利用包含體乾重的蛋白測量的製作方法

2023-10-27 05:29:22 3

專利名稱：：利用包含體乾重的蛋白測量的製作方法
技術領域：
：本發明涉及基於包含體採集物的乾重來測定重組蛋白製備中的蛋白產物的方法。
背景技術：
：在諸如大腸桿菌(E.coli)的細菌中產生的重組蛋白的高水平表達往往導致在細菌細胞內形成稱為包含體的不溶凝聚物(Shein等，Bio/Technology7:1141-49,1989)。一般而言，包含體蛋白是在宿主中過量表達的蛋白，其在表達或純化的較末期階段可通過相差顯微鏡作為沉澱觀察到。包含體是電子緻密的無定形顆粒，其與胞質有不連續的分界但並不被膜包圍(Schoemaker等，EMBOJ4:775-780,1985)。在製備包含體時，各種類型的相互作用可導致其它汙染物(例如內毒素、細胞壁碎片和脂類)的二次吸附(MarstonFAO,Biochem.J.240:1_12，1986)。包含體的平均顆粒大小取決於所表達的特定靶蛋白、宿主菌株、表達系統以及所用的培養基，其範圍可為0.07μm(人生長激素)(BlumP等，Bio/Technology10:301_304，1992)至1.5μm(β-內醯胺酶)(Bowden等，Bio/Technology9725-730，1991)。包含體的進一步描述可參見美國專利第4，512，922號，其將包含體稱為「折射體」。通常在細胞裂解(例如通過溶菌酶、超聲處理或高壓勻漿來裂解)後通過數次離心和洗滌的步驟，從細胞裂解液中採集包含體。參見例如美國專利第4，511，503號；第4，518，526號；第5，605，691號和第6，936，699號。隨後將純化的包含體用例如去垢劑或其它溶液(尿素、SDS、鹽酸胍)溶解或變性，使不溶蛋白分子解摺疊並變得可溶。變性劑隨後可例如通過透析或分子篩來移除，或通過高速離心移除分子量更高的組分並潷出變性齊U。隨後分離出重組蛋白並使其重摺疊，以形成有生物活性的正確的高次結構。為了確保最有效的重摺疊反應，控制重摺疊反應中蛋白的量和濃度是重要的。從包含體中回收的蛋白通常通過高效液相色譜(HPLC)分析包含體採集物的等分試樣來測定。然而，HPLC法的實時分析是個複雜且費時的過程。因此，本領域仍需要測定重組蛋白製備期間所製備的重組蛋白水平的更加高效且準確的方法。發明概述本發明涉及用於測量重組蛋白(細菌)培養物中產生並穿梭至包含體中的蛋白的改良方法。在一個方面，本發明提供了用於計算細菌的包含體(IB)採集物中重組蛋白濃度的方法，該方法包括在公式中將IB採集漿液等分試樣中的乾燥固體的總濃度與蛋白生產率換算係數(PPCF)相乘的步驟，其中該公式的乘積提供了所述IB採集漿液的所述等分試樣中的總重組蛋白的濃度，並且其中所述重組蛋白的PPCF由IB採集漿液的等分試樣通過下述方法測定將該等分試樣中重組蛋白與該等分試樣中總乾燥固體的比乘以1000。總重組蛋白可依照下式計算[(總乾燥固體，mg)/(IB採集漿液等分試樣，g)xPPCF]x總IB採集漿液的重量，g=(總重組蛋白，mg)。上述蛋白生產率換算係數可依照下式計算(PPCF)=[上述等分試樣中重組蛋白(mg)/上述等分試樣中總乾燥固體(mg)]xl000。在備選的實施方案中，換算係數可基於待確定的備選單位來計算。例如，濃度可表示為g/kg、g/L、mg/g或mg/ml，並且因為物質的密度非常接近於1，故通常這些濃度是等同的。據此，假設密度接近lg/ml，則用mg/ml表示的濃度相當於用mg/g表示的濃度。