用於癌症的多價引發-和-增強免疫治療劑的製作方法

2023-07-22 06:36:51 4

專利名稱：：用於癌症的多價引發-和-增強免疫治療劑的製作方法
技術領域：
：本文所公開的發明涉及這樣的方法和組合物，所述方法和組合物用於誘導I類MHC限制性免疫應答，控制所述應答，特別是多價應答的性質和量級，以及促進致病過程中有效的免疫幹涉。本文所公開的是這樣方法和組合物，所述方法和組合物用於誘導針對多種組合的腫瘤相關抗原的免疫應答，這可以促進致病過程中有效的免疫幹涉。現有技術描述美國癌症協會(AmericanCancerSociety)已估計每年超過一百萬人患上癌症，且大約每兩個美國男人中的一個和每三個美國女人中的一個在他們一生中的某時刻會患有某類的癌症。正常體細胞以有秩序的方式生長、分裂和死亡。在細胞增殖疾病，如癌症中，細胞不死亡，而是繼續不受控制地生長和分裂。儘管存在著許多類型的癌症，但是它們通常起因於異常細胞的不受控制生長。對於癌症通常的治療選擇包括手術、放射療法和化學療法。新近建立了治療的第四分支，稱為免疫療法。將免疫療法設計為幫助免疫系統識別癌細胞，和/或加強對癌細胞的應答，從而消滅癌症。免疫療法包括主動和被動免疫療法。主動免疫療法試圖刺激身體自身的免疫系統對抗所述疾病。被動免疫療法通常不依賴於患者的免疫系統攻擊所述疾病；代替地，它們使用在患者體外產生的免疫系統成分(如抗體)。可以將所述免疫系統分類為2個分立的效應子分支，即先天的和適應的免疫性。先天的免疫性涉及大量細胞成分和可溶性因子，其中所述可溶性因子可立即應答，但通常是針對外來剌激的。適應性免疫通常指對來自外源病原體精確表位的特異性地作出應答。所述適應性免疫應答進一步分為2個效應子分支(effectorarm)，稱為體液和細胞免疫系統。所述體液分支集中於利用B-淋巴細胞生產抗體，而所述細胞分支涉及細胞毒性T淋巴細胞的細胞溶解活性。細胞毒性T淋巴細胞(CTL)本身不識別靶抗原上的表位。相反地，CTL檢測展示在細胞表面上的抗原的片段。作為結果，抗原僅在經過所述細胞加工並展示在所述細胞表面上後，對CTL是可見的。已經很好地建立了細胞的抗原加工和展示系統。CTL識別短肽抗原，所述短肽抗原展示在與I類主要組織相容性複合體分子(MHC)非共價聯合的表面上。這些I類肽依次來源於胞質蛋白質的降解。儘管有多種癌症治療方法，但仍存在著對另外和更有效的治療備選方案的持續需要。一個這樣的備選方案展望了這樣的醫學治療的方法學，所述醫學治療的方法學需要或受益於通過免疫作用啟動、刺激和/或增強免疫應答的能力。這些方法學包括依賴於針對所需抗原多肽的免疫應答的產生的那些和依賴於先天免疫應答的啟動和調節的那些。因此癌症治療中的一種方法是通過使用治療抗癌疫苗操控免疫系統。為了生產疫苗或其他免疫原性組合物，將抗原或表位引入受試者中，其中針對該抗原或表位可以測定到免疫應答。儘管腫瘤癌症細胞源自正常細胞並因此在遺傳水平上與之基本相同，但是已知許多瘤細胞呈遞腫瘤相關抗原(TuAAs)。這些抗原可以通過受試者的免疫系統使用，從而識別和攻擊作為外來物質的腫瘤細胞。不幸地，腫瘤細胞似乎通常受到宿主免疫系統的忽略。在試圖生產具有對抗腫瘤細胞的疫苗中，本領域中已經開發出大量不同的策略；然而，有效並適於銷售的產品尚未出現。因此本發明用於克服本領域中的缺陷，並提供本文所公開的多種免疫原性組合物，所述免疫原性組合物耙向癌或腫瘤細胞。發明概述本發明涉及這樣的方法和組合物，所述方法和組合物用於誘導、引發和/或增強對癌抗原的I類MHC限制性表位的免疫應答，從而產生有效的抗癌免疫應答。本發明公開的實施方案涉及腫瘤相關抗原(TuAAs)的組合對患有多種類型癌症的患者的免疫療法的用途。在優選的實施方案中，所述TuAAs是癌細胞自身表達的抗原。這樣的TuAAs的實例是Melan-A，酪氨酸酶，SSX-2,NY-ESO-l和PRAME。在另一個實施方案中，所述TuAAs是與所述腫瘤的非癌成分，如腫瘤相關新脈管系統或其他基質相關的抗原。一個這樣的抗原的實例是PSMA，儘管在前列腺癌中PSMA通過癌細胞表達。在特別優選的實施方案中，兩種類型的抗原都被靶向。本發明的不同方面包括所述免疫原性組合物，它們在規定產品中的聚集，和實現它們用途的方法。一些具體的實施方案涉及免疫原性產品，其包括包含一種或多種核酸組合物和一種或多種肽組合物的多種組合物；其中所述一種或多種核酸組合物可以表達一種或多種I類MHC限制性表位或其類似物，其選自由下列各項組成的組SSX-1表位，NY-ESO-l表位，PRAME表位，PSMA表位，酪氨酸酶表位和Melan-A表位；其中所述一種或多種肽組合物基本上由所述一個或多個I類MHC限制性表位或其類似物組成，其選自由下列各項組成的組SSX-1表位，NY-ESO-l表位，PRAME表位，PSMA表位，酪氨酸酶表位和Mdan-A表位；並且其中一種或多種肽對應於由選定的核酸表達的表位。在所述免疫原性產品的一些實施方案中，所述一種或多種核酸組合物包括這樣的質粒，該質粒選自由下列各項組成的組pSEM,pBPL和pRP12。在一些實施方案中，所述肽組合物包括這樣的肽，該肽選自由下列各項組成的組SSX-24M9(SEQIDNO.1),其類似物KVSEKIFYV(SEQIDNO.5);NY-ESO-l腦5(SEQIDNO.2)，其類似物SNvaLMWITQV(SEQIDNO.6);PRAME425_433(SEQIDNO.3),其類似物S(Nva)LQHLIG(Nle)(SEQIDNO.7);PSMA288.297(SEQIDNO.4),其類似物GLPSIPVHPV(SEQIDNO.8);Melan-A26.35(SEQIDNO.9),其類似物ENvaAGIGILTV(SEQIDNO.11);酪氨酸酶369—377(SEQIDNO.10),和其類似物yMdgtmsqNva(SEQIDNO.12)。在一些實施方案中，所述多種組合物包括能表達SSX-2I類MHC限制性表位或其類似物的核酸分子；能表達NY-ESO-lI類MHC限制性表位或其類似物的核酸分子；能表達PRAMEI類MHC限制性表位或其類似物的核酸分子；能表達PSMAI類MHC限制性表位或其類似物的核酸分子；基本上由所述SSX-2表位或其類似物組成的肽；基本上由所述NY-ESO-l表位或其類似物組成的肽；基本上由所述PRAME表位或其類似物組成的肽；和基本上由所述PSMA表位或其類似物組成的肽。在所述免疫原性產品的一些實施方案中，包括的核酸分子是所述相同組合物的一部分。在一些實施方案中，所述核酸分子是相同的。在一些實施方案中，所述核酸分子包括編碼pBPL的釋放序列(SEQIDNO.13)的序列。在一些實施方案中，所述核酸包括編碼pBPL的免疫原性多肽(SEQIDNO.16)的序列。在一些實施方案中，所述核酸分子是pBPL(SEQIDNO.20)。在一些實施方案中，所述核酸分子包括編碼pRP12的釋放序列(SEQIDNO.14)的序列。在一些實施方案中，所述核酸包括編碼pRP12的免疫原性多肽(SEQIDNO.17)的序列。在一些實施方案中，所述核酸分子是pRP12(SEQID.21)。在一些實施方案中，所述SSX-2表位是SSX-24M9(SEQIDNO.1)。在一些實施方案中，所述NY-ESO-l表位是NY-ESO-h57掘(SEQIDNO.2)。在一些實施方案中，所述PRAME表位是PRAME425-433(SEQIDNO.3)。在一些實施方案中，所述PSMA表位是PSMA288.297(SEQIDNO.4)。在一些實施方案中，所述SSX-2的類似物是KVSEKIFYV(SEQIDNO.5)。在一些實施方案中，所述NY-ESO-1的類似物是SNvaLMWITQV(SEQIDNO.6)。在一些實施方案中，所述PRAME的類似物是S(Nva)LQHLIG(Nle)(SEQIDNO.7)。在一些實施方案中，所述PSMA的類似物是GLPSIPVHPV(SEQIDNO.8)。在所述免疫原性產品的一些實施方案中，多種組合物包括能表達Melan-AI類MHC限制性表位或其類似物的核酸分子；能表達酪氨酸酶I類MHC限制性表位或其類似物的核酸分子；基本上由所述Melan-A表位或其類似物組成的肽；基本上由所述酪氨酸酶表位或其類似物組成的肽。在一些實施方案中，所述核酸分子是所述相同組合物的一部分。在一些實施方案中，所述核酸分子是相同的。在一些實施方案中，所述核酸分子包括編碼pSEM的釋放序列(SEQIDNO.15)的序列。在一些實施方案中，所述核酸包括編碼pSEM的免疫原性多肽的序列(SEQIDNO.18)。在一些實施方案中，所述核酸分子是pSEM(SEQID.N0.19)。在一些實施方案中，所述Mdan-A表位是Melan-A26.35(SEQIDNO.9)。在一些實施方案中，所述酪氨酸酶表位是酪氨酸酶369.377(SEQIDNO.10)。在一些實施方案中，所述免疫原性產品還包括能表達SSX-2I類MHC限制性表位或其類似物的核酸分子；能表達NY-ESO-1I類MHC限制性表位或其類似物的核酸分子。在一些實施方案中，所述免疫原性產品還包括基本上由NY-ESO-1表位組成的肽。在一些實施方案中，所述免疫原性產物還包括基本上由SSX-2表位組成的肽。本發明的實施方案涉及用於引發和增強T細胞應答的組合物和方法。這樣的方法包括引發步驟，其中將包含編碼免疫原核酸的組合物遞送給動物。可以將所述組合物遞送到該動物的多個位點，但是優選地是將所述組合物遞送到淋巴系統(例如到淋巴結)。所述引發步驟可以包括一次或多次所述組合物的遞送，例如，經過一段時間或以持續的方式經過一段時間展開(spreadout)。所述方法可進一步包括增強步驟，該步驟包括施用包含肽免疫原的組合物，所述肽免疫原諸如SSX-24M9(SEQIDNO,1)，NY-ESO國h謂(SEQIDNO.2)，PRAME425-433(SEQIDNO.3)，PSMA288-297(SEQIDNO.4)，Melan-A26.35(SEQIDNO,9)，酪氨酸酶3沐377(SEQIDNO.10)，及其類似物(如SEQ.IDNOS.5，6,7，8，11和12所表示的)，其中所述類似物對相應的由所述核酸組合物所編碼的TuAA表位具有基本相似性。所述增強步驟可以進行一次或多次，例如，以單一丸劑的形式在一段時間內間隔進行，或持續地進行一段時間。儘管不是在所有的實施方案中都需要，一些實施方案可以包括這樣的組合物的應用，所述組合物包括免疫增強劑或佐劑。另外的實施方案包括在其中單獨地或以任意組合的形式使用所公開的質粒的那些實施方案。對應於這些表位和所述免疫策略增強部分的一部分的肽組合物可以是天然序列或與所述天然表位序列基本類似的肽類似物。可以將所述肽單獨地或以2個、3個、4個或更多個免疫原的組合的形式引入所述增強方案。其他實施方案可以包括備選的表位(如在2002年4月4日提交的(公開號20030220239Al)美國專利申請系列號10/117,937中所描述的那些，其題為"EpitopeSequences(表位序列)"，將其特意在此整體引入作為參考)，所述表位如pSEM(SEQIDNO.19)，pBPL(SEQIDNO.20),和pRP12(SEQIDN0.21)質粒中所表達的表位在相似的組合中被取代；且將相應的肽免疫原作為所述免疫策略的增強部分施用。本發明的實施方案可以包含，例如，兩個表達單免疫原的單價質粒代替一個表達全部兩種免疫原的二價質粒；一個表達三種免疫原的三價質粒代替一個二價和一個單價質粒；一個三價質粒和一個單價質粒代替一個四價質粒；或兩個二價質粒代替一個四價質粒。實施方案還可以包含所述多種質粒組合作為所述引發-和-增強免疫策略的引發步驟的一部分的應用。本發明的實施方案可以包含多肽或另外的綴合肽，及其在所述引發-和-增強免疫策略的增強步驟中的用途，其中所述綴合肽能在淋巴中被切割為單獨的肽。本發明的實施方案涉及免疫方法，其包括將一系列免疫原性劑量直接施用到哺乳動物淋巴系統中，其中所述系列可以包括至少一個引發劑量和至少一個增強劑量，且其中所述引發劑量可以包括編碼免疫原的核酸，其中所述增強劑量可無任何病毒、病毒載體或可複製型載體。所述方法可以進一步包括獲得抗原特異性免疫應答。在非限制性的實施例中，所述方法可以包括l-2個引發劑量。所述方法可以包括施用多個引發劑量，其中所述劑量在1到約7天的時程施用。所述引發劑量，增強劑量或引發和增強劑量可以通過多對注射遞送，其中對的第一成員可在對的第二成員的約4天內施用，並且其中不同對的第一成員之間的時間間隔可以是至少約14天。例如，最後的引發劑量和第一次增強劑量之間的時間間隔可以在約7和約100天之間，但是不受此限制。其他實施方案涉及治療癌的方法，其包括向需要其的患者施用多種組合物的步驟，所述多種組合物包括能表達SSX-2I類MHC限制性表位或其類似物的核酸分子；能表達NY-ESO-lI類MHC限制性表位或其類似物的核酸分子；能表達PRAMEI類MHC限制性表位或其類似物的核酸分子;能表達PSMAI類MHC限制性表位或其類似物的核酸分子。另一個實施方案涉及上述方法，其進一步包括施用一種或多種肽的步驟，所述肽選自基本由SSX-2,NY-ESO-l,PRAME和PSMA組成的組的表位或類似物。一種治療癌症的方法，其包括施用免疫原性產品，所述免疫原性產品包括多種組合物，所述組合物包括一種或多種核酸組合物和一種或多種肽組合物；其中所述一種或多種核酸組合物能表達一個或多個I類MHC限制性表位或其類似物，其選自由下列各項組成的組SSX-1表位，NY-ESO-l表位，PRAME表位，PSMA表位，酪氨酸酶表位和Melan-A表位；其中所述一種或多種肽組合物基本由所述一個或多個I類MHC限制性表位或其類似物組成，其選自由下列各項組成的組SSX-1表位，NY-ESO-l表位，PRAME表位，PSMA表位，酪氨酸酶表位和Melan-A表位；並且其中所述一個或多個對應於由選定的核酸所表達的表位。一些實施方案涉及上述方法的應用，其中所述癌症是乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、結腸癌、膀胱癌、肺癌、肝癌、胃癌、睪丸癌、子宮癌、腦癌、淋巴癌、皮膚癌、骨癌、腎癌、直腸癌、黑素瘤、成膠質細胞瘤或肉瘤。其他實施方案涉及一種治療癌症的方法，其包括向需要其的患者施用多種組合物的步驟，所述組合物包括能表達Melan-AI類MHC限制性表位或其類似物的核酸分子；能表達酪氨酸酶I類MHC限制性表位或其類似物的核酸分子；基本上由所述Melan-A表位或其類似物組成的肽；和基本上由所述酪氨酸酶表位或其類似物組成的肽。