氨(氨離子)的測定方法與氨(氨離子)診斷/測定試劑盒的製作方法

2023-10-27 02:53:07 1

專利名稱：氨(氨離子)的測定方法與氨(氨離子)診斷/測定試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明涉及醫學/食品檢驗測定技術領域，更具體地，本發明涉及氨(氨離子)診斷/測定方法及其試劑盒。
背景技術：
氨測定的方法有微量擴散法、離子交換法、酶法和氨電極法等。目前應用最多的方法是酶法和基於離子選擇電極的血氨測定儀分析法。擴散法是標本鹼化後，釋放出NH3,用酸滴定釋放出的氨，或用Nessler反應形成棕黃色碘化雙汞胺進行比色。這些方法需要鹼化，內源性的氨形成造成影響，使其準確性和精密度受到影響，目前已很少應用；離子交換法比擴散法更準確，CV為8% 13% 』離子選擇電極法是利用NH3擴散到電極表面，引起電極的pH發生變化進行測定，該方法的CV為 3. 5% 4. 8%，回收率高。結合具體實際，應以酶法測定為實用。檢索中國專利，僅查出87105593. 7專利申請公開了一種血氨測定速凍杯，卻未發現比較理想的血氨測定方法。

發明內容
[要解決的技術問題]本發明的目的是提供一種氨(氨離子)的測定方法。本發明的另一個目的是提供一種氨(氨離子)診斷/測定試劑盒。[技術方案]本發明是通過下述技術方案實現的。本發明的方法是一種採用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)與酶 (偶)聯法(Couple Reaction)的聯用技術，利用測定還原型煙醯胺輔酶(還原型輔酶)在 340nm波長處的吸光度變化測定氨(氨離子)的方法。本發明氨(氨離子)測定方法的的技術原理是根據下述氨激酶、腺苷三磷酸檸檬酸合成酶、乙醛脫氫酶的系列催化反應完成氨+腺苷三磷酸氨激酶腺苷二磷酸+磷醯胺腺苷二磷酸+磷酸根+乙醯-輔酶A+草醯乙酸腺苷三磷酸檸檬酸合成酶檸檬酸+腺苷三磷酸+輔酶A輔酶A+乙醛+輔酶乙酵脫氫酶(乙醯化)乙醯-輔酶A+還原型輔酶本發明的方法利用氨激酶(ammonia kinase ；EC 2. 7. 3. 8)酶(偶)聯腺苷三磷酸檸檬酸合成酶(ATP citrate synthase ；EC 2. 3. 3. 8)、乙醛脫氫酶 (acetaldehydedehydrogenase ；EC 1. 2. 1. 10)酶促反應比色終點法。氨激酶酶解氨反應產生腺苷二磷酸，再通過(偶)聯合腺苷三磷酸檸檬酸合成酶、乙醛脫氫酶的作用，最終將輔酶(在340nm處沒有吸收峰)還原成為還原型輔酶(在340nm處有吸收峰)，從而得以測定還原型輔酶在340nm處吸光度上升的程度，這樣可以通過測量340nm處吸光度上升的程度， 可以測算氨(氨離子)的濃度大小。本發明涉及一種氨(氨離子)的測定方法。該氨(氨離子)測定方法的步驟如下A、樣品準備A. 1標準樣品的製備將一定量的氨鹽溶於水或緩衝液中，再將氨濃度調整到100微摩爾/升，得到的溶液作為標準樣品；A. 2待測樣品的製備待測液體樣品直接測試，無須預處理；將一定量的待測固體樣品像製備標準樣品一樣溶於水或緩衝液中；A. 3空白樣品所述的水或緩衝液作為空白樣品，其氨(氨離子)濃度為0微摩爾/升；B、試劑溶液的製備分別移取或稱取緩衝液、穩定劑、輔酶、氨激酶、腺苷三磷酸檸檬酸合成酶、乙醛脫氫酶、腺苷三磷酸、單價磷酸鹽、乙醯-輔酶A、草醯乙酸與乙醛，然後將它們混合均勻，用水溶解得到所述的試劑溶液，它們的濃度分別是20-500 mmol/L、0. 