在一個方面，重組蛋白可為以轉化細菌(即轉化或轉染了導致編碼異源蛋白的基因表達的重組DNA載體的細菌)中的不溶包含體形式在細菌中表達的任何蛋白。考慮用於本發明的方法的重組蛋白包括但不限於抗體(例如多克隆抗體、單克隆抗體、人抗體、人源化抗體、Fab抗體片段、F(ab')2抗體片段、Fv抗體片段、ScFv抗體片段或SCA抗體片段、雙特異性抗體、雙抗體、肽體(P印tibody)、嵌合抗體和線性抗體(linearantibody)),酶、激素、細胞因子、趨化因子、生長因子、轉錄因子、跨膜蛋白、細胞表面受體、細胞粘附蛋白、細胞骨架蛋白、融合蛋白或任何以上蛋白的片段或類似物。在一個實施方案中，將一份包含體採集物等分試樣的PPCF用於計算重組蛋白的濃度，所述蛋白來自按照相同方案獲得的不同發酵包含體採集物。在另一個方面，本發明考慮首先將上述等分試樣的包含體採集漿液中的總重組蛋白用HPLC試驗測定。在一個實施方案中，在使包含物採集等分試樣中的包含體溶解後測定蛋白的效價(titer)，並且通過HPLC分析測定樣品中的重組蛋白。在又一個方面，在乾燥前不溶解上述包含物採集等分試樣內的包含體。本發明進一步考慮通過將分離的包含體漿液經由微波輻射乾燥來計算包含體等分試樣的乾重。在一個實施方案中，所述乾燥進一步包括使用加熱。在另一個實施方案中，所述乾燥在CEMLabWaVe9000中進行。進一步考慮可用本領域的常見技術(包括加熱、微波輻射、風乾、冷凍乾燥(lyophilization，freeze-drying)以及真空乾燥)來測定重組蛋白的乾重。一旦將樣品乾燥，則可使用標準的天平裝置測量固體的乾重。詳述本發明涉及用於測定在重組蛋白宿主細胞培養物中產生並穿梭至包含體中的蛋白的改良方法。正如本文所公開，業已發現在相同或基本相同的發酵條件下，包含體的形成大致上是一個有序的過程，並且包含體中重組蛋白的組成是非常一致的。通過發現包含體形成和組成的這種一致性，提出並證實了如下方法通過測量包含體採集漿液的乾重或固體百分比，並接著將該乾重的測量結果乘以預設的換算係數來測定包含體中重組蛋白的濃度。依賴於包含體組成的一致性，該方法測定僅一小等分試樣的包含體採集物中重組蛋白的濃度，以計算蛋白特異性換算係數，並消除了使用費時且複雜的方法(例如HPLC)來測量整個包含體採集物中蛋白的需要。一旦設計並建立用於在給定的宿主細胞中製備給定重組蛋白的發酵方法，只要該發酵方法保持基本不變，該蛋白的換算係數可用於推測不同批次的包含體採集物中的總重組蛋白，而不需要對每個批次進行計算。這一發現提供了在關鍵步驟(例如重摺疊)前控制蛋白的量/濃度的快速、耐用並且花費更少的方法。此外，預設的換算係數可用於監測發酵方法的一致性。術語「重組蛋白」是指在轉染了異源DNA分子的宿主細胞中表達的異源蛋白分子。術語「包含體」是指細菌宿主細胞內的不溶凝聚物，其含有表達在該宿主細胞中的蛋白。雖然轉染的宿主細胞中包含體的蛋白大多是重組(異源)蛋白，但內源(或同源)宿主細胞蛋白可佔總蛋白的一部分。術語「包含體採集物」是指所收集的在用於製備重組蛋白的發酵過程中產生的包含體。包含體採集物的純化程度可不同。「殺滅後樣品(PostKillsample)」是指在細菌裂解之前而在用本領域已知的技術殺滅細菌之後的細菌培養物樣品。細胞糊漿(CellPaste)是指在將細菌宿主細胞裂解以釋放包含體之前收集(通常通過離心)的包含體採集物的樣品。經洗滌的包含體(WIB)部分是指在將包含體洗滌至少一次或兩次(經兩次洗滌的包含體，DffIB)後的包含體採集物。