其他實施方案涉及所述方法的應用，其中所述待治療的癌症是成膠質細胞瘤或黑素瘤。其他實施方案包括向需要其的患者施用組合物的另外的步驟，所述組合物包括能表達SSX-2I類MHC限制性表位或其類似物的核酸分子；能表達NY-ESO-lI類MHC限制性表位或其類似物的核酸分子；基本上由所述NY-ESO-l表位或其類似物組成的肽；和基本上由所述SSX-2表位或其類似物組成的肽。其他實施方案涉及用於誘導哺乳動物中免疫應答的免疫原性組合物組，其包括，以不受限制的方式，1-6個引發劑量和至少一個增強劑量。在這樣的實施方案中，引發劑量可以包括編碼免疫原的核酸，並且其中增強劑量可以包括肽表位，其中所述表位可以由表達所述核酸的pAPC呈遞。所述一個劑量可進一步包括佐劑，例如RNA。引發和增強劑量可在適於直接施用於淋巴系統(例如，淋巴結等)的載體中。核酸可以是質粒。表位可以是I類HLA表位。免疫原可以包括表位陣列，所述陣列可以包括釋放序列。免疫原可以基本上由靶-相關抗原組成。靶-相關抗原可以是腫瘤-相關抗原，但不限於此。免疫原可以包括可包含表位簇的靶-相關抗原的片段。進一步的實施方案涉及在治療癌，包括黑素瘤中的使用所述引發-和-增強治療組合物，四價，二價和/或單價質粒和相應的肽免疫原的方法，其包括根據優化的免疫計劃表通過淋巴結注射給藥(即，直接進入在其中引起並增強了免疫應答的器官)。再進一步的實施方案涉及製備包含本發明組合物的藥物。一個實施方案涉及製備適合於向受試者淋巴系統給藥的藥物。另一個實施方案涉及製備適合於在受試者中誘導抗癌免疫應答的藥物。另一個實施方案涉及製備在受試者中引發和增強T細胞應答的藥物。另一個實施方案涉及製備適合於治療受試者中癌的藥物。另一個實施方案涉及一種或多種能表達一種或多種I類MHC限制性表位或其類似物的核酸組合物，和一種或多種對應於所述I類MHC限制性表位或其類似物的肽組合物在製備適合於在受試者中誘導抗癌免疫應答的藥物中的應用。附圖簡述圖1.pSEM/pBPL激活的動物在肽加強前的四聚體分析。利用在第1、4、15和18天(100ug/天)向兩側腹股溝淋巴結四次注射所述pSEM/pBPL質粒混合物激活第1、2和3組動物(n=60)。在第25天，最後一次質粒注射後10天，進行四聚體分析並與未處理的首次用於實驗的同胎所生的對照(n=5)進行比較。四聚體值(MdanA,酪氨酸酶，SSX-2,NY-ESO-l)表示平均值+ASEM。圖2.在第39天進行Melan-A/酪氨酸酶，SSX-2/NY-ESO-l四聚體分析，從而說明了在單獨的動物中的四價免疫應答。用pBPL+pSEM的質粒混合物在第1、4、15和18天(100Ug/天)在兩側腹股溝淋巴結激活動物，隨後進行肽加強，所述肽加強由在第28和32天(25ug/天)在左側淋巴結中的SSX24M9A42V(SEQID.NO.5)和右側淋巴結中的酪氨酸酶369.377V377Nva(SEQID.NO.12)組成。顯示了來自第2組的代表性動物(n=3)，並與未處理的首次用於實驗的同胎所生的對照的四聚體值進行了比較。圖3.pSEM/pBPL激活的，SSX-2/酪氨酸酶加強的動物的四聚體分析。在第39天，即最後一次肽注射後7天，進行了Melan-A/酪氨酸酶,SSX-2/NY-ESO-l四聚體分析。用pBPL+pSEM質粒混合物在第1、4、15和18天(100ug/天)激活組1的動物(11=10)，隨後在第28和32天(100ug/天)用pBPL+pSEM質粒混合物進行加強。用相似於組1的pBPL+pSEM質粒混合物激活組2和組3的動物(n=50)，隨後進行肽加強，所述肽加強由第28和32天(25Ug/天)在左側淋巴結中的SSX-241.49A42V(SEQID.NO.5)和在右側淋巴結中的酪氨酸酶369.377V377Nva(SEQID.NO.12)組成。將平均四聚體值(MelanA,酪氨酸酶，SSX-2和NY-ESO-l)與未處理的首次用於實驗的同胎所生的對照(n=5)進行比較，並表示平均值+ASEM。圖4A-4B.第一次肽加強後的IFN-YELISpot分析(圖4A)。在第41天進行ELISPOT分析。用pBPL+pSEM質粒混合物在第1、4、15和18天(100ug/天)激活組1的動物(『3，處死的)，隨後在第28和32天(100lig/天)用pBPL+pSEM質粒混合物進行加強。用相似於組1的pBPL+pSEM質粒混合物激活組2和3的動物(n=6，處死的)，隨後進行肽加強，所述肽加強由第28和32天(25yg/天)在左側淋巴結中的SSX-241.49A42V(SEQID.NO.5)和在右側淋巴結中的酪氨酸酶369.377V377Nva(SEQID.NO.12)組成。將每個脾中抗原特異性(MelanA,酪氨酸酶，SSX-2和NY-ESO-l)幹擾素一Y斑形成細胞與未處理的首次用於實驗的同胎所生的對照(11=3)進行比較；圖4A.以一式三份進行IFN-YELISpot分析，其值表示平均值+/-標準偏差。肽刺激濃度是10ug/ml，且溫育了42小時。圖4B.第二次肽加強後的IFN-YELISpot分析。通過在第63天處死代表性的動物進行ELISPOT分析。組1的動物(n=3，處死的)在第1，4,15,18,28,32，49和53天接受pBPL+pSEM混合物的注射(100ug/天)。組2的動物(『4，處死的)在第1，4,15和18天接受pBPL+pSEM混合物的注射(100Ug/天)，隨後進行肽加強，所述肽加強由第28，32，49和53天(25"g/天)在左側淋巴結中的SSX-24M9A42V(SEQID.NO.5)和在右側淋巴結中的酪氨酸酶369-377V377Nva(SEQID.NO.12)組成。組3的動物(n=7，處死的)在第1,4,15和18天接受pBPL+pSEM混合物在兩側腹股溝淋巴結的注射(100Pg/天)，隨後進行肽加強，所述肽加強由第28和32天(25lig/天)左側淋巴結中的SSX-24M9A42V(SEQID.NO.5)和在右側淋巴結中的酪氨酸酶369-377V377Nva(SEQID.NO.12)組成，以及第二次肽加強，所述第二次肽加強由在左側淋巴結中的NY-ESO-l157.165L158Nva(SEQID.NO.6),C165V(12.5ug，在第49和53天)和在右側淋巴結中的MelanA26.35A27Nva(SEQID.NO.11)(25lig，在第49和53天)組成。將每個脾中抗原特異性(MelanA,酪氨酸酶，SSX-2和NY-ESO-1)幹擾素-Y斑形成細胞與未處理的首次用於實驗的同胎所生的對照進行比較(圖4B)。以一式三份進行IFN-YELISpot分析，其值表示平均值+ASEM。肽刺激濃度是10ug/ml，且溫育了42小時。圓5.描述來自體內研究的四聚體水平，IFN-yELISPOT和羧基-螢光素二乙酸酯，琥珀醯亞胺酯(CFSE)柱狀圖，其中在該研究中，動物受到表達全部四種腫瘤相關抗原的人黑素瘤腫瘤細胞的激發。首次用於實驗的對照(左上版)；具有四價免疫性的兩個動物(右上版和左下版)；和具有對MelanA單價應答的動物(右下版)。圖6."原始"對比"擴展"方法的四聚體分析。基於"原始方法"(組1-3)或基於"擴展方法"(組4-6)對動物進行注射，所述注射為在右側腹股溝淋巴結中Dl(pRP12)質粒(4mg/ml)的4次注射，和在左側腹股溝淋巴結中D2(pBPL)質粒(4mg/ml)的4次注射。隨後用PSMA,SSX-2,PRAME和NY-ES0-1肽對動物進行加強。在第l、4、15和18天用Dl(pRP12)質粒和D2(pBPL)質粒(4mg/ml)激活動物，隨後對於所述原始方法，用PSMA288-297(1297V)月太(RLN)(SEQID.NO.8)和SSX-24M9(A42V)肽(LLN)(SEQID.NO.5)在第29和31天進行加強；對於所述擴展方法，用PRAME425—433(L426Nva，L433Nle))肽(RLN)(SEQID.NO.7)和NY-ESO-1157.165(L158Nva,C165V)肽(LLN)(SEQID.NO.6)在第42和45天進行加強(組4-6)。數值表示肽加強後來自個體動物的平均值+ASEM，並與未處理的首次用於實驗的同胎所生的對照(r^5)進行比較。圖7.來自組1中的代表性動物的四價免疫應答(圖6)。質粒激活後，將PSMA肽(25ug)和PRAME肽(20ug)注射到所述右側淋巴結中。將25微克的SSX-2和NY-ESO-l肽中每一種注射到所述左側淋巴結中。顯示的數據通過四聚體和ELISpot測定測量免疫應答。圖8.所述"原始(original)"對比所述"擴展(expanded)"方法的IFN-YELISPOT分析。顯示每個脾的總抗原特異性(SSX-2，NY-ESO-l,PRAME和PSMA)幹擾素-Y斑形成細胞，比較包括低、中等和高肽加強的"原始"和"擴展"方法。以一式三份進行IFN-YELISpot分析，其值表示肽加強後的平均值+ASEM。用濃度為10pg/ml的肽(SSX-2，NY-ESO-l，PRAME和PSMA)在96孔ELISpot板中離體(exvivo)刺激脾細胞(3xl05細胞/孔)72小時。數值由總有核脾細胞推斷而來，並對來自各個動物的每個脾進行了標準化。圖9."Cr細胞毒性測定。圖9描述在免疫小鼠中，在DNA激活和肽加強以及一輪體外刺激後，對PRAME425-433(SEQID.NO.3)，PSMA288-297(SEQID.NO.4)，NY-ESO-l157—165(SEQID.NO.2)和SSX-24M9(SEQID.NO.l)的CTL應答。數據表示如下x軸顯示效應物對靶標的比率，y軸顯示相應的百分比特異性溶解。圖10.由2個周期的PP(PRAME和PSMA)方案和NS(NY-ESO-l和SSX-2)方案的治療方案所激發的免疫應答，其顯示了PRAME的肽優勢。優選實施方案詳述本發明的實施方案基於活性免疫性的誘導(治療性接種疫苗)，所述免疫性優選地共靶向由癌細胞和基本的新脈管系統所表達的多分子。該方法優選地涉及重組DNA(質粒)和合成肽直接進入淋巴結的靶向遞送，從而激發強大的細胞介導免疫應答，該免疫應答具有最終幹擾腫瘤細胞在原發和轉移病灶中生存和/或生活力的潛力。本發明的方法學包括組合使用重組DNA質粒和合成肽，優選地，根據優化的免疫計劃表，利用激活(質粒)/加強(肽)方法，通過淋巴結注射給藥。在優選的實施方案中，淋巴結注射直接進入起始和增強了免疫應答的生物體內。本發明的實施方案可以對具有腫瘤組織的患者施用，所述腫瘤組織表達HLA-A2，具體地HLA-AW201。已經觀察到通過使用該免疫方法所述質粒不僅可以起始免疫應答，還與調節性質相反地使該應答及其隨後的增強向效應物偏向。在沒有該在先的基於核酸的免疫的情況下，重複施用肽導致甚至更加受到調節T細胞控制的應答。將該長期的向著效應物應答的偏向稱為引發。公開的實施方案涉及對癌和黑素瘤的引發-和-增強治療劑，其可以用於獲得多價攻擊，從而提供增加腫瘤對攻擊的敏感性的優勢。如果耙向多於腫瘤細胞上的單一抗原，則抗腫瘤劑的有效濃度相應增加。對與腫瘤相關的基質，如脈管系統的攻擊，也可以增加腫瘤細胞對靶向它們的試劑的可接近性。因此，甚至也在一些正常組織中被表達的抗原也可以得到將其作為靶抗原的更多的考慮，如果在多價攻擊中其他待耙向的抗原也不在該組織中表達的話。該涉及不同形式免疫原的免疫方法的實踐需要至少兩種不同組合物的使用並且，尤其在存在一個以上靶抗原時，其可包括在一起和/或在不同時期施用的數種組合物。因此本發明的實施方案包括免疫原組合物的組和亞組及其各自劑量。多價性可利用包括多價免疫原、單價免疫原組合的組合、包括一種或多種單價免疫原或其不同組合的組合物的協同使用而獲得。根據這些方法製備的用於特定治療方案或方法的多種組合物限定了免疫治療性產品。在一些實施方案中全部產品的組合物或其亞組被一起包裝在試劑盒中。在有些情況下，靶向單個表位或表位組的誘導和增強組合物可包裝在一起。在其他情況中，多種誘導組合物可裝配在一個試劑盒中並且對應的增強組合物裝配在另一個試劑盒中。或者組合物可以分別與印刷形式的或在機器可讀媒介上的說明書一起包裝和銷售，所述說明書描述其如何互相結合使用以實現指定免疫方案的有利結果。進一步的改變對本領域技術人員將是顯而易見的。包括在具體的方案或方式中應用的少於全部組合物的各種包裝方案的使用有利於治療的個性化，例如以腫瘤抗原表達或以觀察到的對免疫治療或其各種組分的應答為基礎，如在2004年6月17日提交的美國臨時申請系列號60/580，969，2005年6月17日提交的美國專利申i青系列號11/155，288(公開號20060008468)以及2005年12月29日提交的美國專利申請系列號11/323,964，全部都題為"COMBINATIONSOFTUMOR-ASSOCIATEDANTIGENSINDIAGNOSTICSFORVARIOUSTYPESOFCANCERS"(用於多種類型癌症的診斷劑中的腫瘤相關抗原的組合)；和美國臨時專利申請系列號60/580，964和美國專利申請系列號11/155，928(公開號20050287068)，兩者題為"IMPROVEDEFFICACYOFACTIVEIMMUNOTHERAPYBYINTEGRATINGDIAGNOSTICWITHTHERAPEUTICMETHODS"(用治療方法通過整合診斷劑提高主動免疫療法的功效)中所述，以上每篇整體引入作為參考。本發明的實施方案包括這樣的肽，所述肽單獨地或與2、3、4或更多種免疫原組合地引入到所述增強方案中。使用少於所有肽表位的原因包括，但不限於如下1)任意所述抗原的次優表達；2)患者不表達或不再表達所述相應的抗原；3)產生對一種或另一種表位的較弱應答，在所述情形中，這樣的肽可以在缺乏其他肽時給出，從而獲得更平衡的應答；4)可以停止引入肽，如果其產生某種免疫毒性的話。I.本發明的治療肽和質粒A.治療肽及其類似物本發明預期使用由癌細胞和所述新脈管系統表達的多分子作為癌症治療中的治療劑。這樣的分子包括腫瘤相關抗原(TuAA)，所述腫瘤相關抗原是由癌細胞本身表達的抗原或與腫瘤的非癌成分，如腫瘤相關新脈管竭統或其它基質相關表達的抗原。TuAA幫助將患者的癌症病症或類型與適合的免疫治療劑或方案相匹配。本發明所預期的TuAA的不受限制的實例包括SSX-2,NY-ESO-1,PRAME,PSMA(前列腺特異性膜抗原)，Melan-A，和酪氨酸酶。因此，在本發明具體的實施方案中，提供了肽，肽類似物或TuAA表位(表1)作為癌症治療劑。