遞送抗癌劑至細胞的方法

2023-07-13 06:37:26 2

專利名稱：遞送抗癌劑至細胞的方法
技術領域：
本發明一般地涉及一種遞送生物活性劑至細胞的方法，所述細胞包括受試者中的 腫瘤細胞。
背景技術：
類黃酮是數目最多和研究最深入的植物多酚之一。類黃酮由一大類天然存 在於水果和蔬菜中的低分子量多酚物質組成，並且是人類飲食的必需部分。乾燥綠茶 葉可以含有多達按重量計30 %類黃酮，包括高百分比的稱為兒茶素(黃烷-3-醇衍 生物或基於兒茶素的類黃酮)的類黃酮，包括(-)_表兒茶素，(-)_表沒食子兒茶素 (印igallocatechin)，(+)-兒茶素，(_)_表兒茶素沒食子酸酯和(_)_表沒食子兒茶素沒食 子酸酉旨(epigallocatechin gallate)。近年來，這些綠茶兒茶素已經引起很多注意，因為它們被認為具有生物學和藥 理學性質，包括抗菌、抗腫瘤、抗血栓形成、血管舒張、抗氧化、抗誘變、抗致癌、高膽固醇 血症、抗病毒和抗炎性質，這些已經在許多人類、動物和體外研究中被證明(Jankim J.， 等 Nature (自然)387，56I (1997) ；Bodoni A.等 J. Nutr. Biochem.(營養生物化學雜 志)13，103-111 (2002) ；Nakagawa K.等 J. Agric. Food Chem.(農業與食品化學雜誌)47， 3967-3973(1999))。這些生物學和藥理學性質在預防疾病和保護基因組的穩定性方面是潛 在有益的。認為兒茶素的許多有益效果是與兒茶素的抗氧化作用相關聯(Terao J.，等Arch. Biochem. Biophys (生物化學與生物物理文獻).308,278-284(1994))。在兒茶素中，認為 (-)「表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)，為綠茶的主要成分，具有最高的活性，這可能是 由於三羥基B環和C3位上的沒食子酸酯部分產生(Isemura M.，等Biofactors (生物因 素)13，81-85 (2000) ；Ikeda I.，等 J. Nutr.(營養學雜誌)135，155(2005) ；Lill G.，等 FEBSLetters (歐洲生物學化學會聯盟通訊)546，265-270 (2003) ；Sakanaka S.和 Okada Y. J. Agric. Food Chem.(農業與食品化學雜誌)52，1688-1692 (2004) ；Yokozawa T.，等， J. Agric. Food Chem.(農業與食品化學雜誌)48，5068-5073 (2000))。通常，類黃酮的活性半衰期在體內局限於數小時；還未確定這些化合物的代謝。盡 管包括EGCG的兒茶素具有有利的抗氧化和抗癌性質，但是通過直接攝取大量綠茶來獲得 治療水平的該化合物是不實際的，原因是固有的容量約束。因此，為了僅通過飲食從類黃酮 獲得治療或藥學益處，需要攝取的食物和飲料量要大於實際消費的量。此外，包括EGCG的 一些類黃酮已經被報導具有促氧化活性，使得直接攝取粗製綠茶成為一種較不有效的遞送 EGCG 的方式(Yen G. C.，等 J. Agric. Food Chem(農業與食品化學雜誌).45，30-34 (1997)； Yamanaka N.，等 FEBS Lett.(歐洲生物學化學會聯盟通訊)401，230-234 (1997)；
4Roedig-Penman A.和 Gordon Μ. H. J. Agric. Food Chem.(農業與食品化學雜誌)1997，45， 4267-4270)。另一方面，已經報導提取的植物多酚的較高分子量級分(原花青素 (procyanidin)和合成寡聚化的(+)_兒茶素和芸香苷顯示與低分子量類黃酮相比增 強的生理學性質，諸如抗氧化和抗癌活性(Zhao J.，等Carcinogenesis (癌症發生)， 1999,20,1737-1745 ；Ariga T.和 Hamano M. AgricBiol. Chem.(農業生物學與化學)54， 2499-2504(1990) ；Chung J. E.，等 Biomacromolecules (生物大分子)5，113-118 (2004)； Kurisawa M.，等 Biomacromolecules (生物大分子)4，1394—1399 (2003) ；Hagerman Α. E.， 等J. Agric. Food Chem.(農業與食品化學雜誌)46，1887 (1998))並且沒有促氧化作用 (Hagerman Α. E.，等 J. Agric. Food Chem(農業與食品化學雜誌).46，1887 (1998) ；Li C.和 Xie B. J. Agric. Food Chem (農業與食品化學雜誌).48，6362 (2000))。然而，預計天然存在 的和合成的高分子量類黃酮在攝取後都不被吸收和轉運到其它組織中，因為這些化合物通 常較大，與蛋白質形成堅固的複合物並耐降解(Zhao J.，等Carcinogenesis (癌症發生)， 1999,20，1737-1745)。在通過口服攝取食物和飲料而消費類黃酮的情形中，類黃酮可以作為抗氧化劑發 揮作用，保護消化道免受消化期間的氧化損傷。然而，可以預計類黃酮僅保留在消化道中， 因此它們的有益生理學活性不大可能為其它組織所利用。此外，它們的強疏水性以及它們 與蛋白形成複合物的傾向使得難以胃腸外遞送這些化合物。發明概述本發明提供了一種遞送生物活性抗癌劑至細胞的方法，所述細胞包括腫瘤 細胞，所述方法使用先前記載在公布的國際申請WO 2006/124000和公布的美國申請 2008/102052中的類黃酮綴合物和遞送劑。本發明基於以下出人意料的發現即使用基於類黃酮的遞送劑以遞送抗癌劑至細 胞，導致抗癌生物活性劑和類黃酮之間的協同作用。因此，這些綴合物和遞送劑結合了由用 作載體的類黃酮部分和被遞送的生物活性劑產生的協同治療效果。一方面，提供了一種遞送載體，所述遞送載體包含抗癌劑以及一種含有游離醛的 遞送劑與類黃酮的綴合物，所述遞送劑在所述類黃酮的A環的C6和/或C8位上綴合。另一方面，提供了一種遞送抗癌劑至細胞的方法，所述方法包括將本文所述的遞 送劑與細胞接觸。另一方面，提供了一種藥物組合物，其包含本文所述的遞送載體。另一方面，提供了本文所述的膠束-蛋白複合物在遞送抗癌劑至受試者的細胞中 的應用。在結合附圖瀏覽本發明的具體實施方案的下列描述後，本領域技術人員將明白本 發明的其它方面和特徵。附圖簡述在附圖中，僅通過舉例說明的方式闡述本發明的實施方案，

