一種金線蓮組培苗快速繁殖方法與流程
2023-10-06 21:50:54
本發明屬於植物繁殖領域，具體涉及一種金線蓮組培苗快速繁殖方法。
背景技術：
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金線蓮別名金線蘭、金絲草，是蘭科(Orchidaceae)開唇植物花葉蘭屬(Anoectochilus Bl.)多年生珍稀草本植物，我國有23種左右，其中部分種全草民間作藥用,為傳統珍稀名貴中藥材，它在民間使用範圍較廣，多用於治療糖尿病、高血脂、B型肝炎等疾病，素有「藥王」、「金草」、「神藥」、「烏人參」等美稱，被稱為「藥中之王」。多年來，由於其市場需求大而導致人工過度採挖，加上金線蓮自然繁殖率低、生長緩慢，野生的金線蓮資源已非常稀少，瀕臨滅絕，早在1987年國務院就將金線蓮列為重點保護的中藥材之一，為國家二級保護植物。而由於人工種植金線蓮又有較大的難度，目前人工種植的數量還非常有限。由於原材料量的限制，近年來金線蓮產業有所萎縮。因此大力發展人工種植已顯得非常必要和迫切。因為金線蓮在臨床中廣泛應用,而且療效極好,具有極高的經濟效益和社會效益，因此市場需求越來越大，而人工種植的金線蓮還遠不能滿足市場的需求，目前市場價格昂貴，由金線蓮製成的幹品目前售價每公斤達到1萬元，市場金線蓮鮮品價格亦高達800-1000元/公斤，若每畝能產出300公斤以上鮮品，則畝產值可達24萬元以上。是目前農業種植業中效益最高的產業之一。大力發展金線蓮的人工種植，不但可以滿足人們對金線蓮的需求，而且還可以因減少對野生資源的依賴而起到保護野生資源的目的，因此人工種植金線蓮不但有很好的市場前景，而且對野生資源的保護也有重要的意義。
技術實現要素：
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本發明的目的是提供一種汙染率極低，從而有效的降低成本的金線蓮組培苗快速繁殖方法。
本發明的金線蓮組培苗快速繁殖方法，其特徵在於，包括以下步驟：
A、選取天湖金線蓮的健康株系，去掉根、葉片和葉鞘，取其莖條，洗淨後切成帶節莖段，消毒後接種到不定芽誘導培養基J1上，培養溫度為23±2℃，光照強度500～1000lx，光照12h/d，獲得不定芽，所述的不定芽誘導培養基J1每升含花寶1號1～2g，蛋白腖0.5～2g，肌醇80～120mg，甘氨酸1.5～2.5mg，鹽酸硫胺素0.05～0.2mg，鹽酸吡哆醇0.4～0.8mg，煙酸0.4～0.8mg，6-苄基腺嘌呤2.0～5.0mg，萘乙酸0.2～0.5mg，蔗糖15～20g，瓊脂6～7g，pH 5.4-5.6；
B、分切不定芽，將高小於3釐米的叢生芽插植於玻璃培養瓶中的增殖培養基J2上，把高大於3釐米的不定芽單株插植於生根培養基JR上，用瓶塞塞住玻璃培養瓶的瓶口，將含有不定芽的增殖培養基J2和生根培養基JR的玻璃培養瓶橫放於全自然光培養室中的培養架上，瓶口統一朝一方向，散射光能直接照射不定芽上，培養溫度23-25℃，光照強度1000-3000lx，光照時間10-16h/d下培養，當增殖培養基J2在培養下收穫增殖材料不定芽，增殖材料不定芽繼續接種至新的玻璃培養瓶中的增殖培養基J2上，用瓶塞塞住玻璃培養瓶的瓶口，將含有不定芽的增殖培養基J2的玻璃培養瓶橫放於全自然光培養室中的培養架上，瓶口統一朝一方向，散射光能直接照射不定芽上，培養條件為培養溫度23-25℃，光照強度1000-3000lx，光照時間10-16h/d下培養，當增殖材料不定芽培養一個繼代周期後進行接種轉移，高小於3釐米的叢生芽插植於增殖培養基J2中，高大於3釐米的不定芽單株插植於生根培養基JR，如此循環，生根培養基JR上的不定芽長根後成為完整植株進行出瓶移栽；