在本發明的備選實施方案中，所述肽可以包括NY-ESO-l,SSX-2,Mdan-A,酪氨酸酶，PRAME和PSMA的天然序列或是其類似物，諸如以下各篇所公開的那些美國臨時申請系列號60/581,001，60/580,962和60/691,889，以及它們相應的專利申請系列號11/156,253(公開號20060063913),11/155,929，(公開號20060094661),11/156,369(公開號20060057673)，—/_(代理巻號MANNK.052A，與本申請同一天提交),一/_(代理巻號MANNK.052A2,與本申請同一天提交)和—/_(代理巻號MANNK.052A3，與本申請同一天提交)；和美國專利申請系列號11/156,369(公開號20060057673)禾H11/156,253(公開號20060063913);以上每篇在此整體引入作為參考。酪氨酸酶，即一種黑色素生物合成酶，主要高水平地表達於黑素細胞中，所述黑素細胞常見於黑素瘤中。因此，認為酪氨酸酶是黑素細胞分化最特異的標誌之一。它還表達於神經膠質細胞中，所述神經膠質細胞與黑素細胞相似，從神經外胚層發育而來。酪氨酸酶因此也是對成膠質細胞瘤，包括多形性成膠質細胞瘤，有效的TuAA。酪氨酸酶作為TuAA的進一步的細節公開於美國專利號5,747,271中，並將其在此整體引入作為參考。在本發明具體的實施方案中，提供了由本文中的SEQ.IDNO:10表示的酪氨酸酶369-377表位(表l)。在本發明中使用的另一種TuAA是Mdan-A，也稱為MART-1(由T細胞識別的黑素瘤抗原)。Mdan-A/MART-1是一種黑素生物合成蛋白，該蛋白也高水平地表達於黑素瘤中。Melan-A/MART-1作為TuAA公開於美國專利號5,994,523;5,874,560;和5,620,886中，以上每篇在此整體引入作為參考。在本發明優選的實施方案中，提供了由本文中的SEQ.IDNO:9所表示的Melan-ATuAA，Melan-A26-35(表1)。SSX-2，也稱為Hom-Mel-40，是高保守性的癌症-睪丸(CT)抗原家族的成員(Gure,A.O.etal，/"/.Ootcw72:965-971,1997,將其整體引入作為參考)。在多種腫瘤中發現癌症-睪丸抗原，但其通常不存在於除睪丸外的正常成熟組織中。在多種腫瘤細胞系中已經發現了SSX家族不同成員的表達。SSX-2作為TuAA公開於美國專利號6,025,191中，將其整體引入作為參考。在本發明的具體的實施方案中，提供了SSX-24M9(SEQ.IDNO:l)及其類似物，SSX-2類似物(SEQ.IDNO:5)，表l。NY-ESO-l，也稱為CTAG-1(癌症-睪丸抗原-l)和CAG-3(癌症抗原-3)，是在廣泛多種腫瘤中出現的癌症-睪丸抗原。NY-ESO-l作為TuAA公開於美國專利號5,804,381中，將其整體引入作為參考。在優選的實施方案中，本發明提供了NY-ESO-l的表位及其類似物，分別由SEQ.IDNO:2和SEQ.IDNO:6所表示(表1)。本發明預期的另一種TuAA是PRAME，也稱為MAPE,DAGE和OIP4。PRAME在本領域中已知為癌症-睪丸(CT)抗原。然而，與許多CT抗原，如MAGE,GAGE禾QBAGE不同，它在急性骨髓白血病中表達。PRAME作為TuAA公開於美國專利號5,830,753中，將其整體引入本文作為參考。在優選的實施方案中，本發明提供了PRAME的表位及其類似物，分別由SEQ.IDNO:3禾卩SEQ.IDNO:7所表示(表1)。本發明中所使用的另一種TuAA是前列腺特異性膜抗原(PSMA)。發現PSMA在前列腺癌細胞中高水平表達。然而，也注意到了PSMA在正常前列腺上皮細胞和非前列腺腫瘤的新脈管系統中的表達。PSMA作為抗新脈管系統製劑公開於美國臨時專利申請系列號60/274,063和美國專利申請系列號10/094,699(公開號20030046714)和11/073,347(公開號20050260234)中；以上每篇在此整體引入作為參考。PSMA作為TuAA描述於美國專利號5,538,866中，將其整體引入本文作為參考。在優選的實施方案中，本發明提供了PSMA的表位及其類似物，分別由SEQ.IDNO:4和SEQ.IDNO:8所表示(表l)。表1SEQ.IDNO的部分列表SEQ.IDNO.身份序列1SSX-24M9kASEKIFYV2ny-ESO-h謂SLLMWITQC3卩RAME職33SLLQHLIGLPSMA288-297GLPSIPVHPI5ssx-2類似物k:vsekifyv6NY-ESO-l類似物SNvaLMWITQV7PRAME類似物SNvaLQHL腿Ie8PSMA類似物GLPSIPVHPV9Mdan-A26-35ELAGIGILTV21tableseeoriginaldocumentpage22tableseeoriginaldocumentpage23如上所討論的，本發明的抗原可以在多種治療疾病，如但不限於癌症的治療方案中使用。B.包含質粒與肽的組合的免疫原性組合物如上所討論的，本發明提供用於治療癌症的包含質粒的免疫原性組合物，其中所述質粒在與合成肽的組合中使用。這樣的免疫原性方案激發強烈的細胞介導的靶向特定癌症的免疫應答，從而消除、根除或改善受試者中的癌症。本發明中所使用的優選質粒是pRP12質粒(SEQIDNO.21)(美國臨時專利申請號60/691,579及其相應的美國專利申請系列號_)(代理巻號MANNK.053A，與本申請同一天提交，兩篇都題為"METHODSANDCOMPOSITIONSTOELICITMULTIVALENTIMMUNERESPONSESAGAINSTDOMINANTANDSUB-DOMINANTEPITOPESEXPRESSEDONCANCERCELLSANDTUMORSTROMA"(激發針對在癌症細胞和腫瘤基質上表達的優勢和次優勢表位的多價免疫應答的方法和組合物)，pBPL質粒(SEQIDNO.20)，和pSEM質粒(SEQIDNO.19)，其中pBPL質粒和pSEM質粒分別公開於美國臨時專利申請號60/691,579和美國專利申請系列號10/292,413(公開號20030228634)中，以上每篇在此整體引入作為參考(注意在那些文獻中將pSEM稱為pMA2M)。可以使用的另外的質粒公開於這些參考文獻中，以及美國專利申請系列號10/225,568(公開號20030138808)中。因此，在多種實施方案中，免疫治療產品包括免疫原性組合物的集聚體。該集聚體可以包含1、2或3種質粒作為一組單獨組合物或單一組合物可以包含兩種或更多質粒。該集聚體還可以包含對應於所述質粒所表達的表位的多個肽。相似地，它們可以作為組合物來提供，所述組合物包含單獨的或多個肽。在一些實施方案中，一種或多種引發質粒與相應的增強肽一起出售。在其它實施方案中，多種質粒一起出售，但無相應的肽。在另外其它實施方案中，在無質粒情況下，相應肽的組一起出售，例如，為了對引發的應答隨後幾輪的增強。因此，在本發明一個特別的實施方案中，提供了這樣的集聚體，該集聚體包括pBPL質粒(在美國申請系列號10/292,413(公開號20030228634)中詳細描述，題為"EXPRESSIONVECTORSENCODINGEPITOPESOFTARGET-ASSOCIATEDANTIGENSANDMETHODSFORTHEIRDESIGN"(編碼靶標相關抗原的表位的表達載體及其設計方法)，特此將其明確地整體引入作為參考)和pRP12質粒(在美國臨時申請號60/691,579，美國專利申請系列號_(代理巻號MANNK.053A，與本申請同一天提交)中描述，兩篇都題為"METHODSANDCOMPOSITIONSTOELICITMULTIVALENTIMMUNERESPONSESAGAINSTDOMINANTANDSUBDOMINANTEPITOPESEXPRESSEDONCANCERCELLSANDTUMORSTROMA"(激發針對在癌症細胞和腫瘤基質上表達的優勢和次優勢表位的多價免疫應答的方法和組合物)，特此將其明確地整體引入作為參考)，其中所述pBPL質粒表達NY-ESO-l^,65(SEQIDNO.2)禾卩SSX-24M9(SEQIDNO.1)表位；所述pRP12質粒表達PRAME425—433(SEQIDNO.3)和PSMA288.297(SEQIDNO.4)表位。所述pBPL和pRP12質粒的釋放序列在此分別由SEQIDN0.13和14表示，且也公開於美國專利申請系列號10/212,413(公開號20030228634)中，將其引入本文作為參考。所述質粒以這樣的方式編碼所述表位，所述方式導致它們可以由pAPC表達和呈遞。在本發明的另一個特別實施方案中，提供了這樣的集聚體，該集聚體包括所述pSEM質粒(在美國專利申請系列號10/292,413(公開號20030228634)中詳細描述並稱為pMA2M，將所述美國專利申請系列號10/292,413引入本文作為參考)，其中所述pSEM質粒表達Melan-A26—35(SEQIDNO.9)和酪氨酸酶369.377(SEQIDNO.10)表位。所述肽類似物Melan-A26.35A27Nva(SEQIDNO.ll)和酪氨酸酶369.377V377Nva(SEQIDNO.12)公開於美國專利申請系列號11/156,369和美國臨時專利申請系列號60/691,889中，兩篇都題為'砂nDPEANALOGS(劍朔以物"，特則每其每^f本引入本文作為參考。該質粒的釋放序列在本文由SEQIDNo.l5表示，並也公開於2005年6月17日提交的美國臨時專利申請號60/691,579;和與本申請同一天提交的美國專利申請—/_(代理巻號MANNK.053A)中，兩篇都題為"METHODSANDCOMPOSITIONSTOELICITMULTIVALENTIMMUNERESPONSESAGAINSTDOMINANTANDSUBDOMINANTEPITOPES,EXPRESSEDONCANCERCELLSANDTUMORSTROMA"(激發針對在癌症細胞和腫瘤基質上表達的優勢和次優勢表位的多價免疫應答的方法和組合物)。所述pSEM質粒以這樣的方式編碼所述Melan-A和酪氨酸酶表位，該方式容許它們由pAPC表達和呈遞。在本發明的另一個特別實施方案中，提供了這樣的集聚體，該集聚體包括表達NY-ESO-lI57.165(SEQIDNO.2)和SSX-24M9(SEQIDNO.l)表位的pBPL質粒(如上描述)，和表達Melan-A26_35(SEQIDNO.9)和酪氨酸酶御7(SEQIDNO.10)表位的pSEM質粒(如上描述)。所述肽類似物Melan-A26.35A27Nva(SEQIDNO.11)，酪氨酸酶369.377V377Nva(SEQIDNO.12)，SSX-24M9A42V(SEQIDNO.5)，和NY-ESO-l157.165L158Nva,C165V(SEQIDNO6)描述於美國臨時申請系列號60/580,962;美國專利申請系列號11/155,929;美國臨時申請系列號60/581,001;美國專利申請系列號11/156,253;美國專利申請系列號11/156,369和美國臨時專利申請系列號60/691,889中，特此將以上每篇整體引入作為參考。所述質粒，即pSEM(SEQIDNO.19)和pBPL(SEQIDNO.20)以這樣的方式編碼各自的表位(Melan-A，酪氨酸酶，NY-ESO-1和SSX-2)，所述方式導致它們可以由pAPC表達和呈遞。本發明的另一個特別實施方案涉及這樣的集聚體，該集聚體包括表達PSMA288_297(SEQIDNO.4)和PRAME425.433(SEQIDNO.3)表位的pRP12質粒(如上描述)，和表達Melan-A26—35(SEQIDNO.9)和酪氨酸酶369.377(SEQIDNO.IO)表位的pSEM質粒(如上描述)。所述肽類似物Melan-A26—35A27Nva(SEQIDNO.11)，酪氨酸酶369.377V377Nva(SEQIDNO.12)，PRAME425—433L426Nva,I433Nle(SEQIDNO.7)，禾卩PSMA288—297I297V(SEQIDNO.8)描述於美國臨時申請系列號60/580,962;美國專利申請系列號11/155,929;美國臨時申請系列號60/581,001;美國專利申請系列號11/156,253;美國專利申請系列號11/156,369和美國臨時專利申請系列號60/691,889中，特此將以上每篇整體引入作為參考。兩種質粒，以這樣的方式編碼它們各自的表位(Melan-A，酪氨酸酶，PRAME和PSMA)，所述方式導致它們可以由pAPC表達和呈遞。在進一步的實施方案中，每個上述集聚體包括對應於(即可以增強對所述表位的應答)由那些質粒所表達的表位的肽。其它特別的實施方案包括單獨的質粒和一個或全部兩個相應的肽。(儘管將本文所指的特異性質粒描述為二價的，但是它們也可以以單價方式增強。)參考本文，PP治療方案要求施用質粒和肽，從而靶向所述PRAME和PSMA抗原。相似地，MT方案靶向Melan-A/酪氨酸酶抗原，NS治療方案耙向NY-ESO-l和SSX-2抗原。II.細胞增殖性疾病和篩選方法
