製備7α－羧基9,11－環氧甾族化合物的方法、中間體以及烯雙鍵環氧化方法

2023-07-11 14:34:56 2

專利名稱：製備7α－羧基9,11－環氧甾族化合物的方法、中間體以及烯雙鍵環氧化方法
本申請是申請日為1996年12月11日、題為「製備7α-羧基9，11-環氧甾族化合物的方法和其中使用的中間體以及烯雙鍵環氧化作用的一般方法」的PCT/US96/20780的發明專利申請的分案申請。原申請的中國專利申請號為96199961.6。
背景技術：
本發明涉及製備9，11-環氧甾族化合物，特別是20-螺環氧乙烷類及其類似物那些化合物的新的方法，在該甾族化合物製備中有用的新的中間體，以及這些新的中間體的製備方法。更特別地，本發明涉及製備9，11α-環氧-17α-羥基-3-氧代孕甾-4-烯-7α，21-二羧酸氫甲酯，γ-內酯(eplerenone；epoxymexrenone)的新的且有優點的方法。
美國專利4559332公開了20-螺環氧乙烷類化合物的製備方法。根據』332專利的方法製備的化合物具有下面通式的包含一個可打開的氧的E環 其中-A-A-代表基團-CH2-CH2-或-CH＝CH-，R1代表α-取向的低級烷氧羰基或羥基羰基殘基。
-B-B-代表基團-CH2-CH2-或α-取向或β-取向的基團 R6和R7是氫，X代表兩個氫原子或氧代基團，Y1和Y2一起代表氧橋-O-，或Y1代表羥基，和Y2代表羥基，低級烷氧基，或者，如果X代表H2，則也可以代表低級烷醯氧基，
以及其中X代表氧代基團且Y2代表羥基的這些化合物的鹽，即相應的17β-羥基-21-羧酸的鹽。
美國專利4559332描述了一些製備epoxymexrenone和相關的式IA化合物的方法。epoxymexrenone的新的和擴大的臨床應用的出現，產生了製備這些和其它相關的甾族化合物的改進的方法的需要。
發明概述本發明首要目的是提供製備具有共同結構特徵的epoxymexrenone，其它的20-螺環氧乙烷和其它甾族化合物的改進的方法。本發明的具體目的是以高產率提供生產式IA產品和其它相關化合物的改進的方法；提供包括最少分離步驟的這樣的方法；提供實現合理基本投資和在合理轉化成本下操作的這樣的方法。
因此，本發明涉及一系列epoxymexrenone的合成方法；製備eplerenone中有用的中間體；和這些新的中間體的合成。
在優選的實施方案的描述中詳細說明了新的合成方法。本發明新的中間體是下面緊接著描述的那些化合物。
式IV化合物相應於下面的結構式 其中-A-A-代表基團-CHR4-CHR5-或-CR4＝CR5-，R3，R4和R5各自獨立地選自氫，滷素，羥基，低級烷基，低級烷氧基，羥基烷基，烷氧基烷基，羥基羰基，氰基，芳基氧基，R1代表α-取向的低級烷氧羰基或羥基羰基殘基，R2是11α-離去基團，它的除去可有效地在9-和11-碳原子之間產生雙鍵；-B-B-代表基團-CHR6-CHR7-或α-取向或β-取向的基團
其中R6和R7各自獨立地選自氫，滷素，低級烷氧基，醯基，羥基烷基，烷氧基烷基，羥基羰基，烷基，烷氧羰基，醯氧基烷基，氰基，芳基氧基，和R8和R9各自獨立地選自氫，滷素，低級烷氧基，醯基，羥基烷基，烷氧基烷基，羥基羰基，烷基，烷氧羰基，醯氧基烷基，氰基，芳基氧基，或者R8和R9一起構成一個碳環或雜環結構，或者R8或R9與R6或R7一起構成一個與五元環D環稠合的碳環或雜環結構。
式IVA化合物相應於這樣一種式IV化合物，其中R8和R9與它們所連接的成環碳原子一起形成下面的結構 其中X，Y1，Y2和C(17)如上定義。
式IVB化合物相應於這樣一種式IVA化合物，其中R8和R9一起形成式XXXIII結構 式IVC，IVD和IVE化合物分別相應於式IV，IVA，或IVB，其中-A-A-和-B-B-各自是-CH2-CH2-，R3是氫，和R1是烷氧羰基，優選甲氧羰基。式IV範圍內的化合物可以通過使一種低級烷基磺醯化試劑或醯化試劑，或一種產生滷素離子的試劑，與式V範圍內的一種相應的化合物反應來製備。
式V化合物相應於下面的結構
其中-A-A-，-B-B-，R1，R3，R8和R9如式IV所定義。
式VA化合物相應於這樣一種式V化合物，其中R8和R9與它們所連接的成環碳原子一起形成下面的結構 其中X，Y1，Y2和C(17)如上定義。
式VB化合物相應於這樣一種式VA化合物，其中R8和R9一起形成式XXXIII結構 式VC，VD和VE化合物分別相應於式V，VA，或VB中任一個，其中-A-A-和-B-B-各自是-CH2-CH2-，R3是氫，和R1是烷氧羰基，優選甲氧羰基。式V範圍內的化合物可以通過使一種鹼金屬烷氧化物與式VI的一種相應的化合物反應來製備。
式VI化合物相應於下面的結構 其中-A-A-，-B-B-，R3，R8和R9如式IV所定義。
式VIA化合物相應於這樣一種式VI化合物，其中R8和R9與它們所連接的成環碳原子一起形成下面的結構 其中X，Y1，Y2和C(17)如上定義。
式VIB化合物相應於這樣一種式VIA化合物，其中R8和R9一起形成式XXXIII結構 式VIC，VID和VIE化合物分別相應於式VI，VIA，或VIB中任一個，其中-A-A-和-B-B-各自是-CH2-CH2-，R3是氫。式VI，VIA，VIB和VIC化合物分別通過水解相應於式VII，VIIA，VIIB或VIIC的化合物來製備。
式VII化合物相應於下面的結構 其中-A-A-，-B-B-，R3，R8和R9如式IV所定義。
式VIIA化合物相應於這樣一種式VII化合物，其中R8和R9與它們所連接的成環碳原子一起形成下面的結構 其中X，Y1，Y2和C(17)如上定義。
式VIIB化合物相應於這樣一種式VIIA化合物，其中R8和R9一起形成式XXXIII結構 式VIIC，VIID和VIIE化合物分別相應於式VII，VIIA，或VIIB中任一個，其中-A-A-和-B-B-各自是-CH2-CH2-，R3是氫。式VII範圍內的化合物可以通過將式VIII範圍內的一種化合物氰化來製備。
式VIII化合物相應於下面的結構
其中-A-A-，-B-B-，R3，R8和R9如式IV所定義。
式VIIIA化合物相應於這樣一種式VIII化合物，其中R8和R9與它們所連接的成環碳原子一起形成下面的結構 其中X，Y1，Y2和C(17)如上定義。
式VIIIB化合物相應於這樣一種式VIIIA化合物，其中R8和R9一起形成式XXXIII結構 式VIIIC，VIIID和VIIIE化合物分別相應於式VIII，VIIIA，或VIIIB中任一個，其中-A-A-和-B-B-各自是-CH2-CH2-，R3是氫。式VIII範圍內的化合物可以通過發酵而有效地以α-取向向底物引入11-羥基來氧化包括式XIII化合物的一種底物而製備，如下文所述。
式XIV化合物相應於下面的結構 其中-A-A-，-B-B-，R3，R8和R9如式IV所定義。
式XIVA化合物相應於這樣一種式XIV化合物，其中R8和R9與它們所連接的成環碳原子一起形成下面的結構 其中X，Y1，Y2和C(17)如上定義。
式XIV化合物相應於這樣一種式XIVA化合物，其中R8和R9一起形成式XXXIII結構 式XIVC，XIVD和XIVE化合物分別相應於式XIV，XIVA，或XIVB中的任何一個，其中-A-A-和-B-B-各自是-CH2-CH2-，R3是氫。式XIV範圍內的化合物可以通過將式XV範圍內的一種相應的化合物水解來製備。
式XV化合物相應於下面的結構 其中-A-A-，-B-B-，R3，R8和R9如式IV所定義。
式XVA化合物相應於這樣一種式XV化合物，其中R8和R9與它們所連接的成環碳原子一起形成下面的結構 其中X，Y1，Y2和C(17)如上定義。
式XVB化合物相應於這樣一種式XVA化合物，其中R8和R9與它們所連接的成環碳原子一起形成式XXXIII結構
式XVC，XVD和XVE化合物分別相應於式XV，XVA，或XVB中任一個，其中-A-A-和-B-B-各自是-CH2-CH2-，R3是氫。式XV範圍內的化合物可以通過將式XVI範圍內的一種相應的化合物氰化來製備。
式XXI化合物相應於下面的結構 其中-A-A-，-B-B-，R3，R8和R9如式IV所定義。
式XXIA化合物相應於這樣一種式XXI化合物，其中R8和R9與它們所連接的成環碳原子一起形成下面的結構 其中X，Y1，Y2和C(17)如上定義。
式XXIB化合物相應於這樣一種式XXIA化合物，其中R8和R9一起形成式XXXIII結構 式XXIC，XXID和XXIE化合物分別相應於式XXI，XXIA，或XXIB中任一個，其中-A-A-和-B-B-各自是-CH2-CH2-，R3是氫。式XXI範圍內的化合物可以通過將式XXII範圍內的一種相應的化合物水解來製備。
式XXII化合物相應於下面的結構
其中-A-A-，-B-B-，R3，R8和R9如式IV所定義。
式XXIIA化合物相應於這樣一種式XXII化合物，其中R8和R9與它們所連接的成環碳原子一起形成下面的結構 其中X，Y1，Y2和C(17)如上定義。
式XXIIB化合物相應於這樣一種式XXIIA化合物，其中R8和R9一起形成式XXXIII結構 式XXIIC，XXIID和XXIIE化合物分別相應於式XXII，XXIIA，或XXIIB中任一個，其中-A-A-和-B-B-各自是-CH2-CH2-，R3是氫。式XXII範圍內的化合物可以通過將式XXIII範圍內的一種化合物氰化來製備。
式XXIII化合物相應於下面的結構 其中-A-A-，-B-B-，R3，R8和R9如式IV所定義。
式XXIIIA化合物相應於這樣一種式XXIII化合物，其中R8和R9與它們所連接的成環碳原子一起形成下面的結構
其中X，Y1，Y2和C(17)如上定義。
式XXIIIB化合物相應於這樣一種式XXIIIA化合物，其中R8和R9一起形成式XXXIII結構 式XXIIIC，XXIIID和XXIIIE化合物分別相應於式XXIII，XXIIIA，或XXIIIB中任一個，其中-A-A-和-B-B-各自是-CH2-CH2-，R3是氫。式XXIII範圍內的化合物可以通過氧化下文所描述的式XXIV的一種化合物來製備。
式104化合物相應於下面的結構 其中-A-A-，-B-B-，和R3如式IV所定義，且R11是C1-C4烷基。
式104A化合物相應於式104，其中-A-A-和-B-B-各自是-CH2-CH2-，R3是氫。式104範圍內的化合物可以通過熱分解式103化合物來製備。
式103化合物相應於下面的結構
其中-A-A-，-B-B-，R3和R11如式104所定義，及R12是C1-C4低級烷基。
式103A化合物相應於式103，其中-A-A-和-B-B-各自是-CH2-CH2-，R3是氫。式103範圍內的化合物可以通過在一種鹼例如鹼金屬烷氧化物的存在下，使式102的一種相應的化合物與丙二酸二烷基酯反應來製備。
式102化合物相應於下面的結構 其中-A-A-，-B-B-，和R3和R11如式104所定義。
式102A化合物相應於式102，其中-A-A-和-B-B-各自是-CH2-CH2-，R3是氫。式102範圍內的化合物可以通過在一種鹼的存在下使式101的一種相應的的化合物與三烴基硫化合物反應來製備。
式101化合物相應於下面的結構 其中-A-A-，-B-B-，R3和R11如式104所定義。
式101A化合物相應於式101，其中-A-A-和-B-B-各自是-CH2-CH2-，R3是氫。式101範圍內的化合物可以通過在一種酸的存在下，使11α-羥基雄甾烯-3，17-二酮或其它式XXXVI化合物與一種原甲酸三烷基酯反應來製備。
以下面給出的具體反應方法的公開為基礎，很明顯這些化合物相對於一種特定反應方法來說具有最大的利用度。本發明化合物的用途是用作epoxymexrenone和其它甾族化合物的中間體。
本發明的其它目的和特徵部分將在下文中變得顯而易見，部分將被指出。
附圖的簡要說明

圖1是6-去氫睪酮-17-α-丙內酯(canrenone)或一種6-去氫睪酮-17-α-丙內酯衍生物向相應的11α-羥基化合物生物轉化的方法的流程示意圖；圖2是6-去氫睪酮-17-α-丙內酯和6-去氫睪酮-17-α-丙內酯衍生物的11α-羥基化生物轉化的優選方法的流程示意圖；圖3是6-去氫睪酮-17-α-丙內酯和6-去氫睪酮-17-α-丙內酯衍生物的11α-羥基化生物轉化的特別優選方法的流程示意圖；圖4是根據圖2方法製備的6-去氫睪酮-17-α-丙內酯的顆粒大小分布；和圖5是根據圖3的方法在轉化發酵罐中滅菌的6-去氫睪酮-17-α-丙內酯的顆粒大小分布。
相應的參考標誌指示附圖中相應的部分。
優選實施方案的描述根據本發明，提出了各種新的製備opoxymexrenone和相應於式I的其它化合物的方法 其中-A-A-代表基團-CHR4-CHR5-或-CR4＝CR5-，R3，R4和R5各自獨立地選自氫，滷素，羥基，低級烷基，低級烷氧基，羥基烷基，烷氧基烷基，羥基羰基，氰基，芳基氧基，R1代表α-取向的低級烷氧羰基或羥基烷基殘基，-B-B-代表基團-CHR6-CHR7-或α-取向或β-取向的基團
其中R6和R7各自獨立地選自氫，滷素，低級烷氧基，醯基，羥基烷基，烷氧基烷基，羥基羰基，烷基，烷氧羰基，醯氧基烷基，氰基，芳基氧基，和R8和R9各自獨立地選自氫，滷素，低級烷氧基，醯基，羥基烷基，烷氧基烷基，羥基羰基，烷基，烷氧羰基，醯氧基烷基，氰基，芳基氧基，或者R8和R9一起構成一個碳環或雜環結構，或者R8或R9與R6或R7一起構成一個與五元環D環稠合的碳環或雜環結構。
除非另有說明，本申請公開說明書中稱之為「低級」的有機基團包含最多7，優選1-4個碳原子。
低級烷氧羰基優選是從具有1-4個碳原子的烷基例如甲基，乙基，丙基，異丙基，丁基，異丁基，仲丁基和叔丁基衍生的烷氧羰基；特別優選的是甲氧基羰基，乙氧基羰基和異丙氧基羰基。低級烷氧基優選是從上述C1-C4烷基，特別是從伯C1-C4烷基衍生的烷氧基；特別優選的是甲氧基。低級烷醯基優選是從具有1-7個碳原子的直鏈烷基衍生的烷醯基；特別優選的是甲醯基和乙醯基。
15，16-位的亞甲基橋優選是β-取向的。
可以根據本發明方法製備的一類優選的化合物是美國專利4559332中所描述的20-螺環氧乙烷化合物，即相應於式IA的化合物 其中-A-A-代表基團-CH2-CH2-或-CH＝CH-，-B-B-代表基團-CH2-CH2-或α-取向或β-取向的式IIIA基團
R1代表α-取向的低級烷氧羰基或羥基羰基殘基，X代表兩個氫原子或氧代基團或＝S，Y1和Y2一起代表氧橋-O-，或Y1代表羥基，和Y2代表羥基，低級烷氧基，或者，如果X代表H2，則也可以代表低級烷醯氧基，本發明新的方法製備的20-螺環氧乙烷化合物優選是其中Y1和Y2一起代表氧橋-O-的式I化合物。
