一種半乳甘露低聚糖的製備方法與流程
2023-10-27 00:46:42
本發明屬於生物製品製備技術領域，具體涉及一種半乳甘露低聚糖的製備方法。
背景技術：
瓜爾豆(Cyamops tetragonooba(L.)Taub.)為印度、巴基斯坦等地廣泛種植的熱帶豆科草本植物。瓜爾豆膠(Guar gum)，由瓜爾豆的種子去皮去胚芽後的胚乳部分，乾燥粉碎後加水，進行加壓水解後用20％的乙醇沉澱，離心分離後乾燥粉碎而得，其黏度為天然膠體中黏度最高者，是目前國際上最廉價且應用廣泛的親水膠體之一。其主要化學成分是半乳糖甘露聚糖，主鏈為(1→4)-β-D-甘露糖單位，側鏈是單個的α-D-半乳糖以(1→6)鍵與主鏈相聯，半乳糖與甘露糖之比為1：1.8，約為1：2。瓜爾膠具有很好的水溶性和增稠性，但原粉往往具有下述的缺點：溶解速度慢，不能快速溶脹和水合；粘度不易控；熱穩定性差等。這些缺點使瓜爾膠在食品及醫藥領域應用受到很大限制，較高的黏性使其不易進入腸道，難以發揮膳食纖維的作用，因此需要改變其理化特性，使其被更加廣泛應用。
功能性低聚糖是由單糖通過糖苷鍵聚合而成的化合物，其製備方法多種多樣，並含有多種生理功能。近年來，國內外對瓜爾豆膠製備半乳甘露低聚糖(GMOS)的關注度日益提高，在活體小鼠試驗中GMOS的生理功能未發生大的改變，且未發現安全性問題。GMOS黏性更低，更容易在腸道中發揮作用，代謝產物甘露糖和半乳糖能夠被微生物攝取，促進有益菌發酵，進而降解腸道內的廢物並促進排出體外。除以上功能特點外，GMOS還具有防治高血脂、抗氧化、增強免疫功能等作用。近年來，隨著人們對健康及腸道功能的關注度不斷提高，GMOS作為一種較優秀的新型低聚糖，也將越來越受到人們關注。
目前降解瓜爾豆膠的方法主要分為化學降解法及酶降解法。氧化降解法是化學降解法中常用的一種降低膠體黏度的方法，但是化學試劑很容易造成殘留，同時反應較為劇烈不容易控制。酶法反應條件溫和，但是底物濃度過高造成反應體系黏度過高、反應時間緩慢、酶解不徹底，而較低的底物濃度在工業化生產中會造成時間及資源的浪費。
技術實現要素：
本發明的內容是提供一種過氧化氫與β-甘露聚糖酶複合降解瓜爾豆膠，並製備具有潤腸通便功能的半乳甘露低聚糖的方法。該方法的優點是將氧化降解與酶解技術整合在一起，反應時間短，條件溫和可控制，產物得率高，直接得到特定分子量的功能性半乳甘露低聚糖，工藝適合規模化生產。
本發明涉及一種過氧化氫與β-甘露聚糖酶複合降解瓜爾豆膠製備半乳甘露低聚糖的方法，其生產過程如下：
1)過氧化氫降解：將抗壞血酸和食品級過氧化氫溶解於水中，再加入瓜爾豆膠進行降解；待降解的黏度為80-200mPas時，加入過氧化氫酶除去殘留過氧化氫，
所述的抗壞血酸在水溶液中的終濃度為0.5-4mmol/L、食品級過氧化氫的終濃度為10-40mmol/L；
所述的除去殘留的過氧化氫，酶添加量3000-8000U/L降解體系，pH6.0-8.0，溫度40-60℃，時間10-25min；
2)酶解：使用酸性β-甘露聚糖酶進行酶解，酶活力40000-50000U/g，酶添加量為100-200U/g瓜爾豆膠底物，酶解溫度40-60℃，鹽酸調節pH 2.0-4.0，作用時間1-2h；
3)離心絮凝：將步驟2)製備的酶解液離心，除去酶解殘渣；上清液濃縮後按照3-5倍體積倍數添加乙醇，沉降除去大分子糖類物質；
4)噴霧乾燥：醇沉上清液懸蒸濃縮至固形物含量≧20％後，按照固形物含量15-25％添加麥芽糊精進行噴霧乾燥，完成製備。
其中噴霧乾燥進口溫度150-190℃，出口溫度80-120℃，流速9-15mL/min，得到分子量小於10000Da GMOS乾粉。