所述的增殖培養基J2每升含花寶1號2～3g，蛋白腖0.5～2g，肌醇80～120mg，甘氨酸1.5～2.5mg，鹽酸硫胺素0.05～0.2mg，鹽酸吡哆醇0.4～0.8mg，煙酸0.4～0.8mg，6-苄基腺嘌呤2.0～3.0mg，萘乙酸0.2～0.5mg，蔗糖20～30g，瓊脂6～7g，pH 5.4-5.6；
所述的生根培養基JR每升含花寶1號2～3g，蛋白腖0.5～2g，肌醇80～120mg，甘氨酸1.5～2.5mg，鹽酸硫胺素0.05～0.2mg，鹽酸吡哆醇0.4～0.8mg，煙酸0.4～0.8mg，6-苄基腺嘌呤0.2～0.5mg，萘乙酸2～5mg，活性碳500～1000mg，蔗糖20～30g，瓊脂6～7g，pH 5.4-5.6。
優選，將步驟A的不定芽轉接到不定芽誘導培養基J1上進行繼代培養，培養溫度為23±2℃，光照度500～1000lx，光照12h/d，繼代周期為35-40天，繼代培養4-5次後可獲得大量的不定芽作為無性繁殖材料。
所述的步驟A的消毒是將帶節莖段，先用體積分數75％酒精水溶液浸泡30s，再在質量分數0.1％升汞水溶液中浸泡並搖動5～16min，無菌水衝洗3次後，用無菌紙吸乾莖段表面水分，並切去兩端各1～2mm，再接種到不定芽誘導培養基J1。
金線蓮組織培養已有很多的報導，有無菌播種種子繁殖和無性繁殖兩種方式，但因其培養基富含營養加上繼代培養周期偏長，普遍存在金線蓮組培苗生產過程中汙染率高於15％，從而導致生產成本高甚至導致停產的問題，本發明利用廣東從化天湖金線蓮的優良株係為外植體進行無性克隆快速繁殖種苗，確保種苗保持原有優良種性及其藥效，利用培養容器橫放和全自然光的培養方式，可有效解決金線蓮組培快繁中汙染率常常高於15％的難題，同時不用螢光燈作為光源，明顯降低了生產成本，經濟效益更加顯著。本發明的方法具有低成本，種性強，藥效高的特點，提高了金線蓮種苗使用的安全性，對瀕危緊缺金線蓮藥用植物資源再生和持續利用具有十分重要意義，滿足健康產業對珍貴中藥材金線蓮的巨大市場需求。
本發明操作簡便，生產成本低，便於道地金線蓮優良株系的無性克隆快速繁殖種苗，確保金線蓮原有的優良種性和療效。利用本發明繁殖金線蓮種苗，有利於保持種源的優良種性，促進金線蓮生長及藥效的提高，提高道地金線蓮的使用價值和安全性，對瀕危緊缺藥用植物資源再生和持續利用具有十分積極的影響。
本發明的技術特點如下：
1、以原生地的金線蓮優良株係為外植體建立其無性繁殖系。
2、將培養容器橫放，汙染率控制在0.5％以下，且培養材料受光均勻，培養材料生長健壯劃一，利於標準化生產。
3、利用全自然光培養室，可顯著降低了生產成本，提高經濟效益。
4、實施本發明只需有簡單的植物組織培養設備即可進行。
具體實施方式：
以下實施例是對本發明的進一步說明，而不是對本發明的限制。
實施例1：