特別優選的式I化合物是其中X代表氧代基團的那些化合物。
其中X代表氧代基團的式IA20-螺環氧乙烷化合物中最特別優選的是其中Y1和Y2一起代表氧橋-O-的那些化合物。
如已經提到的，17β-羥基-21-羧酸也可以是其鹽的形式。特別考慮金屬鹽和銨鹽，例如鹼金屬和鹼土金屬鹽，例如鈉鹽，鈣鹽，鎂鹽，和優選的鉀鹽，及從氨或合適的，優選的生理耐受的，含氮的有機鹼衍生的銨鹽。作為鹼，考慮的不只是胺，例如低級烷基胺(例如三乙胺)，羥基-低級烷基胺[例如2-羥基乙胺，二-(2-羥基乙基)-胺或三-(2-羥基乙基)-胺]，環烷基胺(例如二環己基胺)或苄基胺類(例如苄基胺和N，N』-二苄基乙二胺)，還包括含氮的雜環化合物，例如那些芳香特徵的化合物(例如吡啶或喹啉)或那些具有至少部分飽和的雜環(例如N-乙基哌啶，嗎啉，哌嗪或N，N』-二甲基哌嗪)。
優選的化合物也包括式IA化合物的鹼金屬鹽，特別是鉀鹽，其中R1代表烷氧羰基，X代表氧代基團，以及各Y1和Y2代表羥基。
特別優選的式I和IA化合物是例如下面的化合物9α，11α-環氧-7α-甲氧羰基-20-螺氧-4-烯(spirox-4-ene)-3，21-二酮，9α，11α-環氧-7α-乙氧羰基-20-螺氧-4-烯-3，21-二酮，9α，11α-環氧-7α-異丙氧羰基-20-螺氧-4-烯-3，21-二酮，和各化合物的1，2-脫氫類似物，9α，11α-環氧-6α，7α-亞甲基-20-螺氧-4-烯-3，21-二酮，
9α，11α-環氧-6β，7β-亞甲基-20-螺氧-4-烯-3，21-二酮，9α，11α-環氧-6β，7β；15β，16β-雙亞甲基-20-螺氧-4-烯-3，21-二酮，和各化合物的1，2脫氫類似物，9α，11α-環氧-7α-甲氧羰基-17β-羥基-3-氧代-孕甾-4-烯-21-羧酸，9α，11α-環氧-7α-乙氧羰基-17β-羥基-3-氧代-孕甾-4-烯-21-羧酸，9α，11α-環氧-7α-異丙氧羰基-17β-羥基-3-氧代-孕甾-4-烯-21-羧酸，9α，11α-環氧-17β-羥基-6α，7α-亞甲基-3-氧代-孕甾-4-烯-21-羧酸，9α，11α-環氧-17β-羥基-6β，7β-亞甲基-3-氧代-孕甾-4-烯-21-羧酸，9α，11α-環氧-17β-羥基-6β，7β；15β，16β-雙亞甲基-3-氧代-孕甾-4-烯-21-羧酸，和這些酸的鹼金屬鹽，特別是鉀鹽或銨鹽，以及上面提到的羧酸或其鹽的1，2-脫氫類似物。
9α，11α-環氧-15β，16β-亞甲基-3，21-二氧代-20-螺氧-4-烯-7α-羧酸甲酯，乙酯和異丙酯，9α，11α-環氧-15β，16β-亞甲基-3，21-二氧代-20-螺氧-1，4-二烯-7α-羧酸甲酯，乙酯，和異丙酯，以及9α，11α-環氧-3-氧代-20-螺氧-4-烯-7α-羧酸甲酯，乙酯，和異丙酯，9α，11α-環氧-6β，7β-亞甲基-20-螺氧-4-烯-3-酮，9α，11α-環氧-6β，7β；15β，16β-雙亞甲基-20-螺氧-4-烯-3-酮，以及9α，11α-環氧，17β-羥基-17α(3-羥基-丙基)-3-氧代-雄甾-4-烯-7α-羧酸甲酯，乙酯，和異丙酯，9α，11α-環氧，17β-羥基-17α-(3-羥基-丙基)-6α，7α-亞甲基-雄甾-4-烯-3-酮，9α，11α-環氧-17β-羥基-17α-(3-羥基-丙基)-6β，7β-亞甲基-雄甾-4-烯-3-酮，9α，11α-環氧-17β-羥基-17α-(3-羥基-丙基)-6β，7β 15β，16β-雙亞甲基-雄甾-4-烯-3-酮，包括上面提到的雄甾烷的17α-(3-乙醯氧基丙基)和17α-(3-甲醯氧基丙基)類似物，也包括所有上面提到的雄甾-4-烯-3-酮和20-螺氧-4-烯-3-酮一系列化合物的1，2-脫氫類似物。
具有相同特徵性結構特徵的式I和IA以及類似化合物的化學名稱是根據現行命名法以下面的方式命名的對於其中Y1與Y2一起代表-O-的化合物來自20-螺環氧乙烷(例如其中X代表氧代基團且Y1與Y2一起代表-O-的式IA化合物來自20-螺環氧乙烷-21-酮)；對於其中Y1與Y2代表羥基且X代表氧代基團的那些化合物來自17β-羥基-17α-孕甾烯-21-羧酸；對於其中Y1與Y2代表羥基且X代表兩個氫原子的那些化合物來自17β-羥基-17α-(3-羥基丙基)-孕甾烷。因為環和開鏈形式，也就是說各內酯和17β-羥基-21-羧酸及其鹽分別相互之間緊密相關，後者可以認為只是前者的水合形式，除非另有說明，在前文和後文中，式I終產物和起始物及類似結構中間體中，應該理解所有情況下，一起指所有提到的形式。
根據本發明，對於高產率和以合理的費用製備式I化合物提出了幾種不同的方案。每種合成方法通過製備一系列中間體來進行。一些中間體是新的化合物，並且製備這些中間體的方法是新的方法。
方法1(用烯睪丙內酯或相關的材料起始)製備式I化合物的一種優選的方法是有益地用相應於式XIII的烯睪丙內酯或相關的起始材料開始 其中
-A-A-代表基團-CHR4-CHR5-或-CR4＝CR5-，R3，R4和R5各自獨立地選自氫，滷素，羥基，低級烷基，低級烷氧基，羥基烷基，烷氧基烷基，羥基羰基，氰基，芳基氧基，-B-B-代表基團-CHR6-CHR7-或α-取向或β-取向的基團 其中R6和R7各自獨立地選自氫，滷素，低級烷氧基，醯基，羥基烷基，烷氧基烷基，羥基羰基，烷基，烷氧羰基，醯氧基烷基，氰基，芳基氧基，和R8和R9各自獨立地選自氫，滷素，低級烷氧基，醯基，羥基烷基，烷氧基烷基，羥基羰基，烷基，烷氧羰基，醯氧基烷基，氰基，芳基氧基，或者R8和R9一起構成一個碳環或雜環結構，或者R8和R9與R6或R7一起構成一個與五元環D環稠合的碳環或雜環結構。利用圖1和圖2說明的生物轉化方法類型，在式XIII化合物中引入α-取向的11-羥基，從而生成式VIII化合物 其中-A-A-，-B-B-，R3，R8和R9如上所定義。
優選式XIII化合物具有下面的結構 11α-羥基產物具有下面的結構
兩式中-A-A-代表基團-CH2-CH2-或-CH＝CH-，-B-B-代表基團-CH2-CH2-或α-取向或β-取向的基團 X代表兩個氫原子或氧代基團或＝S，Y1和Y2一起代表氧橋-O-，或Y1代表羥基，和Y2代表羥基，低級烷氧基，或者，如果X代表H2，則也可以代表低級烷醯氧基，以及其中X代表氧代基團且Y2代表羥基的這些化合物的鹽，和在反應中產生的式VIII化合物相應於式VIIIA 其中-A-A-，-B-B-，Y1，Y2和X如式XIIIA所定義。更優選的是，R8和R9一起形成20-螺環氧乙烷結構
其中-A-A-，-B-B-各自是-CH2-CH2-，R3是氫。
在此羥基化步驟中使用的優選的微生物是赭色麴黴(Aspergillusochraceus)NRRL405，赭色麴黴ATCC18500，黑色麴黴(Aspergillusniger)ATCC16888和ATCC26693，構巢麴黴(Aspergillus nidulan)ATCC11267，米根黴(Rhizopus oryzae)ATCC11145，葡枝根黴(Rhizopusstolonifer)ATCC6227b，弗氏鏈黴菌(Streptomyces fradiae)ATCC10745，巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)ATCC14945，克羅斯韋假單孢菌(Pseudomonas cruciviae)ATCC13262，和玫瑰單端孢(Trichothecium roseum)ATCC12543。其它優選的微生物包括Fusarium oxysporum f.sp.cepae ATCC11171和無根根黴(Rhizopusarrhizus)ATCC11145。
對該反應有活性的其它微生物包括藍色犁頭黴(Absidiacoerula)ATCC6647，灰綠犁頭黴(Absidia glauca)ATCC22752，雅致放射毛菌(Actinomucor elegans)ATCC6476，黃柄麴黴(Aspergillusflavipes)ATCC1030，煙麴黴(Aspergillus fumigatus)ATCC26934，蠶白僵菌(Beauveria bassiana)ATCC7159和ATCC13144，Botryosphaeriaobtusa IMI 038560，Calonectria decoraATCC14767，螺捲毛殼黴(Chaetomium cochliodes)ATCC10195，山扁豆生棒孢(Corynesporacassiicola)ATCC16718，短刺小克銀漢黴(Cunninghamellablakesleana)ATCC8688a，刺孢小克銀漢黴(Cunninghamellaechinulata)ATCC3655，美麗小克銀漢黴(Cunninghamella elegans)ATCC9245，Curvularia clavata ATCC22921，新月彎孢(Curvularialunata)ATCC12071，Cylindrocarpon radicicolaATCC1011，Epicoccum humicola ATCC12722，卵形孢球託黴(Gongronella butleri)ATCC22822，Hypomyces chrysospermus，深黃被孢菌(Mortierella isabellina)ATCC42613，大毛黴(Mucormucedo)ATCC4605，灰藍毛黴(Mucor griseo-cyanus)ATCC1207A，疣孢漆斑菌(Myrothecium verrucaria)ATCC9095，珊瑚色諾卡氏菌(Nocardia corallina)，Paecilomyces carneus ATCC46579，展開青黴(Penicillum patulum)ATCC24550，Pithomyces atro-olivaceusIFO6651，Pithomyces cynodontis ATCC26150，密孔菌屬(Pycnosporium sp.)ATCC12231，Saccharopolyspora erythraeATCC11635，黃球瘤孢(Sepedonium chrysospermum)ATCC13378，Stachylidium bicolor ATCC12672，吸水鏈黴菌(Streptomyces hygroscopicus)ATCC27438，Streptomycespurpurascens ATCC25489，總狀共頭黴(Syncephalastrum racemosum)ATCC18192，Thamnostylum piriforme ATCC8992，Thielavia terricolaATCC13807，和可可輪枝孢(Verticillium theobromae)ATCC12474。
預期對11α-羥基化作用顯示活性的另外的微生物包括Cephalosporium aphidicola(植物化學(Phytochemistry)(1996)，42(2)，411-415)，Cochliobolus lunatas(生物技術雜誌(J.Biotechnol.)(1995)，42(2)，145-150)，Tieghemella orchidis(Khim.-Farm.Zh.(1986)，20(7)，871-876)，Tieghemella hyalospora(Khim.-Farm.Zh.(1986)，20(7)，871-876)，Monosporium olivaceum(Acta Microbiol.Pol.，Ser.B.(1973)，5(2)，103-110)，焦麴黴(Aspergillus ustus)(Acta Microbiol.Pol.，Ser.B.(1973)，5(2)，103-110)，禾穀鐮孢(Fusarium graminearum)(ActaMicrobiol.Pol.，Ser.B.(1973)，5(2)，103-110)，灰綠輪枝孢(Verticillium glaucum)(Acta Microbiol.Pol.，Ser.B.(1973)，5(2)，103-110)，和變黑色根黴(Rhizopus nigricans)(甾族生物化學雜誌(J.Steroid Biochem.)(1987)，28(2)，197-201)。
對於烯睪丙內酯或其它式XIII底物的羥基化作用生產規模發酵的製備，在包括一個種菌發酵罐，或一系列兩個或幾個發酵罐的種菌發酵系統中製備種菌。將工作原種孢子懸浮液與細胞生長營養液一起加入到第一個種菌發酵罐中。如果生產所期望或需要的種菌的體積超過在第一個種菌發酵罐中產生的體積，則可以通過在種菌發酵系列中剩餘的發酵罐的接續而將種菌體積逐漸地和等比地增大。優選的是，在種菌發酵系統中製備的種菌對於實現快速引發生產發酵罐中的反應，相對短的生產批量周期和高生產發酵活性來說具有足夠的體積和活細胞。不管種菌發罐系列中容器的數目是多少，第二個和下面的種菌發酵罐大小優選是使得系列中各步驟的稀釋程度基本上相同。各種菌發酵罐中種菌的最初稀釋度可以大約是與生產發酵罐中的稀釋度相同。烯睪丙內酯或其它式XIII底物與種菌及營養液一起加入到生產發酵罐中，羥基化反應在那裡進行。
加入到種菌發酵系統中的孢子懸浮液來自從眾多試管中取出的一隻工作原種孢子懸浮液試管，眾多試管構成工作原種細胞庫，其在使用前在降溫條件下貯存。工作原種細胞庫來自在下面的方法中製備的主原種細胞庫。從合適的來源例如ATCC獲得的孢子樣品最初懸浮於含水基質中，例如鹽水溶液，營養液或表面活性劑溶液，(例如濃度大約是0.001％重量的非離子表面活性劑例如吐溫20)，和分布在培養板上的懸浮液，每個平板擁有固體營養混合物，一般是以不可消化的多糖例如瓊脂為基礎，在那裡繁殖孢子。固體營養混合物優選含有大約0.5％-大約5％重量的葡萄糖，大約0.05％-大約5％重量的氮源，例如腖，大約0.05％-大約0.5％重量的磷源，例如磷酸銨鹽或鹼金屬鹽，例如磷酸氫二鉀，大約0.25％-大約2.5％重量的酵母溶菌產物或抽提物(或其它胺基酸源例如肉膏或腦心浸液)，大約1％-大約2％重量的瓊脂或其它不可消化的多糖。任選地，該固體營養混合物可以進一步含有和/或包含大約0.1％-大約5％重量的麥芽汁。固體營養混合物的pH優選在大約5.0-大約7.0之間，根據需要用鹼金屬氫氧化物或正磷酸調節。其中有用的固體生長培養基如下1.固體培養基#11％葡萄糖，0.25％酵母抽提物，0.3％K2HPO4和2％瓊脂(Bacto)；用20％NaOH調節pH為6.5。