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：本發明的免疫原性組合物，包括質粒和一種或多種肽或其類似物，可以施用於治療受試者的細胞增殖性疾病，如癌症中。可以利用本發明的免疫原性組合物治療的癌症包括，例如，黑素瘤，肺癌包括非小細胞肺癌(NSCLC)或小細胞肺癌(SCLC)，肝癌，成視網膜細胞瘤，星形細胞瘤，成膠質細胞瘤，白血病，成神經細胞瘤，頭和頸癌，乳腺癌，胰腺癌，腎癌，骨癌，睪丸癌，卵巢癌，間皮瘤，宮頸癌，胃腸癌，淋巴瘤，結腸癌，膀胱癌和/或血液，腦，皮膚，眼睛，舌，齒齦的癌症。還預期本發明的免疫原性組合物可以用於治療除癌症外的細胞增殖性疾病。在本發明中所預期的其它細胞增殖性疾病可以包括，例如，發育異常，腫瘤前病灶(例如，腺瘤增生，前列腺上皮內瘤，宮頸發育異常，結腸息肉病)，或原位癌，但不限於這些。可以對從易患癌症或患有癌症的患者獲得的細胞或組織進行篩選，從而更好地確定適合施用於患者的免疫治療方案。這樣的篩選可以包括如下步驟針對在預選的抗原組中的兩種或更多的表達的腫瘤相關抗原(TuAA)，檢驗所述患者的腫瘤組織，從而發展針對該腫瘤的抗原圖譜(profile)。然後可以根據所獲得的抗原圖譜(pmfile)來選擇免疫治療方案。所選擇的方案可以包括施用至少一種免疫治療劑，所述免疫治療劑靶向2、3、4或更多種所述表達的抗原。針對2種或更多由該腫瘤所表達的抗原中的每一個，所述免疫治療劑可以包括或編碼由所述患者的I類MHC類型所限制的表位。可以在腫瘤細胞上，或腫瘤相關基質細胞上，或在二者上都檢測到該抗原的表達。本發明所提供的免疫治療方案包括PP方案，其中靶抗原是PRAME和PSMA;該方案共耙向脈管系統和癌症睪丸抗原。本發明所提供的另一個方案是MT方案，其中靶抗原是Mdan-A和酪氨酸酶；該方案靶向與黑素瘤和成膠質細胞瘤相關的組織特異性抗原。本發明的NS方案涉及靶抗原NY-ESO-l和SSX-2，它們是在廣泛多樣的癌症中發現具有不同出現率的癌症睪丸抗原。在本發明的其它特別實施方案中，提供了方案PPNS(共耙向PRAME，PSMA，NYESO-l,SSX2)，NSMT(共耙向NYESO-l,SSX2，MelanA和酪氨酸酶)或PPMT(共耙向PRAME,PSMA，MelanA，酪氨酸酶)。本發明中所使用的篩選方法可以包括如下步驟:檢驗患者的腫瘤組織，從而檢測在預選組中的一種或多種表達的多肽，其中所述組包括2，或3，或4，或更多種TuAA和至少一種譜系特異性標記；並基於該檢驗確定癌症的診斷。所述組包括至少2，3，4或更多種TuAA，該TuAA選自由下列各項組成的組NY-ESO-l,PRAME，PSMA，酪氨酸酶，melan-A/MART-1和SSX蛋白質。在一些情形中，所述譜系特異性標記可以是TuAA;或者，所述譜系特異性標記不是TuAA。例如，在黑素瘤和/或成膠質細胞瘤的情形中，該譜系特異性標記可以為酪氨酸酶，mdan-A/MART-l或gpl00;在前列腺癌的情形中，該譜系特異性標記可以為PSA或PSMA。由於腫瘤抗原表達傾向為異質的，所以任何具體的活組織檢查樣品可能不會對所有的表達的抗原提供完全的指示。因此，不需要患者的圖譜(profile)含有所有用於治療的抗原。本發明所使用的篩選方法可以包括針對抗原預選組的表達對相應的假定類型的腫瘤組織進行檢驗。在一些情形中，集聚於一種腫瘤類型的TuAA組可以用於篩選其它腫瘤類型，其中所述其它腫瘤類型可以表達至少一些相同的抗原並顯示相同的表達圖譜。本發明的免疫原性組合物可以施用於具有表達111^-八2，特別是1^八-A*0201的腫瘤組織的患者。用於獲得具體腫瘤抗原表達圖譜的示範方法學可以見於下列文獻中，其中所述圖譜可以用於確定哪個抗原或抗原的組合在治療具體癌症中有效，所述文獻是:2004年6月17日提交的美國臨時申請系列號60/580,969;2005年6月17日提交的美國專利申請系列號11/155,288(公開號20060008468);和也在2005年6月17日提交的美國專利申請系列號11/323,964，以上各篇均題為"COMBINATIONSOFTUMOR-ASSOCIATEDANTIGENSINDIAGNOSTICSFORVARIOUSTYPESOFCANCERS"(在用於各種類型癌症的診斷劑中的腫瘤相關抗原的組合)，以上每篇整體引入本文作為參考。在涉及針對具體癌症的免疫應答中特別有益的特異性抗原組合公開於2003年6月17日提交的美國臨時申請系列號60/479，554;2004年6月17日提交的美國專利申請系列號10/871,708(公開號20050118186)(以上兩篇均題為"COMBINATIONSOFTUMOR-ASSOCIATEDANTIGENSINCOMPOSITIONSFORVARIOUSTYPESOFCANCERS"(在用於各種類型癌症的組合物中的腫瘤相關抗原的組合)；和2004年6月17日提交的PCT專利申請公開號WO2004/112825;以上每篇整體引入本文作為參考。III.用於施用的引發-和-增強治療劑在優選的實施方案中，本發明提供一種利用激活(質粒)/加強(肽)方法施用的組合物，其包括組合使用重組DNA質粒和合成肽。這樣的組合物可根據優化的免疫計劃表通過淋巴結注射遞送。本發明的實施方案可施用於具有表達HLA-A2，特別是HLA-A*0201的腫瘤組織的患者。因此，包含質粒和一種或多種肽或其類似物的免疫原性組合物可在治療受試者的癌症中施用。本發明所公開的實施方案涉及對癌，包括黑素瘤的引發-和-增強治療劑，該治療劑可用於獲得多價攻擊，從而提供增加腫瘤對攻擊敏感性的優勢。因此，在具體的實施方案中，本發明提供用於治療癌症的多價引發-和-增強治療劑。該多價治療劑可靶向腫瘤細胞上多於一種的抗原。在腫瘤細胞上多於單一抗原受到靶向的情形中，抗腫瘤治療劑的有效濃度相應地增加。對與腫瘤相關的基質，如脈管系統的攻擊可增加腫瘤細胞對耙向它們的試劑的可接近性。因此，甚至在一些正常組織中也表達的抗原也可得到將其作為靶抗原的更多的考慮，如果在多價攻擊中其他待靶向的抗原也不在所述組織中表達的話。A.二價引發-和-增強治療劑本發明的實施方案涉及用於黑素瘤的二價引發-和-增強治療劑。因此，在本發明中，提供了一種集聚體，其包括pSEM質粒和對應於Melan-A26.35(SEQIDNO.9)和酪氨酸酶369.377(SEQIDNO.10)表位的肽，該集聚體以所述MT方案針對黑素瘤施用。在優選的實施方案中，將所述肽類似物Melan-A26.35A27Nva(SEQIDNO.11)和/或酪氨酸酶369.377V377Nva(SEQIDNO.12)用於所述增強步驟中。本發明所使用的引發-和-增強方法公開如上。所述pSEM質粒集聚體可以以相似於上述討論的用於黑素瘤的四價引發-和-增強治療劑的方式遞送。可以根據本文所公開的方法和對患者使用的MT方案篩選黑素瘤患者，其中所述患者的腫瘤抗原圖譜包括Melan-A和/或酪氨酸酶。所述肽加強的施用可涉及一種或全部兩種由所述質粒表達的抗原。相似地，所述PP和NS方案可利用這樣的集聚體用於二價治療，所述集聚體分別包含對應於PSMA288-297(SEQIDNO.4)和PRAME425—433(SEQIDNO.3)表位的pRP12和肽，以及對應於NY-ESO-l157.165(SEQIDNO.2)和SSX-241.49(SEQIDNO.1)表位的pBPL和肽。可組合這些二價方案，從而產生更高效價的治療，其選擇的實施方案描述如下，並且組合多組免疫原性組合物以支持它們。B.四價引發-和-增強治療劑本發明的一個實施方案涉及用於癌的四價引發-和-增強治療劑。因此，在本發明的一個特別的實施方案中，提供一種集聚體，其包括表達NY-ESO-l157.165(SEQIDNO.2)和SSX-24M9(SEQIDNO.l)表位的pBPL質粒和表達PRAME425—433(SEQIDNO.3)和PSMA288.297(SEQIDNO.4)表位的pRP12質粒(本文稱為PP方案)，以上每種作為免疫策略的引發免疫原施用。本發明預期的"引發"免疫原在許多實施方案中包括誘導，所述誘導使經誘導的T細胞譜系的免疫圖譜具有特別的穩定性。另夕卜，將對應於所述NY-ESO-l，SSX-2，PRAME和PSMA表位的4種肽組合物作為與所述引發免疫原相同的免疫策略的增強部分施用。在優選的實施方案中，所述肽類似物NY-ESO-l,57.,65L158Nva,C165V(SEQIDNO.6);SSX-24M9A42V(SEQIDNO.5);PSMA288.2971297V(SEQIDNO.8);和/或PRAME425.433L426Nva,L433Nle(SEQIDNO.7)用於所述增強步驟。如本發明中所預期的，在許多實施方案中，術語"增強的或增強"，如在T細胞應答上，包括增加細胞數量、活性細胞的數量、活性水平、增殖率或涉及特異性應答的T細胞的相似參數的過程。本發明所使用的引發-和-增強方法更具體地描述於美國臨時申請號60/640,402，美國專利申請系列號10/871,707(公開號20050079152)，和美國專利申請系列號11/323,572中，每篇均題為"METHODSTOELICIT,ENHANCEANDSUSTAINIMMUNERESPONSESAGAINSTMHCCLASSI-RESTRICTEDEPITOPES,FORPROPHYLACTICORTHERAPEUTICPURPOSES"(激發，增強和維持針對I類MHC限制性表位的免疫應答以用於預防或治療目的的方法)，以上每篇都整體引入本文作為參考。在本發明優選的實施方案中，將所述質粒作為引發免疫原，結內(intranodally)施用於腹股溝淋巴結，左側施用一種，右側施用一種。隨後，將所述肽作為增強免疫原繼續結內施用，向左側結在分別的日子施用兩種，向右側結在分別的日子施用另外兩種。優選地，但不要求，將所述肽施用於相同的淋巴結，該淋巴結接受編碼相應表位的質粒。可根據本文所公開的方法篩選癌患者，特別是那些患有卵巢癌、結腸直腸癌、胰腺癌或腎細胞癌的患者，並且將PP和或NS治療方案施用於其腫瘤圖譜包括PRAME，PSMA,NY-ESO-1禾口/或SSX-2的患者。注意到還在LAGEla/s中發現了NY-ESO-1表位，因此也可以在腫瘤圖譜中考慮這個抗原在圖譜中的存在。由於腫瘤抗原表達傾向為異質的，所以任何具體的活組織檢查樣品可能不會對所有的表達的抗原提供完全的指示。因此，患者的圖譜含有所有四種抗原對使該患者成為用本發明的治療劑進行治療的候選者來說不是必須的。然而，優選地，所述圖譜含有所述抗原的2，3，或4種。C.用於黑素瘤的四價引發-和-增強治療劑本發明的實施方案涉及用於黑素瘤的四價引發-和-增強治療劑，其包括質粒pSEM和pBPL和相應的肽。所述pSEM質粒編碼Melan-A26.35(SEQIDNO.9)表位的A2幾類似物和天然酪氨酸酶(酪氨酸酶369.377(SEQIDNO.IO))表位序列(本文中稱為MT方案)。所述pBPL質粒編碼NY-ESO-l157.165(SEQIDNO.2)和SSX-24M9(SEQIDNO.l)天然序列。將包含所述質粒的集聚體作為針對黑素瘤的免疫策略的引發部分施用。另夕卜，將對應於NY-ESO-1,SSX-2,Melan-A和酪氨酸酶表位的四種肽組合物作為該相同免疫策略的增強部分施用。在優選的實施方案中，將所述肽類似物Melan-A26.35A27Nva(SEQIDNO.11),酪氨酸酶369.377V377Nva(SEQIDNO.12)，SSX-24M9A42V(SEQIDNO.5),和NY-ESO-l157.165L158Nva，C165V(SEQIDNO.6)用於該增強步驟中。為了治療癌症如黑素瘤，將所述質粒作為引發免疫原，結內施用於腹股溝淋巴結。隨後，將所述肽結內施用，優選地，作為增強免疫原，在任意具體的日子，將一種施用於左側結，另一種施用於右側結。可根據本文所公開的方法篩選黑素瘤患者並將適合的方案施用於其腫瘤抗原圖譜包括Melan-A和/或酪氨酸酶的患者。所述肽加強的施用可以包括所述質粒表達的抗原的2，3或4種。D.用於成膠質細胞瘤的四價引發-和-增強治療劑在本發明的另一個特別的實施方案中，提供了適用於黑素瘤的四價引發-和-增強治療劑，該治療劑也適用於其他癌症如成膠質細胞瘤。一個這樣的實施方案涉及表達PSMA288-297(SEQIDNO.4)和PRAME425-433(SEQIDNO.3)表位的複合pRP12質粒(如上所述)和表達Melan-A26.35(SEQIDNO.9)和酪氨酸酶369_377(SEQIDNO.IO)表位的pSEM質粒(如上所述)，所述複合pRP12質粒和pSEM質粒均作為免疫策略的引發部分施用。另外，將對應於PSMA,PRAME，Melan-A和酪氨酸酶表位的四種肽組合物作為該相同免疫策略的增強部分施用。在優選的實施方案中，將所述肽類似物Melan-A26.35A27Nva(SEQIDNO.11)，酪氨酸酶369.377V377Nva(SEQIDNO.12),PRAME425-433L426Nva，I433Nle(SEQIDNO.7)和PSMA288—297I297V(SEQIDNO.8)用於該增強步驟中。可根據本文所公開的方法篩選癌症患者並將PP和/或MT方案施用於其腫瘤抗原圖譜包括PRAME,PSMA，Mdan-A和/或酪氨酸酶的患者。所述肽加強的施用可以包括由所述質粒表達的抗原的2，3或4種。IV.遞送本發明組合物的方法
技術領域：
：本發明中，包含作為激活物的重組DNA質粒和作為加強物的合成肽的免疫原性組合物的優選的施用是通過淋巴結注射進行的。可獨立於所述肽(加強)來施用所述質粒(激活)。本發明的實施方案可包括兩個表達單免疫原的單價質粒，其替代了一個表達兩種免疫原的二價質粒。在其他實施方案中，可以使用表達三種免疫原的三價質粒，其替代一個二價和一個單價質粒。在一些情形中，可以使用一個三價質粒和一個單價質粒，其替代一個四價質粒；或兩個二價質粒，其替代一個四價質粒。無論使用哪種本發明的組合物的組合，淋巴結注射是優選的，這是由於它容許根據優化的免疫計劃表向起始和增強了免疫應答的器官的直接遞送。為將所述免疫原性組合物引入到患者的淋巴系統中，所述組合物優選地定向於淋巴管，淋巴結，脾或淋巴系統其他適合的部分。在一些實施方案中，將每種成分作為丸劑施用。在其他實施方案中，一種或多種成分通過輸注遞送，通常經過幾小時到幾天。優選地，通過向所述結插入導管或針將所述組合物定向於淋巴結，如腹股溝或腋結，並在該遞送過程中保持該導管或針。可獲得的適合的針或導管由金屬或塑料(例如，聚氨基甲酸酯，聚氯乙烯(PVC)，特氟隆(TEFLON)，聚乙烯，等)製成。例如，在向腹股溝結插入導管或針時，利用Vial0nTMInSyteWTM插管和24G3/4的導管(BectonDickinson,美國)在超聲波掃描法控制下穿刺腹股溝結，其中所述插管和導管是利用Tegaderm透明敷料(TegadermTM,St.Paul,MN,美國)固定的。這個步驟通常由經驗豐富的放射線學者進行。通過立刻且明顯地增大了淋巴結的尺寸的最小體積鹽水的注射來證明該導管尖端在腹股溝淋巴結內的位置。後面的步驟容許證明所述尖端在結內。可進行這個步驟從而確證所述尖端沒有滑出淋巴結，並且可在植入導管後不同天數重複該步驟。在所述尖端的確滑出淋巴結內位置的情形中，可以植入新的導本發明的治療組合物可以以這樣的方式施用於患者，所述方式與標準疫苗遞送方法一致，所述標準疫苗遞送方法是本領域普通技術人員所熟知的。本發明包含TuAA的質粒和肽或肽類似物的免疫原性組合物的施用方法包括，但不限於透皮，結內，結周(perinodal)，經口，靜脈內，皮內，肌肉內，腹膜內和黏膜施用，通過注射或滴注或吸入遞送。一種對激發CTL應答特別有效的疫苗遞送方法公開於澳大利亞專利號739189;美國專利號6,994,851和6，977,074中，二者均題為"AMETHODOFINDUCINGACTLRESPONSE"o在向受試者遞送或施用免疫原性組合物中，需要考慮多種參數。