1.材料：天湖金線蓮(Anoectochilus roxburghii(wall)lindl.『tianhu』)生長健壯、莖粗、葉片大、葉片網紋清晰且多、抗逆性、抗病蟲害強的健康株系。
2.藥品購買
購買植物組培苗生產所需的培養基成分中的常規的所有藥品，將藥品儲存於乾燥涼爽的室內待用。
3.母液配製
根據培養基配方要求，分門別類按組成成分配製其母液。藥品逐一完全溶解，倒入選定的容量瓶內，最後定容。如遇加熱才能溶解情況，需待溶液冷卻後再定容。盛裝母液的試劑瓶，應貼明顯標籤紙，寫上母液名稱、濃度和配製日期，配製好的母液放置冰箱(2～5℃)備用。
4.培養基配製
根據培養材料組培苗生產的要求，配製其增殖培養基和生根培養基，配製培養基按以下程序添加藥品或母液：糖——無離子水——鐵鹽母液——大量元素母液——微量元素母液——維生素母液——甘氨酸母液——肌醇母液——植物生長調節劑母液——瓊脂，調整pH至5.4-5.6，分別將100毫升的培養基灌裝至每一500毫升的方形玻璃培養容器中，再將培養基立放於一長方體的消毒車上，整體推進配套的高壓消毒鍋中於1.06kg/cm2(121℃)條件下滅菌20min。
5.培養基冷卻
當培養基滅菌完畢後，於培養基凝固之前把長方體的消毒車立起來，使方形玻璃培養瓶處於橫放、瓶口朝左右方向狀態進行冷卻培養基，培養基凝固於玻璃培養瓶的一邊上後待用。
6.外植體選擇、消毒及誘導不定芽和形成無性繁殖系
於廣東從化天湖金線蓮原生地中(北緯23度37分至23度40分，東經113度36分至113度38分)，選取生長健壯、莖粗、葉片大、葉片網紋清晰且多、抗逆性、抗病蟲害強的健康株系，用軟毛刷在流水下將苗株表面小心洗淨，去掉根、葉片和葉鞘，頂部未展開葉片可保留約1cm。用洗衣粉水浸泡，同時輕輕搖動約10min，清水洗淨後拿至超淨工作檯。將處理好的金線蓮莖條切成2cm左右帶節莖段，先用體積分數75％酒精水溶液浸泡30s，再在質量分數0.1％升汞水溶液中浸泡並搖動5～16min，無菌水衝洗3次後，用無菌紙吸乾莖段表面水分，並切去兩端各1～2mm，再接種到不定芽誘導培養基J1進行不定芽誘導，培養溫度為(23±2)℃，光照度500～1000lx，光照12h/d，由此獲得不定芽，不定芽進行繼代培養，繼代培養的培養基為不定芽誘導培養基J1，繼代培養的條件同不定芽誘導，繼代周期為35-40天，同繼代培養4-5次後可獲得大量的不定芽作為無性繁殖材料。
所述的不定芽誘導培養基J1，每升含花寶1號1g，蛋白腖2g，肌醇80mg，甘氨酸2.5mg，鹽酸硫胺素(VB1)0.05mg，鹽酸吡哆醇(VB6)0.8mg，煙酸0.4mg，6-苄基腺嘌呤(6-BA)5.0mg，萘乙酸(NAA)0.2mg，蔗糖20g，瓊脂6g，餘量為水，pH 5.4，其配置方法是將花寶1號1g，蛋白腖2g，肌醇80mg，甘氨酸2.5mg，鹽酸硫胺素(VB1)0.05mg，鹽酸吡哆醇(VB6)0.8mg，煙酸0.4mg，6-苄基腺嘌呤(6-BA)5.0mg，萘乙酸(NAA)0.2mg，蔗糖20g，瓊脂6g加入到少量水中，然後用水定容至1L，調pH值至5.4，滅菌備用。
7.接種轉移
按規定要求將步驟6的無性繁殖材料(不定芽)逐一細緻觀察，剔除汙染材料，用體積分數75％酒精水溶液抹乾淨玻璃培養瓶表面，於玻璃培養瓶中裝填增殖培養基J2或生根培養基JR。於超淨工作檯上，按正常的操作分切無性繁殖材料得到培養材料，從側邊開瓶口中從分切好的培養材料中把高小於3釐米的叢生芽插植於增殖培養基J2中和把高大於3釐米的不定芽單株插植於生根培養基JR中，用瓶塞蓋住瓶口。