圖1是描繪(口 ) EGCG, ( A ) OEGCG和(〇)PEG-EGCG對HMEC的細胞毒性的圖 表。樣品N =5，對照N = 8; 圖2是描繪在(〇)缺少和(·)存在血清下膠束複合物的尺寸的圖表。N = 3 ；
圖3是描繪(口)游離FITC-BSA，(〇)FITC-BSA和OEGCG複合物，(Δ )在蛋白 酶K存在下在PEG-EGCG複合物中的(FITC-BSA+0EGCG)；和(■)在不存在蛋白酶K下遊 離FITC-BSA的螢光強度的圖表。N = 3 ；圖4 是描繪在存在(口 ) PEG-EGCG，( ■ ) OEGCG, ( Δ )赫賽汀(Here印tin)，( ·) 在PEG-EGCG複合物中的(赫賽汀+0EGCG)，( ▲)在PEG-EGCG複合物中的(BSA+0EGCG)下 和(〇)對照(未處理細胞)的SKBR-3細胞的體外細胞增殖的圖表。樣品N = 5，對照N =8 ；圖5是描繪在進行懸浮稀釋的PEG-EGCG複合物中(赫賽汀+0EGCG)的尺寸的圖 表。N = 3.；圖6是描繪在OEGCG，PEG-EGCG,赫賽汀，PEG-EGCG複合物中的(赫賽汀+0EGCG)， 和在PEG-EGCG複合物中的(BSA+0EGCG)的存在下(每組中從左到右的條形)SKBR-3細胞 的體外增殖的圖表。在每個時間點用對照對細胞增殖的百分比歸一化。樣品N =5，對照N =8 ；和圖7是描繪用(Δ)膠束複合物+赫賽汀，(□)僅赫賽汀，或(O)PBS對照每 周處理2次共一個月的荷瘤Balb/裸鼠中腫瘤尺寸的圖表。發明詳述已知類黃酮具有各種各樣的生物學性質，包括具有抗癌作用，抑制癌細胞生 長。包括類黃酮的遞送載體先前在公布的國際申請WO 2006/124000和公布的美國申請 2008/102052 中描述。出人意料地，本發明人已經發現類黃酮遞送載體和生物活性抗癌劑的組合具有協 同抗癌效果，其大於類黃酮遞送載體和生物活性抗癌劑當單獨使用時各自的合併效果。因 此，裝載抗癌劑的該遞送載體提供了一個遞送抗癌劑至細胞的有效途徑，其利用了遞送載 體的類黃酮部分的抗癌活性和抗癌劑的抗癌作用之間的協同作用。通過使用類黃酮和類黃酮的綴合物如EGCG的自組裝，本發明人開發了一種含 有諸如蛋白質、核酸或藥物的抗癌劑的遞送載體。通過自組裝形成遞送載體。例如，如 下合成遞送載體(i)兩步自組裝法，包括寡聚(-)_表沒食子兒茶素-3-0-沒食子酸酯 (OEGCG)和抗癌劑的組裝，和然後預形成的OEGCG-抗癌劑複合物與聚(乙二醇)(PEG)和 EGCG (PEG-EGCG)的綴合物的組裝；和(ii) 一步自組裝法，包括PEG和OEGCG (PEG-0EGCG)的 綴合物與抗癌劑的組裝。通過在溫和水溶液中自發自組裝，兩種遞送載體都形成為穩定和 高度取向的裝載有抗癌劑的膠束複合物，。獲得的膠束納米複合物特徵性地顯示PEG外殼， 內核由OEGCG-抗癌劑複合物組成。由於膠束納米複合物的形成主要由疏水相互作用和氫鍵驅動，所以本文所述的遞 送載體可以用於裝載各種各樣的抗癌劑以改善對細胞的遞送。設計遞送載體以利用增強的滲透性和滯留(EPR)效應，和避免體內施用時網狀內 皮系統(RES)攝取，提供了在癌症部位的選擇性累積。理想地，遞送載體保留了類黃酮分子 和抗癌劑兩者的穩定性，防止遞送過程中活性喪失和降解，當遞送到細胞時發揮協同治療 作用。通過將類黃酮和抗癌劑隔離在遞送載體的內核中直至成功地遞送和釋放到細胞，遞 送載體可以掩蔽這些部分的活性，僅在遞送載體在細胞部位離解後恢復各自的活性。為了證明遞送載體的協同治療作用，將抗癌蛋白赫賽汀(曲妥珠單抗(trastuzumab))裝載到膠束複合物中，如以下實施例1所述。在血清存在下該膠束複合物 保持其完整性並顯示良好的穩定性，沒有作為時間函數的尺寸改變，蛋白在膠束複合物中 被安全保護而不蛋白水解。與單個組分(OEGCG，PEG-EGCG和赫賽汀)相比，裝載赫賽汀的 遞送載體證明具有更大的抑制作用。由於遞送載體的形成主要是由疏水相互作用驅動，所以它可以通過疏水競爭劑 (如兩親分子)解離。因此，當遞送載體在靶細胞部位累積時，遞送載體可以通過生物兩親 分子(如血漿膜脂質)解離，以釋放所含的治療性類黃酮和抗癌化合物。因此，提供了一種遞送抗癌劑至細胞的方法。使用了含有如先前在公布的國際申 請TO 2006/124000和公布的美國申請2008/102052中記載和如下所述的類黃酮和抗癌劑 的遞送載體。遞送載體然後與所述抗癌劑將要遞送的細胞接觸。類黃酮綴合物和遞送載體為了增加有益類黃酮化合物的利用度，將類黃酮與各種遞送劑通過遞送劑上的遊 離醛基團和類黃酮的A環綴合，允許改變類黃酮的物理性質而不破壞類黃酮的多酚結構， 同時增強類黃酮的生物學和藥理學性質。即，醛介導的遞送劑與類黃酮的綴合導致遞送劑連接在類黃酮A環的C6和/或C8 位上，並且不破壞或影響類黃酮的B和C環或類黃酮上的各個羥基基團。遞送劑與類黃酮的綴合可以提供一種組合物，其適於施用於受試者，通過將類黃 酮結合到用遞送劑形成的特殊載體中，並且可以允許施用比通過飲食可以獲得的更高濃度 的類黃酮。遞送劑可以提供組合物的穩定性，得到更慢代謝或降解並因此在體內可以具有 比單獨的未綴合的類黃酮更長半衰期的組合物。例如，遞送劑可以是這樣的性質，即將類黃 酮結合到增強類黃酮水溶性的組合物中，這可以避免網狀內皮系統攝取和隨後被腎清除， 導致體內更長的半衰期。其它遞送劑的綴合可以防止類黃酮被酶降解。通過將遞送劑與類黃酮在酸催化劑存在下反應，遞送劑可以與類黃酮綴合，所述 遞送劑具有游離醛基團，或在酸存在下能夠被轉化為游離醛基團的基團。類黃酮可以是來自一般類別的衍生自核心苯基苄基吡喃酮結構的分子的任何類 黃酮，並且包括黃酮，異黃酮，黃酮醇，黃烷酮，黃烷-3-醇，兒茶素，花色素和查耳酮。在一 個具體實施方案中，類黃酮是兒茶素或基於兒茶素的類黃酮。兒茶素，或基於兒茶素的類黃 酮是屬於一般稱為兒茶素(或黃烷-3-醇衍生物)類別的任何類黃酮，並且包括兒茶素和 兒茶素衍生物，包括表兒茶素，表沒食子兒茶素，兒茶素，表兒茶素沒食子酸酯和表沒食子 兒茶素沒食子酸酯，並且包括兒茶素或基於兒茶素的類黃酮的所有可能的立體異構體。在 具體實施方案中，基於兒茶素的類黃酮是(+)_兒茶素或(-)_表沒食子兒茶素沒食子酸酯。 認為在基於兒茶素的類黃酮中，(-)_表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)具有最高的活性， 這可能是因為三羥基B環和在該類黃酮C3位上沒食子酸酯部分導致。遞送劑是含有游離醛或基團，或可以在酸存在下轉化為游離醛基團的官能團的任 何化學基團或結構部分，例如乙縮醛基團。遞送劑能夠形成為遞送載體，由此允許將綴合的 類黃酮結合到遞送載體中而不損害類黃酮的生物學或藥理學性質。