術語「包含體漿液」或「包含體採集漿液」是指包含體採集物，其含有包含體顆粒的量以及在收集包含體(例如通過離心並潷出上清)後殘留的任何殘留量。包含體漿液在水中可包含重懸浮或部分重懸浮的包含體顆粒。術語「乾重」是指在通過微波、加熱或本領域已知的其它技術從樣品中移除全部液體後包含體漿液等分的重量。乾重還可指總包含體固體或基於包含體固體的重組蛋白百分比的重組蛋白重量。術語「固體百分比」是指在將樣品乾燥並移除樣品中全部液體後，包含體採集漿液等分試樣中固體的量。術語「蛋白生產率換算係數」(PPCF)是指在特定的發酵條件下，特定針對由包含體採集物純化得到的重組蛋白的數值，並且該係數與下述比成比例，所述比為樣品中重組蛋白的重量和相同樣品中總包含體乾燥固體重量之比。該蛋白生產率換算係數允許測定回收自包含體採集物的總重組蛋白。在一個方面，蛋白生產率換算係數通過HPLC試驗測定。PPCF通過下式計算PPCF=[IB採集物等分試樣中的總重組蛋白，mg/相同IB採集物等分試樣中的總乾燥固體，mg]xl000。術語「總重組蛋白的濃度」是指回收自發酵過程的總蛋白，其基於包含體採集物中乾燥固體的總重量中的包含體中重組蛋白的重量。總重組蛋白可利用下式計算[(總乾燥固體，mg)/(IB採集勻漿等分試樣，g)xPPCF]x總IB採集漿液重量(g)=(總重組蛋白，mg)。本發明用於為已設計好的發酵過程中產生的任何重組蛋白測定蛋白生產率換算係數。考慮用於本發明的方法的重組蛋白包括但不限於抗體(例如多克隆抗體、單克隆抗體、人抗體、人源化抗體、Fab抗體片段、F(ab')2抗體片段、Fv抗體片段、ScFv抗體片段或單鏈抗體片段、雙特異性抗體、雙抗體、肽體、嵌合抗體和線性抗體)、酶、激素、細胞因子、趨化因子、生長因子、轉錄因子、跨膜蛋白、細胞表面受體、細胞粘附蛋白、細胞骨架蛋白、融合蛋白或任何以上蛋白的片段或類似物。包含體的純化和分離用於分離包含體、從包含體中純化重組蛋白的技術以及用於使蛋白重摺疊和復性的技術為本領域技術人員所已知。例如參見Sambrook，J等，MolecularCloningaLaboratoryManual(分子克隆實驗手冊)，第17.37-17.41頁，ColdSpringHarborLaboratoryPress(1989)；Rudolph，R等，FASEBJ.10:49-56(1995)。純化包含體可利用本領域已知的技術進行。參見例如Ausube1等，(CurrentProtocolsinMolecularBiology(分子生物學的現亍方案)，Johnffiley禾口Sons,NewYork,NY,Ch，1994)。首先將細胞離心得到細胞顆粒。然後將所述顆粒重懸浮於合適的緩衝液並通過在高壓、超聲或化學方法(例如加入裂解酶或變性劑)裂解細胞來釋放包含體。在本發明中，考慮在不導致包含體溶解的條件下裂解細胞。為了計算發酵過程中蛋白的PPCF，可利用本領域通常使用的試劑(包括胍鹽、尿素、去垢劑及其它的有機溶劑(參見例如美國專利第5，605，691號和Bruggeman等，Biotechniques10:202_209(1991)))將包含體採集物等分試樣中的蛋白溶解。應注意增溶劑的效率會隨著蛋白的物理特性而變化。示例性胍鹽包括鹽酸胍。示例性去汙劑包括十二烷基硫酸鈉(SDS)、Triton-X、辛酸、膽酸、1-癸烷磺酸、去氧膽酸、甘氨膽酸、甘氨去氧膽酸、牛磺膽酸、牛磺去氧膽酸以及硫酸鈉鹽去垢劑家族的成員(例如十四烷基硫酸鈉和十六烷基硫酸鈉)(參見美國專利第5，605，691號)。這些試劑可單獨使用或彼此組合使用，或與適用於所純化的重組蛋白的其它試劑組合使用。