2.固體培養基#22％腖(Bacto)，1％酵母抽提物(Bacto)，2％葡萄糖和2％瓊脂(Bacto)，用10％H3PO4調節pH為5。
3.固體培養基#30.1％腖(Bacto)，2％麥芽汁(Bacto)，2％葡萄糖和2％瓊脂(Bacto)；pH為5.3。
4.液體培養基5％廢糖蜜，0.5％玉米漿，0.25％葡萄糖，0.25％NaCl和0.5％KH2PO4，調節pH為5.8。
5.Difco真菌學瓊脂(低pH)。
可以根據主原種的未來要求來選擇培養主原種細胞庫中所使用的瓊脂平板數目，但是一般製備大約15-30個平板。適當生長期後，例如7-10天，在含水載體，一般是鹽水或緩衝液的存在下，刮平板收集孢子，得到的主原種懸浮液分裝在小瓶中，例如在許多1.5ml小瓶中裝入1ml。為了製備在研究或生產發酵操作中使用的工作原種孢子懸浮液，可以以上述製備主原種孢子懸浮液的方法將一個或幾個這些第二代主原種小瓶中的內含物分布在瓊脂平板上並在瓊脂平板上培養。期望常規生產操作時，可以使用100-400這樣多的平板來產生第二代工作原種。刮每個平板使原種到分開的工作原種小瓶中，每個小瓶一般含有1ml產生的種菌。為了永久保存，主原種懸浮液和第二代生產種菌兩者有益地保存在含有液氮或其它降溫液的降溫儲存容器的蒸汽空間中。
在圖1所示的方法中，製備含水生長培養基，其含有氮源例如腖，酵母產生物或等價物，葡萄糖，和磷源例如磷酸鹽。微生物的孢子在該菌種發酵系統中的該培養基中培養。優選的微生物是赭色麴黴(Aspergillus ochraceus)NRRL405(ATCC18500)。然後將這樣製備的菌種原種與式XIII底物一起引入到生產發酵罐中。攪拌發酵肉湯並通氣，反應進行足夠的時間使進行到期望的完全程度。
用於菌種發酵罐的培養基優選含有含水混合物，該混合物含有大約0.5％-大約5％重量的葡萄糖，大約0.05％-大約5％重量的氮源，例如腖，大約0.05％-大約0.5％重量的磷源，例如磷酸銨鹽或鹼金屬鹽，例如磷酸一銨或磷酸氫二鉀，大約0.25％-大約2.5％重量的酵母溶菌產物或抽提物(或其它胺基酸源例如酒糟)，大約1％-大約2％重量的瓊脂或其它不可消化的多糖。特別優選的菌種生長培養基含有大約0.05％-大約5％重量的氮源，例如腖，大約0.25％-大約2.5％重量的自溶酵母或酵母抽提物，大約0.5％-大約5％重量的葡萄糖，大約0.05％-大約0.5％重量的磷源，例如磷酸一銨。特別經濟的處理操作是通過使用另一種優選的菌種培養基而提供的，該培養基含有大約0.5％-大約5％重量的玉米漿，0.25％-大約2.5％重量的自溶酵母或酵母抽提物，大約0.5％-大約5％重量的葡萄糖，大約0.05％-大約0.5％重量的磷酸一銨。玉米漿是特別經濟的蛋白質，肽類，碳水化合物，有機酸，維生素，金屬離子，痕量元素和磷酸鹽的來源。來自其它穀物的麥芽汁可以代替玉米漿使用或者除玉米漿之外還加入來自其它穀物的麥芽汁。培養基的pH優選通過例如加入鹼金屬氫氧化物或正磷酸而調節在大約5.0和大約7.0範圍之間。當玉米漿作為氮源和碳源時，pH優選調節在大約6.2至大約6.8範圍之間。含有腖和葡萄糖的培養基優選調節在pH大約5.4和大約6.2之間。在菌種發酵中使用的有用的生長培養基中有下面兩種1.培養基#12％腖，2％自溶酵母(或酵母抽提物)，和2％葡萄糖；用20％NaOH調節pH為5.8。
2.培養基#23％玉米漿，1.5％酵母抽提物，0.3％磷酸一銨和3％葡萄糖；用20％NaOH調節pH為6.5。
將微生物孢子從小瓶引入到培養基中，一般情況下小瓶中每毫升懸浮液含有大約109個孢子。在菌種培養之初用生長培養基稀釋不將孢子種群密度降低到每毫升含有大約107個孢子，實現菌種增殖的最佳生產率。優選的是，在菌種發酵系統中培養孢子，直到菌種發酵罐中的疊集菌絲體體積(PMV)至少是大約20％，優選35％-45％。既然菌種發酵容器(或組成菌種發酵系列的許多容器的任何容器)中的周期取決於容器中的初始濃度，因此期望提供兩個或三個菌種發酵階段來促進整個過程。但是，優選避免使用系列中明顯多於三個菌種發酵罐，因為如果菌種發酵是通過過多階段進行的話，則活性遭到損害。菌種培養發酵在攪拌下，在大約23℃-37℃範圍內的溫度下，優選在大約24℃-28℃範圍內的溫度下進行。
來自菌種發酵系統的培養物與生產生長培養基一起加入到生產發酵罐中。在本發明的一個實施方案中，沒有滅菌的烯睪丙內酯或其它式XIII底物用作反應底物。優選的是將底物以在生長培養基中10％-30％重量漿狀物的形式加入到生產發酵罐中。為了增加適於11α-羥基化反應的表面積，在加入到發酵罐之前通過將底物通過離機降低顆粒體積機(off line micronizer)來減小式XIII底物顆粒大小。也分開加入含有葡萄糖的滅菌營養培養的原種，和含有酵母產生物例如自溶酵母(或以其它來源例如酒糟為基礎的等價物胺基酸混合物)的第二代滅菌營養溶液。培養基含有含水混合物，混合物含有大約0.5％-大約5％重量的葡萄糖，大約0.05％-大約5％重量的氮源，例如腖，大約0.05％-大約0.5％重量的磷源，例如磷酸銨鹽或鹼金屬鹽，例如磷酸氫二鉀，大約0.25％-大約2.5％重量的酵母溶菌產物或抽提物(或其它胺基酸源例如酒糟)，大約1％-大約2％重量的瓊脂或其它不可消化的多糖。特別優選的生產生長培養基含有大約0.05％-大約5％重量的氮源，例如腖，大約0.25％-大約2.5％重量的自溶酵母或酵母抽提物，大約0.5％-大約5％重量的葡萄糖，大約0.05％-大約0.5％重量的磷源，例如磷酸一銨。另一種優選的生產培養基含有大約0.5％-大約5％重量的玉米漿，大約0.25％-大約2.5％重量的自溶酵母或酵母抽提物，大約0.5％-大約5％重量的葡萄糖，大約0.05％-大約0.5％重量的磷酸一銨。生產發酵培養基的pH優選以上述對菌種發酵培養基描述的方法，分別調節到對於以腖/葡萄糖為基礎的培養基和以玉米漿為基礎的培養基的pH相同的優選的範圍。有用的生物轉化培養基在下面給出1.培養基#12％腖，2％自溶酵母(或酵母抽提物)，和2％葡萄糖；用20％NaOH調節pH為5.8。
2.培養基#21％腖，1％自溶酵母(或酵母抽提物)，和2％葡萄糖；用20％NaOH調節pH為5.8。
3.培養基#30.5％腖，0.5％自溶酵母(或酵母抽提物)，和0.5％葡萄糖；用20％NaOH調節pH為5.8。
4.培養基#43％玉米漿，1.5％酵母抽提物，0.3％磷酸一銨和3％葡萄糖；用20％NaOH調節pH為6.5。
5.培養基#52.55％玉米漿，1.275％酵母抽提物，0.255％磷酸一銨和3％葡萄糖；用20％NaOH調節pH為6.5。
6.培養基#62.1％玉米漿，1.05％酵母抽提物，0.21％磷酸一銨和3％葡萄糖；用20％NaOH調節pH為6.5。
在各生產批量周期中，將沒有滅菌的烯睪丙內酯和滅菌的營養液以5-20份，優選10-15份，優選以基本上相等的等份，依次加入到生產發酵罐中。有利的是，最初以足夠的量加入底物，使在用菌種發酵肉湯接種之前濃度達到大約0.1％重量至大約3％重量之間，優選達到大約0.5％重量至大約2％重量之間，然後周期性加入，一般是每8-24小時加入一次，使累計比例達到大約1％重量至大約8％重量之間。每隔8小時加入附加的底物的情況下，總的加入量比只是每天加入一次底物的情況稍低一些，例如是0.25％-2.5％重量。在後一種情況下累計的烯睪丙內酯的加入量需要是在2％-大約8％重量範圍內。在發酵反應期間加入的補充的營養混合物優選是提縮物，例如一種含有大約40％-60％重量滅菌葡萄糖，和大約16％-32％重量滅菌酵母抽提物或其它酵母產生物的滅菌源(或其它胺基酸源)。因為向圖1生產發酵罐中加入的底物是沒有滅菌的，因此向發酵肉湯中周期性加入抗生素來控制不期望的生物體的生長。可以加入例如卡那黴素，四環素，和頭孢氨苄的抗生素而不會對生長和生物轉化產生不利的影響。優選的是，以例如以肉湯總量為基礎的大約0.0004％至大約0.002％的濃度向發酵肉湯中加入這些抗生素，包括例如以肉湯總量為基礎的大約0.0002％至大約0.0006％硫酸卡那黴素，大約0.0002％至大約0.006％的四環素鹽酸鹽和/或大約0.001％至大約0.003％的頭孢氨苄。
一般情況下，生產發酵批量周期是80-160小時左右。因此各式XIII底物和營養液部分一般以每2-10小時，優選每4-6小時加入。有利的是還將消泡劑摻入到菌種發酵系統和生產發酵罐中。
優選的是，在圖1的方法中，向生產發酵罐中加入的種菌是發酵罐中總混合物體積的大約0.5-7％，更優選大約1-2％，葡萄糖濃度保持在大約0.01％-1.0％，優選大約0.025％-0.5％，更優選大約0.05％-0.25％重量，周期性加入，優選各部分是總批量填料的大約0.05％-0.25％。發酵溫度一般控制在大約20℃-37℃範圍內，優選在大約24℃-28℃，但是可能會期望在反應中逐步降低溫度，例如以2℃的增量，以保持疊集菌絲體體積(PMV)低於大約60％，更優選低於大約50％，從而防止發酵肉湯粘度幹擾令人滿意的混合。如果生物質生長超過了液體表面，生物質中保留的底物可以從反應帶中去除，使成為對於羥基化反應是不可得的。關於生產率，期望在發酵反應頭24小時內達到PMV為30-50％，優選35-45％範圍內，但此後，優選控制條件來控制進一步的生長在上述限度內。在反應期間，發酵培養基的pH控制在大約5.0-6.5之間，優選在大約5.2-5.8之間，並且以大約400-800rpm之間的速度攪拌發酵罐。通過向批量中通氣大約0.2-1.0vvm，並保持發酵罐上空壓力在大約1大氣壓和1.0巴表壓之間，更優選在大約0.7巴表壓左右，來實現溶解的氧氣水平為至少是大約10％飽和。攪拌速度也可以提高，因為必須保持最小的溶解的氧氣的水平。有利的是，溶解的氧氣保持在大大高於10％，事實上保持在50％這樣高以促進底物的轉化。保持pH在5.5±0.2範圍內對於生物轉化也是最佳的。根據需要通過加入一種普通的消泡劑控制發泡。所有的底物都加完後，優選繼續反應直到式VIII產物與剩餘的未反應的式XIII底物的摩爾比至少是大約9∶1。這樣的轉化作用可以在上述指出的80-160小時批量周期內完成。
發現高轉化作用與將初始營養水平減少到低於初始加入水平相關，並且通過控制通氣速度和攪拌速度來避免底物從液體肉湯中濺出來。在圖1的方法中，營養水平減小到不大於大約初始加入量的60％，然後保持在不大於大約60％，優選大約50％；而在圖2和圖3的方法中，營養水平減小到不大於大約初始加入量的80％，然後保持在不大於大約80％，優選大約70％。通氣速度優選不大於1vvm，更優選在大約0.5vvm範圍內；而攪拌速度優選不大於600rpm。
在圖2中詳細說明了製備式VIII化合物的特別優選的方法。優選的微生物還是赭色麴黴(Aspergillus ochraceus)NRRL405(ATCC18500)。在該方法中，生長培養基優選含有大約0.5％-大約5％重量的玉米漿，大約0.5％-大約5％重量的葡萄糖，0.1％-大約3％重量的酵母抽提物，大約0.05％-大約0.5％重量的磷酸銨。但是也可以使用這裡所描述的其它生產生長培養基。菌種培養物基本上以對於圖1的方法所描述的方法製備，使用這裡所描述的任何菌種發酵培養基。沒有減低顆粒體積的烯睪丙內酯或其它式XIII底物在生長培養基中的懸浮液在一個混合器中無菌製備，優選以大約10％和大約30％重量底物之間的相對高的濃度。優選的是無菌製備可以包括混合後的懸浮液的滅菌或巴氏滅菌法。在一批生產量初始時向生產發酵罐加入生產一批生產量所需要的滅菌底物懸浮液的全部量，或者周期性連續加入。底物顆粒大小通過在連機剪切泵中溼研磨而減小，連機剪切泵將漿狀物轉移到生產發酵罐，從而避免了使用離機降低顆粒機的需要。通過巴氏消毒法而不是滅菌法實現無菌條件，團聚作用的程度是不明顯的，但是期望使用剪切泵來提供顆粒大小的正對照。基本上以上述方法相同的方法將滅菌生長培養基和葡萄糖溶液引入到生產發酵罐中。在加入之前所有的向生產發酵罐中加入的成分都滅菌，因此不需要抗生素。
優選的是，在圖2的操作方法中，以大約0.5％至大約7％的比例向生產發酵罐中加入種菌，發酵溫度是大約20℃-大約37℃，優選是大約24℃-大約28℃，例如通過加入氣體氨，氫氧化銨水溶液，鹼金屬氫氧化物水溶液，或正磷酸，將pH控制在大約4.4和大約6.5之間，優選在大約5.3和大約5.5之間。根據圖1的方法，優選調節溫度來控制生物質的生長，使得PMV不超過55-60％。初始葡萄糖加入量優選在大約1％和大約4％重量之間，更優選2.5％-3.5％重量，但是在發酵過程中優選使其降至低於大約1.0％重量。補充的葡萄糖以總的一批生產量為基礎的大約0.2％和大約1.0％重量之間的份數周期性加入，從而保持葡萄糖在發酵帶中的濃度在大約0.1％和大約1.5％重量範圍內，優選是大約0.25％和大約0.5％重量。可以任選地與葡萄糖一起補加氮源和磷源。不管怎樣，因為在一批生產量周期開始時確定了總的烯睪丙內酯的加入量，所以必須供給的含氮和磷的營養物也可以同時加入，使在反應期間補加只使用葡萄糖溶液。攪拌的速度和性質是一個明顯的變數。中等劇烈的攪拌促進質在固體底物和水相之間轉移。但是，應該使用低剪切高速攪拌機來防止微生物髓鞘質的降解。優選的攪拌速度根據培養基肉湯粘度，氧氣濃度，和容器，折流板和葉輪位型影響的混合條件，在200-800rpm範圍內變化。一般情況下，優選的攪拌速度在350-600rpm範圍內。攪拌葉輪優選提供軸向向下的泵動作用，這樣有助於發酵的生物質很好地混合。一批生產量優選以大約0.3和大約1.0vvm之間的速度，優選以0.4-0.8vvm的速度通氣。發酵罐上空的壓力優選在大約0.5和大約1.0巴量之間。優選控制溫度，攪拌，通氣和回壓，保持溶解的氧氣在生物轉化期間在至少大約10％體積範圍內。總的一批生產量周期一般在大約100和大約140小時之間。
儘管圖2方法操作原理以早期基本上加入全部烯睪丙內酯量為基礎，但是應該理解，發酵肉湯的生長可能在加入大量烯睪丙內酯之前就進行了。任選地，在一次生產量後期也可以加入一部分烯睪丙內酯。但是，一般情況下，在發酵開始後48小時內應該向轉化發酵罐中加入至少大約75％滅菌烯睪丙內酯填料。而且，為了促進生物轉化酶的產生，期望在發酵開始或者至少在頭24小時內加入至少大約25％重量烯睪丙內酯。