同樣，遞送劑應當是生 物相容性的，並且在一些實施方案中可以是生物可降解的。下列討論是指其中類黃酮是基於兒茶素的類黃酮和其中遞送劑是聚合物的實施 方案。然而，應當理解，在含有醛的化學基團和類黃酮之間的醛縮合反應可應用於如上所述，任何具有游離醛基團的遞送劑，包括遞送劑的酸處理後，與任何類黃酮的綴合。因此，該反應可以包括聚合物與基於兒茶素的類黃酮的綴合，所述聚合物含有遊 離醛基團或在酸存在下能夠轉化為游離醛基團的基團。基於兒茶素的類黃酮可以是單個基於兒茶素的類黃酮的單體單元或它可以是一 個或多個基於兒茶素的類黃酮的寡聚物。如上所述，聚合物與類黃酮的綴合導致類黃酮生 物學或藥理學性質的增強。而且，基於兒茶素的類黃酮的寡聚物傾向於具有放大或增加水 平的與基於兒茶素的類黃酮相關的生物學和藥理學性質，並且甚至可以具有降低的促氧化 作用，所述促氧化作用有時與單體的基於兒茶素的類黃酮相關。因此，基於兒茶素的類黃酮 是寡聚化的基於兒茶素的類黃酮，其具有放大或增強的類黃酮性質。基於兒茶素的類黃酮的寡聚物是已知的，包括通過酶催化氧化偶聯和通過醛介導 的寡聚化製備的寡聚物。醛介導的寡聚化過程導致無支鏈的寡聚物，其具有限定的鍵，例如 通過碳碳鍵，如從一個單體的A環上C6或C8位連至下一單體的A環上C6或C8位的CH-CH3 橋，當適用時包括任一可能的立體構型。因此，CH-CH3鍵可能在一個單體的A環的C6位和 下一單體的C6或C8之間，或者它可以在第一單體的A環的C8位和下一單體的C6或C8位 之間。基於兒茶素的類黃酮的寡聚物可以是2個或更多個連接在一起的單體單元。在某 些實施方案中，基於兒茶素的類黃酮寡聚物具有2至100個類黃酮單體單元，10至100個，2 至80個，10至80個，2至50個，10至50個，2至30個，10至30個，20至100個，30至100 個或50至100個單體單元。聚合物可以是在與基於兒茶素的類黃酮綴合前具有游離醛基、或具有在酸存在下 轉化為醛基團的基團(例如乙縮醛基團)的任何聚合物。另外，應當理解，聚合物應當是無 毒性的，生物相容的和適於藥用。聚合物也可以具有其它所需性質，例如聚合物可以具有低 免疫原性，和它可以是生物可降解的或非生物可降解的，這取決於組合物的期望生物學應 用，例如用於基於兒茶素的類黃酮和抗癌劑在體內特定部位的控釋。可以基於它的具體特性和它形成某些類型的遞送載體的能力來選擇聚合物。例 如，聚合物可以是醛封端的聚(乙二醇)，或它可以是醛基團衍生化的透明質酸，或這些聚 合物的衍生物。備選地，聚合物可以是苯氧基甲基(甲基亞胼基)樹狀聚合物(PMMH)，例 如，環三膦腈核心PMMH或硫代磷醯基核心PMMH。聚合物也可以是任何生物學聚合物，其被 修飾成含有游離醛基或在酸存在下能轉化為醛的基團，例如醛修飾的蛋白質，肽，多糖或核 酸。在一個具體實施方案中，聚合物是醛封端的聚(乙二醇)(PEG-CHO)。在另一具體實施 方案中，聚合物是醛衍生化的透明質酸，與氨基乙醯醛二乙基乙縮醛綴合的透明質酸，或用 酪胺衍生化的任一上述透明質酸聚合物。聚合物上的游離醛基團允許將聚合物以可控方式綴合到類黃酮結構的A環的C6 或C8位，或兩者，由此防止破壞類黃酮結構，特別是類黃酮的B和C環，由此保存了類黃酮 的有益生物學和藥理學性質。聚合物通過聚合物的醛基團與基於兒茶素的類黃酮的A環的C6和/或C8位反應 而綴合到基於兒茶素的類黃酮。使用聚合物的醛基團與基於兒茶素的類黃酮的酸催化縮合，或在醛基團與基於兒 茶素的類黃酮縮合之前使用酸將聚合物上的官能團轉化為游離醛，從而合成綴合物。
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為了將聚合物與基於兒茶素的類黃酮綴合，聚合物和基於兒茶素的類黃酮可以分 開溶解在適當溶劑中。例如在酸存在下，通過滴加，將具有游離醛的聚合物加至含有基於兒 茶素的類黃酮的溶液。使得反應進行完全。在綴合反應後，例如通過透析或通過分子篩分 離可以從綴合組合物上去除過多的未反應的聚合物或基於兒茶素的類黃酮。基於兒茶素的類黃酮與聚合物的比率可以變化，以使僅一個聚合物結構部分連接 至聚合物的基於兒茶素的類黃酮部分，或者使得存在有在聚合物上多於一個的位置上連接 的基於兒茶素的類黃酮部分，或者使得基於兒茶素的類黃酮部分連接有兩個聚合物部分， 一個在基於兒茶素的類黃酮的C6和C8位的任一個上。通過原始試劑的比率可以控制最終組合物中聚合物與基於兒茶素的類黃酮的比 率。例如，當聚合物結構部分與基於兒茶素的類黃酮部分的摩爾比約為1時，單個聚合物結 構部分將連接至單個基於兒茶素的類黃酮部分(可以使用單體的或寡聚的)。然而，在高 濃度聚合物下，例如聚合物與基於兒茶素的類黃酮的摩爾比為10 1，可以獲得具有聚合 物-類黃酮-聚合物的三嵌段結構的組合物。還考慮含有游離醛的聚合物和基於兒茶素的類黃酮的綴合物，其中聚合物在類黃 酮A環的C6和/或C8位綴合。聚合物的綴合還允許將基於兒茶素的類黃酮結合到各種組合物或載體中。通過基 於聚合物的物理性質選擇具體的含有游離醛基團的聚合物，可以將類黃酮結合到各種各樣 的不同載體類型中，允許在不同情形中遞送高濃度的類黃酮至身體的各個目標區域。因此，由上述反應獲得的綴合物可以形成為遞送載體，這取決於綴合物的聚合物 部分的性質。遞送載體可以用於將基於兒茶素的類黃酮遞送至身體，包括身體內的特定靶 部位，這取決於遞送載體的性質。抗癌劑抗癌劑被包括在遞送載體中，其然後與所述抗癌劑將要遞送的細胞接觸。因此， 提供了一種遞送載體，其含有與聚合物通過聚合物上的游離醛基綴合的基於兒茶素的類黃 酮，所述遞送載體另外包含抗癌劑。抗癌劑可以是對細胞具有抗癌作用的任何試劑，所述抗癌作用包括抗腫瘤作用， 如細胞毒性、凋亡、抗有絲分裂、抗血管生成或抑制轉移作用。抗癌作用意欲包括抑制或減 少腫瘤細胞生長，抑制或減少癌發生，殺死腫瘤細胞，或抑制或減少細胞(包括腫瘤細胞) 的致癌或致腫瘤性質。抗癌劑包括蛋白，核酸，小分子或藥物。蛋白抗癌劑可以是肽，抗體，激素，酶，生長 因子或細胞因子。核酸抗癌劑可以是單鏈或雙鏈DNA或RNA，短髮夾RNA，siRNA，或可以包 含編碼抗癌產物的基因。還包括在抗癌劑範圍內的是化學治療劑或血管生成抑制劑。抗癌 劑可以是抗體，包括針對腫瘤細胞_表面標誌的單克隆抗體，免疫調節肽，細胞因子或生長 因子。抗癌劑可以是赫賽汀(曲妥珠單抗)或TNP470。形成含有抗癌劑的遞送載體在一個具體實施方案中，遞送載體是膠束納米複合物，其適於胃腸外遞送基於兒 茶素的類黃酮和抗癌劑至細胞，包括位於受試者體內特定部位的細胞。為了形成含有抗癌劑的遞送載體，選擇具有以下性質的聚合物，即使得它與組合 物的基於兒茶素的類黃酮部分組裝，保護類黃酮免受溶液環境影響。