蛋白表達本發明的目標包含體通過在細菌宿主菌株中表達重組蛋白形成。考慮用於本發明的細菌宿主菌株包括大腸桿菌菌株，其包括但不限於BL21(DE3)、BL21(DE3)pLysS和BL21(DE3)pLysE(F.W.Studier等，MethodsinEnzymology(酶學方法)18560-89(1990))、MC1061、AG1、AB1157、BNN93、BW26434、CGSC第7658號菌株、C60、C600hflA150(Y1073，BNN102)、D1210、DB3.1、DHl、DH5α、DhlOB、DH12S、DMl、ER2566(NEB)、HB101、IJ1126、IJ1127、JM83、JM10UJM103、JM105、JM106、JM107、JM108、JM109、JM109(DE3)、JMl10、JM2.300、LE392、Mach1、MC4100、MG1655Rosetta(DE3)pLysS、Rosetta-gami(DE3)pLysS、RRl、STBL2、STBL4、SURE、SURE2、TG2、TOP10、TopIOF'、W3110、XLl-Blue、XL2-Blue、XL2-BlueMRF'、XLl-Red、XL10-Gold、XL10_GoldKanR0適合製備重組蛋白並形成包含體的本領域已知的其它細菌菌株可用於本發明的方法中。依照本領域已知的標準發酵方法在選定的菌株中表達重組蛋白。上述方法可根據所用的細菌菌株和待表達的重組蛋白修改。例如，在採集包含體前，細菌培養物可生長於選定密度(OD6J的培養基和合適的選擇培養基中。參見Ausubel等(CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley和Sons，NewYork,NY，1994)。製備重組蛋白的方法參見例如美國專利第6，759，215號和第6，632，426號。包含體採集物中蛋白的測定包含體採集物等分試樣中重組蛋白的濃度可通過本領域已知的方法測定，所述方法包括高效液相色譜(HPLC)、離子交換色譜、布拉德福德試驗(Bradfordassay)、紫外吸光度、螢光技術或蛋白印跡(Westernblot)分析。以上方法中，HPLC法允許在同一輪檢測運行中計算蛋白濃度和樣品的純度。據此，在本發明的一個方面，考慮使用HPLC獲得樣品的蛋白濃度。為了測定發酵培養物和包含體採集物的等分試樣中蛋白的量，進行HPLC效價測定(HPLCtiter)。在HPLC效價測定中，收集IB採集物的等分試樣試樣，溶解包含體並使蛋白變性。隨後用本領域已知的方法和技術(CurrentProtocolsinProteinChemistry(蛋白質化學的現行方案)，JohnWiley和Sons，NewYork,NY,1994)和本文所述的方法和技術製備用於HPLC的樣品，以測定蛋白樣品中蛋白的純度/濃度。無論如何測定IB採集物等分試樣的重組蛋白，所計算出的濃度將用於測定蛋白生產率換算係數。包含體的乾重或固體百分比的測定方法包含體採集物的乾重或固體百分比可使用本領域的任何方法(包括加熱、微波輻射、風乾、冷凍乾燥和真空乾燥)測定。一旦樣品乾燥，則可使用標準的天平裝置測量固體的乾重。加熱與微波輻射的組合對於乾燥等分試樣試樣並測定其中的固體百分比有效。在一個方面，包含體採集物可利用微波輻射和加熱來乾燥。CEMLabffave9000儀(CEMCorporation,Matthews,NC)被設計為使液體、固體和漿液的水分/固體範圍達到0.01%-99.99%，解析度高至0.01%。