所述的增殖培養基J2每升含花寶1號2g，蛋白腖2g，肌醇80mg，甘氨酸2.5mg，鹽酸硫胺素(VB1)0.05mg，鹽酸吡哆醇(VB6)0.8mg，煙酸0.4mg，6-苄基腺嘌呤(6-BA)3.0mg，萘乙酸(NAA)0.2mg，蔗糖30g，瓊脂6g，pH 5.6。其配製方法是：將花寶1號2g，蛋白腖2g，肌醇80mg，甘氨酸2.5mg，鹽酸硫胺素(VB1)0.05mg，鹽酸吡哆醇(VB6)0.8mg，煙酸0.4mg，6-苄基腺嘌呤(6-BA)3.0mg，萘乙酸(NAA)0.2mg，蔗糖30g，瓊脂6g溶於少量水中，然後用水定容至1L，調pH至5.6，滅菌備用。
所述的生根培養基JR每升含花寶1號2g，蛋白腖2g，肌醇80mg，甘氨酸2.5mg，鹽酸硫胺素(VB1)0.05mg，鹽酸吡哆醇(VB6)0.8mg，煙酸0.4mg，6-苄基腺嘌呤(6-BA)0.5mg，萘乙酸(NAA)2mg，活性碳1000mg，蔗糖20g，瓊脂7g，pH 5.4。其配製方法為：將花寶1號2g，蛋白腖2g，肌醇80mg，甘氨酸2.5mg，鹽酸硫胺素(VB1)0.05mg，鹽酸吡哆醇(VB6)0.8mg，煙酸0.4mg，6-苄基腺嘌呤(6-BA)0.5mg，萘乙酸(NAA)2mg，活性碳1000mg，蔗糖20g，瓊脂7g溶於少量水中，然後用水定容到1L，調pH值至5.4，滅菌備用。
8.全自然光照培養室的設計和培養
使用鋼化玻璃建成透光的培養室，配備遮陽系統、降溫設備、培養架。遮陽系統包括內外遮陽網，通過調控內外遮陽網使培養室內頂層培養架的光照強度為3000～5000Lux，頂層往下的第二、三層培養架光照強度為1000～3000Lux，底層即頂層下第四層光照強度100～1000Lux。降溫設備採用冷暖兩用空調，可將玻璃培養室的溫度控制在20～25℃。培養架寬為60釐米，高為200釐米，離地面10釐米為第四層，層距60釐米，共四層，培養架長度可根據培養室的大小而定。
將接種有不定芽的增殖培養基J2和生根培養基JR的玻璃培養瓶橫放於全自然光培養室中的培養架上，瓶口統一朝一方向，散射光能直接照射培養材料上，避免常規的立放的培養容器瓶蓋對光的遮擋而影響培養材料對光的吸收；同時由於瓶口的側開可有效避免培養室中的微粒進入培養容器中，汙染發生小於0.5％，遠低於通常汙染率低於5％的要求。放置於培養溫度(23-25)℃，光照強度1000-3000lx，光照時間10-16h/d下培養，當增殖培養基J2在培養下收穫增殖材料不定芽，增殖材料不定芽繼續接種至新的玻璃培養瓶中的增殖培養基J2上，用瓶塞塞住玻璃培養瓶的瓶口，將含有不定芽的增殖培養基J2的玻璃培養瓶橫放於全自然光培養室中的培養架上，瓶口統一朝一方向，散射光能直接照射不定芽上，培養條件為培養溫度23-25℃，光照強度1000-3000lx，光照時間10-16h/d下培養，當增殖材料不定芽培養一個繼代周期後進行接種轉移，高小於3釐米的叢生芽插植於增殖培養基J2中，高大於3釐米的不定芽單株插植於生根培養基JR，如此循環，生根培養基JR上的不定芽長根後成為完整植株進行出瓶移栽。
實施例2：