在如圖3說明的進一步優選的方法中，在加入種菌之前，在生產發酵容器中將全部一批生產量填料和營養溶液滅菌。可以使用的營養溶液以及其中優選條件與圖2的方法基本上相同。在本發明實施方案中，攪拌機葉輪的剪切作用破壞了底物的團聚作用，另一方面是要進行滅菌。已經發現，如果烯睪丙內酯的平均粒度小於大約200μ，並且至少75％重量的顆粒小於240μ，則反應進行得令人滿意。發現使用合適的高速攪拌機，例如圓盤渦輪高速攪拌機，以200-800rpm範圍內適當的速度，末端速度至少是大約400cm/秒，就提供足以保持減輕在生產發酵罐中滅菌時往往會發生的團聚作用的粒度特徵剪切速度。圖3方法的其它操作基本上與圖2的方法相同。圖2和圖3的方法提供了幾種優於圖1方法的顯著的優點。一個特殊的優點是可控制使用低耗費營養基質例如玉米漿。以及進一步的優點是不需要抗生素，簡化了進料過程，使烯睪丙內酯或其它式XIII底物一次滅菌。另一個特別的優點是在反應周期期間能使用簡單的葡萄糖溶液用於補充而不用使用複雜的營養溶液。
在圖1-3所示的方法中，式VIII產物是結晶固體，其與生物質一起通過過濾或者低速離心而從反應肉湯中分離出來。或者可以用有機溶劑將產物從全反應肉湯中萃取出來。通過溶劑萃取回收式VIII產物。為了最大限度回收，用萃取溶劑處理液相濾液和生物質過濾器或濾餅，但是通常≥95％的產物與生物質相關。一般情況下，烴，酯，滷代烴，和酮溶劑可以用於萃取。優選的溶劑是乙酸乙酯。其它典型的合適的溶劑包括甲苯和甲基異丁基酮。對於從液相中萃取，適宜使用與其所接觸的反應溶液的體積大約相等的溶劑的體積。為了從生物質中回收產物，將後者懸浮於溶劑中，溶劑優選相對於底物初始加入量過量很多，例如每克初始的烯睪丙內酯加入量用50-100ml溶劑，得到的懸浮液優選回流20分鐘至幾小時，以確保產物從生物質的凹面和孔隙轉移到溶劑相中。此後，過濾或離心去除生物質，濾餅優選用新鮮溶劑和去離子水兩者洗滌。然後合併水和溶劑洗液並使各相分離。式VIII產物通過結晶從溶液中回收。為了獲得最大產率，用新鮮溶劑處理菌絲體兩次。沉降使水相完全分離後，從溶劑相中回收產物。最優選的是真空去除溶劑，直到開始結晶，然後，將濃縮的萃取液冷卻到0-20℃。優選大約10℃至大約15℃靜置一段時間用於結晶沉降和生長，一般是8-12小時。
特別優選圖2的方法，尤其是圖3的方法。這些方法在低粘度下操作，並且可以變化來控制反應參數，例如pH，溫度和溶解的氧氣。而且不用藉助抗生素可以容易地保持滅菌條件。
生物轉化過程是放熱的，所以應該使用加套式發酵罐或冷卻蛇管在生產發酵罐中去除熱。或者反應肉湯可以通過外部熱交換器環流。根據肉湯中氧氣效能的測定，通過調節空氣進入反應器的速度，優選將溶解的氧氣保持在至少大約5％體積的水平，優選至少在大約10％體積的水平，就足以提供反應的能量，並且保證葡萄糖轉化成二氧化碳和水。pH優選控制在大約4.5和大約6.5之間。
在式XIII底物11-羥基化的各種不同的方法中，產率受從固體底物轉移到液相或認為反應所發生的相界的質量的限制。如上述所指出的，產率不明顯受質量轉移速率限制，只要底物的顆粒平均粒度減小到小於大約300μ，並且至少75％重量的顆粒小於240μ。但是，在一些變化的實施方案中，這些方法的產率可以進一步提高，所述變化的實施方案中向生產發酵罐中提供有機溶劑中的烯睪丙內酯或其它式XIII底物的實際加入量。根據一項選擇，將底物溶解於一種水不混溶溶劑中，並與含水的生長培養基接種物和一種表面活性劑混合。有用的水不混溶溶劑包括，例如，DMF，DMS0，C6-C12脂肪酸，C6-C12正鏈烷烴，植物油，脫水山梨糖醇，和含水的表面活性劑溶液。填料的攪拌作用產生一個乳液反應系統，該系統具有底物從有機液相向反應點質量轉移的增大的界面面積。
第二個選擇是最初將底物以實質上大於其在水中的溶解度的濃度溶解於水可混溶溶劑中，例如丙酮，甲基乙基酮，甲醇，乙醇，或甘油中。通過在提高的溫度下製備初始底物溶液，提高了溶解度，從而進一步提高了加入到反應器中的溶液形式的底物的量，並且最終提高了反應器的有效載量。與相對冷的含有生長培養基和種菌的含水填料一起向生產發酵反應器中進入熱的底物溶液。當底物溶液與含水培養基混合時，發生底物沉澱。然而，在基本過飽和中等劇烈攪拌條件下，形成晶核比晶體生長更有利，並且形成高表面積的非常細的顆粒。高表面積促進液相和固相之間的質轉移。而且，在水可互溶溶劑的存在下也提高了含水液相中底物的平衡濃度。因此提高了產率。
儘管微生物可能不一定耐受含水相中的高濃度有機溶劑，但是可以使用一定濃度的乙醇，例如大約3％-大約5％重量範圍的乙醇以有利於反應。
第三種選擇是將底物溶解於含水的環糊精溶液中。詳細說明的環糊精包括羥基丙基-β-環糊精和甲基-β-環糊精。底物∶環糊精的摩爾比可以是大約1∶1至大約1∶1.5，底物∶環糊精。然後可以將底物∶環糊精混合物無菌加入生物轉化反應器中。
11α-羥基烯睪丙內酯，以及11α-羥基化過程中的其它產物(式VIII和VIIIA)是新的化合物，可以通過過濾反應培養基，並且從過濾培養基收集的生物質中提取產物來分離。常規有機溶劑例如乙酸乙酯，丙酮，甲苯，氯化烴，和甲基異丁基酮可以用於提取。然後式VIII產物可以從相同類型有機溶劑中重結晶。式VIII化合物具有作為製備式I化合物特別是式IA的中間體的實際價值。
優選的是式VIII化合物相應於式VIIIA，其中-A-A-和-B-B-是-CH2-CH2-，R3是氫，低級烷基或低級烷氧基，，並且R8和R9一起構成20-螺烷環 而且，根據反應式1的方法，式VIII化合物在鹼性條件下與氰化物離子源反應，產生式VII烯胺化合物 其中-A-A-，R3，-B-B-，R8和R9如上定義。其中底物相應於式VIIIA，產物是式VIIA 其中-A-A-，R3，-B-B-，Y1，Y2和X如式XIII所定義。
式VIII的11α-羥基底物的氰化作用可以通過將其與一種氰化物離子源例如酮基氰醇，最優選的是丙酮氰醇，在一種鹼和一種鹼金屬鹽的存在下反應來進行，鹼金屬鹽最優選氯化鋰。或者，氰化作用可以不用氰醇而通過使用鹼金屬氰化物在一種酸的存在下進行。
在酮基氰醇的方法中，反應在溶液中進行，優選使用質子惰性極性溶劑例如二甲基甲醯胺或二甲亞碸。生成烯胺時每摩爾底物需要至少2摩爾氰化物離子源，並且優選使用稍過量的氰化物源。鹼優選是含有氮原子的鹼例如二烷基胺，三烷基胺，鏈烷醇胺，吡啶或類似物。但是，也可以使用無機鹼例如鹼金屬碳酸鹽或鹼金屬氫氧化物。優選的是，式VIII底物最初存在的比例是大約20-50％重量比例，鹼存在的比例是每當量底物0.5-2當量。反應溫度的要求不嚴格，但是高溫下操作提高產率。例如，使用三乙胺為鹼的情況下，反應在大約80℃-大約90℃範圍下進行是有利的。在這樣的溫度下，反應在大約5-大約20小時內進行完全。在使用二異丙基乙基胺為鹼並且反應在105℃進行時，反應8小時進行完全。在反應完全後，真空去除溶劑，殘留的油狀物溶解於水中，並用稀酸優選鹽酸中和到pH7。產物從該溶液中沉澱出來，然後用蒸餾水洗滌並空氣風乾。釋放出來的HCN可以用惰性氣體去除並在鹼性溶液中使反應停止。將乾燥的沉澱溶解於氯仿或其它合適的溶劑中，然後用濃鹽酸例如6N HCl萃取。通過加入無機鹼，優選鹼金屬氫氧化物，將萃取液中和到pH7，然後冷卻到0℃左右。將得到的沉澱洗滌乾燥後從合適的溶劑例如丙酮中重結晶，產生適合於在該方法下一步中使用的式VII產物。
另一方面，反應可以在含有水可互溶有機溶劑例如甲醇的含水溶劑體系中進行，或者在含有水和有機溶劑例如乙酸乙酯的兩相體系中進行。在該方法中，可以通過用水稀釋反應溶液，然後用有機溶劑例如二氯甲烷或氯仿萃取該產物，然後用濃的礦物酸，例如2N HCl從有機萃取液中反萃取來回收產物。參見美國專利3200113。
根據另一方面，該反應可以在一種水可互溶溶劑例如二甲基甲醯胺，二甲基乙醯胺，N-甲基，吡咯烷酮或二甲亞碸中進行，然後用水稀釋反應產物溶液，並且例如通過加入一種鹼金屬碳酸鹽使變為鹼性，然後冷卻到0-10℃，從而使產物沉澱。優選用鹼金屬次滷酸鹽(hypohalite)或其它有效防止氰化物揮發的試劑使系統猝止。過濾並且用水洗滌後，沉澱的產物適用於該方法的下一步反應。
根據另一方面，可以通過使式VIII底物在一種質子源存在下，與過量的鹼金屬氰化物，優選氰化鈉，在含有質子惰性水可互溶的極性溶劑例如二甲基甲醯胺或二甲基乙醯胺的含水溶劑中反應，來製備式VII烯胺產物。質子源優選是礦物酸或C1-C5羧酸，硫酸是特別優選的。相反地，其中氰化作用試劑是商售的氰化鋰DMF溶液情況下，不需要加入分離的質子源。
氰化物離子優選以每當量底物大約2.05和大約5摩爾當量的比例加入到反應器中。相信礦物酸或其它質子源促進HCN加成到4，5和6，7雙鍵上，並且優選以每摩爾當量底物至少1摩爾當量的比例存在；但是反應體系應該通過保持鹼金屬氰化物比酸過量來保持鹼性。反應優選在至少大約75℃，一般是60-100℃的溫度下，反應大約1-大約8小時，優選大約1.5-大約3小時。反應結束時，將反應混合物冷卻，優選冷卻到室溫左右；優選在大約冰浴溫度下通過酸化反應混合物，並且將其與冷水混合，來沉澱產物烯胺。相信酸化作用閉合17-內酯，其在氰化作用中常用的鹼性條件下有開環趨勢。用反應過程中存在的相同的酸，優選硫酸，方便地酸化反應混合物。優選以每摩爾產物大約10-大約50摩爾當量的比例加入水。
式VII化合物是新的化合物，並且具有作為製備式I特別是式IA的中間體的重要價值。優選的是，式VII化合物相應於式VIIA，其中-A-A-和-B-B-是-CH2-CH2-，R3是氫，低級烷基或低級烷氧基，，並且R8和R9一起構成20-螺烷環 最優選的式VII化合物是5』R(5』α)，7』β-20』-氨基十六氫-11』β-羥基-10』α，13』α-二甲基-3』，5-二氧螺[呋喃-2(3H)，17』α(5』H)-[7，4]亞甲基(metheno)[4H]環戊[a]菲]-5』-腈。
在反應式1合成的下一步中，水解式VII烯胺，產生式VI二酮化合物 其中-A-A-，R3，-B-B-，R8和R9如式VIII定義。水解可以使用任何含水有機或無機酸。優選鹽酸。為了提高產率，優選使用一種水可互溶有機溶劑，例如低級鏈烷醇作為輔助溶劑。酸應該以每當量式VII底物至少1當量的比例存在。在含水體系中，在大約80℃在大約5小時的期間內，烯胺底物VII可以基本上轉化成式VII的二酮。在高溫下操作提高產率，而溫度的要求不嚴格。根據溶劑體系和酸的揮發性選擇合適的溫度。
優選的是，式VII烯胺底物相應於式VIIA 而二酮產物相應於式VIA， 其中-A-A-，-B-B-，Y1，Y2和X如式VIIIA定義。
在反應完後，將溶液冷卻到0-25℃，結晶產物。產物結晶可以從合適的溶劑中重結晶，合適的溶劑例如異丙醇或甲醇，產生適用於該方法下一步反應的式VI產物；但是通常不必重結晶。式VI產物是新的化合物，並且具有作為製備式I化合物特別是式IA化合物的中間體的實際價值。優選的是，式VI化合物相應於式VIA，其中-A-A-和-B-B-是-CH2-CH2-，R3是氫，低級烷基或低級烷氧基，，並且R8和R9一起構成20-螺烷環 最優選的式VI化合物是4』S(4』α)，7』α-十六氫-11』α-羥基-10』β，13』β-二甲基-3』，5，20』-三氧螺[呋喃-2(3H)，17』β-[4，7]亞甲基[17H]環戊[a]菲]-5』β(2』H)-腈。
在本發明一個特別優選的實施方案中，用上述相同的方法由式VIII化合物產生式VII產物烯胺，並就地轉化成式VI二酮。在本發明的該實施方案中，式VIII底物與含有質子源的含水溶劑中適量的鹼金屬氰化物，或者如上所述任選地一種鹼和氯化鋰存在下與過量酮基氰醇反應。然而，代替冷卻反應混合物，酸化，並且以計算引起烯胺沉澱的比例加入水，優選避免大量冷卻反應混合物。在氰化作用反應終止時需要向反應混合物中加入水和一種酸，優選一種礦物酸，例如硫酸，加入的酸的比例足以中和過量的鹼金屬氰化物，對於每摩爾式VIII底物一般需要加入至少1摩爾當量的酸，優選對於每摩爾底物加入大約2摩爾和大約5摩爾當量之間的酸。而且溫度需要保持足夠高，並且稀釋度足夠大，使得避免大量沉澱，並且使在液相中進行由烯胺向二酮的水解。因此，該方法可以以最小幹擾和高產率進行。水解優選在至少80℃的溫度下，更優選在大約90-100℃範圍內，一般進行大約1-10小時，更優選大約2-5小時。然後將反應混合物冷卻，優選冷卻到大約0℃和大約15℃之間的溫度，在冰浴中冷到大約5℃至大約10℃對於沉澱式VI產物二酮是有益的。通過過濾可以回收固體產物，並且通過用水洗滌來去除雜質。
在反應式1合成的下一步中，式VI二酮化合物與金屬烷氧化物反應，將4和7位的酮橋打開，裂解羰基和4-碳之間的鍵，在7位形成一個α-取向的鏈烷醯基氧基羰基取代基並去除5-碳處的氰基。該反應的產物是相應於式V的羥基酯化合物 其中-A-A-，R3，-B-B-，R8和R9如式VIII定義，R1是低級烷氧羰基或羥基羰基。反應中使用的金屬烷氧化物相應於式R10OM，其中M是鹼金屬，R10O相應於R1中的烷氧取代基。當金屬烷氧化物是鉀或鈉的甲氧化物時，反應產率是最為令人滿意的，但是可以使用其它低級烷氧化物。鉀的烷氧化物是特別優選的。也可以使用苯氧化物，其它芳基氧化物，以及芳基硫化物。反應一般在相應於式R10OH其中R10如上定義的醇的存在下進行。可以使用其它常規試劑。優選的是，式VI底物以大約2％和大約12％重量之間的比例存在，更優選至少大約6％重量，R10OM以每摩爾底物大約0.5和大約4摩爾之間的比例存在。溫度的要求不嚴格，但是提高的溫度提高產率。反應時間一般是大約4-24小時，優選大約4-16小時。一般情況下，根據使用的溶劑，反應在大氣壓回流溫度下進行。
在式VI二酮向式VI羥基酯的轉化中，副產物氰化物離子可以與產物反應生成5-氰基酯。因為平衡在低濃度下更有利，所以反應優選在高稀釋度下進行，例如對於用鈉甲氧化物的反應高達40∶1。已經發現通過使用鉀的甲氧化物而不是鈉的甲氧化物可以實現明顯高得多的產率，因為大約20∶1範圍的稀釋度一般足以減小其中鉀的甲氧化物作為試劑的反向氰化作用的程度。
根據本發明，進一步發現反向氰化作用反應可以通過採用適當的化學或物理方法從反應帶中去除副產物氰化物離子來抑制。因此在本發明的另一個實施方案中，二酮與鹼金屬烷氧化物的反應可以在氰離子的沉澱劑的存在下進行，氰離子沉澱劑例如含有形成不可溶氰化物的陽離子的鹽。這樣的鹽可以例如包括碘化鋅，硫酸鐵，或者基本上所有的比相應的氰化物更溶解的鹼土金屬或過渡金屬的滷化物，硫酸鹽或其它鹽。如果碘化鋅以每當量二酮底物大約1當量範圍內的比例存在，發現反應產率與沒有鹼金屬滷化物存在下進行的方法相比大大提高。
甚至在使用了除去氰離子的沉澱劑的情況下，仍然優選在高稀釋度下，但由於使用了沉澱劑，溶劑與二酮底物的摩爾比，與不用該試劑的反應相比，可以大大減少。式V羥基酯的回收根據下面描述的提取或非提取方法進行。