該儀器提供的蛋白輸出的讀數精度為0.lmg，並且提供0-100%全功率(630瓦特)的以增大的微波功率。在相關的實施方案中，包含體樣品可使用本領域已知地其它的水分分析設備乾燥，這些設備包括但不限於:CEMAVC-80MicrowaveMoistureAnalyzer、CEMSmartSystem、DenverInstrumentM2MicrowaveAnalyzer(Denverlnstruments,Denver,CO)、OmnimarkμWave(Sartorius-Omnimark,Goettingen,Germany)禾口SartoriusMMA30(Sartorius,Goettingen,Germany)。以下實施例闡述了本發明的各種非限制性實施方案和/或為其提供了支持。實施例1重組蛋白常常在大腸桿菌中以不溶的包含體表達。以往，包含體被認為是過量表達的重組蛋白的隨機沉澱。然而，近來提示包含體可以以有序的凝聚過程形成，而且若發現這些包含體具有一致的重組蛋白組成，則可不再需要使用複雜且費時的HPLC方法對每一發酵和包含體採集物進行包含體採集物的重組蛋白濃度定量。因此，為了確定包含體是否以有序方式產生組成一致的重組蛋白，設計初始實驗以試圖用公式表示數學模型，其允許用最少的實驗嘗試對蛋白的含量進行定量。在用於製備重組的人粒細胞集落刺激因子(r-metHuG-CSF)的細胞發酵過程的末尾，用高壓裂解大腸桿菌細胞並在蛋白溶解和重摺疊前通過多次離心方法採集包含體。然後將該包含體培養液首先用於蛋白濃度分析。為測定r-metHuG-CSF蛋白相對於乾燥樣品中宿主蛋白和其它汙染物的量，測定了包含體的「生產率」。生產率定義為樣品蛋白和包含體樣品的總乾重之比，並且當該比乘以1000時，獲得了對於在固定的發酵過程中表達的所需重組蛋白的蛋白生產率轉換係數(PPCF)(PPCF)=[(總重組蛋白，mg)/(總乾燥固體，mg)]xl000。在測定該比時，用IB採集物漿液的等分試樣進行RP-HPLC。通過在管中漩渦震蕩或在燒杯中攪拌將部分IB採集物漿液懸浮，並將ImL懸浮培養液加入到30mL溫育/變性緩衝液(8M鹽酸胍、50mMTris、5mMEDTA、50mMDTT,ρΗ8.4士0.1)。在65士3°C的水浴中溫育混合物約30分鐘，隨後將40μL經變性並還原的r-metHuG-CSF進樣至Agilent1100HPLC(Agilent,SantaClara,CA)上的4.6x1OOmmPOROSRl/10柱(AppliedBiosystems,FosterCity，CA)。在約6.2分時重組蛋白在如下的快速梯度下洗出用60%流動相A至55%流動相Β以2mL/分的流速洗脫9分鐘。在整個分析過程中，用設定在214nm的在線紫外檢測器對蛋白峰定量。將各樣品的r-metHuG-CSF蛋白含量通過線性回歸構建的標準校正曲線計算。在細胞破碎前採集的細胞發酵樣品(例如殺滅後樣品和細胞糊漿樣品)，即通過將發酵培養液離心得到的細胞沉澱採集樣品，含有包括宿主細胞蛋白在內的大量大腸桿菌成分。HPLC分析顯示細胞糊漿中重組的r-metHuG-CSF蛋白平均約佔細胞糊漿總乾重的29%(表1和表2)。進一步的分析還顯示大腸桿菌宿主細胞的蛋白與該細胞糊漿中樣品蛋白的比是可變的，其由細胞糊漿生產率中相對較大的變化性反映(表1和表2)。表1是經兩次洗滌的包含體(DWIB)的生產率與獲得該DWIB的細胞糊漿的生產率的對比情況。將生產率表示為樣品蛋白與總乾重之比乘以100%。