1.材料：天湖金線蓮(Anoectochilus roxburghii(wall)lindl.『tianhu』)生長健壯、莖粗、葉片大、葉片網紋清晰且多、抗逆性、抗病蟲害強的健康株系。
2.藥品購買
購買植物組培苗生產所需的培養基成分中的常規的所有藥品，將藥品儲存於乾燥涼爽的室內待用。
3.母液配製
根據培養基配方要求，分門別類按組成成分配製其母液。藥品逐一完全溶解，倒入選定的容量瓶內，最後定容。如遇加熱才能溶解情況，需待溶液冷卻後再定容。盛裝母液的試劑瓶，應貼明顯標籤紙，寫上母液名稱、濃度和配製日期，配製好的母液放置冰箱(2～5℃)備用。
4.培養基配製
根據培養材料組培苗生產的要求，配製其增殖培養基和生根培養基，配製培養基按以下程序添加藥品或母液：糖——無離子水——鐵鹽母液——大量元素母液——微量元素母液——維生素母液——甘氨酸母液——肌醇母液——植物生長調節劑母液——瓊脂，調整pH至5.4-5.6，分別將100毫升的培養基灌裝至每一500毫升的方形玻璃培養容器中，再將培養基立放於一長方體的消毒車上，整體推進配套的高壓消毒鍋中於1.06kg/cm2(121℃)條件下滅菌20min。
5.培養基冷卻
當培養基滅菌完畢後，於培養基凝固之前把長方體的消毒車立起來，使方形玻璃培養瓶處於橫放、瓶口朝左右方向狀態進行冷卻培養基，培養基凝固於玻璃培養瓶的一邊上後待用。
6.外植體選擇、消毒及誘導不定芽和形成無性繁殖系
於廣東從化天湖金線蓮原生地中(北緯23度37分至23度40分，東經113度36分至113度38分)，選取生長健壯、莖粗、葉片大、葉片網紋清晰且多、抗逆性、抗病蟲害強的健康株系，用軟毛刷在流水下將苗株表面小心洗淨，去掉根、葉片和葉鞘，頂部未展開葉片可保留約1cm。用洗衣粉水浸泡，同時輕輕搖動約10min，清水洗淨後拿至超淨工作檯。將處理好的金線蓮莖條切成2cm左右帶節莖段，先用體積分數75％酒精水溶液浸泡30s，再在質量分數0.1％升汞中浸泡並搖動5～16min，無菌水衝洗3次後，用無菌紙吸乾莖段表面水分，並切去兩端各1～2mm，再接種到不定芽誘導培養基J1進行不定芽誘導，培養溫度為(23±2)℃，光照度500～1000lx，光照12h/d，由此獲得不定芽，不定芽進行繼代培養，繼代培養的培養基為不定芽誘導培養基J1，繼代培養的條件同不定芽誘導，繼代周期為35-40天，同繼代培養4-5次後可獲得大量的不定芽作為無性繁殖材料。
所述的不定芽誘導培養基J1每升含花寶1號2g，蛋白腖0.5g，肌醇120mg，甘氨酸1.5mg，鹽酸硫胺素(VB1)0.2mg，鹽酸吡哆醇(VB6)0.4mg，煙酸0.8mg，6-苄基腺嘌呤(6-BA)2.0mg，萘乙酸(NAA)0.5mg，蔗糖15g，瓊脂7g，pH 5.6。其配製方法是將花寶1號2g，蛋白腖0.5g，肌醇120mg，甘氨酸1.5mg，鹽酸硫胺素(VB1)0.2mg，鹽酸吡哆醇(VB6)0.4mg，煙酸0.8mg，6-苄基腺嘌呤(6-BA)2.0mg，萘乙酸(NAA)0.5mg，蔗糖15g，瓊脂7g加入到少量水中，然後用水定容至1L，調pH值至5.6，滅菌備用。
7.接種轉移