如果選擇適當的溶劑，在該溶劑中綴合物的聚合物部分是可溶的和比基於兒茶素的類黃酮更可溶，所述綴合物將 自組裝，將溶液排除在類黃酮核心之外，由此允許膠束複合物的組裝。在膠束納米複合物遞送載體的一個具體實施方案中，選擇的聚合物是醛-封端的 PEG或其衍生物。PEG是廣泛用作藥物成分的聚合物，並且具有良好的親水性、無毒性、無免 疫原性和生物相容性特性，生物可降解性低。通過將PEG-CHO綴合至基於兒茶素的類黃酮，形成具有強烈的自組裝傾向的綴合 物。在一個實施方案中，PEG與基於兒茶素的類黃酮的單體綴合，以形成PEG-類黃酮。遞送 載體與非綴合的基於兒茶素的類黃酮和抗癌劑一起形成。因此，中心核含有較高濃度的類 黃酮和抗癌劑，而膠束納米複合物的外殼包含綴合的PEG-單體類黃酮，並以兩步法組裝。 在一個具體實施方案中，中心核是寡聚的EGCG(OEGCG)並且外部核由綴合的PEG-EGCG制 成。遞送載體的該兩步組裝形成導致結合到遞送載體核心內的寡聚類黃酮的生物學 活性的暫時部分或完全掩蔽，以及防止抗癌劑在遞送至細胞前降解。例如，在組裝到遞送載 體的核心中的同時，很少能獲得寡聚EGCG的增強性質，這是由於在遞送載體的組裝核心部 分中與其它分子的物理相互作用所致。在例如通過載體與細胞磷脂膜融合從遞送載體中釋 放後，遞送的組分解離，使寡聚的基於兒茶素的類黃酮的生物學性質去掩蔽，並將抗癌劑釋 放以遞送到細胞中。遞送載體的該實施方案非常適於遞送抗癌劑。由於基於兒茶素的類黃酮具有剛性 的多環核結構，這些分子與諸如蛋白質和核酸的抗癌劑以及含有環結構的其它分子很好地 締合，這可能是通過將兒茶素環與抗癌劑上的一個或多個環堆疊。因此，在組裝到膠束納米 複合物中之前，可以使用寡聚的基於兒茶素的類黃酮來與抗癌劑締合。根據待遞送至體內特定部位的抗癌劑的總量，以及可以包括在膠束納米複合物中 而不使膠束結構不穩定的抗癌劑的量，選擇抗癌劑的濃度。在某些實施方案中，抗癌劑可以 構成膠束複合物的至多50w/w%，或至多40w/w%。當結合到本遞送載體中時，抗癌劑的生物學活性也被暫時部分或完全掩蔽。如同 寡聚的基於兒茶素的類黃酮，在抗癌劑被組裝到遞送載體中同時，掩蔽或隔離了抗癌劑的 生物學性質，使得它們較少被利用，這意味著在包含在遞送載體中時抗癌劑不能發揮抗癌 活性或以生物活性方式與其它分子相互作用，並且也免受其它分子的活性影響。在抗癌劑 從遞送載體釋放後，可再次利用抗癌劑的生物學性質，並且一旦遞送至細胞，抗癌劑能夠發 揮抗癌作用。在另一個實施方案中，將PEG綴合至寡聚的基於兒茶素的類黃酮。遞送劑的該實 施方案具有強烈的自組裝性質，並且可以以單步驟法自組裝。如同以上的兩步組裝膠束納 米複合物，單步驟組裝的膠束納米複合物包括抗癌劑。上述膠束納米複合物是納米尺度尺寸的，並且可以是直徑約Inm至約lOOOOnm，或 直徑約20nm至約4000nm，或直徑約20nm至約lOOnm。膠束納米複合物的尺寸可以通過改 變寡聚的基於兒茶素的類黃酮的長度、聚合物的長度和未綴合的寡聚的基於兒茶素的類黃 酮的濃度來改變。膠束納米複合物的尺寸可以是PH依賴性的，這取決於所用的聚合物。例 如，在其中綴合的聚合物是PEG的膠束納米複合物中，膠束的直徑傾向於隨著pH增加而減
通常，含有抗癌劑的膠束納米複合物經歷自組裝並且因此需要很少的合成。對於 兩步法，要形成核心的組分，包括抗癌劑，溶解在適當溶劑中，例如溶解在稀釋DMSO或甲醇 中，並使其組裝。該溶劑是以下溶劑，在該溶劑中核心組分是可溶的並且該溶劑在水中是可 混溶的，或者該溶劑可以是揮發性的，或者從該溶劑中可以分離或提取組裝的膠束。如上所 述，核心組分包括抗癌劑和基於兒茶素的類黃酮，例如寡聚的基於兒茶素的類黃酮。然後將 擬形成外殼的聚合物_基於兒茶素的類黃酮綴合物加到溶液中，並使膠束複合物形成。對於一步自組裝法，將聚合物_基於兒茶素的類黃酮綴合物以及抗癌劑一起溶解 在關於兩步法所述的適當緩衝液中，並使膠束納米複合物組裝。該膠束納米複合物系統提供以下能力，即實現基於兒茶素的類黃酮的可控生物分 布，和由PEG外殼導致的血流中延長的循環半衰期，以及基於兒茶素的類黃酮化合物的放 大的病理活性，具有附加的益處，即這些化合物可以伴隨有裝載在膠束內核中的抗癌劑的 治療作用。當抗癌劑是敏感分子如蛋白質時，納米尺度膠束提供了便利的遞送載體，其具有 溫和的自組裝方法的優勢，該方法不涉及與當前使用的常規包封技術可能相關的機械、熱 和化學應力，所述常規技術可能導致敏感的生物活性抗癌劑如蛋白質的變性。在另一個具體實施方案中，遞送載體是水凝膠，其可以用作敷料，用於抗癌劑的緩 釋遞送，或用作組織再生的支架。選擇聚合物以具有良好的可膨脹性特性和具有可用於聚合物結構部分交聯的適 當基團，並且是無毒性的和生物相容的，並且在一些實施方案中是生物可降解的。在水凝膠的一個具體實施方案中，聚合物是醛衍生化的透明質酸，或透明質酸的 衍生物，如透明質酸氨基乙醯醛二乙基乙縮醛綴合物，或醛衍生化的透明質酸或透明質酸 氨基乙醯醛二乙基乙縮醛綴合物的酪胺衍生物。包含透明質酸_基於兒茶素的類黃酮的綴合物可以容易地交聯以形成水凝膠，而 不破壞類黃酮的生物學或藥理學性質。該水凝膠也可以包含如上所述的抗癌劑，用於釋放 抗癌劑至施用水凝膠的部位處的細胞。通過將透明質酸與基於兒茶素的類黃酮在酸性條件下，例如在約1至約5、或例如 在約1的PH下反應來合成透明質酸_類黃酮綴合物。綴合的聚合物_類黃酮然後例如通 過透析純化，然後與抗癌劑和交聯劑如過氧化氫混合。加入交聯催化劑，例如辣根過氧化物 酶，然後可以將水凝膠快速倒入模具以形成所需形狀，之後完成交聯反應。例如，水凝膠可 以成型為適於作為創傷敷料應用的平板。水凝膠的組分可以被注射和反應以體內形成水凝膠，例如通過將未交聯的綴合物 與抗癌劑，以及如過氧化氫的交聯劑和如辣根過氧化物酶的交聯催化劑一起注射來形成。 該水凝膠有效用於遞送藥物至體內特定部位，或用於組織工程。由於透明質酸具有多個可以在綴合反應過程中與類黃酮反應的位點，通過改變起 始反應中基於兒茶素的類黃酮的濃度，可以改變透明質酸聚合物和基於兒茶素的類黃酮之 間的綴合程度。例如，可以調整反應物的比率使得獲得的綴合物在聚合物上具有約至約 10%的與類黃酮綴合的位點。備選地，另外的還未綴合的透明質酸可以在水凝膠交聯前加 入混合物中，以使水凝膠中的一些聚合物分子將不綴合至類黃酮。遞送抗癌劑至細胞為了使用含有類黃酮的遞送載體遞送抗癌劑至細胞，將包含抗癌劑的遞送載體與細胞接觸，這可以允許抗癌劑被攝取到細胞中。因此，將抗癌劑遞送至細胞包括將含有抗癌劑的遞送載體與細胞表面接觸。不局 限於任何具體理論，遞送系統被兩親分子如質膜的脂質所離解，由此通過被動靶向在細胞 的部位處釋放，並可以釋放到細胞中。擬向其遞送抗癌劑的細胞可以是任何細胞，包括體外細胞，培養物中的細胞，或受 試者內的體內細胞。