表2顯示了經洗滌的包含體(WIB)與獲得該WIB的細胞糊漿之間生產率的對比情況。表1__tableseeoriginaldocumentpage8表2____tableseeoriginaldocumentpage8tableseeoriginaldocumentpage9這些結果和HPLC分析顯示在細胞裂解後，通過離心步驟將大部分宿主細胞蛋白從包含體部分移除。由於重組r-metHuG-CSF顯示緊湊的洗脫曲線，包含體、經洗滌的包含體和經兩次洗滌的包含體以幾乎相同的曲線洗脫(Theinclusionbodies,washedinclusionbodiesanddoublewashedinclusionbodieselutewithalmostthesameprofile,withtherecombinantr—metHuG—CSFproteindemonstratingatightelutionprofile.)。分析顯示重組蛋白佔包含體總蛋白的幾乎93%。重組蛋白的平均生產率從細胞糊漿的29%增大至包含體的67%。此外，生產率的變異性(相對標準偏差(RSD))從細胞糊漿的8%減少至包含體的3%(表1和表2)。在重組蛋白在各發酵採集物之間以有序和一致的方式形成包含體並且發酵以相同或基本相同的方法進行的情況下，使用本發明可將測定的IB採集物漿液等分試樣的蛋白生產率換算係數用於測定其它發酵採集物中的蛋白。例如一旦如本文所示地計算得到上述係數，給定量的IB採集物漿液中的總蛋白可容易地通過將漿液中的乾燥固體與以上測定的PPCF相乘來測定，而不需要對在相同發酵條件下製備的各IB採集物實施HPLC。實施例2為了確定上述的乾重分析是否允許準確預測IB採集物的重組蛋白濃度，將如上所述地用乾重樣品中獲得的重組蛋白的預測濃度與用HPLC測量的樣品濃度進行比較。HPLC樣品的製備與上述的效價測量試驗完全相同，其中將40μL經變性並還原的IB採集物漿液進樣至Agilent1100HPLC(Agilent,SantaClara,CA)上具有5μm顆粒直徑和300人的孔徑的4.6mmIDxl50mmC4鍵合相矽膠柱(YMC，Shimogyo-ku，Kyoto，Japan)。將還原蛋白混合物在完全梯度下分離，所述梯度用20%流動相A至85%流動相BW.1%(體積比)TFA的90%乙腈溶液]以0.SmL/分的流速洗脫80分鐘。在整個分析過程中，用設定在214nm的在線紫外測定器監測蛋白峰。在與傳統的HPLC試驗比較時，乾重試驗與HPLC試驗的結果相關(表3)。對於HPCL試驗和乾重試驗之間的相關，將670用作換算係數。表3_tableseeoriginaldocumentpage9tableseeoriginaldocumentpage10兩種試驗之間的差異是固有變異性的組合，且主要是由HPLC試驗導致，因為它是單次測定的並通常具有較大變異性。這兩種試驗的平均差異小，為0.3%。乾重試驗的準確性大概在士3%之內。這些結果證實通過基於包含體的蛋白含量計算蛋白濃度來測定蛋白乾重的方法是用於在進行蛋白的重摺疊步驟前測定蛋白濃度的準確且快速的方法。用該方法測定蛋白濃度節省了製備HPLC樣品所需的時間，還節省了製備這些樣品的資金。此外，使用乾重測量是在計算蛋白的重摺疊步驟所需的試劑前測定蛋白的濃度準確方法。因此，本方法提供了用於在大規模蛋白製備中測定蛋白濃度的更快速、更便宜的方法。實施例3為了發現可能影響上述乾重試驗的因素，對經受不同製備步驟的IB樣品進行試驗。