001-7mol/L、 0. l-2mmol/L、1000-80000U/L、1000-80000U/L、1000-80000U/L、l—lOOmmol/L、I-IOOmmol/ L、l-100mmol/L、l-100mmol/L 與 l-lOOmmol/L ；C、待測樣品與在步驟B)得到的試劑溶液按照體積比1/10至1/500進行混合，在溫度15-45°C下反應5-60分鐘，在主波長340nm與副波長405nm(如果受儀器限制可以不設副波長)下進行測定，測定其吸光度隨時間的變化；D、在與步驟C)同樣的條件下測定步驟A)標準樣品的吸光度隨時間的變化；E、在與步驟C)同樣的條件下測定在步驟A)空白樣品的吸光度隨時間的變化；F、數據處理由步驟C-E)所述測定的主波長340nm的吸光度隨時間的變化，根據下式計算得到
氨的含量
ΔΑ (樣品)-ΔΑ(空白)
氨(氨離子)含量=-χ標準濃度(μπιοΙ/L)
ΔΑ (標準)-ΔΑ(空白)式中Δ A(樣品)表示步驟C)得到的待測樣品的吸光度變化；Δ A(空白)表示步驟Ε)得到的空白樣品的吸光度變化；Δ A (標準)表示步驟D)標準樣品的吸光度變化。根據本發明，在所述的氨(氨離子)測定方法中，所述的緩衝液應該理解是能夠使其測定介質的PH基本保持穩定(一般是6. 0-9.0)的溶液。如果該ρΗ高於9.0或ρΗ低於6. 0，則該測定方法使用的酶的活性達不到預期的活性效果，因此需要添加更多的介質與酶，才有可能達到預期的活性效果。在本發明中，所述的緩衝液是一種或多種選自三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩衝液、磷酸鹽緩衝液、咪唑-鹽酸緩衝液、磷酸氫二鈉-檸檬酸緩衝液、硼砂-鹽酸緩衝液、甘氨酸-氫氧化鈉緩衝液、巴比妥鈉-鹽酸緩衝液、硼酸-硼砂緩衝液、二乙醇胺緩衝液或 「PBS」緩衝液的緩衝液。優選地，所述的緩衝液例如選自三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl)緩衝液、磷酸鹽緩衝液或「 PBS，，緩衝液。更優選地，所述的緩衝液例如選自三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl)緩衝液或磷酸鹽緩衝液。根據本發明，在所述的氨(氨離子)測定方法中，所述的穩定劑應該理解是一種能保護試劑中的介質(底物)與酶，使其不會隨著時間推移而改變其性質，進而失去活性的物質，它會使得試劑具備很長的活性壽命，通常長達數月，甚至一、二年。如果沒有所述的穩定劑，則試劑的活性在溶液中只能維持數十小時，頂多數天，就會逐漸失去活性而不再具備檢測性能。在本發明中，所述的穩定劑使用量是0.01-7mol/L。如果所述的穩定劑使用量不夠，則試劑活性的壽命就會縮短；如果所述的穩定劑使用量過高，則會增加成本。在本發明中，所述的穩定劑是一種或多種選自氯化鈉、乙二醇、丙二醇、甘油或雙乙酸鈉或疊氮鈉防腐劑的穩定劑。優選地，所述的穩定劑例如是一種或多種選自氯化鈉、丙二醇、甘油或雙乙酸鈉或疊氮鈉的穩定劑。