當上下文允許時，除非另外指出，本文所用的術語「細胞」是指和包括 單個細胞，多個細胞或細胞群體。細胞可以是體外細胞，包括從受試者中外植的細胞或者它 可以是受試者中的體內細胞。類似地，當上下文允許時，除非另外指出，對「多個細胞」的提 及也包括對單個細胞的提及。細胞可以源於任何生物體，例如動物，包括哺乳動物，包括人。當遞送至細胞時，抗癌劑保留它的抗癌功能，如上所述，並且可以遞送至細胞中。 使用已知方法和技術，包括蛋白檢測方法，免疫測定和螢光標記技術，本領域技術人員可以 容易地確定抗癌劑是否已經遞送至細胞中。 上述組合物和遞送載體非常適於抗癌劑以及基於兒茶素的類黃酮向受試者體內 特定部位的可控和靶向遞送。類黃酮可以在靶向部位提供抗菌、抗腫瘤、抗血栓形成、血管 舒張、抗氧化、抗誘變、抗致癌、高膽固醇血症、抗病毒和抗炎活性。另外，遞送載體包括抗癌 劑，使得遞送載體有效用於治療癌症。例如，免疫調節肽和蛋白質，包括細胞因子和生長因 子，已經作為一類重要的藥物出現而用於癌症治療。因此，現在提供了一種遞送抗癌劑至受試者的方法，包括施用遞送載體，所述遞送 載體包括含有游離醛的聚合物與基於兒茶素的類黃酮的綴合物，還考慮了聚合物在類黃酮 的A環的C6和/或C8位綴合，如上所述。在某些實施方案中，將綴合物形成為遞送載體， 如膠束納米複合物或水凝膠，如上所述。受試者是需要用抗癌劑治療的任何動物，包括人。因此，提供了一種藥物組合物，其包含遞送載體，所述遞送載體含有如上所述的抗 癌劑和類黃酮。藥物組合物可以進一步包括藥用稀釋劑或載體。藥物組合物可以常規地含 有藥學上可接受濃度的鹽，緩衝劑，防腐劑和各種相容性載體。對於所有遞送形式，遞送載 體可以以生理鹽溶液配製。藥用稀釋劑或載體的比例和性質通過選擇的給藥途徑，與生物活性蛋白的相容性 (如果合適)和標準的藥學實踐來確定。通過用於製備適於施用給受試者的藥用組合物的已知方法可以製備藥物組合物， 以使有效量的遞送載體和任何一種或多種附加的活性物質在混合物中與藥用媒介物合併。 將有效量的遞送載體施用於受試者。本文所用的術語「有效量」是指在達到期望結果所需 的劑量下和時間期間，有效地，例如將抗癌劑遞送至受試者內的靶細胞或細胞群體的量，包 括將期望量的抗癌劑遞送至細胞，其基於包括以下的因素抗癌劑的效果，類黃酮的效果， 和抗癌劑與類黃酮一起的協同作用。適當的載體描述在例如雷明頓藥物科學(Remington』 s PharmaceuticalSciences，Mack出版公司，伊斯頓，Pa.，USA 1985)。在這個基礎上，組合物 包括(儘管不是排除性地)與一種或多種藥用媒介物或稀釋劑締合的遞送載體的溶液，並 且包含在具有適當PH和與生理流體等滲的緩衝液中。
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在普通貯存和使用條件下，該藥物組合物可以含有防腐劑以防止微生物生長， 並且可以保持抗癌劑的任何生物學活性。本領域技術人員將了解如何製備適當的製劑。 用於選擇和製備適當製劑的常規步驟和成分描述在例如雷明頓藥物科學(Remington』 s Pharmaceutical Sciences)和 1999 年公布的美國藥典國家處方集(The United States Pharmacopeia :The NationalFormulary(USP 24NF19))中。備選地，遞送載體可以在離使 用足夠近的時刻通過混合各組分而配製，而不需要防腐劑。遞送載體可以使用已知方法施用，這將取決於遞送載體的形式。優選非口服途徑。 如果遞送載體作為溶液配製，或是膠束納米顆粒的形式，則遞送載體可經胃腸外遞送，包括 靜脈內、肌內遞送，或者直接注射到靶組織或器官中。如果遞送載體作為水凝膠配製，則綴 合物可以局部施用或通過外科插入在於傷口部位。當施用於受試者時，以有效量和在達到期望結果的劑量下以及足夠的時間段來遞 送載體。例如，遞送載體可以以遞送抗癌劑所需的數量和劑量施用，所述抗癌劑可以發揮作 用以緩解、改善、減輕、改進、穩定、防止疾病或病症的擴散，減慢或延緩疾病或病症的進展， 或治癒疾病或病症，或抑制、降低或損害疾病相關酶的活性。一種疾病相關的酶是參與代謝 或生化途徑的酶，當所述途徑被中斷時，或當所述酶或途徑的調節控制被中斷或抑制時，所 述酶的活性參與到疾病或病症例如癌症的發生或進展中。施用至受試者的遞送載體的有效量可以根據許多因素而改變，所述因素諸如遞送 載體的藥效學性質，包括抗癌劑，聚合物結構部分和基於兒茶素的類黃酮結構部分，給藥方 式，受試者的年齡、健康和重量，病症或疾病狀態的性質和程度，治療的頻率和同時進行的 治療的類型，如果有的話，和遞送載體的濃度和形式。基於上述因素，本領域技術人員可以確定適當量。遞送載體可以最初以適當量施 用，根據受試者的臨床反應，所述適當量可以根據需要調整。遞送載體的有效量可以經驗地 確定，並且取決於可以安全施用的遞送載體的最大量。然而，施用的遞送載體的量應當是產 生所需結果的最小量。還提供了含有抗癌劑和類黃酮的如上所述的遞送載體。還提供了上述遞送載體在遞送抗癌劑至細胞中的應用，或上述遞送載體在製備藥 物中的應用，所述藥物用於將抗癌劑遞送至細胞，包括當細胞是受試者中的體內細胞時。本發明進一步通過下列非限制性實施例進行闡述。
實施例實施例1 包括綠茶衍生物的裝載蛋白質的膠束複合物的協同治療作用材料和方法合成OEGCG 和 PEG-EGCG 通過 EGCG (Kurita Ltd.)和乙醛(pH 2)的 Baeyer 反應 合成 OEGCG。為 了合成 PEG-EGCG，將醛封端的 PEG (Mw5000, NOF Co.)和 EGCG 在 pH = 2 下反應。如先前在公布的國際申請WO 2006/124000和公布的US申請2008/102052中所