為了確定包含體樣品中變異性的程度，將經由新的乾重測量方法獲得的r-metHuG-CSF蛋白的濃度與通過傳統的HPLC測量方法獲得的濃度比較。變異性的次要因素是樣品的濃度。當將IB採集物漿液樣品極度稀釋時，稱重的變異性會增大。乾重試驗通常在兩個儀器上重複進行2次，每個樣品總計四個測量結果。由於HPLC試驗的複雜性，通常為單次測定。對於乾重和固體百分比的測量，通過在管中漩渦震蕩或在燒杯中攪拌將包含體培養液懸浮。將約2mL懸浮的培養液裝入CEMSmartSystemSolidsandMoistureAnalyzer、CEMLabffave9000(CEMCorporation,Matthews,NC,USA)的預平衡過的樣品墊上。以100%的功率水平將r-metHuG-CSF樣品加熱並乾燥5分鐘。固體百分比由儀器自動算出。乾重測量之間的對比結果在表4和表5中示出。表4用冰凍樣品顯示出乾重試驗的準確性。表4tableseeoriginaldocumentpage11乾重的準確性也用新鮮樣品進行測量。用兩個獨立的儀器進行每個批次兩次測量，每個批次總計四，測量。新-樣品測量的平均it在表5中示出。_5tableseeoriginaldocumentpage11一般而言，發現乾重試驗的準確性受兩個因素的影響。主要因素是樣品的新鮮度；包含體傾向於在冷凍-解融或長期貯存於4°C時聚集，其導致樣品不均一和更高的試驗變異性。以上所示的結果證實包含體乾重測量的結果可媲美用常規HPLC測量獲得的結果，而且即使IB採集物樣品首先經冷凍或貯存於4°C，該結果都依然準確。儘管所檢測的固體百分比可由於測量前的樣品製備而變化，其乾重測量結果一致並與用常規HPLC蛋白測量獲得的那些結果相符。因此，本發明提供了用於測定包含體採集物中蛋白濃度地準確且有效的方法，以減少進行重摺疊反應前所需樣品的量從而增大可用於重摺疊反應的量，還為在重組蛋白製備中對重摺疊步驟的蛋白進料提供了更好的控制，並極大地提高了重組蛋白的產量和質量。如以上的闡述性實施例所述，本發明的許多修改和變更對於本領域的技術人員是期望存在的。因此只有所提交權利要求中出現的此類限定落入本發明之內。權利要求用於計算細菌的包含體採集物中重組蛋白濃度的方法，該方法包括在公式中用蛋白生產率換算係數與IB採集漿液等分試樣中乾燥固體的總濃度相乘的步驟，其中該公式的乘積提供了所述IB採集漿液的所述等分試樣的總重組蛋白濃度，其中IB採集漿液等分試樣中所述重組蛋白的PPCF通過將所述等分試樣中的重組蛋白與所述等分試樣中的總乾燥固體的比乘以1000來計算，其中所述包含體縮寫為IB，所述蛋白生產率換算係數縮寫為PPCF。2.權利要求1的方法，其中，將一份包含體採集物等分試樣的PPCF用於計算重組蛋白的濃度，所述蛋白來自按照相同的方案獲得的不同發酵包含體採集物。3.權利要求2的方法，其中，首先將所述IB採集漿液等分試樣中的總重組蛋白通過HPLC試驗測定。4.權利要求1的方法，其中，通過將分離的包含體漿液經由微波輻射乾燥來計算所述乾重。5.權利要求4的方法，其中，所述乾燥進一步包括使用加熱。6.權利要求7的方法，其中，所述乾燥在CEMLabffave9000中進行。全文摘要本發明涉及用於有效製備重組蛋白的改良方法。更具體地，本發明涉及一種方法，該方法用於在大規模製備重組蛋白的重摺疊步驟前計算包含體中的蛋白，從而提高重摺疊步驟的效率、總產量和樣品蛋白的質量。文檔編號G01N33/68GK101815944SQ200880105528公開日2010年8月25日申請日期2008年7月9日優先權日2007年7月3日發明者R·張申請人:安姆根有限公司