更優選地，所述的穩定劑例如是一種或多種選自甘油或雙乙酸鈉的穩定劑。在本發明中，所述的輔酶是一種或多種選自NADP+、NAD+或thio_NAD+的輔酶。根據一種本發明的優選實施方式，本發明使用全自動生化分析儀測定氨(氨離子)時，待測樣品、所述標準樣品與所述空白樣品由該分析儀在設定條件下(參數)自動取樣，然後在下述條件下進行測定測定方法為二點終點法/終點法，溫度37°C，反應時間10 分鐘，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測氨(氨離子)樣品與試劑的體積比例為 1/10-1/500，反應方向為正反應，延遲時間1/0分鐘，檢測時間4/5分鐘。根據另一種本發明的優選實施方式，本發明使用的試劑溶液配製成如下雙劑試劑由所述的緩衝液、穩定劑、輔酶、腺苷三磷酸、單價磷酸鹽、乙醯-輔酶A、草醯乙酸與乙醛組成的試劑1 ；由所述的緩衝液、穩定劑、氨激酶、腺苷三磷酸檸檬酸合成酶與乙醛脫氫酶組成的試劑2 ；其中輔酶、氨激酶、腺苷三磷酸檸檬酸合成酶、乙醛脫氫酶、腺苷三磷酸、單價磷酸鹽、乙醯-輔酶A、草醯乙酸、乙醛在試劑1或試劑2中的位置是不限定的。根據另一種本發明的優選實施方式，本發明使用的試劑配製成如下三劑試劑由所述的緩衝液、穩定劑、輔酶、腺苷三磷酸、單價磷酸鹽、乙醯-輔酶A、草醯乙酸與乙醛組成的試劑1 ；由所述的緩衝液、穩定劑、腺苷三磷酸檸檬酸合成酶與乙醛脫氫酶組成的試劑2 ；由所述的緩衝液、穩定劑與氨激酶組成的試劑3 ；
其中輔酶、氨激酶、腺苷三磷酸檸檬酸合成酶、乙醛脫氫酶、腺苷三磷酸、單價磷酸鹽、乙醯-輔酶A、草醯乙酸、乙醛在試劑1、試劑2或試劑3中的位置是不限定的。在本發明氨(氨離子)測定方法中使用的測定儀器可以是紫外/可見光分析儀， 例如上海精密儀器儀表有限公司銷售的紫外可見分光光度計、天津喀納斯光學分析儀器有限公司銷售的723可見分光光度計；半自動生化分析儀，例如上海偉思醫用設備有限公司的BTS-330半自動生化分析儀；全自動生化分析儀，例如由邁瑞公司以商品名BS-300、奧林帕斯公司以商品名AU400、東芝公司以商品名120、日立公司以商品名7600、雅培公司以商品名CB8000或貝克曼公司以商品名CX20銷售的全自動生化分析儀。本發明還涉及氨(氨離子)診斷/測定試劑盒。該氨(氨離子)診斷/測定試劑盒由下述粉狀試劑組成，在使用時用水將它們溶解得到具有下述濃度範圍的可直接使用的液體試劑
緩衝液穩定劑輔酶氨激酶
腺苷三磷酸檸檬酸合成酶乙醛脫氫酶腺苷三磷酸單價磷酸鹽乙醯-輔酶A 草醯乙酸
20-500mmol/L 0.001-7mol/L 0.l-2mmol/L 1000-80000U/L 1000-80000U/L 1000-80000U/L l-100mmol/L l-100mmol/L
l-100mmol/L l-100mmol/L
乙醛
l-100mmol/Lo
測定試劑盒有
根據一種本發明的優選實施方式，本發明的氨(氨離子)診斷試劑1
緩衝液IOOmmol/L
穩定劑500mmol/L
輔酶0. 25mmol/L
腺苷三磷酸 5mmol/L 單價磷酸鹽 5mmol/L 乙醯-輔酶A 5mmol/L 草醯乙酸 5mmol/L 乙酸5mmol/L ；
