聚合酶擴增牛pdhb基因，pcr反應體系為：模板1.2μl,引物f/r各0.6μl，kod酶0.4μl，10×buffer2.0μl，dntpmix2.0μl，mg2+2.0μl，ddh2o12.0μl；
pcr反應條件為：95℃預變性5min；94℃變性30s、59℃退火30s、72℃延伸1min10s，共35個循環；72℃終止反應10min。
進一步，將pgmt-pdhb重組質粒和padtrack-cmv穿梭質粒分別用限制性內切酶kpni和noti進行雙酶切，回收目的片段後用t4連接酶進行連接，轉化到後top10-gold感受態細胞後挑取padtrack-cmv-pdhb陽性克隆擴繁獲取菌液，提取質粒後雙酶切鑑定。
進一步，將padtrack-cmv-pdhb重組質粒用pmeⅰ線性化後，酶切產物轉化到含有骨架載體padeasy-1的e.colibj5183感受態細胞；挑取pad-pdhb陽性克隆，搖菌後提取質粒；用pacⅰ對重組腺病毒質粒pad-pdhb進行酶切鑑定，將重組質粒轉化、塗板、挑取單克隆、菌液鑑定後送測序驗證。
本發明的優點及積極效果為：通過構建秦川牛丙酮酸脫氫酶β亞基(pyruvatedehydrogenaseβsubunit，pdhb)基因的重組腺病毒載體，為pdhb基因在牛前體脂肪細胞分化過程中的功能做準備。經測序驗證，本發明克隆獲得的牛pdhb基因cds與資料庫genbank收錄的序列一致，將pdhb基因cds與穿梭載體padtrack-cmv重組並轉染hek293a細胞後成功獲得了重組腺病毒ad-pdhb，其滴度為1.66×109pfu·ml-1。腺病毒ad-pdhb侵染牛肌內前體脂肪細胞後，pdhb在mrna的表達水平比對照組高25.5倍。
本發明成功克隆了秦川牛pdhb基因並構建了重組腺病毒質粒pad-pdhb，並獲得能夠在牛肌內前體脂肪細胞中過表達pdhb基因的高滴度重組腺病毒ad-pdhb。本發明通過構建腺病毒過表達載體，持續穩定地表達pdhb基因。本發明採用秦川牛背最長肌組織作為實驗材料，克隆秦川牛pdhb基因。利用adeasy-1系統構建牛pdhb基因的高滴度重組腺病毒，從而能夠持續穩定的表達該基因。為研究該基因在牛肌內前體脂肪細胞中過表達後，對細胞分化的影響提供實驗基礎。本發明通過構建牛pdhb基因的腺病毒過表達載體系統，為檢測pdhb基因在牛前體脂肪細胞分化過程中的作用奠定實驗基礎；成功構建了秦川牛pdhb基因的重組腺病毒表達載體，重組腺病毒ad-pdhb能夠在牛肌內前體脂肪細胞中過表達pdhb基因。
附圖說明
圖1是本發明實施例提供的牛pdhb基因過表達重組腺病毒載體構建方法流程圖。
圖2是本發明實施例提供的牛pdhb基因的克隆示意圖；
圖中：m:dl2000dnamarker；1-2:pdhb基因pcr產物。
圖3是本發明實施例提供的牛pdhb基因的亞克隆示意圖；
圖中：m:dl2000dnamarker；1:pdhb基因cds序列pcr產物。
圖4是本發明實施例提供的padtrack-cmv-pdhb質粒的雙酶切鑑定示意圖；
圖中：m:trans2kplusiidnamarke；1:雙酶切產物。
圖5是本發明實施例提供的腺病毒重組質粒pad-pdhb酶切鑑定示意圖；
圖中：m:λ-hindⅲdigestmarker；1:pacⅰ酶切產物。
圖6是本發明實施例提供的重組腺病毒ad-pdhb的包裝示意圖。
圖7是本發明實施例提供的重組腺病毒ad-pdhb感染牛肌內前體脂肪細胞示意圖；
圖中：a:重組腺病毒ad-pdhb；b:對照組ad-egfp；c:空白對照。
圖8是本發明實施例提供的牛pdhb基因在感染48h的相對表達水平示意圖。
具體實施方式
為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下結合實施例，對本發明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發明，並不用於限定本發明。
下面結合附圖對本發明的應用原理作詳細的描述。
本發明實施例提供的秦川牛pdhb基因重組腺病毒載體的序列為：genbank:ay370909.2(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/ay370909.2)。
如圖1所示，本發明實施例提供的牛pdhb基因過表達重組腺病毒載體構建方法包括以下步驟：
s101：根據牛pdhb基因mrna序列(genbankaccessionno.nm_001035435)設計引物，克隆該基因的編碼區(codingsequence,cds)序列；