另外,可以使用劑量方案和免疫計劃表。通常所述治療組合物中成分的含量從患者到患者和從抗原到抗原變化，這依賴於這樣的因素如抗原在誘導應答中的活性；淋巴經過患者系統的流速；受試者的體重和年齡；治療的疾病和/或病症的類型；疾病或病症的嚴重性；先前或同時的治療幹涉；個體免疫系統合成抗體的能力；所需保護的程度；施用的方式，等，以上全部可由實施者輕而易舉地確定。通常，所述治療組合物可以約l-約500微升/小時或約24-約12000微升/天的速度遞送。所述抗原的濃度是這樣的從而使在24小時中遞送約0.1微克-約10，000微克所述抗原。所述流速基於這樣的知識，即每分鐘大約約100-約1000微升淋巴液流經成熟腹股溝淋巴結。其目的是最大化疫苗製劑在淋巴系統中的局部濃度。一些對患者的經驗研究可能對確定給定的疫苗製劑在人中最有效的輸注水平是必要的。在特別的實施方案中，本發明的免疫原性組合物可以多個連續劑量進行施用。該多個劑量，根據需要，可以是2，3，4，5，6或更多劑量。在本發明的另一個實施方案中，預期可將所述免疫原性組合物的劑量在彼此間隔約幾秒鐘或幾分鐘內施用於右側或左側腹股溝淋巴結內。例如，可將所述質粒(激活)首次注射到右側淋巴結內，隨後在幾秒鐘或幾分鐘內將第二質粒注射到左側腹股溝淋巴結內。在其他情形中，可施用一種或多種表達一種或多種免疫原的質粒的組合。優選地，在首次注射入淋巴結後的隨後注射是在首次注射的約1,2，3,4，5，6,7，8,9，10或更多分鐘內，但不超過約30,40，50或60分鐘內進行的。相似的考慮適用於將兩種肽分別施用於右側和左側淋巴結。可能需要以數天間隔施用多個劑量的本發明的免疫原性組合物，其中在隨後施用之間間隔若干天(l,2，3,4,5，6或7,或更多天)。在其他情形中，本發明組合物的隨後施用可能需要在最初劑量施用後約1,2，3或更多周內或在約1,2,3或更多月內通過兩側腹股溝淋巴結注射進行施用。施用可以以與所述劑量製劑相容的任意方式並以這樣的量如治療有效量來進行。本發明免疫原性組合物的有效量或劑量是在待治療的受試者中提供所需應答所需要的量。V.實施例以下實施例被包括進來，從而證明本發明優選的實施方案。本領域中的那些技術人員將理解後面的實施例中公開的方法學代表發明人發現的在實施本發明中起到良好的作用的方法學，並由此可以考慮其構成本發明實施的優選模式。然而，本領域中的那些技術人員根據本公開內容，將理解對具體公開的實施方案可作出許多改變，並仍然得到在本發明精神和範圍內的相同或相似的結果。實施例1實驗方法動物因為針對人T細胞表位的免疫應答由於其固有的MHC限制性免疫性，不能在最初的非臨床模型中進行研究，所以選擇了經遺傳處理的小鼠模型，該小鼠模型表達在人群中頻繁表達的人A*0201基因(Pascolo等,1997)。與免疫缺陷小鼠(異種移植模型的基礎)相反，所述A+0201轉基因模型(HHD)是免疫感受態的，因此容許對活性免疫治療策略的評估。由此，在這些研究中使用了8-12周齡的雌性H-2I類-陰性(敲除)HLA-A2.1轉基因HHD小鼠。將該動物詞養在無病原體條件下。方法學在實施例2-6中對二價pSEM質粒(非複製重組DNA)和pBPL二價質粒關於激活Tcl(Y幹擾素產生的)免疫應答的能力進行了評估，其中34所述二價pSEM質粒編碼腫瘤相關抗原Melan-A26.35(SEQIDNO.9)和酪氨酸酶369-377(SEQIDNO.10)，所述pBPL二價質粒編碼腫瘤相關抗原SSX-24M9(SEQIDNO.l)禾卩NY-ESO-l157.165(SEQIDNO.2)。使用了Melan-A26-35(A27Nva;ENvaAGIGILTV(SEQIDNO.ll))肽類似物，酪氨酸酶369.377(V377Nva;YMDGTMSQNva(SEQIDNO.12))肽類似物，NY-ESO-l157.165(L158Nva,C165V;S(Nva)LMWITQV(SEQIDNO.6》肽類似物和SSX-24M9(A42V;KVSEKIFY(SEQIDNO.5))肽類似物進行隨後的加強。在臨床緩衝液(127mMNaCl，2.5mMNa2HP04,0.88mMKH2P04,0.25mMNa2EDTA,0.5%ETOH，在水中)中配製質粒。在PBS中配製濃度為1.0mg/ml的MelanA26.35(A27Nva)(SEQIDNO.ll)類似物。相似地，在PBS中配製濃度為1.0mg/ml的酪氨酸酶369.377(V377Nva)(SEQIDNO.12)類似物。在PBS中配製濃度為1.0mg/ml的SSX-24M9(A42V)(SEQIDNO.5)類似物，而在含有5%DMSO的PBS中配製濃度為0.5mg/ml的用於免疫的NY-ESO-l157—165(L158Nva,C165V)(SEQIDNO.6)肽類似物。利用BDFACSCalibur流式細胞儀收集細胞計量數據，並利用CellQuest軟體通過控制(gating)淋巴細胞群進行分析。質粒和肽的結內遞送通過在該研究的第l、4、15、18、29、32、49和53天的兩側腹股溝結內注射施用該劑量製劑。通過吸入異氟垸麻醉小鼠，並在無菌條件下進行手術。手術準備完成後，在腹股溝褶中切開一個0.5-lcm的切口，以暴露腹股溝淋巴結。利用0.5mL胰島素注射器將最大體積25UL(lmg/mL的溶液中的25ug)的質粒或肽直接注射到右側和左側腹股溝淋巴結中。用無菌6.0尼龍皮膚縫線封閉該切口。質粒(激活)服(加強)免疫計劃表如上所述，向兩側腹股溝淋巴結施用pSEM/pBPL混合物(100ng/天)，來免疫3組雌性HHD動物。組1(11=10隻小鼠)在第1，4，15,18,28,32，49和53天接受質粒注射；組2和組3(n=25隻小鼠/組)分別在第1，4,1535和18天接受質粒注射，如表2中所顯示(見下)。在第28，32，49和53天，在右側淋巴結使用酪氨酸酶V377Nva(SEQIDNO.12)(25tig/天)禾卩在左側淋巴結使用SSX-2A42V(SEQIDNO.5)(25ug/天)肽來加強來自組2的動物。在第28和32天，在右側淋巴結使用酪氨酸酶V377Nva(SEQIDNO.12)(25Pg/天)和在左側淋巴結使用SSX-2A42V(SEQIDNO.5)(25ug/天)肽來加強來自組3的動物，然後在第49和53天，在右側淋巴結使用NY-ESO-1L158Nva，C165V(SEQIDNO.6)(12.5iig/天)和在左側淋巴結使用MdanAA27Nva(SEQIDNO,U)(25yg/天)肽來加強來自組3的動物，也如表2中所示。表2.免疫計劃表tableseeoriginaldocumentpage36四聚體分析CDS+抗原特異性T細胞的計數需要I類MHC服複合物對T細胞受體(TCR)的同源識別。這可以通過利用I類MHC四聚體實現，所述I類MHC四聚體由4個HLAMHCI類分子的複合物組成，其中每個HLAMHCI類分子與特異性肽結合併與螢光蛋白綴合。因此，四聚體測定容許定量總T細胞群，該T細胞群特異於複合在特定MHC分子中的給定肽。在對細胞和適當的T細胞受體的結合進行定量中，向標記的四聚體使用了流式細胞術。此外，由於結合不依賴於功能途徑，這個群體不考慮功能狀態，包括所有的特異性CD8+T細胞。在最後一次的質粒(第25天)和肽免疫(第39和60天)之後的7天，在如在以上質粒/肽免疫計劃表中所述免疫的動物中測量了CTL應答。密度離心後，從外周血中分離單核細胞(哺乳動物淋巴細胞分離液(LympholyteMammal)，Cedarlane實驗室)，並用HLA-A*0201SSX-2(KASEKIFYV(SEQIDNO.l))-PEMHC四聚體(BeckmanCoulter,T02001),HLA-A*0201NY-ESO(SLLMWITQC(SEQIDNO.2))-APCMHC四聚體(BeckmanCoulter,T02001),HLA-A*0201MdanA(ELAGIGILTV(SEQIDNO.9))-PEMHC四聚體(BeckmanCoulter,T02001),HLA-A*0201酪氨酸酶(YMDGTMSQV(SEQIDNO.IO))-APC匿C四聚體(BeckmanCoulter,T02001)染色。然後用FITC綴合的大鼠抗小鼠CD8a(Ly-2)單克隆抗體(BDBiosciences,553031)對這些細胞進行共染色。利用BDFACSCalibur流式細胞儀收集數據，並利用Cellquest軟體通過控制淋巴細胞群並計算CD8+CTL群中四聚體陽性細胞的百分比進行分析。幹擾素-Y(IFN-Y)ELISpot測定代替測量細胞毒性，可以通過在ELISPOT測定中測量由特異性效應細胞產生的IFN-Y來評估CD8+CTL應答。在該測定中，將抗原呈遞細胞(APC)固定在微量滴定孔的塑料表面上，並且將效應細胞以多種效應物耙標比率加入其中。APC與抗原特異性效應細胞的結合引發所述效應細胞產生細胞因子，包括IFN-Y。可以對所述細胞進行染色，從而檢測細胞內IFN-Y的存在，並且可以在顯微鏡下對陽性染色的焦點(斑)的數量進行計數。在第27和62天，從安樂死的動物中分離脾，所述動物經歷了上述質粒/肽免疫計劃表。密度離心後(哺乳動物淋巴細胞分離液，Cedarlane實驗室，Burlington,NC)，將該單核細胞重新懸浮於HL-l培養基中。與10ligMelan-A26.35(SEQIDNO.9),酪氨酸酶369隱377(SEQIDNO.),SSX-241.49(SEQIDNO.1)，或NY-ESO-1157.165(SEQIDNO.2)天然肽一起，在96孔濾膜板(多篩IP膜96孔板,Millipore,Boston,MA)的一式三份的孔中，溫育脾細胞(5xl5或3xl5細胞/L)。顯影前，在37。C，5%C0237和100%溼度下溫育樣品42小時。將小鼠IFN-Y包被的抗體(IFN-y抗體對，U-CyTechBiosciences,荷蘭)在與脾細胞溫育前，用作包被試劑，隨後用作伴隨的生物素化的檢測抗體。將來自U-CyTech的GABA綴合物和專有的底物用於進行IFN-Y斑顯影。在顯影后24小時，利用ELISpotReader軟體版本3.2.3，在AID國際板讀數器上測量免疫的動物的CTL應答，其中所述軟體是經過對IFN-Y斑分析校準的。51鉻釋放測定鉻釋放測定是眾所周知的評估CTL活性的測定。簡言之，用鉻的放射性同位素(51Cr)標記在其表面表達抗原的靶細胞。然後將患者的細胞與所述靶細胞混合併溫育幾小時。抗原表達細胞的溶解釋放51Cr到培養基中。通過在存在或缺乏患者效應細胞的條件下比較表達目標抗原或對照抗原的耙細胞的溶解計算細胞特異性溶解，且細胞特異性溶解通常表示為％特異性溶解。實施例2肽加強前用質粒PSEM和PBPL進行免疫這個研究的目的是確定用質粒pSEM和pBPL的免疫是否可以誘導針對4種腫瘤相關抗原SSX-24M9(SEQIDNO.1)，NY-ESO-l157-165(SEQIDNO,2)，Melan-A26.35(SEQIDNO.9)和酪氨酸酶369-377(SEQIDNO.IO)的四價應答。向兩側腹股溝淋巴結使用pSEM/pBPL混合物(100yg/天)，來免疫3組雌性HHD動物(H-2I類-陰性(敲除)HLA-A2.1轉基因HHD小鼠，8-12周齡)。組l(n40隻小鼠)在第1,4,15,18,28,32,49和53天接受質粒注射；組2和組3(n=25隻小鼠/組)分別在第1,4，15和18天接受質粒注射(表2，見上)。在第25天，從所述免疫的動物中收集血液，並且利用如本文別處所討論的四聚體測定進行CD8+T細胞分析。將應答與首次用於實驗的同胎所生對照小鼠(n=5)進行比較。圖1顯示來自於在肽加強前受到pSEM和pBPL二價質粒(n=60)的混合物四次注射激活的動物的四聚體數據，所述二價質粒被設計為分別編38碼Mdan-A26_35(SEQIDNO.9)/酪氨酸酶3,77(SEQIDNO.10)，和NY-ESO-l157-165(SEQIDNO.2)/SSX-24M9(SEQIDNO.1)。如通過四聚體測定所測量到的，受到每日劑量100ug的四次pSEM/pBPL質粒混合物注射激活的動物表現出三價SSX-2,NY-ESO-l和Melan-A應答(組l-3，n=60總共)，但是未能產生任何酪氨酸酶特異性CTL。另外，揭示出Melan-A和NY-ESO-l是分別由所述二價質粒pSEM和pBPL所表達的優勢表位，如圖1中所示。實施例3通過質粒激活的SSX-2/酪氨酸酶的單獨免疫評估在質粒激活後單獨使用次優勢表位肽進行的加強是否足夠獲得四價免疫應答。因此，用次優勢表位酪氨酸酶V377Nva(SEQIDNO.12)和SSX-2A42V(SEQIDNO.5)肽類似物加強來自以上組2的動物，並將免疫應答與首次用於實驗的對照進行比較。用pBPL+pSEM質粒混合物，在第1，4，15和18天(IOOug/天)，在兩側腹股溝淋巴結內，對動物進行激活，隨後進行肽加強，該肽加強由在第28和32天，左側淋巴結中的SSX-24M9A42V(SEQID.NO.l)和右側淋巴結中的酪氨酸酶369-377V377Nva(SEQID.NO.12)(25"g/天)組成。在第39天，即最後一次的肽注射後7天，從所述免疫的動物中收集血液，並利用如本文別處所討論的四聚體測定進行CD8+T細胞分析。圖2顯示在第39天，在所述酪氨酸酶和SSX-2肽加強後當利用四聚體流式細胞術測定，與選定的首次用於實驗的對照動物進行比較時，在3個代表性的免疫動物中產生了來自外周血的四價應答。例如，動物2證明了特異於SSX-2(5.8%),NY-ESO-l(4.1%),酪氨酸酶(8.7%)和MelanA(10.8%)的四聚體應答。將這些數據放在一起，表示包括29.4。/。的總CD8+T細胞所有組成成分的特異性CTL應答。此外，該結果顯示質粒激活後，單獨使用所述次優勢表位肽的加強足以獲得四價免疫應答。實施例4通過質粒激活的SSX-2/酪氨酸酶的免疫為了產生更平衡的四價免疫應答，用所述次優勢肽表位酪氨酸酶369-377(V377Nva)(SEQIDNO.12)和SSX-241.49(A42V)(SEQIDNO.5)加強動物(組2和3，n=50)，並將免疫應答與用pSEM/pBPL質粒混合物加強的動物(組l，n=10)或首次用於實驗的對照(n=10)進行比較。在第39天，即最後一次肽注射後7天，對Melan-A/酪氨酸酶，SSX2/NY-ESO-l四聚體進行了分析(如上所述)。