優選的是，式VI二酮底物相應於式VIA， 而羥基酯產物相應於式VA
其中-A-A-，-B-B-，Y1，Y2和X如式VIIIA定義，R1如式V中定義。
式V產物是新的化合物，並且具有作為製備式I化合物特別是式IA化合物的中間體的實際價值。優選的是，式V化合物相應於式VA，其中-A-A-和-B-B-是-CH2-CH2-，R3是氫，低級烷基或低級烷氧基，，並且R8和R9一起構成20-螺烷環 最優選的式V化合物是11α，17α-二羥基-3-氧代孕甾-4-烯-7α，21-二羧酸氫甲酯，γ-內酯。
式V化合物可以通過酸化反應溶液，例如用濃鹽酸酸化，冷卻到室溫，並用有機溶劑例如二氯甲烷或乙酸乙酯提取來分離。提取液用含水鹼性洗液洗滌，乾燥並過濾，然後去除溶劑。或者可以用濃酸中止含有式V產物的反應溶液。濃縮產物溶液，冷卻到0-25℃，並且過濾分離固體產物。
根據式V產物回收的一個優選的方法，在反應結束後通過蒸餾去除甲醇和HCN，在蒸餾之前或期間加入水和酸。在蒸餾之前加入水使操作簡化，而蒸餾期間行進性加入使體積保持基本上不變。在蒸餾進行時式V產物從底部結晶出來。該回收方法提供了高質量結晶產物而不需要提取操作。
根據另一方面，含有式V產物的反應溶液可以用礦物酸例如4N HCl中止，然後蒸餾去除溶劑。溶劑的去除對於從反應產物中去除殘留的HCN也是有效的。已經發現，若其中式V化合物作為製備epoxymexrenone的方法的中間體，純化式V化合物不一定要多溶劑提取，如本文所述。事實上，這樣的提取經常可以完全避免。在溶劑提取用於產物純化的情況下，期望用鹽水和鹼洗補充溶劑洗滌。而在免除了溶劑提取的情況下，鹽水和鹼洗也免除了。免除了提取和洗滌，明顯提高了該方法的產率，不損失產量或產品質量，也免去了用乾燥劑例如硫酸鈉乾燥洗滌溶液的需要。粗產物11α-羥基-7α-烷氧基羰基產物又溶解於溶劑中，用於該方法的下一個反應步驟，該反應步驟是11-羥基轉化成11-位的好的離去基團，從而產生式IV化合物 其中-A-A-，R3，-B-B-，R8R9如式VIII定義，R1是式V中的定義，R2是低級芳基磺醯基氧基，烷基磺醯基氧基，醯基氧基或滷素。優選的是，通過與向含有式V中間體產物的溶液中加入的低級烷基磺醯滷，醯滷或酸酐反應來酯化11α-羥基。優選低級烷基磺醯滷，特別是甲磺醯氯。另一方面，可以通過適當的試劑反應例如亞硫醯溴，亞硫醯氯，硫醯氯或草醯氯，將11α-羥基轉化成滷化物。形成11α-磺酸酯的其它試劑包括甲苯磺醯氯，苯磺醯氯和三氟甲磺酸酐。反應在含有滷化氫清除劑例如三乙胺或吡啶的溶劑中進行。也可以使用無機鹼例如鉀或鈉的碳酸鹽。式V羥基酯的初始濃度優選在大約5％-大約50％重量之間。優選稍微過量存在酯化試劑。對於該反應，二氯甲烷是特別合適的試劑，但是也可以使用其它試劑例如二氯乙烷，吡啶，氯仿，甲乙酮，二甲氧基乙烷，甲基異丁基酮，丙酮，其它酮類，醚類，乙腈，甲苯和四氫呋喃。反應溫度主要受溶劑的揮發性限制。在二氯甲烷中，反應溫度優選在大約-10℃和大約10℃範圍內。
優選的是，式V羥基酯底物相應於式VA，
而產物相應於式IVA 其中-A-A-，-B-B-，Y1，Y2和X如式XIII定義，R1是低級烷醯氧基羰基或羥基羰基，R2在式IV中定義。
式IV產物是新的化合物，並且具有作為製備式I化合物特別是式IA的中間體的實際價值。優選的是，式IV化合物相應於式IVA，其中-A-A-和-B-B-是-CH2-CH2-，R3是氫，低級烷基或低級烷氧基，，並且R8和R9一起構成20-螺烷環 最優選的式IV化合物是17α-羥基-11α-(甲基磺醯基)氧基-3-氧代孕甾-4-烯-7α，21-二羧酸氫甲酯，γ-內酯。
如果需要，可以通過去除溶劑來分離式IV化合物。優選首先用含水的鹼性洗液例如0.5-2N氫氧化鈉洗滌反應溶液，接著，用酸洗，例如0.5-2N鹽酸。去除反應溶劑後，例如通過將產物溶解於二氯甲烷，然後加入降低式IV產物溶解度的另一種溶劑例如乙醚，使其以結晶形式沉澱，使產物重結晶。
根據下文的進一步詳細說明，在式IV產物的回收中，或者在製備將式IV中間體轉化成式II中間體的反應溶液中，如果代之以用離子交換樹脂去除酸性和鹼性雜質處理溶液，則可以免卻所有的提取和/或洗滌步驟。首先用陰離子交換樹脂處理溶液，之後用陽離子交換樹脂。另一方面，可以首先用無機吸附劑例如鹼性氧化鋁或鹼性氧化矽處理反應溶液，接著用稀酸洗滌。鹼性氧化鋁或鹼性氧化矽一般可以以每千克產物大約5-50g的比例，優選每千克產物大約15-20g的比例與反應溶液混合。不管使用離子交換樹脂還是無機吸附劑，通過簡單地在室溫攪拌下將樹脂或無機吸附劑與反應溶液攪拌成漿狀物，然後過濾去除樹脂或無機吸附劑來進行處理。
在本發明一種可選擇和優選的實施方案中，通過去除部分溶劑，以濃縮溶液粗產物形式回收式IV產物化合物。直接在該方法的下面步驟中使用該濃縮的溶液，從式IV化合物中去除11α-離去基團，從而產生式II烯酯 其中-A-A-，R3，-B-B-，R8和R9如式VIII定義，R1是式V中的定義。為了該反應的目的，式IV化合物的R2取代基可以是任何離去基團，其去除有效生成9-和11-碳之間的雙鍵。優選離去基團是低級烷基磺醯基氧基或醯氧基取代基，其通過與一種酸和一種鹼金屬鹽反應而被去除。可以使用礦物酸，但是優選使用低級鏈烷酸。有益的是用於該反應的試劑進一步包括使用的鏈烷酸的鹼金屬鹽。特別優選的是離去基團包括甲磺醯基氧基，用於該反應的試劑包括甲酸或乙酸和一種這些酸或另一種低級鏈烷酸的鹼金屬鹽。離去基團是甲磺醯基氧基且去除試劑是甲酸和甲酸鉀的情況下，發現9，11與11，12-烯烴的比例比較高。如果在去除離去基團的過程中存在游離的水，則有生成雜質特別是7，9-內酯的趨勢 其難於從終產物中去除。因此用乙酸酐或其它乾燥劑來去除甲酸中存在的水。反應之前反應混合物中存在的游離的水的含量，根據KarlFischer分析對於水的測定，應該保持在低於以總反應溶液為基礎的大約0.5％重量的水平，優選低於大約0.1％重量。儘管優選反應混合物儘可能保持乾燥，但是0.3％重量的水已可實現令人滿意的結果。優選的是，反應加入的混合物含有大約4％和大約50％重量之間的鏈烷酸中式IV底物。優選含有大約4-20％重量的酸的鹼金屬鹽。乙酸酐用作乾燥劑的情況下，其優選以每摩爾鏈烷酸大約0.05-0.2摩爾之間的比例存在。
發現在消除試劑包括作為消除離去基團並生成烯酯(9，11-烯烴)的試劑的三氟乙酸，三氟乙酸酐和乙酸鉀的混合物時，反應混合物中副產物7，9-內酯和11，12-烯烴的比例相對低。三氟乙酸酐作為乾燥劑，應該以以三氟乙酸消除劑為基礎至少大約3％重量，更優選至少大約15％重量，最優選大約20％的比例存在。
另一方面，可以通過在有機溶劑例如DMSO，DMF，或DMA中加熱式IV的溶液，消除式IV化合物的11α-離去基團，產生式II烯酯。
進一步根據本發明，式IV化合物最初在一種酸例如甲苯磺酸或無水礦物酸例如硫酸的存在下，與鏈烷酸烯酯例如乙酸異丙烯酯反應，生成式IV化合物的3-烯醇酯 另一方面，通過用一種酸酐和鹼例如乙酸和乙酸鈉處理，可以生成3烯醇酯。進一步可選擇的方法包括在一種酸的存在下用烯酮處理，產生IV(Z)。然後式IV(Z)的中間體在甲酸或乙酸存在下與鹼金屬甲酸鹽或乙酸鹽反應，產生式IV(Y)Δ-9，11烯醇乙酸酯 其然後在有機溶劑中，優選在一種醇例如甲醇中，或者通過乙酸烯醇酯的熱分解，或者通過其與鹼金屬烷氧化物反應，被轉化成式II烯酯。消除反應對於式II烯酯是高選擇性的，優先11，12-烯烴和7，9-內酯。在乙酸烯醇酯向烯酮的轉化過程中保持該選擇性。
優選的是，式IV底物相應於式IVA， 而烯酯產物相應於式IIA 其中-A-A-，-B-B-，Y1，Y2和X如式XIIIA定義，R1在式V中定義。
如果需要，可以通過去除溶劑，將固體產物溶解於冷水中，並且用有機溶劑例如乙酸乙酯萃取，來分離式II化合物。適當的洗滌和乾燥步驟後，通過去除萃取溶劑來回收產物。然後將烯酯溶解於適合於向式I產物轉化的溶劑中。另一方面，可以通過向濃縮的產物溶液中加入水並過濾固體產物，從而，優選去除7，9-內酯來分離烯酯。式II底物向式IA產物的轉化可以以美國專利4559332中描述的方法進行，該專利在這裡引作參考，或者，更優選通過下文描述的使用滷代乙醯胺促進劑的新的反應。
在本發明的另一個實施方案中，不用分離式IV中間體化合物就可以將式V羥基酯轉化成式II烯酯。在該方法中，將羥基酯溶解於一種有機溶劑例如二氯甲烷；或者向該溶液中加入醯化劑，例如甲磺醯氯，或滷化劑，例如硫醯氯。攪拌混合物，在涉及滷化作用的情況下，加入鹽酸清除劑，例如咪唑。鹼與溶液的混合是高度放熱的，因此應該用完全冷卻以控制速度進行。加入鹼之後，得到的混合物升至中等溫度，例如0℃至室溫，或稍高，一般反應1-4小時。反應完全後，優選在高真空(例如24」至28」Hg)條件下在-10至+15℃，更優選在大約0-大約5℃下，去除溶劑，濃縮溶液，並且去除過量的鹼。然後將底物再溶解於有機溶劑優選滷化溶劑例如二氯甲烷中以轉化成烯酯。
優選分別在無水反應器中混合有機酸，有機酸鹽和乾燥劑，優選甲酸，鹼金屬甲酸鹽和乙酸酐來製備離去基團消除劑。乙酸酐的加入是放熱的，結果釋放CO，因此一定要控制加入速度。為了促進水的去除，反應溫度優選保持在60-90℃範圍內，更優選大約65-大約75℃。然後，向式IV化合物的產物溶液中加入該試劑以促進消除反應。4-8小時後，優選將反應混合物加熱到至少大約85℃的溫度，但是不超過約95℃，直到去除所有的揮發蒸餾物質，然後一般再保持大約1-4小時以完成反應。冷卻反應混合物，通過標準提取技術回收後，可以根據需要通過蒸發溶劑來回收烯酯。
進一步發現，可以通過另一種方法從反應溶液中回收式II烯酯，該方法避免了消除反應後的提取步驟的需要，從而節省了費用，提高了產量和/或提高了產率。在該方法中，通過在去除甲酸後用水稀釋反應混合物來沉澱烯酯產物。然後過濾分離產物。不需要提取。
根據不用分離式IV化合物的由式V羥基酯向式II烯酯轉化的進一步選擇的方法，式V羥基酯的11α-羥基被滷原子置換，然後通過熱脫氫滷化作用就地生成式II烯酯。通過在低溫下在一種滷化氫清除劑例如咪唑存在下，與硫醯滷，優選硫醯氯反應，有效進行滷素置換羥基作用。羥基酯溶解於溶劑例如四氫呋喃中並冷卻到0至-70℃。加入硫醯滷，將反應混合物加熱到中等溫度，例如室溫，保持足以完成消除反應的一段時間，一般是1-4小時。該實施方案的方法不只是將兩步合成為一步，而且也避免了使用滷化反應試劑；酸(例如乙酸)；和乾燥劑(乙酸酐或硫酸鈉)。而且，反應不需要回流條件，並且避免產生當使用乙酸為乾燥劑時產生的副產物CO。
在本發明一個特別優選的實施方案中，不用分離任何純化形式的中間體就可以將式VI二酮化合物轉化成epoxymexrenone或其它式I化合物。根據該優選方法，用強酸溶液猝滅含有羥基酯的反應溶液，冷卻到室溫，然後用合適的萃取溶劑萃取。有利的是，在萃取之前向反應混合物中加入無機鹽水溶液，例如10％重量鹽水溶液。洗滌萃取液，並通過共沸蒸餾從酮裂解反應中去除殘留的甲醇溶劑來乾燥。
然後在低溫下使得到的含有大約5％-50％重量式V化合物的濃溶液與醯化劑或烷基醯化劑接觸，生成磺酸酯或二羧酸酯。烷基磺醯化作用或羧化反應完全之後，將反應液通過酸性交換樹脂柱後通過鹼性交換樹脂柱，去除鹼性和酸性雜質。每次通過後，用合適的溶劑例如二氯甲烷衝洗柱子，從中回收殘留的磺醯酯或二羧酸酯。合併的洗脫液和衝洗液被合併並濃縮，優選真空濃縮，產生含有式IV磺醯酯或二羧酸酯的濃溶液。然後該濃縮液與含有有效去除11α-酯離去基團，並且去除氫生成9，11雙鍵的試劑的乾燥劑接觸。優選去除離去基團的溶劑含有如上所述的甲酸/鹼金屬甲酸鹽/乙酸酐乾燥劑溶液。反應完全後，冷卻反應混合物，並真空去除甲酸和/或其它揮發性成分。將殘餘物冷卻到室溫，進行適當的洗滌步驟後乾燥，得到含有式II烯酯的濃溶液。該烯酯然後可以用這裡所描述的或者是在美國專利4559332中描述的方法轉化成epoxymexrenone或其它式I化合物。
在本發明一個特別優選的實施方案中，從反應液中真空去除溶劑，式IV產物分配在水和一種合適的有機溶劑例如乙酸乙酯中。然後用有機溶劑反萃含水層，用鹼性溶液，優選含有一種鹼金屬滷化物的鹼金屬氫氧化物的溶液洗滌反萃液。濃縮有機相，優選真空濃縮，得到式II烯酯產物。式II產物然後可以溶解於有機溶劑例如二氯甲烷中，以』332專利中描述的方法進一步反應，產生式I產物。
在環氧化反應中使用三滷乙腈的情況下，發現溶劑的選擇是重要的，最優選滷化溶劑，特別優選二氯甲烷。例如二氯乙烷和氯苯溶劑給出合理的令人滿意的產率，但是在二氯甲烷反應介質中一般得到更好的產率。溶劑例如乙腈和乙酸乙酯一般給出不好的產率，而在溶劑例如甲醇或水/四氫呋喃中的反應給出極少期望的產物。
進一步根據本發明，發現通過使用三滷乙醯胺而不是三滷乙腈為環化反應的過氧化物活化劑，可以實現epoxymexrenone合成中的很多改進。根據特別優選的方法，通過在三氯乙醯胺和一種合適的緩衝劑的存在下使式IIA底物與過氧化氫反應進行環氧化作用。反應優選在大約pH3-7範圍內，更優選在大約5-7的pH下進行。然而儘管有這些考慮，在優選pH範圍外也可以成功實現反應。
用含有磷酸氫二鉀的緩衝液和/或用含有相對比例在大約1∶4和大約2∶1之間，更優選在大約2∶3範圍內的磷酸氫二鉀和磷酸二氫鉀混合物的緩衝液獲得特別好的結果。也可以使用硼酸鹽緩衝液，但是一般給出比磷酸二鉀或K2HPO4或K2HPO4/KH2PO4混合物慢的轉化作用。不管緩衝液的組成是什麼，其應該提供上面指出範圍內的pH值。除了緩衝液全部組成或其精確的pH外，發現如果至少緩衝液的一部分由二元鹼性磷酸氫鹽離子組成，則反應進行得有效得多。相信該離子基本上作為生成包括促進劑和過氧化氫離子的加成物或配合物中的均相催化劑而參與反應，該加成物或配合物的產生可能接著對於總的環氧化作用反應機理是必需的。因此，對於二元鹼性磷酸氫鹽(優選來自K2HPO4)的定量需要可能只是少的催化劑濃度。一般情況下，優選以每當量底物至少大約0.1當量，例如大約0.1-大約0.3當量的比例存在HPO4。
反應在合適的溶劑優選二氯甲烷中進行，但是也可以使用其它的滷化的溶劑，例如氯苯或二氯乙烷。發現甲苯和甲苯與乙腈的混合物也是令人滿意的。沒有依據特定的理論，判斷反應在兩相系統中進行最有效，其中生成過氧化氫中間體，並分布在低水含量的有機相中，並與有機相中的底物反應。因此優選的溶劑是其中水溶解度低的溶劑。包括有另一種溶劑例如乙腈會促進從甲苯中有效回收。