s102：測序驗證後將其重組到穿梭載體padtrack-cmv上，經pmeⅰ線性化後，轉化到含有padeasy-1腺病毒骨架載體的e.colibj5183感受態細胞中進行同源重組，以獲得重組質粒pad-pdhb；
s103：再將經pacⅰ酶切線性化的pad-pdhb轉染到hek293a細胞中，進行病毒包裝並擴增高滴度病毒ad-pdhb，綠色螢光蛋白(gfp)標記法測定病毒滴度；
s104：將高濃度的ad-pdhb病毒感染牛肌內前體脂肪細胞，實時螢光定量pcr(qrt-pcr)檢測pdhb的表達量。
下面結合實驗對本發明的應用原理作進一步的描述。
1材料與方法
1.1材料
本實驗用到的cdna是以24月齡秦川公牛背最長肌提取rna後反轉錄而來的(由本實驗室保存)；腺病毒穿梭載體padtrack-cmv、含有骨架載體padeasy-1的e.colibj5183菌株、hek293a細胞均由本實驗室保存；瓊脂糖、脂質體lipofectamintm2000、dmem培養基、胎牛血清fbs、胰蛋白酶trypsin0.25％edta均購自美國invitrogen公司；top10-gold感受態細胞、質粒小提中量抽提試劑盒、無內毒素大提試劑盒和瓊脂糖凝膠回收試劑盒均購自天根生化科技(北京)有限公司；trans2kplusiidnamarker購自北京全式金生物公司；pgem-t載體、dnat4連接酶購自promega公司；dl2000marker、λ-hindⅲdigestmarker、kod高保真dna聚合酶、螢光定量pcr試劑盒、限制性內切酶pmeⅰ、pacⅰ、kpni和noti均購自大連寶生物(takara)公司；dna引物合成和測序均由英濰捷基(上海)貿易有限公司完成。
1.2方法
1.2.1秦川牛pdhb基因的克隆
根據牛pdhb基因mrna(genbankaccessionno.nm_001035435)序列，用primer5.0軟體設計引物。引物序列為pdhb-f：agatggcggtggttgctgtg；pdhb-r：attaaaaggtcttatgggat，pcr產物大小為1166bp。以肌肉cdna為模板，用kod高保真dna聚合酶擴增牛pdhb基因，pcr反應體系(20μl)為：模板1.2μl,引物f/r(10μm)各0.6μl，kod酶0.4μl，10×buffer2.0μl，dntpmix2.0μl，mg2+2.0μl，ddh2o12.0μl。反應條件為：95℃預變性5min；94℃變性30s、59℃退火30s、72℃延伸1min10s，共35個循環；72℃終止反應10min。pcr產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。將pcr產物經dna片段回收試劑盒純化後連接到pgem-t載體，進而轉化到top10-gold感受態細胞。挑取陽性克隆擴繁獲取菌液，菌液pcr鑑定正確後送測序進行驗證。以測序正確的菌液為模板，引物序列為gpdhb-f：ggggtaccagatggcggtggttgctgtg；gpdhb-r：ataagaatgcggccgcattaaaaggtcttatgggat(小寫字母分別為引人的kpni和noti酶切位點)，進行亞克隆牛pdhb基因的cds序列，pcr產物大小為1080bp。pcr反應體系同前。反應條件退火溫度為62℃，其餘條件也同前。pcr產物純化後連接到pgem-t載體，轉化後挑取pgmt-pdhb陽性克隆擴繁獲取菌液，菌液pcr鑑定正確後送測序進行驗證。
1.2.2腺病毒ad-pdhb的構建及鑑定
1.2.2.1重組穿梭質粒padtrack-cmv-pdhb的構建及鑑定
將pgmt-pdhb重組質粒和padtrack-cmv穿梭質粒分別用限制性內切酶kpni和noti進行雙酶切，回收目的片段後用t4連接酶進行連接，轉化到後top10-gold感受態細胞後挑取padtrack-cmv-pdhb陽性克隆擴繁獲取菌液，提取質粒後雙酶切鑑定。
1.2.2.2重組腺病毒質粒pad-pdhb的構建及鑑定
將padtrack-cmv-pdhb重組質粒用pmeⅰ線性化後，酶切產物轉化到含有骨架載體padeasy-1的e.colibj5183感受態細胞。挑取pad-pdhb陽性克隆，搖菌後提取質粒。用pacⅰ對重組腺病毒質粒pad-pdhb進行酶切鑑定，將重組質粒轉化、塗板、挑取單克隆、菌液鑑定後送測序驗證。
1.2.2.3腺病毒ad-pdhb的包裝、擴增及滴度測定