述，形成膠束複合物。細胞毒性測試使用人正常乳腺上皮細胞(HMEC，Cambrex, USA)研究EGCG衍生物 的細胞毒性，並與未接觸的EGCG的情形進行比較。對於樣品和對照，將細胞分別一式五份和一式八份(在乳腺上皮細胞生長培養基中1 χ IO4細胞/孔)接種在96孔微量培養板中， 並使得粘附過夜。在細胞用不同濃度的EGCG，OEGCG或PEG-EGCG處理2天後，使用Alamar Blue評估細胞活力，Alamar Blue是一種被細胞的細胞色素c活性還原的染料蛋白水解評估當樣品經受蛋白酶K(0.05mg/ml)處理時，使用螢光分光光度計 (日立，日本，Aex = 490nm和λ em = 530nm)，通過監測在FITC-BSA中的螢光強度增加，來 測定蛋白降解。所有測量每個進行三次。癌細胞增殖評估對於樣品和對照，分別將SKBR-3細胞(ATCC，HTB30, USA)分別 一式五份和一式八份(在McCoy』 s 5A培養基中1 χ IO4細胞/孔)接種在96孔微量培養 板中，並使得粘附過夜。然後將培養基用含有樣品(OEGCG，PEG-EGCG，赫賽汀(0. 5mg/ml)， 裝載赫賽汀的膠束複合物，和裝載BSA的膠束複合物)的培養基替換，並將細胞在37°C、在 5% CO2中溫育。在所示時刻，將培養基用不含酚紅的含有10% Alamar Blue的培養基替換。 在4小時溫育後，從570和600nm處染料吸光度的降低來測定細胞增殖。結果通過以下合成膠束複合物(i)兩步自組裝法，涉及寡聚的(-)_表沒食子兒茶 素-3-0-沒食子酸酯(OEGCG)的組裝，當適用時包括使用相關蛋白(螢光標記蛋白或抗癌 劑)，和然後預先形成的OEGCG (加蛋白質)複合物與聚(乙二醇)(PEG)和EGCG (PEG-EGCG) 的綴合物的組裝；或(ii) 一步自組裝法，涉及PEG和OEGCG (PEG-0EGCG)的綴合物(當適 用時和相關蛋白)的組裝。在兩種情形中，通過在溫和水溶液中的自發自組裝，膠束複合物 立即形成為穩定和高度取向的膠束複合物，包括用相關蛋白裝載，並顯示PEG外殼，內核由 OEGCG (加蛋白質)複合物組成。對於HMEC，PEG-EGCG不顯示細胞毒性，而OEGCG和EGCG顯示低細胞毒性(見圖1)。 膠束複合物保持其完整性，並證明在血清存在下的良好穩定性，而無尺寸變化(見圖2)。將膠束複合物裝載以螢光標記蛋白(FITC-BSA)並進行蛋白酶(蛋白酶K)處理， 以研究蛋白隨時間的降解(圖3)。游離FITC-BSA的螢光強度隨時間而大大增強，表明蛋白 被蛋白酶K降解。與此對比，裝載到膠束複合物中的FITC-BSA的螢光強度保持非常低(甚 至低於缺少蛋白酶K下的游離FITC-BSA的強度)，說明在這些系統中蛋白被堅固保護而免 於蛋白水解。對於裝載赫賽汀(曲妥珠單抗)的膠束複合物，體外研究了癌細胞生長的抑制，所 述赫賽汀(曲妥珠單抗)是針對HER2/neU(erbB2)受體的人源化單克隆抗體，其誘導過表 達HER2的轉移乳腺癌腫瘤的消退(圖4)。裝載赫賽汀的膠束複合物顯示無尺寸減小，測試 直達1000倍稀釋(圖5)。當SKBR-3 (過表達HER2的人乳腺癌細胞系)用游離赫賽汀或載 體組分(0EGCG或PEG-EGCG)處理時，觀察到細胞生長被抑制。與單獨的OEGCG或PEG-EGCG 相比，裝載BSA的膠束複合物顯示更多的抑制作用(而BSA本身顯示沒有作用)。特別地， 與遞送的單個組分(OEGCG，PEG-EGCG或赫賽汀)和裝載BSA的膠束複合物相比，裝載赫賽 汀的膠束複合物顯示令人印象深刻的更大的抑制作用。由於膠束納米複合物的形成主要是由疏水相互作用驅動，所以複合物將通過表面 活性劑的疏水競爭而分解。在複合物保留在細胞上時，通過與生物兩親分子如細胞膜的脂 質相互作用，複合物將逐漸解離和釋放組分。在表現治療作用之前，膠束複合物顯示時間滯 後(圖6)，即在早期時間點時(即在10小時)沒有顯示作用，而游離蛋白和單獨載體組分立即開始發揮抗癌作用。這說明了在PEG外殼內裝載了蛋白質的膠束複合物的結構優勢。 除了延遲釋放以外，通過與細胞相互作用導致的解離，膠束複合物提供了治療分子(蛋白 質和載體組分)的持續釋放。鑑於以下事實這些特徵將是特別有用和有利的載體將需要 從施用點行進到期望的靶部位，之後發揮治療活性。討論使用兩種EGCG衍生物已經合成了核_殼膠束納米複合物載體，所述兩種EGCG 衍生物被設計成與蛋白質以空間有序結構結合。這些複合物通過在水溶液中的自發自組 裝形成膠束納米複合物(圖1)。膠束納米複合物由兩個自組裝過程驅動(i)通過寡聚 EGCG(OEGCG)和蛋白質之間的絡合作用，以形成核心，和(ii)通過圍繞預先形成的核心的 聚(乙二醇)-EGCG (PEG-EGCG)的絡合作用，以形成外殼。獲得的膠束納米複合物顯示PEG 殼，具有OEGCG-蛋白複合物核心。該結構特徵可以用於降低蛋白免疫原性和防止通過網狀 內皮系統攝取導致的蛋白的快速腎清除和蛋白水解，減少了頻繁注射或輸注治療的需要。 高度水溶性的PEG外殼和定製的尺寸(< IOOnm)可以不僅延長血漿半衰期，而且提供增強 的滲透性和滯留效應，導致在腫瘤以及感染和炎症部位的選擇性累積。利用EGCG對於蛋白的親和性用抗癌蛋白裝載膠束複合物。裝載蛋白的複合物證 明了比游離蛋白或載體本身大得多的抗癌作用。該膠束系統可以提供改進的各種生物分子 的遞送，以便利用與各類類黃酮_衍生化載體相關的協同治療作用和遞送作用的優勢。實施例2 用含有赫賽汀的膠束複合物治療Balb/裸鼠如下對Balb/裸鼠誘發腫瘤。將17 β -雌二醇小球(0. 72mg，60天釋放)通過皮 下注射施用於每隻小鼠。次日，每隻小鼠皮下注射BT474細胞的懸浮液(8.1 X IO6細胞 /IOOuL Matrigel)。使得腫瘤發展兩周。在注射BT474細胞後兩周，使用裝載有赫賽汀的膠束納米複合物、單獨的赫賽汀 或作為對照的PBS，通過靜脈內注射處理小鼠，一周兩次，共一個月時間。在該治療方案後， 評估腫瘤尺寸。結果在圖7中顯示。如本領域技術人員可以理解的，可以對本文所述的例舉性的實施方案進行許多修 改。本發明意欲包括在如權利要求所定義的它的範圍內的所有這些修改。所有本文提及的文獻通過引用完整地結合於此。儘管本文公開了本發明的各種實施方案，但是根據本領域技術人員的公知常識可 以在本發明的範圍內進行許多適應性改變和改動。這些改動包括將已知的等價物替代本發 明的任何方面，以便以基本上相同的方式獲得相同的結果。除非另外定義，本文所用的所有 技術和科學術語具有與本發明所屬領域的普通技術人員所通常理解的相同的含義。參考文獻Kataoka, K. , Kwon, G. S. , Yokoyama, Μ. , Okano, T. & Sakurai, Y. Blockcopolymer micelles as vehicles for drug delivery (用作藥物遞送用載體的嵌段共聚物膠 束)· J. Control. Release (控制釋放雜誌)24，119-132(1993)。Otsuka,H. ,Nagasaka, Y. & Kataoka, K. Pegylated nanoparticles forbiological and pharmaceutical applications (用於生物學和藥學應用的PEG化納米顆粒).Adv. Drug Deliv. Rev.(先進藥物遞送評論)55，403-419 (2003)。Kakizawa,Y. & Kataoka,K. Block copolymer micelles for delivery ofgene and