本發明通過控制食品級過氧化氫添加量，在避免反應過於劇烈的情況下，能夠使瓜爾豆膠底物濃度迅速降低，從而節省後續酶解時間，使酶解產物更為均勻。過氧化氫酶的使用可消除反應體系中殘留過氧化氫，符合國家食品級過氧化氫作為加工助劑的使用標準。本發明採用氧化降解與酶解復配的技術，極大提高了反應底物濃度，克服了瓜爾豆膠高黏度對酶解反應的限制，用環保、經濟的工藝手段生產溶解性良好的具有潤腸通便功能的GMOS固體粉末。具有反應時間短、能耗低、操作方便、成本低的優點，產物均勻且得率高，適合大規模工業化生產。產品純度較高，造粒後顆粒溶解性良好，可用作具有潤腸通便功效的新型原料和助劑。
具體實施方式
下面結合實施例對本發明進行詳細的描述。
實施例1
1、將1mmol抗壞血酸、30mmol食品級過氧化氫溶解於1L水中，溶解均勻後加入200g瓜爾豆膠，40℃下反應釜反應15min，轉速40-60r/min。
2、按照3000U/L向反應液中添加過氧化氫酶，40℃反應15min。
3、反應結束後，可參照GB-T 23499-2016，用鈦鹽比色法測定反應體系中是否殘留過氧化氫。
4、用鹽酸將反應液調節pH至2.5，按照200U/g瓜爾豆膠底物的量加入酸性β-甘露聚糖酶進行酶解，50℃反應1h。
5、將酶解液煮沸滅酶，然後用離心機4800rpm離心20min，去除不溶性酶解殘渣。
6、上清液懸蒸濃縮至400mL，按照上清液3倍體積加入1200mL 95％乙醇，此時出現少量白色糖沉澱，4800rpm離心20min除去大分子糖類物質。
7、醇沉上清液懸蒸濃縮至350mL後測固形物含量，按照固形物含量20％添加麥芽糊精，溶解均勻後進行噴霧乾燥即得半乳甘露低聚糖，其中噴霧乾燥進口溫度165-170℃，出口溫度80-90℃，流速9-12mL/min。產物均為分子量低於10000Da的半乳甘露低聚糖，產物的得率可達到85％左右。
8、利用溼法造粒機，95％乙醇溼法造粒，造粒後60℃烘2-3h至恆重，過40目及100目篩，即得到40-100目水溶性良好的固體低聚糖粉末顆粒。
實施實例2
1、將20mmol抗壞血酸、1.5mol食品級過氧化氫溶解於50L水中，酶解罐夾套通入蒸汽把罐內水預熱至45-50℃，加入12.5kg瓜爾豆膠，發酵罐在50℃下攪拌反應25min，轉速55-60r/min。
2、按照3000U/L向反應液中添加過氧化氫酶，50℃攪拌反應15min，轉速55-60r/min。
3、反應結束後，參照GB-T 23499-2016，用鈦鹽比色法測定反應體系中是否殘留過氧化氫。
4、用鹽酸將反應液調節pH至2.5，按照200U/g瓜爾豆膠底物的量加入酸性β-甘露聚糖酶進行酶解，50℃繼續攪拌反應1h左右。酶解結束後將溫度升高至90℃，保持10min滅酶。
5、蝶式離心機6500r/min離心，去除不溶性酶解殘渣。
6、上清液使用雙效濃縮設備濃縮至15L，按照濃縮後體積的3倍加入45L 95％乙醇，此時出現少量白色糖沉澱，離心除去大分子糖類物質。
7、醇沉上清液懸蒸濃縮至15L後測固形物含量，按照固形物含量20％添加麥芽糊精，溶解均勻後進行噴霧乾燥即得半乳甘露低聚糖，其中噴霧乾燥進口溫度165-170℃，出口溫度80-90℃，流速12-15mL/min。產物均為分子量低於10000Da的半乳甘露低聚糖，產物的得率可達到87％左右。
8、利用溼法造粒機，95％乙醇溼法造粒，造粒後60℃烘3h至恆重，過40目及100目篩，即得到40-100目水溶性良好的固體低聚糖粉末顆粒。
實施例3
本發明技術製備低聚糖與商業低聚糖產品的潤腸通便效果的比較觀察：
按照實施實例1製備本發明技術半乳甘露低聚糖。
取1400g瓜爾豆膠底物溶解於7L水中，溶解均勻後添加抗壞血酸2mmol/L、過氧化氫40mmol/L進行降解，40℃震蕩反應0.5h。按照10000U/L向反應液中添加過氧化氫酶，40℃震蕩反應20min。用鹽酸將反應液調節pH至2.5，按照200U/g瓜爾豆膠底物的量加入酸性β-甘露聚糖酶進行酶解，50-55℃反應釜攪拌4-5h。反應釜升溫至90℃保持10min滅酶，4800rpm離心20min去除不溶性酶解殘渣，上清液懸蒸濃縮至2L，按照上清液3倍體積加入6L 95％乙醇，4800rpm離心20min除去大分子糖類物質。醇沉上清液懸蒸濃縮至2L後按照固形物含量添加20％麥芽糊精進行噴霧乾燥即得半乳甘露低聚糖，其中噴霧乾燥進口溫度160-170℃，出口溫度80-90℃，流速9-12mL/min。產物均為分子量低於10000Da的半乳甘露低聚糖，產物的得率87％。利用95％乙醇進行溼法造粒，60℃烘乾1-2h，過40目及100目篩，得到40-100目溶解性良好低聚糖固體顆粒。