在式II底物向式I產物的轉化中，甲苯提供了方法優點，因為底物大量地溶解於甲苯而產物不溶解。因此，當轉化達到40-50％範圍時反應中沉澱出產物，產生三相混合物，通過過濾可以方便地從中分離產物。在進行該方法該步驟的轉化作用中，甲醇，乙酸乙酯，單獨的乙腈，THF和THF/水尚未證明和滷化溶劑或甲苯一樣有效。
儘管三氯乙醯胺是最優選的，但是也可以使用其它三滷乙醯胺，例如三氟乙醯胺。三滷代甲基苯甲醯胺，和在拉電子三滷代甲基基團與醯胺的羰基之間有亞芳基部分的其它化合物也是有用的。也可以使用3，3，3-三滷代丙醯胺，但是結果不好。通常，過氧化物活化劑相應於下式R0C(O)NH2
其中R0是有拉電子能力(根據σ常數測定)至少與一氯代甲基一樣高的基團。更特別地，過氧化物活化劑相應於下式 其中X1，X2和X3獨立地選自滷原子，氫，烷基，滷代烷基和氰基和氰基烷基，RP選自亞芳基和-(CX4X5)n-，其中n是0或1，X1，X2，X3，X4，和X5中至少一個是滷原子或全滷代烷基。其中X1，X2，X3，X4，或X5中任何一個不是滷原子時，其優選是滷代烷基，更優選是全滷代烷基。特別優選的活化劑包括其中n是0且X1，X2和X3中至少兩個是滷原子的化合物；或者其中所有X1，X2，X3，X4，和X5是滷原子或是全滷代烷基的化合物。每個X1，X2，X3，X4，和X5優選是氯或氟，雖然混合的滷化物也是合適的，但最優選氯，可以是全氯代烷基或全溴代烷基和其混合物。
優選的是，過氧化物活化劑以最初存在的每當量底物至少大約1當量，更優選大約1.5當量至2當量的比例存在。過氧化氫應該以至少不過分過量的量加入到反應中，或者隨著環氧化作用反應的進行跟進性加入。儘管反應對於每摩爾底物只消耗1-2當量的過氧化氫，但是優選以相對於初始存在的底物和活化劑顯著過量的量加入過氧化氫。本發明不限制於特別的理論，相信反應機理涉及生成活化劑與OOH-的加成物，該反應的形成是可逆反應，平衡有利於反方向反應，因此為了使反應向正向方向進行必需有大量初始過量的過氧化氫。反應溫度不在窄範圍內限制，在0-100℃範圍內可以有效進行。最佳溫度取決於溶劑的選擇。一般情況下，優選的溫度在大約20-30℃之間，但是在某些溶劑中，例如甲苯，反應可以在60-70℃範圍內有利地進行。在25℃時，反應一般需要10小時以下，一般是3-6小時。如果需要，可以在反應周期末加入另外的活化劑和過氧化氫，使底物的轉化完全。
在反應周期末，去除水相，優選洗滌有機反應液以去除水溶性雜質，然後可以通過去除溶劑來回收產物。去除溶劑之前，應該用至少弱的至中等的鹼性洗液，例如碳酸鈉，洗滌反應液。優選的是，反應混合物依次用下面物質洗滌弱還原溶液例如弱的亞硫酸鈉水溶液(例如3％重量)；鹼溶液，例如氫氧化鈉或氫氧化鉀(優選大約0.5N)；酸溶液例如鹽酸(優選大約1N)；最終中性洗液含有水或鹽水，優選的飽和的鹽水，以減小產物損失。去除反應溶劑之前可以有益地加入另一種溶劑例如有機溶劑，優選乙醇，這樣蒸餾去除大多數揮發性反應溶劑後，通過結晶來回收產物。
應該明白，除了製備epoxymexrenone的各種方法外，已經很好地應用了使用三氯乙醯胺或其它新的過氧化物活化劑的新的環氧化作用方法，而且事實上可以用於在多種底物液相反應中跨烯烴雙鍵生成環氧化物。該反應在其中烯烴碳原子是四取代和三取代的不飽和的化合物中特別有效，即和，其中Ra至Rd代表不是氫的取代基。其中底物是帶有三取代雙鍵的環化合物，或者是帶有四取代雙鍵的環或無環化合物的反應進行得最快而且完全。舉例的該反應的底物包括Δ-9，11-烯睪丙內酯，和 因為三取代和四取代雙鍵反應進行得更快更完全，對於在包括其中烯烴碳原子是一元取代的或者甚至是二元取代的其它雙鍵的化合物中跨這樣三取代和四取代雙鍵的選擇性環氧化作用是特別有效的。
應該進一步明白，該反應可以用來有利於一元取代的或者甚至是二元取代的雙鍵的環氧化作用，例如各種各樣甾類底物中的11，12-烯。但是因為其優選以高選擇性環氧化更高級取代的雙鍵，例如9，11-烯，所以本發明方法對於在這裡其他地方所描述的各種反應方法的環氧化步驟中實現高產量和高產率是特別有效的。
該改進的方法顯示，用於製備下面的化合物特別有益 其製備方法是將下述化合物環氧化， 已經證明本發明方法中使用三氯乙醯胺代替三氯乙腈作為環氧化作用反應的氧轉移劑有多種優點。三氯乙醯胺試劑系統對於在相同分子結構中跨三取代雙鍵與二取代和α，β-酮基烯烴的環氧化作用提供嚴格的區域控制。因此大大提高了反應產率，產物曲線和終產物純度。進一步發現使用三滷乙腈所觀察到的氧的大大過量的產生在用三氯乙醯胺時沒有出現，這對環氧化作用方法賦予更高的安全性。進一步與三氯乙腈促進的反應相反，三氯乙醯胺反應具有最小的放熱作用，因此有利於控制反應的放熱曲線。發現攪拌作用最小，反應器效能更一致，這是一個好於三氯乙腈方法的進一步的優點。與三氯乙腈促進的反應相比，該反應更適合於大規模生產。產物的分離和純化是簡單的，沒有發現例如使用間-氯代過氧苯甲酸或其它過酸所發現的羰基官能團的Bayer-Villager氧化作用(環氧化物促進的酮向酯的轉化作用)，並且該試劑不貴，易得，並且容易操作。
本發明新的環氧化方法作為方法1合成的關鍵步驟非常有用。在一個特別優選的實施方案中，如下進行方法1的全部過程
方法2本發明第二種新的反應方法(方法2)用烯睪丙內酯或其它相應於式XIII的底物起始 其中-A-A-，R3，-B-B-，R8和R9如式VIII定義。在該方法的第一個步驟中，式XIII底物轉化成式XII產物 使用了基本上與上述將式VIII底物轉化成式VII中間體的方法相同的氰化反應方法。優選式XIII底物相應於式XIIIA 並且烯胺產物相應於式XIIA
其中-A-A-，-B-B-，Y1，Y2和X如式XIII定義。
在該方法2的第二個步驟中，式XII烯胺水解為式XI中間體二酮產物 其中-A-A-，R3，-B-B-，R8和R9如式VIII定義，使用了基本上與上述將式VIII底物轉化成式VII中間體的方法相同的反應方法。優選式XII底物相應於式XIIA 並且二酮產物相應於式XIA
其中-A-A-，-B-B-，Y1，Y2和X如式VIIIA中定義。
進一步根據反應方法2，式XI二酮與一種鹼金屬烷氧化物反應生成mexrenone或相應於式X的其它產物， 其中-A-A-，R3，-B-B-，R8和R9如式VIII定義，R1如在式V中定義。該方法使用了基本上與上述將式VI化合物轉化成式V化合物的方法相同的反應方法來進行。優選式XI底物相應於式XIA 並且中間體產物相應於式XA
其中-A-A-，-B-B-，Y1，Y2和X如式XIIIA中定義，R1如在式V中定義。
接著通過新的生物轉化方法將式X化合物9α-羥基化，得到式IX產物 其中-A-A-，R3，-B-B-，R8和R9如式VIII定義，R1如在式V中定義。可以用於該羥基化步驟的微生物中的微生物是Nocardia conicruriaATCC 31548，Nocardia aurentiaATCC 12674，山扁豆生棒孢(Corynespora cassiicola)ATCC 16718，StreptomyceshydroscopicusATCC 27438，深黃被孢黴(Mortierella isabellina)ATCC 42613，蠶白僵菌(Beauvria bassiana)ATCC 7519，產紫青黴(Penicillum purpurogenum)ATCC 46581，Hypomyces chrysospermusIMI 109891，Thamnostylum piriformeATCC 8992，短刺小克銀漢黴(Cunnighamella blakesleeana)ATCC 8688a，刺孢小克銀漢黴(Cunninghamella echinulata)ATCC 3655，美麗小克銀漢黴(Cunninghamella elegans)ATCC 9245，玫瑰單端孢(Trichotheciumroseum)ATCC 12543，Epicoccum humicolaATCC 12722，Saccharopolyspora eythraeATCC 11635，蠶白僵菌(Beauvriabassiana)ATCC 13144，簡單節桿菌(Arthrobacter simplex)，Bacterium cyclooxydansATCC 12673，Cylindrocarbon radicicolaATCC 11011，Nocardia aurentiaATCC 12674，犬股諾卡氏菌(Nocardiacanicruria)，限定諾卡氏菌(Norcardia restrictus)ATCC 14887，睪丸酮假單孢菌(Pseudomonas testosteroni)ATCC 11996Rhodococcus equiATCC 21329，偶發分枝桿菌(Mycobacteriumfortuitum)ATCC-6842，和玫瑰色紅球菌(Rhodococcus rhodochrous)ATCC 19150。
反應基本上以上述與方法1和2相關的方法進行。特別優選方法1的方法。
生物轉化中使用的生長培養基優選含有大約0.05％至大約5％重量可利用氮；大約0.5％至大約5％重量的葡萄糖；大約0.25％-大約2.5％重量的酵母產生物；大約0.05％至大約0.5％重量可得的磷。特別優選的生長培養基包括下列物質大豆粉大約0.5％-大約3％重量的葡萄糖；大約0.1％-大約1％重量的大豆粉；大約0.05％-大約0.5％重量的鹼金屬滷化物；大約0.05％-大約560.5％重量的酵母產生物例如自溶酵母或酵母抽提物；大約0.05％-大約0.5％重量的磷酸鹽例如磷酸氫二鉀；pH＝7；腖-酵母抽提物-葡萄糖大約0.2％-大約2％重量的腖；大約0.05％-大約0.5％重量的酵母抽提物；和大約2％-大約5％重量的葡萄糖；Mueller-Hinton大約10％-大約40％重量的牛肉浸液；大約0.35％-大約8.75％重量的酪蛋白水解物；大約0.15％-大約0.7％重量的澱粉。
真菌可以在大豆粉或腖營養物中生長，而放線菌和真桿菌可以在大豆粉(加0.5％-1％重量的羧酸鹽例如甲酸鈉用於生物轉化)或在Mueller-Hinton肉湯中生長。
在實施例19中討論了通過發酵從mexrenone產生11β-羥基mexrenone。
式IX產物是新的化合物，其通過過濾分離，用合適的有機溶劑例如乙酸乙酯洗滌，並且從相同或相似的溶劑中重結晶。它們具有作為製備式I特別是式IA化合物的中間體的實際價值。優選的是，式IX化合物相應於式IXA，其中-A-A-和-B-B-是-CH2-CH2-，R3是氫，低級烷基或低級烷氧基，，並且R8和R9一起構成20-螺烷環
在合成方法2的下一步反應中，式IX產物與一種脫水劑反應生成式II化合物 其中-A-A-，R3，-B-B-，R8和R9如式VIII定義，R1如在式V中定義。其中底物相應於式IXA，產物是式IIA 其中-A-A-，-B-B-，Y1，Y2和X如式XIIIA中定義，R1如在式V中定義。
在該合成方法的最後步驟中，通過根據美國專利4559332中描述的方法的環氧化作用，或者優選通過上述本發明新的環氧化作用方法，將式II產物轉化成式I。
在一個特別優選的方案中，如下進行方法2的全部過程
方法3這種情況下的合成用相應於式XX的底物開始 其中-A-A-和R3如式VIII定義，-B-B-也如式VIII定義，除了R6和R7都不是在16，17位與D環稠合的環的一部分，並且R26是低級烷基，優選甲基。式XX底物與Sulfonium ylide反應產生相應於式XIX的環氧化物中間體
其中-A-A-，R3，-B-B-和R26如式XX中定義。
在合成方法3的下一步反應中，式XIX中間體轉化成式XVIII另一種中間體 其中-A-A-，R3，-B-B-如式XX定義。在該步驟中，式XIX底物通過在溶劑中在一種鹼的存在下與NaCH(COOEt)2反應而轉化成式XVIII中間體。該式XVIII化合物暴露於熱水和一種鹼性滷化物，產生相應於式XVII的脫羧化中間體 其中-A-A-，R3，-B-B-如式XX定義。這種式XX化合物轉化成式XVII化合物的方法基本上相應於美國專利3897417，3413288和3300489中描述的方法，這些專利在此引作參考。儘管底物不同，但是用於引入17-螺內酯部分的試劑，機理和條件基本上相同。
式XVII中間體與脫氫劑的反應得到式XVI進一步的中間體
其中-A-A-，R3，-B-B-如上定義。
一般有用的脫氫劑包括二氯二氰基苯並醌(DDQ)和氯醌(2，3，5，6-四氯-對-苯並醌)。另一方面，脫氫作用可以通過先後的6-碳處的滷化作用，接著脫滷化氫反應來實現。
式XVI中間體接著轉化成式XV烯胺 其中-A-A-，R3，-B-B-如式XX定義。基本上以上述對於式VIII的11α-羥基化合物轉化成式VII烯胺的方法通過氰化作用轉化。一般情況下，氰離子源可以是鹼金屬氰化物。鹼優選是吡咯烷和/或四甲基胍。可以使用甲醇溶劑。
式XV產物是新的化合物，其可以通過色譜分離。這些和其它式AXV新的化合物具有作為製備式I特別是式IA化合物的中間體的實際價值。式AXV化合物相應於下面的結構，
其中-A-A，R3，-B-B-，R8和R9如上定義。在最為優選的式XV化合物中-A-A-和-B-B-是-CH2-CH2-。
根據上述產生式VI二酮化合物的水解作用，式XV烯胺可以轉化成式XIV二酮 其中-A-A-，R3，-B-B-如式XX中定義。用於合成epoxymexrenone的特別優選的是那些式XIV化合物，其也落在式VIA範圍內。
式XIV產物是新的化合物，其可以通過沉澱來分離。這些和其它式AXIV新的化合物具有作為製備式I特別是式IA化合物的中間體的實際價值。式AXIV化合物相應於下面的結構， 其中-A-A-，R3，-B-B-，R8和R9如上定義。在更為優選的式AXIV和XIV化合物中，-A-A-和-B-B-是-CH2-CH2-。
基本上使用上述將式VI二酮轉化成式V羥基酯的方法將式XIV化合物進一步轉化成式XXXI化合物。在該例子中，在進一步轉化成式XXXII產物之前必需分離中間體XXXI，
其中-A-A-，-B-B-和R3如式XX中定義，優選的式XXXI化合物是那些落在式IIA範圍內的化合物。用上文或美國專利4559332中描述的方法，將式XXXI化合物轉化成式XXXII化合物。在一個特別優選的實施方案中，如下進行方法3的全部過程
方法4方法4的頭三個步驟與方法3的相同，即用相應於式XX的化合物開始製備式XVII中間體。