15related compounds (用於遞送基因和相關化合物的嵌段共聚物膠束).Adv. Drug Delivery Rev.(先進藥物遞送評論)54，203-222 (2002)。Lee, Ε. S. , Na, K. & Bae, Y. H. Polymeric micelle for tumor ρH andfolate-mediated targeting (用於腫瘤pH和葉酸介導的靶向的聚合物膠 束)· J. Control. Release (控制釋放雜誌)91，103-113(2003)。Farokhzad, 0. C. , Jon, S. , Khademhosseini, A. , Tran, Τ. -N. Τ. , LaVan, D. A. & Langer, R. Nanoparticle-aptamer bioconjugates :A new approach fortargeting prostate cancer cells (納米顆粒-適體生物綴合物一種用於靶向前列腺癌細胞的新方 法).Cancer Res.(癌症研究)64，7668-7672 (2004)。Gref, R. , Minamitake, Y. , Peracchia, Μ. T. , Trubetskoy, V. , Torchi 1 in, V. &Langer, R. Biodegradable long-circulating polymeric nanospheres (生物可降角軍的 長效循環聚合物納米球)· Science (科學)263，1600-1603 (1994)。Duncan, R. The dawning era of polymer therapeutics ( ^^iflJ ^n ^O WS 明)· Nature Rev.(自然·評論)2，347-360 (2003)。Hubbel 1，J. Enhancing drug function (增強藥物功能).Science (科學)300， 595-596(2003)。Kopecek, J. , Kopeckova, P. , Minko, Τ. & Lu, Ζ. HPMAcopo 1 ymer-anticancer drug conjugates :Design, activity, and mechanism ofaction(HPMA ^M^ ~ trLfMM^^M^n 物設計，活性和作用機制).Eur. J. Pharm. Biopharm.(歐洲藥學和生物藥學雜誌)50， 61-81(2000)。Gordon, Α. N. , Fleagle, J. Τ. , Guthrie, D. , Parkin, D. Ε. , Gore, Μ. Ε. &Lacave, Α. J. Recurrent epithelial ovarian carcinoma :Α randomized phase IIIstudy of pegylated liposomal doxorubicin versus topotecan(復發性上皮卵巢癌PEG化月旨質體 多柔比星比較託泊替康的隨機化III期臨床研究).J. Clin. Oncol.(臨床腫瘤學雜誌)19， 3312-3322(2001)。Cao, Y. & Cao, R. Angiogenesis inhibited by drinking tea(喝茶抑制血管發 生).Nature (自然)398，381 (1999)。Jankun, J. , Selman, S. H. , Swiercz, R. & Skrzypczak-Jankun, E. Whydrinking green tea could prevent cancer (為何飲用綠茶可以防癌)· Nature (自然)387, 561(1997)。Garbisa, S. , Biggin, S. , Cavallarin, N. , Sartor, L. , Benelli, R. & Albini, Α. Tumor invasion :Molecular shears blunted by green tea (月中瘤侵襲被綠茶變純白勺 分子剪刀).Nature Med.(自然醫學)5，1216 (1999)。N￡mce，C.L.& Shearer，WT. Is green tea good for HIV-I infection (參:(寸 於HIV-I感染有好處嗎？)J. Allergy Clin. Immunol.(變態反應和臨床免疫學雜誌)112， 851-853(2003)。Tachibana, H. , Koga, K. , Fujimura, Y. & Yamada, K. A receptor for greentea polyphenol EGCG(綠茶多酚EGCG的受體).Nature Struct. Mol. Biol.(自然結構與分子生 物學)11，380-381 (2004)。
Mei,Y. ,Qian,F. ,Wei,D. & Liu,J. Reversal of cancer multidrug resistanceby green tea polyphenols (通過綠茶多酚逆轉癌多藥抗藥性).J. Pharm. Pharmacol.(藥學和 藥理學雜誌)56，1307-1314 (2004)。Kuroda, Y. & Hara, Y. Antimutagenic and anticarcinogenic activity of teapolyphenols(茶多酚的抗誘變和抗致癌活性).Mutat. Res.(突變研究)436， 69-97(1999)。Bordoni, A. , Hrelia, S. ,Angeloni, C. ,Giordano,Ε. ,Guarnieri,C. ,Caldarera, C. Μ. & Biagi,P. L. Green tea protection of hypoxia/reoxygenationinjury in cultured cardiac cells (綠茶保護培養的心臟細胞中的缺氧/再氧合損傷).J. Nutr. Biochem.(營 養生物化學雜誌)13，103-111 (2002)。Yang, C. S. & Wang, Ζ. -Y. Tea and cancer (茶禾口癌症).J. Natl. Cancerlnst.(國 立癌症研究所雜誌)85，1038-1049 (1993)。Kuzuhara, Τ. , Sei, Y. , Yamaguchi, K. , Suganuma, Μ. & Fujiki, H. DNAand RNA as new binding targets of green tea catechins (作為綠茶兒茶素的新結合革巴標的DNA禾口 RNA). J. Biol. Chem.(生物學和化學雜誌)281，17446-17456(2006)。Matsumura, Y. & Maeda, H. A new concept for macromoleculartherapeutics in cancer chemotherapy-Mechanism of tumoritropic accumulationof proteins and the antitumor agent smancs (癌症化療中大分子治療劑的新構思蛋白質和抗腫瘤劑淨司他 丁斯酯的趨腫瘤累積的機制).Cancer Res.(癌症研究)46，6387-6392 (1986)。