按規定要求將步驟6的無性繁殖材料(不定芽)逐一細緻觀察，剔除汙染材料，用體積分數75％酒精水溶液抹乾淨玻璃培養瓶表面，於玻璃培養瓶中裝填增殖培養基J2。於超淨工作檯上，按正常的操作分切無性繁殖材料得到培養材料，從側邊開瓶口中從分切好的培養材料中把高小於3釐米的叢生芽插植於增殖培養基J2中和把高大於3釐米的不定芽單株插植於生根培養基JR。
所述的增殖培養基J2每升含花寶1號3g，蛋白腖0.5g，肌醇120mg，甘氨酸1.5mg，鹽酸硫胺素(VB1)0.2mg，鹽酸吡哆醇(VB6)0.4mg，煙酸0.8mg，6-苄基腺嘌呤(6-BA)2.0mg，萘乙酸(NAA)0.5mg，蔗糖20g，瓊脂7g，pH 5.4。其配製方法是：將花寶1號3g，蛋白腖0.5g，肌醇120mg，甘氨酸1.5mg，鹽酸硫胺素(VB1)0.2mg，鹽酸吡哆醇(VB6)0.4mg，煙酸0.8mg，6-苄基腺嘌呤(6-BA)2.0mg，萘乙酸(NAA)0.5mg，蔗糖20g，瓊脂7g溶於少量水中，然後用水定容至1L，調pH至5.4，滅菌備用。
所述的生根培養基JR每升含花寶1號3g，蛋白腖0.5g，肌醇120mg，甘氨酸1.5mg，鹽酸硫胺素(VB1)0.2mg，鹽酸吡哆醇(VB6)0.4mg，煙酸0.8mg，6-苄基腺嘌呤(6-BA)0.2mg，萘乙酸(NAA)5mg，活性碳500mg，蔗糖30g，瓊脂6g，pH 5.6。其配製方法為：將花寶1號3g，蛋白腖0.5g，肌醇120mg，甘氨酸1.5mg，鹽酸硫胺素(VB1)0.2mg，鹽酸吡哆醇(VB6)0.4mg，煙酸0.8mg，6-苄基腺嘌呤(6-BA)0.2mg，萘乙酸(NAA)5mg，活性碳500mg，蔗糖30g，瓊脂6g溶於少量水中，然後用水定容到1L，調pH值至5.6，滅菌備用。
8.全自然光照培養室的設計和培養
使用鋼化玻璃建成透光的培養室，配備遮陽系統、降溫設備、培養架。遮陽系統包括內外遮陽網，通過調控內外遮陽網使培養室內頂層培養架的光照強度為3000～5000Lux，頂層往下的第二、三層培養架光照強度為1000～3000Lux，底層即頂層下第四層光照強度100～1000Lux。降溫設備採用冷暖兩用空調，可將玻璃培養室的溫度控制在20～25℃。培養架寬為60釐米，高為200釐米，離地面10釐米為第四層，層距60釐米，共四層，培養架長度可根據培養室的大小而定。
將接種有不定芽的增殖培養基J2和生根培養基JR的玻璃培養瓶橫放於全自然光培養室中的培養架上，瓶口統一朝一方向，散射光能直接照射培養材料上，避免常規的立放的培養容器瓶蓋對光的遮擋而影響培養材料對光的吸收；同時由於瓶口的側開可有效避免培養室中的微粒進入培養容器中，汙染發生小於0.5％，遠低於通常汙染率低於5％的要求。放置於培養溫度(23-25)℃，光照強度1000-3000lx，光照時間10-16h/d下培養，當增殖培養基J2在培養下收穫增殖材料不定芽，增殖材料不定芽繼續接種至新的玻璃培養瓶中的增殖培養基J2上，用瓶塞塞住玻璃培養瓶的瓶口，將含有不定芽的增殖培養基J2的玻璃培養瓶橫放於全自然光培養室中的培養架上，瓶口統一朝一方向，散射光能直接照射不定芽上，培養條件為培養溫度23-25℃，光照強度1000-3000lx，光照時間10-16h/d下培養，當增殖材料不定芽培養一個繼代周期後進行接種轉移，高小於3釐米的叢生芽插植於增殖培養基J2中，高大於3釐米的不定芽單株插植於生根培養基JR，如此循環，生根培養基JR上的不定芽長根後成為完整植株進行出瓶移栽。