此後，例如使用美國專利4559332的方法將式XVII中間體環氧化，產生式XXIV化合物 其中-A-A-，R3和-B-B-如式XX中定義。但是，在本發明特別優選的實施方案中，根據上述方法1中描述的將式II烯酯轉化成式I產物的方法，用含有醯胺型過氧化物活化劑，最優選三氯乙醯胺的氧化作用試劑在9，11-雙鍵處將式XVII底物環氧化。用於該反應的條件和試劑的比例基本上與對於式II烯酯轉化成epoxymexrenone描述的相同。
已經發現使用一種過酸例如間-氯過氧苯甲酸，也能以非常好的產率有效進行式XVII底物的環氧化作用。但是，三氯乙醯胺試劑提供優異的結果，減少了Bayer-Villager氧化副產物的生成。後者副產物能夠去除，但是這需要從溶劑例如乙酸乙酯中研製，接著從另一種溶劑例如二氯甲烷中結晶。通過與脫氫化(氧化)試劑例如DDQ或氯醌反應，或者使用溴化/脫溴化氫(或其它滷化/脫滷化氫)程序，將式XXIV環氧化物脫氫，產生6-和7-碳之間的雙鍵，來產生另一種新的式XXIII中間體 其中-A-A-，R3和-B-B-如式XX中定義。特別優選的式XXIII化合物是其中-A-A-和-B-B-如式XIII中定義的那些化合物。
儘管直接氧化對於形成式XXIII產物是有效的，但是產率一般很低。因此優選氧化作用分兩步進行，首先在C-6位將式XXIV底物滷化，然後脫滷化氫，生成6，7-烯烴。優選用一種N-滷代有機試劑例如F-溴代琥珀醯胺進行滷化作用。在一種合適的溶劑中，例如乙腈，在滷化促進劑例如苯甲醯過氧化物存在下進行溴化作用。反應在大約50-大約100℃範圍內的溫度下有效進行，一般在常壓回流溫度下在一種溶劑例如四氯化碳，乙腈或其混合物中進行。然而完成反應一般需要4-10小時。去除反應溶劑，殘餘物溶解於水不互溶溶劑例如乙酸乙酯中。得到的溶液依次用弱鹼性溶液(例如鹼金屬碳酸氫鹽)和水，或者優選用飽和鹽水洗滌，以減少產物損失，然後去除溶劑，，殘餘物溶解於適於脫滷化氫反應的另一種溶劑(例如二甲基甲醯胺)中。
合適的脫滷化氫試劑，例如1，4-二氮雜雙環[2，2，2]辛烷(DABCO)與鹼金屬滷化物例如溴化鋰一起被加入到溶液中，將溶液加熱到適當的反應溫度，例如60-80℃，反應持續幾小時，一般是4-15小時，以完成脫溴化氫作用。可以根據需要在反應周期期間加入另外的脫溴化氫試劑，以使反應完全。然後，例如通過加入水以沉澱產物，然後過濾分離，並且優選用另外量的水洗滌，來回收式XXIII產物。產物優選例如從二甲基甲醯胺中重結晶。
式XXIII產物，例如9，11-環氧烯睪丙內酯，是新的化合物，其可以通過萃取/結晶來分離。其具有作為製備式I特別是式IA化合物的中間體的實際價值。例如其可以用作製備式XXII的底物。在最優選的式XXIII化合物中，-A-A-和-B-B-是-CH2-CH2-。
基本上使用上述對於製備式VII化合物的方法，使式XXIII化合物與氰化物離子反應，來產生相應於式XXII的新的環氧烯胺化合物 其中-A-A-，R3和-B-B-如式XX中定義。特別優選的式XXII化合物是其中-A-A-和-B-B-如式XIII中定義的那些化合物。
式XXII產物是新的化合物，其可以通過沉澱和過濾來分離。其具有作為製備式I特別是式IA化合物的中間體的實際價值。在最優選的式XXII化合物中，-A-A-和-B-B-是-CH2-CH2-。
基本上使用上述對於製備式VI化合物的方法，使式XXII環氧烯胺化合物轉化成新的式XXI環氧二酮化合物。
式XXI產物是新的化合物，其可以通過沉澱和過濾來分離。其具有作為製備式I特別是式IA化合物的中間體的實際價值。特別優選的式XXI化合物是其中-A-A-和-B-B-如式XIII中定義的那些化合物，在最為優選的式XXI化合物中，-A-A-和-B-B-是-CH2-CH2-。
使用上述環氧化方法或者美國專利4559332的方法將式XXI化合物轉化成式XXXII化合物。在一個特別優選的實施方案中，如下進行方法4的全部過程 方法5方法5的方法用相應於式XXIX的底物開始
其中-A-A-，和-B-B-如式XX中定義。該底物通過與原甲酸三甲酯反應被轉化成式XXVIII產物 其中-A-A-，R3和-B-B-如式XX中定義。生成式XXVIII之後，用上述將式XX底物轉化成式XVII的方法將式XXIX轉化成式XXVII化合物。式XXVII化合物具有下面的結構 其中-A-A-，-B-B-和R3如式XX中定義，且RX是任何一般的羥基保護基團。
使用上述製備式XVI化合物的方法，氧化式XXVII化合物，得到相應於式XXVI的新的化合物 其中-A-A-，-B-B-和R3如式XX中定義。特別優選的式XXIX，XXVIII，XXVII和XXVI化合物是其中-A-A-和-B-B-如式XIII中定義的那些化合物。
式XXVI產物是新的化合物，其可以通過沉澱/過濾來分離。其具有作為製備式I特別是式IA化合物的中間體的實際價值。特別優選的式XXVI化合物是其中-A-A-和-B-B-如式XIII中定義的那些化合物。在最為優選的式XXVI化合物中，-A-A-和-B-B-是-CH2-CH2-。
使用上面對於式VIII化合物的氰化作用定義的方法，將式XXVI新的中間體轉化成式XXV新的9-羥基烯胺中間體 其中-A-A-，R3和-B-B-如式XX中定義。
式XXV產物是新的化合物，其可以通過沉澱/過濾來分離。其具有作為製備式I特別是式IA化合物的中間體的實際價值。特別優選的式XXV化合物是其中-A-A-和-B-B-如式XIII中定義的那些化合物。在最為優選的式XXVI化合物中，-A-A-和-B-B-是-CH2-CH2-。
基本上使用上述對於製備式VI二酮化合物描述的條件，將式XXV9-羥基烯胺中間體轉化成式XIV二酮化合物。注意在該例子中，反應有效地同時進行烯胺結構的水解和9，11位的脫水，產生9，11雙鍵。然後使用上述方法3中描述的相同步驟，將式XIV化合物轉化成式XXXI化合物，然後生成式XIII化合物。
在一個特別優選的實施方案中，如下進行方法5的全部過程
方法6方法6提供了製備epoxymexrenone和其它相應於式I的化合物的好的方法，用11α-羥基化的雄烯二酮或其它式XXXV化合物開始 其中-A-A-，R3和-B-B-如式XIII中定義，產生相應於式XXXVI的中間體 其中-A-A-，R3和-B-B-如式XIII中定義。除了底物的選擇，進行11α-羥基化的方法基本上根據上述方法1的說明。下面的微生物適於進行雄烯二酮或其它式XXXV化合物的11α-羥基化作用赭色麴黴(Aspergillus ochraceus)NRRL 405(ATCC 18500)；黑色麴黴(Aspergillus niger)ATCC 11394；構巢麴黴(Aspergillus nidulans)ATCC 11267；米根黴(Rhizopus orvzae)ATCC 11145；葡枝根黴(Rhizopus stolonifer)ATCC 6227b；玫瑰單端孢(Trichothecium roseum)ATCC 12519和ATCC 8685。
接著11α-羥基雄甾-4-烯-3，17-二酮，或其它式XXXVI化合物通過在一種酸催化劑存在下與一種醚化劑例如原甲酸三烷基酯反應而轉化成式(101)11α-羥基-3，4-烯醇醚 其中-A-A-，R3和-B-B-如式XIII中定義，R11是甲基或其它低級烷基(C1-C4)。為了進行該轉化作用，通過與一種酸，例如苯磺酸水合物或甲苯磺酸水合物混合，來酸化11α-羥基底物，並且溶解於低級醇溶劑優選乙醇中。在保持混合物冷卻的同時，優選保持在大約0℃-大約15℃，在5-40分鐘期間內，逐漸加入原甲酸三烷基酯，優選原甲酸三乙酯。然後將混合物升溫，反應在大約20℃-大約60℃之間的溫度下進行。優選反應在30℃-50℃進行1-3小時後加熱到回流反應一段時間，一般是2-6小時，來完成反應。將反應混合物冷卻，優選冷卻到0℃-15℃，優選冷卻到大約5℃，並且真空去除溶劑。
使用上述方法3中式XX化合物轉化成式XVII化合物的相同反應方法，向式101化合物引入式XXXIII17-螺內酯部分。例如，式101底物可以在合適的溶劑例如DMSO中在一種鹼例如鹼金屬氫氧化物存在下與一種Sulfonium ylide反應，產生相應於式102的中間體
其中-A-A-，R3，R11和-B-B-如式101中定義。然後式102中間體在一種鹼金屬烷氧化物存在下與一種丙二酸二酯反應，形成5元螺內酯環，並且產生式103中間體 其中-A-A-，R3，R11和-B-B-如式101中定義，R12是C1-C4低級烷基。最後在一種鹼金屬滷化物存在下將合適的溶劑例如二甲基甲醯胺中的式103化合物加熱，去除烷氧羰基部分，產生式104中間體 其中-A-A-，R3，R11和-B-B-如式XIII中定義。
接著3，4-烯醇醚化合物104被轉化成式XXIII化合物，即其中R8和R9一起形成式XXXIII部分的式VIII化合物。該氧化步驟基本上以方法4合成中式XXIV化合物轉化成式XXIII中間體的氧化步驟相同的方法進行。直接氧化可以使用一種試劑例如2，3-二氯-5，6-二氰基-1，4-苯並醌(DDQ)或四氯苯並醌(氯醌)進行，或者優選進行兩個階段的氧化作用，首先溴化，例如用N-滷代溴化劑例如N-溴代琥珀醯胺(NBS)或1，3-二溴-5，5-二甲基乙內醯脲(DBDMH)，然後用一種鹼，例如用DABCO，在溴化鋰存在下並且加熱，進行脫溴化氫。使用NBS進行溴化的情況下也必須使用酸，以便將3-烯醇醚轉化成烯酮。對於溴化和烯醇醚向烯酮的轉化，一種離子型的、而不是游離基溴化劑的DBDMH自身是有效的。
然後通過方法1中描述的步驟將式VIII化合物轉化成epoxymexrenone或其它式I化合物。
各式101，102，103和104中間體是新的化合物，具有作為epoxymexrenone或其它式IA和I化合物的中間體的實際價值。在各式101，102，103和104化合物中-A-A-和-B-B-優選是-CH2-CH2-，R3是氫，低級烷基或低級烷氧基。更優選的是，式101化合物是3-乙氧基-11α-羥基雄甾-3，5-二烯-17-酮，式102化合物是3-乙氧基螺[雄甾-3，5-二烯-17β，2』-環氧]-11α-醇，式103化合物是3-乙氧基-11α-17α-二羥基孕甾-3，5-二烯-21，21-二羧酸氫乙酯，γ-內酯，式104化合物是3-乙氧基-11α-17α-二羥基孕甾-3，5-二烯-21-羧酸，γ-內酯。
在一個特別優選的實施方案中，如下進行方法6的全部過程
方法7方法7提供了製備epoxymexrenone和其它式I化合物的方法，用包括β-谷甾醇，膽甾醇，豆甾醇或其它式XXXVII化合物的起始底物 其中-A-A-，R3和-B-B-如式XIII中定義，D-D是-CH2-CH2-或-CH＝CH-，並且各R13，R14，R15和R16獨立地選自氫或C1-C4烷基。
在合成的第一個步驟中，通過式XXXVII化合物的生物轉化來製備11α-羥基雄甾烯二酮或其它式XXXVI化合物。生物轉化過程基本上根據上述對於烯睪丙內酯(或者其它式XIII底物)的11α-羥基化作用描述的方法進行。
在製備11α-羥基雄甾烯二酮中，最初通過式XXXVII化合物的生物轉化來製備4-雄甾烯-3，17-二酮。最初的生物轉化可以用美國專利3759791中描述的方法進行，該專利引作參考。然後，基本上根據上文對於烯睪丙內酯(或者其它式XIII底物)的11α-羥基化作用描述的方法將4-雄甾烯-3，17-二酮轉化成11α-羥基雄甾烯二酮。
方法7合成的其它部分與方法6相同。在一個特別優選的實施方案中，如下進行方法7的全部過程
在下面的實施例中進一步詳細說明本發明方法，步驟和組分，以及這裡所使用的條件和試劑。
實施例1用表1列出的生長培養基製備斜面培養物(Slants)
為了製備第一代培養基，將赭色麴黴懸浮於試管中的蒸餾水中(2ml)；將這種懸浮液0.15ml等份加到如上述已經製備的斜面上。這些斜面在25℃溫育7天，其後表面培養物的外觀是白色棉毛狀菌絲體。反向下部染成橙色，下部染成橘黃色。
第一代斜面培養物懸浮於含有吐溫80非離子表面活性劑(3％重量)的滅菌溶液中(4ml)，該懸浮液的0.15ml等份用來接種第二代斜面，第二代斜面用表2列出的生長培養基製備
第二代斜面培養物在25℃保溫10天，產生大量金黃色孢子；反向染成棕橙色。
製備具有表3列出組成的保護培養基。
來自5個第二代斜面培養的培養物懸浮於100ml燒瓶中的保護溶液(15ml)中該懸浮液分布在100×10mm試管中的等份中(每份0.5ml)，用於凍幹。這些在-70℃至-80℃在丙酮/乾冰浴中預冷凍20分鐘，然後立即轉移到預先冷卻到-40℃至-50℃的乾燥的室內。這些預冷凍等份在50μHg餘壓和≤-30℃時凍幹。凍幹後向每個帶有溼度計的試管加入2-3粒滅菌矽膠，並火焰密封。
為了獲得適於工業規模發酵的母代斜面培養物，將已經在上述方法中製備的單一等份的凍幹培養物懸浮於蒸餾水(1ml)中，並用0.15ml等份接種提供有表2列出的組成的生長培養基的斜面。母代斜面在25℃保溫7天，保溫後，在斜面上生長的培養物在4℃下貯存。
為了製備常規培養物，將來自母代斜面的培養物懸浮於含有吐溫80(3％重量)的滅菌溶液中，得到的懸浮液的0.15ml等份分布在包被有表2描述的生長培養基的斜面上。常規斜面培養物可以用來接種用於實驗室或工業發酵的第一代菌種瓶。
為了製備第一代接種瓶，將根據上述製備的來自常規斜面的培養物移出並懸浮於含有吐溫80(3％重量)的溶液(10ml)中。將0.1等份得到的懸浮液加入到含有表4列出組成的生長培養基的500ml帶有隔板的燒瓶中。
菌種瓶在旋轉振蕩器(200rpm，5cm移動度)中在28℃保溫24小時，結果得到具有直徑3-4mm類小丸狀的菌絲體。顯微鏡觀察下，發現菌種培養物是純的培養物，聯絲生長(這個術語用於描述用顯微鏡觀察到的真菌細胞的長的、扭絞的、素狀的排列)，有大的菌絲，並且很好地扭曲。懸浮液的pH是5.4-5.6。根據通過離心(3000rpm×5分鐘)測定，PMV是5-8％。
通過用來自菌種培養瓶的生物質(1ml)的第二代500ml振蕩瓶中接種具有表4列出組成的生長培養基(100ml)來製備轉化瓶培養物。得到的混合物在旋轉振蕩器(200rpm，5cm移動度)中在28℃保溫18小時。檢查培養物，發現含有直徑3-4mm類小丸狀的菌絲體。顯微鏡檢查下，測定出培養物是純的培養物，聯絲絲狀生長，其中頂端細胞滿是細胞質，並且老化的細胞幾乎沒有液泡化。培養物懸浮液的pH是5-5.2。通過離心測定PMV是10-15％之間。因此認為該培養物適於烯睪丙內酯向11α-羥基烯睪丙內酯的轉化。