用pBPL+pSEM質粒混合物在第1，4,15和18天(IOOUg/天)，對組1的動物(n=10)進行激活，隨後用pBPL+pSEM質粒混合物，在兩側腹股溝淋巴結內，在第28和32天進行加強(100ug/天)。用pBPL+pSEM質粒混合物，在第1,4，15和18天(100Pg/天)，在兩側腹股溝淋巴結內，對組2和3動物進行激活(11=50),隨後進行肽加強，該肽加強由在第28和32天，左側淋巴結中的SSX241-49A42V(SEQID.NO.5)和右側淋巴結中的酪氨酸酶369-377V377Nva(SEQID.NO.12)(25ug/天)組成。將對於MdanA,酪氨酸酶，SSX2和NY-ESO-l的平均四聚體值與未處理的首次用於實驗的同胎所生的對照(n=5)進行比較，並表示為平均值+/-SEM。圖3顯示與組1(n=10;單獨的質粒)相比，對組2和3(n=50)的酪氨酸酶和SSX-2加強之前和之後的免疫應答。質粒加強後，特優免疫應答是Melan-A和NY-ESO-l特異的(組l)，如圖1中所觀察到的。在另一方面，經過所述質粒混合物激活並經過所述次優勢肽加強的動物的酪氨酸酶應答加強了大於2倍，SSX-2應答加強了大於2.5倍，由此建立了平衡的四價免疫應答，圖3。因此，該數據顯示平衡的四價免疫應答是通過用次優勢表位肽，即酪氨酸酶369-377(V377Nva)(SEQIDNO.12)和SSX-24M9(A42V)(SEQIDNO.5)加強而獲得的。實施例5第一次和第二次肽加強的IFN-YELISPOT分析通過在從組2選擇的動物中測量肽加強後幹擾素Y產生(IFN力細胞的頻率證實了上述實施例中所獲得的四聚體數據。IFN-YELISpot分析在第一肽加強(圖4A)和第二肽加強(圖4B)後進行。如本文別處所述，ELISPOT分析是通過在第41天，即最後一次肽加強後9天，處死代表性動物來進行的。用pBPL+pSEM質粒混合物在第1，4,15和18天(100ug/天)對組1動物(n=3，處死的)進行激活，隨後用pBPL+pSEM質粒混合物，在第28和32天(IOOUg/天)，在兩側腹股溝淋巴結內進行加強。用pBPL+pSEM質粒混合物，在第1,4,15和18天(IOOug/天)，在兩側腹股溝淋巴結內，對組2動物(n=6,處死的)進行激活，隨後進行肽加強，該肽加強由在第28和32天，左側淋巴結中的SSX241.49A42V(SEQID.NO.5)和在右側淋巴結中的酪氨酸酶369_377V377Nva(SEQID.NO.12)(25ug/天)組成。將每個脾中的抗原特異性(MelanA,酪氨酸酶,SSX2,和NY-ESO-l)幹擾素-Y斑形成細胞與未處理首次用於實驗的同胎所生對照(n=3)進行比較，圖4A。第二次肽加強後，通過在第63天，即第二次肽加強後IO天處死代表性動物進行ELISPOT分析。組1動物(n=3，處死的)在第1,4,15,18,28,32,49,禾卩53天(100ug/天)，在兩側腹股溝淋巴結內，接受pBPL+pSEM混合物的注射。組2動物(n=4，處死的)在第1,4,15，和18天(100ug/天)，在兩側腹股溝淋巴結內，接受pBPL+pSEM混合物的注射，隨後進行肽加強，該肽加強由在第28，32，49和53天(25"g/天)，左側淋巴結中的SSX24M9A42V和右側淋巴結中的酪氨酸酶369-377V377Nva組成。組3動物(n=4，處死的)在第1,4,15，和18天(100ug/天)，在兩側腹股溝淋巴結內，接受pBPL+pSEM混合物的注射，隨後進行肽加強和第二次肽加強，所述肽加強由在第28和32天(25ug/天)，左側淋巴結中的SSX2"-49A42V(SEQIDNO.5)和右側淋巴結中的酪氨酸酶369.377V377Nva(SEQIDNO.12)組成；所述第二次肽加強由左側淋巴結中的NY-ESO-l157-165L158Nva，C165V(SEQIDN0.6)(12.5ug，第49和53天)和右側淋巴結中的MelanA26.35A27Nva(SEQIDNO,11)(25ug，第49和53天)組成。將每個脾中的抗原特異性(MelanA，酪氨酸酶，SSX2,和NY-ESO-l)幹擾素-Y斑形成細胞與未處理首次用於實驗的同胎所生對照進行比較，圖4B。圖4A顯示經過所述質粒混合物激活及酪氨酸酶和SSX-2肽加強的動物(組2，n=6)顯示了比經過質粒單獨處理的動物(組1,n=3)高2-8倍的IFNY產生細胞的強烈四價應答。另外，當動物接受次優勢表位肽SSX-2和酪氨酸酶(組2)或優勢表位肽NY-ESO-l和MelanA(組3)任一的第二次加強時，與經過pSEM和pBPL質粒組合單獨激活和加強的動物(組1)相比，維持了四價應答(圖4B)。針對所有四種抗原的更平衡的免疫應答是簡單地通過用次優勢表位類似物SSX-2和酪氨酸酶的加強獲得的。總的說來，由上述實施例(2-5)所獲得的數據描述四價免疫應答成功產生於用本發明的NS和/或MT方案免疫的動物中。在首次用於實驗的動物或用pSEM/pBPL質粒混合物單獨加強的動物(組1)和用次優勢肽表位酪氨酸酶和SSX-2在第28和32天加強的動物(組2和3)的免疫應答(四聚體和IFN-yELISPOT分析)之間的比較證實了四價免疫應答在用該方案免疫的動物中成功產生。在第49和53天的第二次肽加強後獲得了相似的結果，其中組3(n=25)是利用優勢表位肽，即MelanA26-35(A27Nva)(SEQIDNO.Il)和NY-ESO-1157.l65(L158Nva,C165V)(SEQIDNO.6)加強的；組2(11=25)是再次利用次優勢表位肽，即酪氨酸酶369-377(V377Nva)(SEQIDNO.12)和SSX-24M9(A42V)(SEQIDNO.5)加強的。實施例6針對人黑素瘤的免疫應答的產生羧基-螢光素二乙酸酯，琥珀醯亞胺酯(CFSE)測定提供一種用於螢光標記細胞的簡單和靈敏性的方法。該方法容許分析抗原特異性和非特異性T細胞增殖。CFSE方法用於評估免疫方法的功效。對基於其四聚體水平所選擇的動物清除肺中人CFSE標記的黑素瘤腫瘤細胞的能力進行了分析。在第61天，基於高四聚體水平從各個組(組l，2和3)中選擇2隻動物，並用CFSE標記的腫瘤細胞進行靜脈內注射。更明確地，用CFSEhi(VybrantCFDASE細胞追蹤試劑盒，MolecularProbes)螢光(l.OyM，15分鐘)染色人624.38培養的黑素瘤腫瘤細胞(10xl06)，並且與相同比例的由CFSEIo螢光(O.lyM)染色的624.28HLA-A2陰性對照細胞一起對組1，2或3免疫小鼠(N:2/組)或首次用於實驗的HHD小鼠(N=2)進行靜脈內共注射，其中所述人624.38培養的黑素瘤腫瘤細胞表達針對SSX-2,NY-ESO-l，酪氨酸酶和MelanA的全部四種腫瘤相關抗原。動物在2小時後接受靶細胞的第二次注射。在第62天，即靶細胞注射後約14小時，測量人靶細胞特異性消除，該測量是通過處死小鼠，去除肺組織和通過流式細胞術測量CFSEhi相對於CFSEIo的螢光(FL1信道(channd))。用於計算百分數特異性溶解的公式顯示如下。x100圖5顯示來自首次用於實驗的對照(左上版)、具有四價免疫性的2隻動物(右上和左下版)和具有對MdanA單價應答的動物(右下版)的四聚體水平，IFNYELISPOT結果和2個峰CFSE柱狀圖。如所預期，該首次用於實驗的對照動物不能清除所述靶細胞，這通過維持相同比例的兩個柱狀圖峰所證明，如顯示了單價免疫應答的動物中的情形。在另一方面，表現出對所有四種抗原的免疫應答的動物更能清除人黑素瘤腫瘤靶細胞，其具有71%和95%的特異性溶解。實施例7通過原始對比擴展方法產生免疫應答評估用所述質粒Dl(pRP12)和D2(pBPL)的免疫是否可以誘導HHD-1小鼠中針對四種腫瘤相關抗原PSMA288_297(SEQIDNO.4),PRAME425-433(SEQIDNO.3)，SSX-24M9(SEQIDNO.l)和NY-ESO-1157_165(SEQIDNO.2)的四價應答。對兩種不同的加強策略進行了關於它們提高所需免疫應答的能力的測試。第一種方法("原始"方法)在加強過程中利用各種肽的單一注射。第二種方法("擴展"方法)測試了各種肽的兩次注射。在試圖確定劑量-應答關係和幫助定義最佳肽濃度中，測試了各種肽的三種劑量水平(低，中和高)。用質粒Dl和D2直接注射到兩側腹股溝淋巴結中，以免疫6組雌性HHD-1動物，其中10隻/組。用所述"原始"方法加強來自組1-3的動物，用所述"擴展"方法加強組4-6的動物。在"原始方法"中的動物(組1-3，n-10/組)在第1，4，15和18天，接受在右側腹股溝淋巴結中的四次D1(pRP12(SEQIDNO.21))質粒(100ug/劑量)注射和在左側腹股溝淋巴結中的四次D2(pBPL(SEQIDNO.20))質粒(IOOIXg/劑量)注射。隨後在第29天，進行用PSMA288.297(I297V)(SEQIDNO.8)在右側淋巴結中和SSX-24M9(A42V)(SEQIDNO.5)在左側淋巴結中的加強，以及在第32天，進行用PRAME425.433(L426Nva，L433Nle)(SEQIDNO.7)在右側淋巴結中和NY-ESO-l157.165(L158Nva，C165V)(SEQIDNO.6)在左側淋巴結中的加強。在"擴展方法"中的動物(組4-6，『lO/組)在第1,4，15和18天，接受在右側腹股溝淋巴結中的四次D1(pRP12(SEQIDNO.21))質粒(100ug/劑量)注射和在左側腹股溝淋巴結中的四次D2(pBPL(SEQIDNO.20))質粒(IOOyg/劑量)注射。隨後在第29和32天，對該動物進行用PSMA288.297(I297V)(SEQIDNO.8)在右側淋巴結中和SSX-24M9(A42V)(SEQIDNO.5)在左側淋巴結中的加強，以及在第43和46天，進行用PRAME425_433(L426Nva,L433Nle)(SEQIDNO,7)在右側淋巴結中和NY-ESO-l157—165(L158Nva,CI65V)(SEQIDNO.6)在左側淋巴結中的加強。在兩種方法中，最後一次肽加強後7天，從各個組收集血液，並利用四聚體測定進行CD8+T細胞分析(圖6)。將應答與首次用於實驗的同胎所生對照小鼠(n=5)進行比較。圖6中顯示了比較由低、中和高肽加強組成的原始和擴展方法的SSX-2,NY-ESO-l，PRAME和PSMA的四聚體值。用Dl和D2質粒的四次注射激活並隨之用肽類似物PSMA，PRAME,NY-ESO-l和SSX-2加強的動物顯示了對全部四種抗原的免疫應答，正如四聚體分析(圖6)所評估的，對PRAME和PSMA的免疫應答佔優勢。另外，在單獨動物中顯示了通過該免疫策略所激發的四價免疫應答(圖7)。觀察到該應答不依賴於加強方案(原始的對比擴展的)。另外，儘管各個治療方法中的高劑量組(25yg肽)產生最高應答率，但是沒有觀察到明顯的劑量-應答關係。而且，該四聚體數據說明PRAME和PSMA是該動物免疫後的優勢表位。實施例8原始對比擴展方法的免疫應答的IFN-yELISPOT為了證實用所述四聚體測定所觀察到的結果，進行了幹擾素-Y(IFN-力ELISpot測定。來自實施例7中各組的動物在最後肽加強後22天後被處死，並取下脾進行IFN-yELISPOT分析。在第68天從被安樂死的動物中分離脾，並在密度離心後(哺乳動物淋巴細胞分離液，Cedarlane實驗室，Burlington,NC)，將單核細胞重新懸浮於HL-1培養基中。用10UgPSMA288_297(SEQIDNO.4),PRAME425-433(SEQIDNO.3)，SSX-24M9(SEQIDNO.1)，或NY-ESO-l157.165(SEQIDNO.2)，天然肽，在96孔濾膜板(多篩IP膜96孔板，Millipore,MA)的一式三份的孔中，溫育脾細胞(3xK)s或1.5xls細胞/孔)。顯影前，在37。c，5%(302和100。/。溼度溫育樣品72小時。將小鼠IFN-y包被的抗體(IFN-y抗體對，U-CyTechBiosciences,荷蘭)在與脾細胞溫育前，用作包被試劑，隨後用作伴隨的生物素化的檢測抗體。將來自U-CyTechBiosciences的GABA綴合物和專用的底物用於IFN-y斑顯影。在顯影后24小時，利用ELISpotReader軟體版本3.2.3，在AID國際板讀數器上測量被免疫的動物的CTL應答，其中所述軟體是經過對IFN-y斑分析校準的。圖7中顯示的IFNYELISPOT結果與所述四聚體數據(圖6)良好地關聯，並且證明了通過所述"原始"治療方法所激發的對PRAME425.433(SEQIDNO.3),PSMA288.433(SEQIDNO.4)，SSX-24M9(SEQIDNO.l)和NY-ESO-l157.165(SEQIDNO.2)的強烈的免疫應答。所述"擴展"方法，如通過IFN-yELISPOT分析的，似乎並沒有提供任何超越所述"原始"方法的明顯優勢。實施例9通過所述PP/NS治療方案所產生的四價免疫應答評估四價免疫應答是否可以通過用次優勢表位PSMA和SSX-2的第一次加強及再用優勢表位PRAME和NY-ESO-l加強來引發。來自組l("原始"方案，高劑量)的代表性動物在第1,4，15和18天，接受在右側腹股溝淋巴結中的四次D1(pRP12(SEQIDNO.21))質粒(100yg/劑量)注射和在左側腹股溝淋巴結中的四次D2(pBPL(SEQIDNO.20))質粒(100ug/劑量)注射。隨後在第29天，對該動物用肽，即PSMA288.297(I297V)(SEQIDNO.8)在右側淋巴結中(25ug)和SSX-241.49(A42V)(SEQIDNO.5)在左側淋巴結中(25lig)進行加強，以及在第32天，用PRAME425-433(L426Nva，L433Nle)(SEQIDNO.7)在右側淋巴結中(20"g)和NY-ESO-h謂(L158Nva，C165V)(SEQIDNO.6)在左側淋巴結中(25ug)進行加強。數據(圖8)顯示通過兩種獨立的測定，即四聚體和ELISpot分析所測量的四價免疫應答。實施例1051鉻-釋放測定測量對PRAME.，PSMA,NY-ESO和SSX-2的CTL活性利用"Cr細胞毒性測定，評估了在免疫小鼠中，經過DNA激活和肽加強以及一輪體外刺激後，對PRAME425—433(SEQIDNO.3)，PSMA288—297(SEQIDNO.4),NY-ESO-1157—165(SEQIDNO.2)和SSX-24M9(SEQIDNO.l)的CTL應答。