1、小鼠排便實驗
參照保健食品檢驗與評價技術規範(2003版)中關於通便功能檢驗的方法安排實驗。將60隻雄性昆明小鼠適應性餵養後，按照平均體重隨機分為本發明技術GMOS低、高劑量組，商業低聚木糖、低聚半乳糖產品作為兩個陽性對照組，以及陰性對照組、便秘模型組，每組10隻。本發明技術低、高劑量組分別灌胃本發明製作的的GMOS 0.25g/kg bw、1g/kg bw；商業低聚木糖與低聚半乳糖產品作為陽性對照組，分別灌胃1g/kg bw；陰性對照組和便秘模型組灌胃給予蒸餾水。灌胃量為10mL/kg bw，每日定時灌胃，每日一次，期間自由飲食，連續給藥20d後，小鼠禁食不禁水20h，除陰性對照組灌胃蒸餾水外，其他各組灌胃10mg/kg bw洛哌丁胺造便秘模型。0.5h後，陰性對照組和便秘模型組小鼠用墨汁灌胃，本發明實驗組與陽性對照組小鼠灌胃含對應受試樣的墨汁，動物均單籠飼養，正常飲水進食。從灌墨汁開始，記錄每隻動物首粒排黑便所需時間、5h內排便粒數及重量，觀察結束後糞便烘乾至恆重計算含水量。
實驗結果如表1，結果顯示與正常陰性對照組小鼠相比，便秘模型組小鼠首次黑便時間增長，5h內排便粒數減少，糞便含水量顯著降低，差異均有極顯著性(P<0.01)，說明造模成功。本發明GMOS高低劑量組與便秘模型組相比，首次黑便時間縮短、5h內排便粒數增加、糞便含水量提高，且差異均有極顯著性(P<0.01)，說明本發明GMOS能夠改善小鼠便秘情況。
表1：本發明技術製作的GMOS與其他低聚糖產品對小鼠排便的影響
註：與便秘模型組相比，*p<0.05，**p<0.01
2、小鼠腸道推進實驗
參照保健食品檢驗與評價技術規範(2003版)中關於通便功能檢驗的方法安排實驗。將60隻雄性昆明小鼠適應性餵養後，按照平均體重隨機分為本發明技術GMOS低、高劑量組，商業低聚木糖、低聚半乳糖產品作為兩個陽性對照組，以及陰性對照組、便秘模型組，每組10隻。本發明技術低、高劑量組分別灌胃本發明製作的的GMOS 0.25g/kg bw、1g/kg bw；商業低聚木糖與低聚半乳糖產品作為陽性對照組，分別灌胃1g/kg bw；陰性對照組和便秘模型組灌胃給予蒸餾水。灌胃量為10mL/kg bw，每日定時灌胃，每日一次，期間自由飲食，連續給藥20d後，小鼠禁食不禁水20h，除陰性對照組灌胃蒸餾水外，其他各組灌胃10mg/kg bw洛哌丁胺造便秘模型。25min後，脫頸椎處死動物，打開腹腔分離腸繫膜，剪取上端自幽門、下端至回盲部的腸管，輕輕將小腸拉成直線，測量腸管長度為「小腸總長度」，從幽門至墨汁前沿為「墨汁推進長度」，計算墨汁推進率如下：推進率(％)＝墨水移動距離(cm)/小腸全長(cm)×100。實驗結果見表2，結果顯示與便秘模型組小鼠相比，正常陰性對照組小鼠腸道推進率高129.62％，存在極顯著差異(P<0.01)，說明造模成功。本發明GMOS高、低劑量組與便秘模型組相比，腸道推進率分別提高了87.88％、37.87％，且差異均有極顯著性(P<0.01)。說明本發明GMOS能夠改善小鼠便秘情況。
表2：本發明技術製作的GMOS與其他低聚糖產品對小鼠小腸運動的影響
註：與便秘模型組相比，*p<0.05，**p<0.01
上述內容是結合具體實施方式對本發明所做的進一步說明，不能認定本發明的具體實施方式只局限於這些說明。應當理解的是，對本領域普通技術人員來說，在未背離本發明的原理實質下所做的改進、修飾、替代、簡化，均應為等效的處理方式，而所有這些變換都應該屬於本發明所附權利要求的保護範圍。