權利要求
一種遞送載體，所述遞送載體包含抗癌劑以及一種含有游離醛的遞送劑與類黃酮的綴合物，所述遞送劑在所述類黃酮的A環的C6和/或C8位上綴合。
2.權利要求1所述的遞送載體，其中所述遞送劑是聚合物並且其中所述類黃酮是基於 兒茶素的類黃酮。
3.權利要求2所述的遞送載體，其中所述類黃酮是以下基於兒茶素的類黃酮(-)-表 兒茶素，(-)_表沒食子兒茶素，(+)_兒茶素，(-)_表兒茶素沒食子酸酯或(-)_表沒食子兒 茶素沒食子酸酯。
4.權利要求1至3中任一項所述的遞送載體，其中所述類黃酮是單體的或其中所述類 黃酮是寡聚的。
5.權利要求4所述的遞送載體，其中所述類黃酮是寡聚的並且通過以下寡聚化(i)酶 催化氧化偶聯；( )醛介導的寡聚；或(iii)第一單體單元的A環上C6或C8位與第二單 體單元的A環上C6或C8位之間的碳-碳鍵。
6.權利要求5所述的遞送載體，其中所述類黃酮是通過第一單體單元的A環上C6位與 第二單體單元的A環上C8位之間的碳-碳鍵來寡聚化，或者其中所述類黃酮是通過(_)-表 沒食子兒茶素沒食子酸酯單體的碳_碳C6-C6，C6-C8，C8-C6或C8-C8鍵而寡聚化的寡聚 (-)_表沒食子兒茶素沒食子酸酯(OEGCG)。
7.權利要求1所述的遞送載體，其中所述聚合物是醛封端的聚(乙二醇)，醛衍生化的 透明質酸，透明質酸氨基乙醯醛二乙基乙縮醛綴合物，醛衍生化的透明質酸-酪胺，透明質 酸氨基乙醯醛二乙基乙縮醛綴合物-酪胺，環三膦腈核心苯氧基甲基(甲基亞胼基)樹狀 聚合物或硫代磷醯基核心苯氧基甲基(甲基亞胼基)樹狀聚合物。
8.權利要求7所述的遞送載體，其中所述聚合物是醛封端的聚(乙二醇)並且所述遞 送載體是膠束納米複合物。
9.權利要求8所述的遞送載體，其中所述膠束納米複合物包括與寡聚的基於兒茶素的 類黃酮綴合的醛封端的聚(乙二醇)。
10.權利要求9所述的遞送載體，其中所述膠束納米複合物包括內核和外殼，所述內核 含有寡聚的基於兒茶素的類黃酮，並且所述外殼含有綴合物，所述綴合物包含與單體的基 於兒茶素的類黃酮綴合的醛封端的聚(乙二醇)。
11.權利要求10所述的遞送載體，其中所述寡聚的基於兒茶素的類黃酮是通過以下寡 聚化(i)酶催化氧化偶聯；(ii)醛介導的寡聚；或(iii)第一單體單元的A環上C6或C8 位與第二單體單元的A環上C6或C8位之間的碳-碳鍵。
12.權利要求11所述的遞送載體，其中所述寡聚的基於兒茶素的類黃酮是通過第 一單體單元的A環上C6位與第二單體單元的A環上C8位之間的碳-碳鍵來寡聚化，或 者其中所述寡聚的基於兒茶素的類黃酮是通過(-)_表沒食子兒茶素沒食子酸酯單體的 碳_碳C6-C6，C6-C8，C8-C6或C8-C8鍵而寡聚化的寡聚(_)_表沒食子兒茶素沒食子酸酯 (OEGCG)。
13.權利要求10所述的遞送載體，其中當將所述寡聚的基於兒茶素的類黃酮裝配在所 述膠束納米複合物中時，所述寡聚的基於兒茶素的類黃酮的生物學活性被掩蔽，並且其中 當將所述寡聚的基於兒茶素的類黃酮從所述膠束納米複合物釋放時，所述寡聚的基於兒茶 素的類黃酮的生物學活性不被掩蔽。
14.權利要求7所述的遞送載體，其中所述聚合物是醛衍生化的透明質酸，透明質酸氨 基乙醯醛二乙基乙縮醛綴合物，醛衍生化的透明質酸-酪胺，透明質酸氨基乙醯醛二乙基 乙縮醛綴合物_酪胺或它們的組合，並且所述遞送載體是水凝膠。
15.權利要求14所述的遞送載體，其是通過注射未交聯的聚合物-類黃酮綴合物以及 交聯劑而在體內形成的。
16.權利要求1至15中任一項所述的遞送載體，其中所述類黃酮具有增強的生物類黃 酮性質。
17.權利要求10所述的遞送載體，其中所述寡聚的基於兒茶素的類黃酮具有增強的生 物類黃酮性質。
18.權利要求10所述的遞送載體，其中當將所述抗癌劑裝配在所述膠束納米複合物中 時，所述抗癌劑的生物學活性被掩蔽，並且其中當所述生物活性劑從所述膠束納米複合物 中釋放時，所述生物活性劑的生物學活性不被掩蔽。
19.權利要求1至18中任一項所述的遞送載體，其中所述抗癌劑是蛋白質，肽，核酸，小 分子，藥物，抗體，激素，酶，生長因子，細胞因子，單鏈DNA，雙鏈DNA，單鏈RNA，雙鏈RNA，短 髮夾RNA，siRNA,抗生素，化學治療劑，血管生成抑制劑，針對腫瘤細胞表面標誌的抗體，免 疫調節肽，細胞因子或生長因子。
20.權利要求19所述的遞送載體，其中所述抗癌劑是針對腫瘤細胞表面標誌的抗體。
21.權利要求20所述的遞送載體，其中所述抗體是曲妥珠單抗。
22. —種遞送抗癌劑至細胞的方法，所述方法包括將權利要求1至21中任一項所述的 遞送載體與所述細胞接觸。
23.權利要求22所述的方法，其中所述細胞是體外的。
24.權利要求22所述的方法，其中所述細胞是體內的並且所述方法包括將所述遞送載 體施用於需要抗癌治療的受試者。
25.權利要求24所述的方法，其中所述受試者是人。
26.權利要求24或權利要求25所述的方法，其中施用包括注射、外科植入或局部應用。
27.藥物組合物，其包含權利要求1至21中任一項所述的遞送載體。
28.權利要求27所述的藥物組合物，其另外含有藥用載體。
29.權利要求1至21中任一項所述的遞送載體在遞送抗癌劑至受試者的細胞中的應用。
30.權利要求29所述的應用，其中所述受試者是人。
31.權利要求29或30所述的應用，其中所述遞送載體被配製用於注射、外科植入或局部給藥。
全文摘要
提供了一種遞送載體，所述遞送載體包含抗癌劑以及一種含有游離醛的遞送劑與類黃酮的綴合物，所述遞送劑在所述類黃酮的A環的C6和/或C8位上綴合。獲得的遞送載體可以遞送抗癌劑至細胞。
文檔編號C08B37/08GK101909655SQ200880122383
公開日2010年12月8日 申請日期2008年10月23日 優先權日2007年10月23日
發明者傑基·Y·英, 慄澤元一, 鄭株潤 申請人:新加坡科技研究局