組成如下的試劑2
緩衝液IOOmmol/L
穩定劑500mmol/L
氨激酶16000U/L
腺苷三磷酸檸檬酸合成酶 18000U/L 乙醛脫氫酶12000U/L。
根據另一種本發明的優選實施方式，本發明的氨(氨離子)診斷/測定試劑盒有
試劑1 緩衝液IOOmmol/L穩定劑500mmol/L輔酶0. 25mmol/L腺苷三磷酸 5mmol/L單價磷酸鹽 5mmol/L乙醯-輔酶 A5mmol/L草醯乙酸5mmol/L乙醛5mmol/L ；組成如下的試劑2 緩衝液100mmol/L穩定劑500mmol/L腺苷三磷酸檸檬酸合成酶 18000U/L乙醛脫氫酶12000U/L ；組成如下的試劑3:緩衝液IOOmmol/L穩定劑500mmol/L氨激酶16000U/L。根據另一種本發明的優選實施方式，在本發明的氨(氨離子)診斷/測定試劑盒中，所述的緩衝液是一種或多種選自三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩衝液、磷酸鹽緩衝液、咪唑-鹽酸緩衝液、磷酸氫二鈉-檸檬酸緩衝液、硼砂-鹽酸緩衝液、甘氨酸-氫氧化鈉緩衝液、 巴比妥鈉-鹽酸緩衝液、硼酸-硼砂緩衝液、二乙醇胺緩衝液或「PBS」緩衝液的緩衝液。優選地，所述的緩衝液例如選自三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl)緩衝液、 磷酸鹽緩衝液或「PBS」緩衝液。更優選地，所述的緩衝液例如選自三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl)緩衝液或磷酸鹽緩衝液。在本發明中，所述的穩定劑是一種或多種選自氯化鈉、乙 乙酸鈉或疊氮鈉防腐劑的穩定劑。優選地，所述的穩定劑例如是一種或多種選自氯化鈉、丙 疊氮鈉的穩定劑。更優選地，所述的穩定劑例如是一種或多種選自甘油或雙乙酸鈉的穩定劑。在本發明中，無論是單劑試劑、雙劑試劑或三劑試劑，在本發明測定氨(氨離子) 的方法中，所述的輔酶可以是一種或多種選自NADP+、NAD+或thio-NAD+的輔酶。使用本發明的氨(氨離子)診斷/測定試劑盒時，可以使用紫外/可見光分析儀， 例如上海精密儀器儀表有限公司銷售的紫外可見分光光度計、天津喀納斯光學分析儀器有限公司銷售的723可見分光光度計；半自動生化分析儀，例如上海偉思醫用設備有限公司的BTS-330半自動生化分析儀；全自動生化分析儀，例如由邁瑞公司以商品名BS-300、奧林帕斯公司以商品名AU400、東芝公司以商品名120、日立公司以商品名7600、雅培公司以商品名CB8000或貝克曼公司以商品名CX20銷售的全自動生化分析儀。
〖、丙二醇、甘油或雙
〖、甘油、雙乙酸鈉或
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在採用本發明方法測定氨(氨離子)時，根據實驗要求進行多次試驗，然後將得到的這些試驗結果按照下式計算出精密度(CV)
權利要求
1.一種利用酶比色法及酶聯法技術的氨(氨離子)濃度測定方法，其測定的技術原理是根據下述氨激酶、腺苷三磷酸檸檬酸合成酶、乙醛脫氫酶的系列催化反應完成氨+腺苷三磷酸氨激酶腺苷二磷酸+磷醯胺腺苷二磷酸+磷酸根+乙醯-輔酶A+草醯乙酸腺苷三磷酸檸檬酸合成酶檸檬酸+腺苷三磷酸+輔酶A 輔酶A+乙醛+輔酶乙酵脫氫酶(乙醯化)乙醯-輔酶A+還原型輔酶