CTL是通過脾細胞的離體刺激產生的，所述脾細胞是在所述肽免疫方案完成後22天從免疫小鼠(N=6)中獲得的。簡言之，處死小鼠並取下脾。將脾進行勻漿，並過濾該細胞混懸液從而產生單細胞混懸液。將5xle細胞/孔的量塗布在24孔組織培養板中，並將1.5xl(f個經肽脈衝輸送(peptide-pulsed)，y照射和LPS(脂多糖)損傷(blast)的B細胞加入到每個孔中。還將小鼠重組IL-2以濃度lng/ml加入其中。對於PRAME組，溫育該細胞4天；對於PSMA,SSX-2和NY-ESO-1組各溫育6天。在離體的刺激後，從所述板收集CTL，洗滌並塗布到96孔U形底微量滴定測定板中，其濃度為在總體積100的每孔中106,3.3xl05,和1.bd0S細胞/L。為了評估肽特異性溶解，用"Cr標記T2細胞，並用20g/mL的各種肽(SSX-2，NY-ESO-1,PSMA,或PRAME)在37'C脈衝1.5小時。溫育後，洗漆並重新懸浮所述細胞。將10，000個51Cr標記的和肽脈衝的T2細胞加入到每個孔中。再在37'C溫育所述細胞4小時。溫育後，收集上清液，並利用y計數器測量一式三份的樣品中的細胞溶解活性。利用每個重複孔的平均cpm，對每個效應細胞濃度計算了校正的百分比溶解(圖8)。利用如下公式計算百分比特異性溶解百分比釋放=100X(實驗釋放-自發釋放)/(最大釋放-自發釋放)。數據如下表示X軸顯示效應物與耙標的比率；y軸顯示相應的百分比特異性溶解。結果(圖8)顯示對來自每個組針對T2細胞的關於CTL的"鉻釋放測定(CRA)數據，其中所述T2細胞經過作為靶標的PRAME425-433(SEQIDNO.3)(版l)，PSMA288_297(SEQIDNO.4)0^2)，NY-ESO-l157.165(SEQIDN0.2)(版3),或SSX-24M9(SEQIDNO.1)(版4)肽的脈衝輸送(pulsed)。對其特異性溶解值與未脈衝輸送的T2對照細胞進行比較。考慮到ELISA分析(數據未顯示)說明所述PRAME組的免疫原性非常強，且為了避免抗原誘導的細胞死亡，在4天IVS流程後，進行對所述PRAME組的CRA。對於其他肽組，該CRA在6天IVS後進行。發現在體外再刺激後，從所有免疫組所分離的T細胞，與來自首次用於實驗的動物的那些相反，特異性地殺死用肽脈衝輸送的T2細胞。如通過51Cr細胞毒性測定所評估的，在所有組中誘導了CTL對PRAME425_433(SEQIDNO.3)，PSMA288-297(SEQIDNO.4)，SSX-24.49(SEQIDNO.l)和NY-ESO-h詣(SEQIDNO.2)應答。這些CTL對無肽的T2對照細胞沒有作用。該結果證明了通過從免疫小鼠分離的CTL的T2靶細胞溶解是肽特異性的。與所述"原始"方法相比，所述"擴展"方法沒有提供顯著提高的溶解百分比，這進一步暗示了所述"原始"方法足以引發針對多抗原的基本免疫應答。而且，由於所述CRA測定增加的靈敏性，與所述四聚體和ELISPOT測定相比，來自其各組的特異性NY-ESO-l應答更普遍。實施例11使用多治療周期評估用質粒Dl(pRP12(SEQIDNO.21))和D2(pBPL(SEQIDNO.20))是否可以在多於一個周期的本發明治療方案後，在針對四種腫瘤相關抗原的HHD-1小鼠中，維持強烈的免疫應答，其中所述四種腫瘤相關抗原是PSMA288—297(SEQIDNO,4),PRAME425.433(SEQIDNO.3),SSX-241.49(SEQIDNO.1)，禾口NY-ESO-l。w65(SEQIDN0.2)。用質粒Dl和D2直接向兩側腹股溝淋巴結注射，並隨後用PSMA288-297(SEQIDNO.4),PRAME425_433(SEQIDNO.3),SSX-241—49(SEQIDNO.1),和NY-ESO-l157.165(SEQIDNO.2)對其進行肽加強，從而免疫雄性和雌性HHD-1小鼠。在第1，4，15和18天，動物在右側腹股溝淋巴結中接受四次D1(pRP12(SEQIDNO.21))質粒注射和在左側腹股溝淋巴結中接受四次D2(pBPL(SEQIDNO.20))質粒注射。隨後在第29天，對該動物用PSMA288.297(I297V)(SEQIDNO.8)在右側淋巴結中和SSX-24M9(A42V)(SEQIDNO.5)在左側淋巴結中進行加強，以及在第32天，用PRAME425.433(L426Nva,L433Nle)(SEQIDNO.7)在右側淋巴結和NY-ESO-l157.165(L158Nva,C165V)(SEQIDNO.6)在左側淋巴結中進行加強。在14天休息期後重複該第二激活(質粒)/加強(肽)治療周期。用質粒載體(N=16隻動物/組)；肽載體(N=16隻動物/組)；高劑量質粒(400ug總劑量)(N=16隻動物/組)；高劑量(25ug總劑量)肽(N46隻動物/組)；高劑量質粒(400lig總劑量)+低劑量肽(5ug總劑量)(N=16隻動物/組)；低劑量質粒(100yg總劑量)+高劑量肽(25ug總劑量)(N=14隻動物/組)；或高劑量質粒(400ug總劑量)+高劑量肽(25ug總劑量)(N=16隻動物/組)對動物進行注射，並與所述幼稚對照組N=7隻動物/組進行比較。在最後肽加強後14天，處死來自每組的動物，並取出脾，進行IFN-YELISPOT分析(圖9)。該數據顯示動物可以在所述PP(PRAME和PSMA)方案和所述NS(NY-ESO-l和SSX-2)方案的兩周期治療方案後產生強烈的免疫應答。總的來說，在實施例7-11中所獲得的數據顯示了在所述PP/NS治療免疫方法後，顯著的T細胞，而非顯著的抗體應答。在一個完整治療周期後，利用ELISA測定，在免疫小鼠的血清中沒有檢測到肽特異性抗體(數據未顯示)。此外，抗原特異性T細胞應答包含關於PRAME和PSMA前導(leading)和SSX-2和NY-ESO-l追蹤(trailing)的以量級表示的效應和記憶T細胞(IFNY細胞因子產生，細胞溶解和四聚體結合)。另外該結果說明了儘管擴展該治療方法可能不能獲得更高的T細胞免疫性，但是在治療周期內可能需要相對於優勢肽的次優勢肽的重新安排以提高針對NY-ESO-l或任何其他次優勢表位的免疫性。除了已在本申請中公開的那些，特此明確地將以下每篇整體引入本文作為參考。利用所公開的類似物在誘導、引發、維持、調節和增強I類MHC限制性T細胞應答，以及對抗原的特定效應和記憶CTL應答中的有效方法在如下各篇中有所描述美國專利號6,994,851(2〃/06)和6,977,074(12/20/2005)，二者均題為"AMethodofInducingaCTLResponse(誘導CTL應答的方法)"；在2003年6月17日提交的美國臨時申請號60/479,393，題為"METHODSTOCONTROLMHCCLASSI-RESTRICTEDIMMUNERESPONSE(控制I類MHC限制性免疫應答的方法)"；和美國專利申請號10/871,707(公開號20050079152)和在2004年12月29日提交的臨時美國專利申請號60/640,402，二者均題為"Methodstoelicit,enhanceandsustainimmuneresponsesagainstMHCclassI-restrictedepitopes,forprophylacticortherapeuticpurpose(用於預防或治療目的的激發、增強和維持針對I類MHC限制性表位的免疫應答的方法)"。所述類似物還可以用於研究，從而獲得進一步優化的類似物。在以下各篇中提供了大量管家表位2002年4月4日提交的美國申請號10/117,937(公開號20030220239Al)，禾P10/657,022(20040180354)，禾B2003年9月5日提交的PCT申請號PCT/US2003/027706(公開號WO04022709A2);和2001年4月6日提交的美國臨時申請號60/282，211;2001年11月7日提交的60/337,017;2002年3月7日提交的60/363,210;和2002年9月5日提交的60/409,123;以上每個申請均題為"EpitopeSequences(表位序列)"。所述類似物可以進一步用在任何在以下申請中所描述的多種模式中。在2000年4月28曰提交的美國專利申請號09/561,571中公開並更完整地定義了表位簇，其可以包含或包括所述本發明的類似物，其題為EPITOPECLUSTERS(表位簇)。使用和遞送所述本發明類似物的方法在以下各篇中描述美國專利申請號09/380,534和6977074(2005年12月20日授權)和PCT申請號PCTUS98/14289(公開號WO9902183A2)，均題為"METHODOFINDUCINGACTLRESPONSE(誘導CTL應答的方法)"。在以下各篇中公開了用於這樣的免疫治療劑的有益表位的選擇原則2000年4月28日提交的美國專利申請號09/560,465,2001年12月7日提交的10/026,066(公開號20030215425Al)，和2001年11月7日提交的10/005,905，全部題為"EpitopeSynchronizationinAntigenPresentingCells(抗原呈遞細胞中的表位同步化)";6,861,234(2005年3月1日授權的；app.#09/561,074)，題為"MethodofEpitopeDiscovery(表位發現方法)";2000年4月28日提交的09/561,571，題為EPITOPECLUSTERS(表位簇);2002年3月7日提交的10/094,699(公開號20030046714Al)，題為"Anti-NeovasculaturePreparationsforCancer(用於癌症的抗新脈管系統製劑)"；2002年4月4日提交的申請號10/117,937(公開號20030220239Al)禾口PCTUS02/11101(公開號WO02081646A2)，均題為"EPITOPESEQUENCES(表位序列)"；和2003年9月5日提交的申請號10/657,022和PCT申請號PCT/US2003/027706(公開號WO04022709A2)，均題為"EPITOPESEQUENCES(表位序列)"。在以下各篇中公開了疫苗質粒總體設計的各個方面2000年4月28日提交的美國專利申請號09/561,572，題為"ExpressionVectorsEncodingEpitopesofTarget-AssociatedAntigens(編碼耙標相關抗原表位的表達載體)"和2002年11月7日提交的10/292,413(公開號20030228634Al)，題為"ExpressionVectorsEncodingEpitopesofTarget-AssociatedAntigensandMethodsfortheirDesign(編碼革巴標相關抗原表位的表達載體以及它們的設計方法)"；2002年8月20日提交的10/225,568(公開號2003-0138808)，2003年8月19日提交的PCT申請號PCT/US2003/026231(公開號WO2004/018666)，均題為"EXPRESSIONVECTORSENCODINGEPITOPESOFTARGET-ASSOCIATEDANTIGENS(編碼靶標相關抗原表位的表達載體)"；和美國專利號6,709,844，題為"AVOIDANCEOFUNDESIRABLEREPLICATIONINTERMEDIATESINPLASMIDPROPAGATION(在質粒增殖中避免不需要的複製中間體)"。在以下各篇中公開了在指導針對特定癌症的免疫應答中特別受益的特異性抗原組合2003年6月17日提交的臨時美國專利申請號60/479,554和2004年6月17日提交的美國專利申請號10/871,708和PCT專利申請號PCTYUS2004/019571(公開號WO2004/112825)，均題為"Combinationsoftumor-associatedantigensinvaccinesforvarioustypesofcancers(用於多種類型癌症的疫苗中腫瘤相關抗原的組合)"。與腫瘤新脈管系統相關的抗原(例如，PSMA,VEGFR2，Tie-2)也有效用於癌疾病，如公開於2002年3月7日提交的美國專利申請號10/094,699(公開號20030046714Al)，其題為"Anti-NeovasculaturePreparationsforCancer(用於癌症的抗新脈管系統製劑)"。通過生物應答調節劑的靶向施用觸發、維持和調控免疫應答的方法公開於2004年12月29日提交的美國臨時申請號60/640,727中。在誘導免疫應答中繞開CD4+細胞的方法公開於2004年12月29日提交的美國臨時申請號60/640,821中。示範性疾病，生物以及與靶生物、細胞和疾病相關的抗原和表位描述於2001年2月2日提交的美國申請號6977074(2005年12月20日授權)中，其題為"METHODOFINDUCINGACTLRESPONSE(誘導CTL應答的方法)"。示範方法學見於2004年6月17日提交的美國臨時申請號60/580,969和2006年1月12日公開的美國專利申請號2006-0008468-A1中，二者均題為"COMBINATIONSOFTUMOR-ASSOCIATEDANTIGENSINDIAGNOTISTICSFORVARIOUSTYPESOFCANCERS(用於多種類型癌症的診斷劑中腫瘤相關抗原的組合)"。方法學和組合物也公開於2004年12月29日提交的美國臨時申請號60/640,598中，其題為"COMBINATIONSOFTUMOR-ASSOCAITEDANTIGENSINCOMPOSITIONSFORVARIOUSTYPESOFCANCER(用於多種類型癌症的組合物中腫瘤相關抗原的組合)"。在以下各篇中更完整地討論了用於評估和監測包括利用本發明類似物的免疫方法的免疫應答性的診斷技術的綜合2004年6月17日提交的臨時美國專利申請號60/580,964和2005年12月29日公開的美國專利申請號US-2005-0287068-Al，二者均題為"Improvedefficacyofactiveimmunotherapybyintegratingdiagnosticwiththerapeuticmethods(通過利用治療方法整合診斷劑提高主動免疫療法的功效)"。