取5μg無內毒素試劑盒提取重組腺病毒質粒pad-pdhb，用pacⅰ酶切後回收大片段。當hek293a細胞生長到80％左右時，按脂質體lipofectamintm2000說明書2μg質粒/孔轉染，進行重組腺病毒ad-pdhb包裝。將細胞置於含5％co2的37℃培養箱中孵育6h後換液，待細胞長滿培養皿，將細胞傳代於25cm2細胞培養皿中。每天觀察綠色螢光蛋白(gfp)的表達，待細胞長滿瓶底時，再傳入75cm2細胞培養瓶中，每天觀察出毒跡象，即細胞收縮變圓，並伴隨有細胞脫落。轉染12-14d後，當出現明顯的細胞病變反應，且有50％以上細胞從培養瓶壁脫落後收集細胞，-80℃/37℃反覆凍融3次，10，000g離心10min，收集病毒上清，即為第一代病毒母液p1。將p1病毒再次感染hek293a細胞，感染48h後收集細胞，-80℃/37℃反覆凍融3次，10，000g離心10min收集病毒上清，標記為p2。同樣方法用p2代病毒感染大量的hek293a細胞擴增病毒至p3代。取200μl的p3代病毒沸水孵育10min後立即冰浴，短暫離心後取上清用於pcr鑑定模板。pcr鑑定反應體系和條件同1.2.1。將收集的高滴度病毒懸液用綠色螢光蛋白(gfp)標記法測定病毒滴度的方法。
1.2.3重組腺病毒ad-pdhb的活性鑑定
當牛肌內前體脂肪細胞生長到80％左右時，分別侵染高滴度病毒ad-pdhb和ad-egfp。侵染48h後觀察綠色螢光表情況，收集細胞提取總rna，實時螢光定量pcr(qrt-pcr)檢測檢測pdhb基因的表達情況。定量引物為pdhb-rt-f：tctgagatgggctttgctgg，pdhb-rt-r：tgacctggtcgatggcttgc，pcr產物大小為109bp。以牛gapdh基因(accessionno.nm_001034034)作為內參，引物為：gapdh-rt-f：ccaacgtgtctgttgtggat，gapdh-rt-r：ctgcttcaccaccttcttga，pcr產物大小為80bp。
2結果
2.1秦川牛pdhb基因的克隆及鑑定
通過克隆獲得條帶單一的pcr產物大小為1166bp(圖2)，膠回收後連接到pgm-t載體，經測序驗證，目的基因與資料庫genbank收錄的序列一致。設計帶酶切位點的引物，進行亞克隆獲得1080bp的條帶單一的pcr產物(圖3)，即為牛pdhb基因的cds序列，膠回收後連接到pgm-t載體，進一步測序驗證無誤。說明牛pdhb基因克隆成功，可進行下一步實驗。
2.2重組穿梭質粒padtrack-cmv-pdhb的鑑定
限制性內切酶kpni和noti雙酶切padtrack-cmv-pdhb質粒，得到大小分別約為9kb和1kb的兩條條帶(圖4)，符合預期。說明重組穿梭質粒padtrack-cmv-pdhb構建成功，可與腺病毒骨架載體重組。
2.3腺病毒重組質粒pad-pdhb的鑑定
將經pmeⅰ酶切線性化的穿梭質粒padtrack-cmv-pdhb轉化到含有padeasy-1的e.colibj5183感受態。提取質粒後pacⅰ酶切鑑定，電泳檢測到兩條大小分別約為30和4.5kb(圖5)的電泳條帶，初步證明腺病毒重組質粒pad-pdhb重組成功。後經測序驗證，表明pad-pdhb重組成功，可進行下一步的腺病毒包裝實驗。
2.4腺病毒ad-pdhb的包裝、擴繁及滴度測定
將經pacⅰ酶切線性化後的30kb左右的大片段膠回收後，轉染hek293a細胞。轉染24h，ad-pdhb在螢光顯微鏡下已能看到少量細胞開始出現綠色螢光；10d時，綠色螢光數明顯增多，視野變亮並在局部出現葡萄串樣螢光聚集,呈彗星狀；13d時，綠色螢光鋪滿整個視野，大量細胞病變脫落，出現明顯的空斑(圖6)。而空白對照組ad-egfp,轉染24h時也出現綠色螢光；7d時，呈現彗星狀；11d時，大量細胞病變脫落，出現明顯的空斑(圖6)。反覆感染hek293a細胞3次後獲得高滴度病毒。滴度病毒用綠色螢光蛋白(gfp)標記法測定病毒滴度，滴度為1.66×109pfu·ml-1。
2.5病毒活性鑑定
重組腺病毒ad-pdhb感染牛肌內前體脂肪細胞48h後，觀察到大量的綠色螢光(圖7)，表明病毒感染效率較高。收集細胞後，實時螢光定量pcr檢測結果表明感染腺病毒ad-pdhb的pdhb基因表達量比對照組ad-egfp高25.5倍(圖8)。
本發明首先通過設計特異引物，將牛pdhb基因克隆出來，然後再通過設計帶酶切位點的引物進行亞克隆獲得牛pdhb基因的cds區，採用此方法可以有效提高克隆的效率。
本發明通過構建牛pdhb基因的腺病毒過表達載體系統，為檢測pdhb基因在牛前體脂肪細胞分化過程中的作用奠定實驗基礎；成功構建了秦川牛pdhb基因的重組腺病毒表達載體，重組腺病毒ad-pdhb能夠在牛肌內前體脂肪細胞中過表達pdhb基因。
以上所述僅為本發明的較佳實施例而已，並不用以限制本發明，凡在本發明的精神和原則之內所作的任何修改、等同替換和改進等，均應包含在本發明的保護範圍之內。