2.一種氨(氨離子)的測定方法，其特徵在於該方法的步驟如下 2. 1樣品準備2. 1. 1標準樣品的製備將一定量的氨鹽溶於水或緩衝液中，再將其濃度調整到100微摩爾/升； 2. 1.2待測樣品的製備待測液體樣品直接測試，無須預處理；將一定量的待測固體樣品像製備標準樣品一樣溶於水或緩衝液中； 2. 1.3空白樣品所述的水或緩衝液作為空白樣品，其氨(氨離子)濃度為0微摩爾/升； 2. 2試劑溶液的製備分別移取或稱取緩衝液、穩定劑、輔酶、氨激酶、腺苷三磷酸檸檬酸合成酶、乙醛脫氫酶、腺苷三磷酸、單價磷酸鹽、乙醯-輔酶A、草醯乙酸與乙醛，然後將它們混合均勻，用水溶解得到所述的試劑溶液，它們的濃度分別是20-500mmol/L、0. 001-7mol/L、0. l-2mmol/L、 1000-80000U/L、1000-80000U/L、1000-80000U/L、l-lOOmmol/L、l-lOOmmol/L、1-lOOmmol/ LU-lOOmmol/L 與 l-100mmol/L ；2. 3待測樣品與在步驟2. 2)得到的試劑溶液按照體積比1/10至1/500進行混合，在溫度15-45°C下反應5-60分鐘，在主波長340nm與副波長405nm(如果受儀器限制，可以不設副波長)下進行測定，測定其吸光度隨時間的變化；2. 4在與步驟2. 3)同樣的條件下測定步驟2. 1. 1)標準樣品的吸光度隨時間的變化； 2. 5在與步驟2. 3)同樣的條件下測定在步驟2. 1. 3)使用的水或緩衝液作為空白溶液的吸光度隨時間的變化；2.6數據處理由步驟2. 3-2. 5)所述測定的主波長340nm的吸光度隨時間的變化，根據下式計算得到氨的含量氨含量=式中ΔΑ(樣品)表示步驟2. 3)得到的待測樣品的吸光度變化； ΔΑ(空白)表示步驟2. 5)得到的空白溶液的吸光度變化； 八八(標準)表示步驟2. 4)標準樣品的吸光度變化。
3.根據權利要求1、2所述的測定方法，其特徵在於使用全自動生化分析儀測定時，待
4.根據權利要求1、2或3所述的測定方法，其特徵在於，所述的穩定劑是一種或多種選自氯化鈉、乙二醇、丙二醇、甘油或雙乙酸鈉、疊氮鈉等防腐劑的穩定劑；所述的緩衝液是一種或多種選自三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩衝液、磷酸鹽緩衝液、咪唑-鹽酸緩衝液、磷酸氫二鈉-檸檬酸緩衝液、硼砂-鹽酸緩衝液、甘氨酸-氫氧化鈉緩衝液、巴比妥鈉-鹽酸緩衝液、硼酸-硼砂緩衝液、二乙醇胺緩衝液或「PBS」緩衝液的緩衝液；所述的輔酶是一種或多種選自NADP+、NAD+或thio-NAD+的輔酶。
5.根據權利要求1、2或3所述的測定方法，其特徵在於5. 1所述的試劑溶液配製成如下單劑試劑它是由所述的緩衝液、穩定劑、輔酶、腺苷三磷酸、單價磷酸鹽、乙醯-輔酶A、草醯乙酸、乙醛、氨激酶、腺苷三磷酸檸檬酸合成酶與乙醛脫氫酶組成的；5. 