編碼免疫原性多肽的載體公開於以下各項中2002年11月7日提交的美國專利申請號10/292,413(公開號20030228634Al)，題為ExpressionVectorsEncodingEpitopesofTarget-AssociatedAntigensandMethodsfortheirDesign(編石馬耙標相關抗原表位的表達載體以及它們的設計方法)，和2005年6月17日提交的美國臨時申請號60/691,579，題為"Methodsandcompositionstoelicitmultivalentimmuneresponsesagainstdominantandsubdominantepitopes,expressedoncancercellsandtumorstroma(激發針對表達在癌症細胞禾口月中瘤基質上的優勢和次優勢表位的多價免疫應答的方法和組合物)"。在2005年6月17日提交的美國臨時申請號60/691,581中發現了其他有用的公開內容，包括有關的方法和組合物，其題為"MultivalentEntmin-and-AmplifyImmunotherapeuticsforCarcinoma(用於癌的多價引發-和-增強免疫治療劑)"。其他方法學、組合物、肽和肽類似物公開於2004年6月17日提交的美國臨時申請號60/581,001和60/580,962中，二者分別題為"SSX-2PEPTIDEANALOGS(SSX-2肽類似物)"和"NY-ESOPEPTIDEANALOGS(NY-ESO肽類似物)"。將以上段落中所提及的每篇申請和專利教導的全部內容在此整體引入作為參考。另外的類似物，肽和方法公開於以下各篇中美國專利申請公開號20060063913，其題為"SSX-2PEPTIDEANALOGS(SSX-2肽類似物)"；和2006年3月16日公開的美國專利公開號2006-0057673Al，其題為"EPITOPEANALOGS(表位類似物)";和PCT申請公開號WO/2006/009920，其題為"EPITOPEANALOGS(表位類似物)"；以上各篇均在2005年6月17日提交。進一步的方法學和組合物公開於以下各篇中2004年6月17日提交的美國臨時申請號60/581,001，其題為"SSX-2PEPTIDEANALOGS(SSX-2肽類似物)"，和2004年6月17日提交的美國臨時申請號60/580,962，其題為"NY-ESOPEPTIDEANALOGS(NY-ESO肽類似物)"，將二者中每篇在此整體引入作為參考。作為實例，而不受其限制，將每篇所教導的內容都在此引入作為參考，所述內容關於I類MHC限制性表位，類似物，類似物的設計，表位和類似物的使用，使用和製備表位的方法，和設計和使用核酸載體進行它們的表達。明確地在此引入作為參考的其他申請是2005年6月17日提交的美國專利申請系列號11/156,253(公開號20060063913)，題為"SSX-2PEPTIDEANALOGS(SSX-2肽類似物)"；2005年6月17日提交的美國專利申請系列號11/155,929，題為"NY-ESO-lPEPTIDEANALOGS(NY-ESO畫l肽類似物)"(公開號20060094661);2005年12月29日提交的美國專利申請系列號11/321,967，題為"METHODSTOTRIGGER,MAINTAINANDMANIPULATEIMMUNERESPONSESBYTARGETEDADMINISTRATIONOFBIOLOGICALRESPONSEMODIFIERSINTOLYMPHOIDORGANS(通過生物應答調節劑向淋巴器官的耙向施用觸發、維持和調控免疫應答的方法"；2005年12月29日提交的美國專利申請系列號11/323,572，題為"METHODSTOELICITENHANCEANDSUSTAINIMMUNEREPONSESAGAINSTMCHCLASSIRESTRICTEDEPITOPES,FORPROPHYLACTICORTHERAPEUTICPURPOSES(用於預防或治療目的的激發、增強和維持針對I類MHC限制性表位的免疫應答的方法)";2005年12月29日提交的美國專利申請系列號11/323,520，題為"METHODSTOBYPASSCD4+CEIXSINTHEINDUCTIONOFANIMMUNERESPONSE(在誘導免疫應答中繞過CD4+細胞的方法)"；2005年12月29日提交的美國專利申請系列號11/323,049，題為"COMBINATIONOFTUMOR-ASSOCIATEDANTIGENSINCOMPOSITIONSFORVARIOUSTYPESOFCANCERS(用於多種類型癌症的組合物中腫瘤相關抗原的組合)"；2005年12月29日提交的美國專禾U申請系歹(J號11,323,964，題為"COMBINATIONSOFTUMOR-ASSOCIATEDANTIGENSINDIAGNOSTICSFORVARIOUSTYPESOFCANCERS(用於多種類型癌症診斷中的腫瘤相關抗原的組合)";2005年6月17日提交的美國臨時申請系列號60/691,889，題為"EPITOPEANALOGS(表位類似物)"。權利要求1.一種免疫原性產品，其包括多種組合物，所述組合物包括一種或多種核酸組合物，和一種或多種肽組合物；其中所述一種或多種核酸組合物可以表達一種或多種I類MHC限制性表位或其類似物，其選自由下列各項組成的組SSX-1表位，NY-ESO-1表位，PRAME表位，PSMA表位，酪氨酸酶表位和Melan-A表位；其中所述一種或多種肽組合物基本由所述一種或多種I類MHC限制性表位或其類似物組成，其選自由下列各項組成的組SSX-1表位，NY-ESO-1表位，PRAME表位，PSMA表位，酪氨酸酶表位和Melan-A表位；並且其中所述一種或多種肽對應於由所述選定的核酸所表達的表位。2.權利要求1的免疫原性產品，其中所述一種或多種核酸組合物包括質粒，所述質粒選自由下列各項組成的組pSEM,pBPL和pRP12。3.權利要求1的免疫原性產品，其中所述一種或多種肽組合物包括肽，所述肽選自由下列各項組成的組SSX-241-49(SEQIDNO.1),其類似物KVSEKIFYV(SEQIDNO.5);NY-ESO-l157.165(SEQIDNO.2),其類似物SNvaLMWITQV(SEQIDNO.6);PRAME425.433(SEQIDNO.3)，其類似物S(Nva)LQHLIG(Nle)(SEQIDNO.7);PSMA288.297(SEQIDNO.4),其類似物GLPSIPVHPV(SEQIDNO.8);Melan-A26—35(SEQIDNO.9)，其類似物ENvaAGIGILTV(SEQIDNO.11);酪氨酸酶369.377(SEQIDNO.10)，和其類似物YMDGTMSQNva(SEQIDNO.12)。4.權利要求l的免疫原性產品，其中所述多種組合物包括a)能表達SSX-2I類MHC限制性表位或其類似物的核酸分子；b)能表達NY-ESO-lI類MHC限制性表位或其類似物的核酸分子；c)能表達PRAMEI類MHC限制性表位或其類似物的核酸分子；d)能表達PSMAI類MHC限制性表位或其類似物的核酸分子；e)基本上由所述SSX-2表位或其類似物組成的肽；f)基本上由所述NY-ESO-l表位或其類似物組成的肽；g)基本上由所述PRAME表位或其類似物組成的肽；和h)基本上由所述PSMA表位或其類似物組成的肽。5.權利要求4的產品，其中a)和b)的核酸分子是所述相同組合物的一部分。6.權利要求5的產品，其中所述核酸分子相同。7.權利要求6的產品，其中所述核酸分子包括編碼pBPL的釋放序列(SEQIDNO.13)的序列。8.權利要求7的產品，其中所述核酸包括編碼pBPL的免疫原性多肽(SEQIDNO.16)的序列。9.權利要求8的產品，其中所述核酸分子是pBPL(SEQIDN0.20)。10.權利要求4的產品，其中c)和d)的核酸分子是所述相同組合物的一部分。11.權利要求10的產品，其中所述核酸分子相同。12.權利要求10的產品，其中所述核酸分子包括編碼pRP12的釋放序列(SEQIDNO.14)的序列。13.權利要求12的產品，其中所述核酸包括編碼pRP12的免疫原性多肽(SEQIDNO.17)的序列。14.權利要求12的產品，其中所述核酸分子是pRP12(SEQID.21)。15.權利要求1的產品，其中所述SSX-2表位是SSX-241-49(SEQIDNO.1)。16.權利要求l的產品，其中所述NY-ESO-l表位是NY-ESO-"57.i65(SEQIDNO.2)。17.權利要求l的產品，其中所述PRAME表位是PRAME425433(SEQIDNO.3)。18.權利要求l的產品，其中所述PSMA表位是PSMA288.297(SEQIDNO,4)。19.權利要求1的產品，其中所述e)中的SSX-2的類似物是KVSEKIFYV(SEQIDNO.5)。20.權利要求1的產品，其中所述f)中的NY-ESO-1的類似物是SNvaLMWITQV(SEQIDNO.6)。21.權利要求1的產品，其中所述g)中的PRAME的類似物是S(Nva)LQHLIG(Nle)(SEQIDNO.7)。22.權利要求1的產品，其中所述h)中的PSMA的類似物是GLPSIPVHPV(SEQIDNO.8)。23.—種治療癌症的方法，包括向需要其的患者施用權利要求1的產formulaseeoriginaldocumentpage424.權利要求23的方法，其中所述癌症是乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、結腸癌、膀胱癌、肺癌、肝癌、胃癌、睪丸癌、子宮癌、腦癌、淋巴癌、皮膚癌、骨癌、腎癌、直腸癌、黑素瘤、成膠質細胞瘤或肉瘤。25.—種治療癌的方法，包括向需要其的患者施用多種組合物的步驟，所述組合物包括i)能表達SSX-2I類MHC限制性表位或其類似物的核酸分子；ii)能表達NY-ESO-1I類MHC限制性表位或其類似物的核酸分子；iii)能表達PRAMEI類MHC限制性表位或其類似物的核酸分子；和iv)能表達PSMAI類MHC限制性表位或其類似物的核酸分子。26.權利要求25的方法，還包括施用一種或多種肽的步驟，所述肽選自基本由SSX-2,NY-ESO-l，PRAME,和PSMA組成的組的表位或類似27.權利要求l的免疫原性產品，其中所述多種組合物包括i)能表達Melan-AI類MHC限制性表位或其類似物的核酸分子；ii)能表達酪氨酸酶I類MHC限制性表位或其類似物的核酸分子；iii)基本上由所述Melan-A表位或其類似物組成的肽；和iv)基本上由所述酪氨酸酶表位或其類似物組成的肽。28.權利要求27的產品，其中所述i)和ii)的核酸分子是所述相同組合物的一部分。29.權利要求28的產品，其中所述核酸分子是相同的。30.權利要求29的產品，其中所述核酸分子包括編碼pSEM的釋放序列(SEQIDNO.15)的序列。31.權利要求30的產品，其中所述核酸包括編碼pSEM的免疫原性多肽(SEQIDNO.18)的序列。32.權利要求31的產品，其中所述核酸分子是pSEM。33.權利要求27的產品，其中所述Melan-A表位是Melan-A26-35(SEQIDNO.9)。34.權利要求27的產品，其中所述酪氨酸酶表位是酪氨酸酶369-377(SEQIDNO.10)。35.權利要求27的產品，還包括i)能表達SSX-2I類MHC限制性表位或其類似物的核酸分子；和ii)能表達NY-ESO-lI類MHC限制性表位或其類似物的核酸分子。36.權利要求35的產品，還包括基本上由NY-ESO-l表位組成的肽。37.權利要求35或36的產品，還包括基本上由SSX-2表位組成的肽。38.—種治療癌症的方法，包括向需要其的患者施用多種組合物的步驟，所述組合物包括i)能表達Melan-AI類MHC限制性表位或其類似物的核酸分子；ii)能表達酪氨酸酶I類MHC限制性表位或其類似物的核酸分子；iii)基本上由所述Melan-A表位或其類似物組成的肽；和iv)基本上由所述酪氨酸酶表位或其類似物組成的肽。39.權利要求38的方法，其中所述癌症是成膠質細胞瘤。40.權利要求38的方法，其中所述癌症是黑素瘤。41.權利要求38的方法，還包括向需要其的患者施用組合物的步驟，所述組合物包括i)能表達SSX-2I類MHC限制性表位或其類似物的核酸分子；和ii)能表達NY-ESO-lI類MHC限制性表位或其類似物的核酸分子；iii)基本上由所述NY-ESO-l表位或其類似物組成的肽；和iv)基本上由所述SSX-2表位或其類似物組成的肽。42.權利要求l的免疫原性產品，其中所述多種組合物包括a)能表達SSX-2I類MHC限制性表位或其類似物的核酸分子；b)能表達NY-ESO-lI類MHC限制性表位或其類似物的核酸分子；c)基本上由所述SSX-2表位或其類似物組成的肽；禾口d)基本上由所述NY-ESO-l表位或其類似物組成的肽。43.權利要求1的免疫原性產品，其中所述多種組合物包括a)能表達PRAMEI類MHC限制性表位或其類似物的核酸分子；b)能表達PSMAI類MHC限制性表位或其類似物的核酸分子；c)基本上由所述PRAME表位或其類似物組成的肽；禾口d)基本上由所述PSMA表位或其類似物組成的肽。44.權利要求1的免疫原性產品在製備適於向受試者的淋巴系統施用的藥物中的用途。45.權利要求1的免疫原性產品在製備適於在受試者中誘導抗癌免疫應答的藥物中的用途。46.權利要求1的免疫原性產品在製備在受試者中引發和增強T細胞應答的藥物中的用途。47.權利要求1的免疫原性產品在製備用於在受試者中治療癌的藥物中的用途。48.—種或多種能表達一種或多種I類MHC限制性表位或其類似物的核酸組合物，和一種或多種對應於所述I類MHC限制性表位或其類似物的肽組合物，在製備適於在受試者中誘導抗癌免疫應答的藥物中的用全文摘要本發明提供一種治療細胞增殖疾病如癌症的方法，該方法是通過向需要其的受試者提供一種免疫原性組合物進行的，所述免疫原性組合物包括質粒和肽或其類似物。在本發明的實施方案中，提供了這樣的方法和組合物，所述方法和組合物誘導、引發和/或增強對癌抗原I類MHC限制性表位的免疫應答，從而產生有效的抗癌免疫應答。文檔編號A61K39/00GK101687020SQ200680021752公開日2010年3月31日申請日期2006年6月16日優先權日2005年6月17日發明者劉利平,劉西平,戴維·C·戴蒙德,江峙生,肯特·史密斯,裘志勇,阿德裡安·博特,劍龔申請人:曼康公司