2所述的試劑溶液配製成如下雙劑試劑試劑1，它是由所述的緩衝液、穩定劑、輔酶、腺苷三磷酸、單價磷酸鹽、乙醯-輔酶A、草醯乙酸與乙醛組成的；試劑2，它是由所述的緩衝液、穩定劑、氨激酶、腺苷三磷酸檸檬酸合成酶與乙醛脫氫酶組成的；其中輔酶、氨激酶、腺苷三磷酸檸檬酸合成酶、乙醛脫氫酶、腺苷三磷酸、單價磷酸鹽、 乙醯-輔酶A、草醯乙酸、乙醛在試劑1或試劑2中的位置是不限定的；5.3所述的試劑配製成如下三劑試劑試劑1，它是由所述的緩衝液、穩定劑、輔酶、腺苷三磷酸、單價磷酸鹽、乙醯-輔酶A、草醯乙酸與乙醛組成的；試劑2，它是由所述的緩衝液、穩定劑、腺苷三磷酸檸檬酸合成酶與乙醛脫氫酶組成的；試劑3，它是由所述的緩衝液、穩定劑與氨激酶組成的；其中輔酶、氨激酶、腺苷三磷酸檸檬酸合成酶、乙醛脫氫酶、腺苷三磷酸、單價磷酸鹽、 乙醯-輔酶A、草醯乙酸、乙醛在試劑1、試劑2或試劑3中的位置是不限定的。
6.一種氨(氨離子)診斷/測定試劑盒，其特徵在於6. 1它由下述粉狀試劑組成，在使用時用水將它們溶解得到具有下述濃度範圍的可直接使用的液體試劑20-500mmol/L 0.001-7mol/L 0.l-2mmol/L 1000-80000U/L 1000-80000U/L 1000-80000U/L l-100mmol/L緩衝液穩定劑輔酶氨激酶腺苷三磷酸檸檬酸合成酶乙醛脫氫酶腺苷三磷酸單價磷酸鹽乙醯-輔酶A 草醯乙酸乙醛l-100mmol/L l-100mmol/L l-100mmol/L l-100mmol/L ； 6. 2根據權利要求6. 1所述的氨(氨離子)診斷/測定試劑盒，其特徵在於它有組成如下的試劑1 緩衝液穩定劑輔酶腺苷三磷酸單價磷酸鹽乙醯-輔酶A 草醯乙酸乙醛組成如下的試劑2 緩衝液穩定劑氨激酶腺苷三磷酸檸檬酸合成酶乙醛脫氫酶20-500mmol/L 0.001-7mol/L 0.l-2mmol/L l-100mmol/L l-100mmol/Ll-100mmol/L l-100mmol/L l-100mmol/L ；20-500mmol/L 0. 001-7mol/L 1000-80000U/L 1000-80000U/L 1000-80000U/L ；6. 3根據權利要求6. 1所述的氨(氨離子)診斷/測定試劑盒，其特徵在於它有組成如下的試劑1 20-500mmol/L 0.001-7mol/L 0.l-2mmol/L l-100mmol/L l-100mmol/Ll-100mmol/L l-100mmol/L l-100mmol/L ；緩衝液穩定劑輔酶腺苷三磷酸單價磷酸鹽乙醯-輔酶A 草醯乙酸乙醛組成如下的試劑2 緩衝液穩定劑腺苷三磷酸檸檬酸合成酶乙醛脫氫酶組成如下的試劑3 緩衝液穩定劑氨激酶20-500mmol/L 0.001-7mol/L 1000-80000U/L 1000-80000U/L20-500mmol/L 0.001-7mol/L 1000-80000U/Lc
全文摘要
本發明涉及利用酶比色法及酶聯法技術的氨(氨離子)含量的測定方法、試劑的組成及成分，其測定的技術原理是依據氨激酶、腺苷三磷酸檸檬酸合成酶、乙醛脫氫酶的系列催化反應完成，本發明還涉及一種氨(氨離子)診斷/測定試劑盒。本發明的測定方法靈敏度高、誤差小，因此本發明的測定方法與試劑盒可以廣泛地應用於臨床醫學/食品檢驗。
文檔編號G01N33/52GK102539726SQ20101058428
公開日2012年7月4日 申請日期2010年12月13日 優先權日2010年12月13日
發明者王爾中 申請人:蘇州艾傑生物科技有限公司