將烯睪丙內酯(1g)微粒化成大約5μ並懸浮於滅菌水中(20ml)。向該反應液加入40％(w/v)滅菌葡萄糖溶液；16％(w/v)自溶酵母滅菌溶液；和滅菌抗生素溶液；所有比例在表5中0反應時間一行裡給出。將硫酸卡那黴素(40mg)，四環素鹽酸鹽(40mg)和頭孢氨苄(200mg)溶解於水(100ml)來製備抗生素溶液。逐漸向振蕩瓶中的培養物加入甾類化合物懸浮液，葡萄糖溶液，和自溶酵母溶液。
隨著反應的進行，定期分析反應混合物以測定葡萄糖含量。用薄層色譜測定向11α-羥基烯睪丙內酯的轉化作用。以控制保持葡萄糖含量在大約0.1％重量範圍內的速度在反應期間向發酵反應混合物中加入另外的烯睪丙內酯底物和培養物。甾類懸浮液，葡萄糖溶液，自溶酵母溶液和抗生素溶液的添加方案在表5中列出。轉化反應在旋轉振蕩器(200rpm，5cm移動度)上在25℃持續96小時。發酵期間pH範圍在4.5和6之間。無論什麼時候PMV升至或高於60％時，從中取出10ml肉湯培養物並代之以10ml蒸餾水。在發酵周期開始以後在反應期間在4，7，23，31，47，55，71，80，和96小時時間間隔處通過從肉湯中取樣並且用TLC分析，來監測烯睪丙內酯的消失和11α-羥基烯睪丙內酯的出現。根據對這些樣品測定，該反應進程在表6中列出。
*Rf.和RF.是「相對於溶劑前沿(relative to solvent front)」的縮寫，用於薄層色譜中描述化合物相對於溶劑前沿的移動。
實施例2根據實施例1描述的方法製備第一代菌種瓶培養物。製備具有表7列出的組成的培養混合物。
向10L幾何體積的轉化發酵罐中最初加入這樣的營養化合物(4L)。發酵罐為圓筒型，高度與直徑比是2.58。每個發酵罐帶有一個400rpm汽輪式攪拌器，其帶有兩個2號圓輪，6個葉片。葉輪的外徑是80mm，每個葉片的半徑大小是25mm，高30mm，上輪位於容器頂部以下280mm處，下輪位於頂部以下365mm處，容器的擋板高210mm，並且從容器內垂直壁半徑向內延伸25mm。
菌種培養物(40ml)與發酵罐中的營養物混合，並且通過在28℃，通氣速度是0.5l/分鐘，壓力是0.5kg/cm2下培養22小時，得到轉化培養物。在22小時時，培養物的PMV是20-25％，並且pH是5-5.2。
製備含有烯睪丙內酯(80g)的滅菌水(400ml)懸浮液，向轉化發酵罐中的混合物加入10ml。同時以表8中0小時反應時間處給出的比例加入40％(w/v)滅菌葡萄糖溶液；16％(w/v)自溶酵母滅菌溶液；和滅菌抗生素溶液。抗生素溶液用實施例1描述的方法製備。
隨著反應的進行，定期對反應混合物進行分析來測定葡萄糖含量，並且通過薄層色譜測定向11α-烯睪丙內酯的轉化作用。以根據下文所述的對反應肉湯樣品的TLC分析為基礎，因為烯睪丙內酯底物被消耗，所以向反應混合物加入另外的烯睪丙內酯。也監測葡萄糖水平，而且不管什麼時候葡萄糖濃度降到大約0.05％重量或更低，要加入補充的葡萄糖溶液，將濃度提高到大約0.25％重量。在反應周期期間在不連續的時間也加入營養和抗生素。甾類懸浮液，葡萄糖溶液，自溶酵母溶液和抗生素溶液的添加方案在表8中列出。轉化反應以每分鐘每體積液體0.5體積，正壓頭是0.3kg/cm2的通空氣速度持續90分鐘。溫度保持在28℃，直到PVM達到45％，然後降到26℃，並且保持在該溫度，PMV從45％升至60％，之後控制在24℃。初始攪拌速度是400rpm，40小時後升至700rpm。根據指出的，通過加入2M正磷酸或2M氫氧化鈉，將pH保持在4.7和5.3之間。隨著泡沫的產生，通過加入幾滴消泡劑SAG471來控制發泡。反應期間以4小時的間隔通過對肉湯樣品的TLC分析來監測烯睪丙內酯的消失和11α-羥基烯睪丙內酯的出現。當大部分烯睪丙內酯從肉湯中消失時加入另外的增量數。
加入所有的烯睪丙內酯之後，當TLC分析顯示烯睪丙內酯底物相對於11α-羥基烯睪丙內酯產物的濃度降低到大約5％時中止反應。
反應周期結束時，發酵肉湯通過乾酪衣過濾，以從液體肉湯中分離菌絲體。將菌絲體級分重新懸浮於乙酸乙酯中，每克反應過程中加入的烯睪丙內酯用大約65體積(5.2升)。菌絲體的乙酸乙酯懸浮液在攪拌下回流1小時，冷卻到大約20℃，在Buchner上過濾。依次用乙酸乙酯(每克烯睪丙內酯加量5體積；0.4L)和去離子水(500ml)洗滌菌絲體濾餅，從濾餅上去除乙酸乙酯提取液。棄除濾餅。將富集的提取液，洗滌液和水洗液收集在分離器中，然後靜置2小時以相分離。
然後棄除含水相，並且將有機相真空濃縮，使殘留體積達350ml。將靜止的底部冷卻到15℃，並在攪拌下保持大約1小時。過濾得到的懸浮液，取出結晶產物，並用乙酸乙酯(40ml)洗滌過濾濾餅。乾燥後測定11α-羥基烯睪丙內酯產量是60g。
實施例3用實施例1描述的方法由常規斜面製備孢子懸浮液。在2000ml有隔板的圓底燒瓶中(3個隔板，每個隔板50mm×30mm)，向具有表4組成的營養溶液(500ml)中加入1等份(0.5ml)孢子懸浮液。得到的混合物在燒瓶中在交替振蕩器上(每分鐘振蕩120次；5cm移動度)在25℃溫育24小時，得到培養物，在顯微鏡下觀察，發現是純的培養物，菌絲很好地扭曲。培養物的pH在大約5.3和5.5之間，PMV(根據通過在3000rpm離心5分鐘測定)是8-10％。
使用這樣製備的培養物，在垂直圓筒狀不鏽鋼發酵罐中製備菌種培養物，發酵罐幾何體積是160L，縱橫尺寸比是2.31(高＝985mm；直徑＝425mm)。每個發酵罐帶有一個汽輪式攪拌器，其帶有兩個圓輪，每個圓輪有6個葉片，葉輪的外徑是240mm，每個葉片的半徑大小是80mm，高50mm，上輪位於發酵罐頂部以下780mm處，第二個輪位於995mm深度處，垂直的擋板高890mm，並且從發酵罐內垂直壁半徑向內延伸40mm。攪拌在170rpm下操作。向發酵罐加入表9列出組成的營養混合物(100L)，接著加入一部分如上製備的pH為5.7的原種菌(1L)。
接種的混合物在通氣速度是0.5L/L-min，壓頭是0.5kg/cm2下培養22小時。溫度控制在28℃，直到PMV達到25％，然後降到25℃。pH控制在5.1-5.3之間。菌絲體體積的生長見表10，還有pH和菌種培養反應的溶解的氧氣的曲線。
使用這樣製備的菌種培養物，在圓筒狀不鏽鋼發酵罐中進行轉化發酵，發酵罐直徑是1.02m，高1.5m，幾何體積是1.4m3。每個發酵罐帶有一個汽輪式攪拌器，其帶有兩個葉輪，一個輪位於發酵罐頂部以下867cm處，另一個輪位於頂部以下1435cm處，每個圓輪有6個葉片，葉片半徑95cm，高75cm，垂直的擋板高1440cm，並且從發酵罐內垂直壁半徑向內延伸100cm。製備具有表11列出組成的營養混合物
向發酵罐中加入初始量(170L)的該營養混合物(pH＝5.7)，接著加入如上製備的該實施例的菌種接種物(7L)。
含有接種物的營養混合物在通氣速度是0.5L/L-min，壓頭0.5kg/cm2下培養24小時，溫度保持在28℃，攪拌速度是110rpm。表12中給出了菌絲體體積的生長，還有pH和菌種培養反應的溶解的氧氣的曲線。
培養結束後，發現菌絲體呈小丸狀，但是這些小丸一般較小並且相對疏鬆地聚集。分散的菌絲體懸浮於肉湯中。最終pH是5.1-5.3。
向這樣製備的轉化培養物中加入烯睪丙內酯(1.250kg；顆粒化為5μ)的滅菌水(5L)的懸浮液。以表14中0反應時間指出的比例加入滅菌的添加物溶液和抗生素溶液。附加溶液的組成在表13中列出。
在通氣速度是0.5L/L-min，壓頭0.5kg/cm2下將生物轉化進行大約96小時，如果需要，通過加入7.5M氫氧化鈉或4M磷酸調節pH範圍是4.7-5.3。攪拌速度最初是100rpm，在40小時時提高到165rpm，在64小時時是250rpm。初始溫度是28℃，當PMV達到45％時降到26℃，PMV升至60％時降到24℃。根據需要加入細滴中的SAG471來控制發泡。以4小時間隔監測發酵中葡萄糖水平，不管什麼時候葡萄糖濃度降至1gpl以下時向體系中加入增量的滅菌添加物溶液(10L)。反應期間用HPLC監測烯睪丙內酯的消失和11α-羥基烯睪丙內酯的出現。當至少最初烯睪丙內酯加入量的90％轉化成11α-羥基烯睪丙內酯時，加入1.250kg增量的烯睪丙內酯。當增量中90％烯睪丙內酯已經轉化時，加入另一份1.250kg增量。使用相同的標準加入進一步的增量(一份1.250kg)，直到加入反應器的總量(20kg)。向反應器加入全部的烯睪丙內酯量後，當未反應的烯睪丙內酯相對於產生的11α-羥基烯睪丙內酯的量的濃度是5％時中止反應。表14中給出了加入烯睪丙內酯，滅菌附加溶液，和抗生素溶液的方案。
當生物轉化完全時，通過在籃狀離心機中離心從肉湯中分離菌絲體。對濾液進行HPLC測定，只含有肉湯中11α-羥基烯睪丙內酯總量的2％，因此省去濾液。將菌絲體懸浮於2m3容積提取罐中的乙酸乙酯中(1000L)。攪拌和乙酸乙酯回流條件下將懸浮液加熱1小時後冷卻，並在籃狀離心機中離心。菌絲體濾餅用乙酸乙酯(200L)洗滌後出料。使富集甾類的溶劑提取液靜置1小時以分離水相。水相用又一些量的乙酸乙酯(200L)萃取後棄除。離心澄清合併的溶劑相併置於濃縮器中(500L幾何體積)，並真空濃縮，得到100L殘餘體積。在進行蒸發時，加入到濃縮器中的合併的提取液和洗液溶液的初始量是100L，隨著溶劑的去除，通過連續或周期性加入合併的溶液來保持該體積不變。蒸發步驟完全後，蒸發器的底部冷卻到20℃，並且攪拌2小時，之後在Buchner過濾器上過濾。濃縮器釜用乙酸乙酯(20L)洗滌，然後用該洗滌溶液來洗滌過濾器上的濾餅。產物在50℃真空下乾燥16小時，11α-羥基烯睪丙內酯產量14千克。
實施例4赭色麴黴NRRL405的凍幹的孢子懸浮於具有表15給出組成的玉米漿生長培養基(2ml)中
在用於瓊脂平板上孢子繁殖的接種物中使用得到的懸浮液。製備10個瓊脂平板，每個平板含有表16給出組成的固體葡萄糖/酵母抽提物/磷酸鹽/瓊脂生長培養基
0.2ml等份懸浮液轉移到每個平板的表面。平板在25℃溫育10天。然後將孢子從所有的平板收集到具有表17給出組成的滅菌冷保護培養基中
得到的懸浮液分裝在20個小瓶中，每個小瓶轉移1ml。這些小瓶構成主細胞庫，其可以用來產生在用於烯睪丙內酯向11α-羥基烯睪丙內酯生物轉化的接種物的傳代中使用的工作細胞庫。在-130℃在液氮冷凍器的氣相中貯存含有主細胞庫的小瓶。
為了開始製備工作細胞庫，將來自單個主細胞庫小瓶的孢子再懸浮於具有表15列出組成的滅菌生長培養基(1ml)中。懸浮液分作10個0.2ml等份，每一等份用來接種具有表16列出組成的固體生長培養基的瓊脂平板。這些平板在25℃溫育10天。在溫育的第3天，生長培養基的下部變為棕-橙色。溫育後，大量產生金黃色孢子。通過上述用來製備主細胞庫的方法收集各平板的孢子。總共製備了100個小瓶，每個小瓶含有1ml懸浮液。這些小瓶構成工作細胞庫。小瓶也在-130℃在液氮冷凍器的氣相中貯存。
向250ml Erlenmeyer燒瓶中加入具有表15列出組成的生長培養基(50ml)。向燒瓶中加入一等份(0.5ml)工作細胞懸浮液，並與生長培養基混合。接種的混合物在25℃保溫24小時，產生合併的菌絲體體積百分數大約是45％的第一代菌種培養物。目測培養物，發現含有直徑1-2mm的類小丸狀菌絲體；顯微鏡觀察發現其是純的培養物。
通過向2.8L Fernbach燒瓶中加入具有表15列出組成的生長培養基，然後用一部分(10ml)該實施例第一代菌種培養物接種該培養基，開始第二代菌種培養物的培養，第一代菌種培養物的繁殖如上所述。接種的混合物在旋轉振蕩器上(200rpm，5cm移動度)在25℃保溫24小時。保溫後，該培養物具有如上對於第一代菌種培養物描述的相同的性質，並且適用於其中烯睪丙內酯生物轉化成11α-烯睪丙內酯的轉化發酵。
在Braun E Biostat發酵罐中進行轉化，發酵罐指標如下容積 15L，圓底高度 53cm直徑 20cmH/D2.65葉輪 直徑7.46cm，6個葉片每個2.2×1.4cm葉輪間距 自罐底部65.5，14.5和25.5cm擋板 4個，1.9×48cm分布器 直徑10.1cm，21個孔-1mm直徑溫度控制 通過外部容器套方法提供將烯睪丙內酯以20g/L的濃度懸浮於去離子水(4L)中，並且在發酵罐中的混合物在300rpm下攪拌時加入一部分(2L)具有表18列出組成的生長培養基。
得到的懸浮液攪拌15分鐘，之後用附加的去離子水將體積增加到7.5L。在這時，懸浮液的pH通過加入20％重量氫氧化鈉溶液而調至5.2-6.5，然後將懸浮液在Braun E發酵罐中通過在121℃加熱30分鐘來滅菌。滅菌後的pH是6.3±0.2，終體積是7.0L。用一部分(0.5L)上述製備的該實施例的第二代菌種培養物接種滅菌的懸浮液，通過加入50％滅菌葡萄糖溶液將體積增加到8.0L。使發酵在28℃的溫度下進行，直到PMV達到50％，然後降溫到26℃，當PMV超過50％時，為了保持恆定的PMV低於大約60％，進一步降溫到24℃。空氣通過分布器按以初始液體體積為基礎0.5vvm的速度通入，發酵罐中的壓力保持在700毫巴規量。攪拌開始是600rpm，根據要保持溶解的氧氣的濃度高於30％體積的需要，逐步增加到1000rpm。監測葡萄糖濃度。因為發酵反應消耗葡萄糖，在初始的高葡萄糖濃度降至低於1％時，用50％重量滅菌葡萄糖溶液提供補充的葡萄糖，來保持一批生產周期剩餘時間內具有0.05％-1％範圍內的濃度。接種前pH是6.3±0.2。在最初發酵周期期間pH降至大約5.3後，通過加入氫氧化銨來保持周期的剩餘時間內的pH在5.5±0.2範圍內。通過加入聚乙二醇消泡劑控制發泡，該消泡劑由OSISpecialties，Inc以商品名SAG 471出售。
培養物的生長主要發生在周期的頭24小時，此時PMV是大約40％，pH是大約5.6，並且溶解的氧氣的量是大約50％體積。隨著培養物的生長開始烯睪丙內酯的轉化。在生物轉化期間通過每天進行分析監測烯睪丙內酯和11α-羥基烯睪丙內酯的濃度。用熱的乙酸乙酯萃取樣品，並且用TLC和HPLC分析得到的樣品溶液。當殘留的烯睪丙內酯濃度大約是初始濃度的10％時，認為生物轉化完全。大約的轉化時間是110-130小時。
當生物轉化完全時，通過離心從肉湯中分離菌絲體生物質。用等體積乙酸乙酯萃取上清液，棄除水相。將菌絲體級分重新懸浮於乙酸乙酯，每克加入到發酵反應器中的烯睪丙內酯大約使用65體積。攪拌下菌絲體懸浮液回流1小時，冷卻到大約20℃，在Buchner漏鬥中過濾。菌絲體濾餅用5體積的乙酸乙酯洗滌兩次然後用去離子水(1L)洗滌，取代殘留的乙酸乙酯。合併含水的萃取液，富集的溶劑，溶劑洗液和水洗液。根據對殘留的甾類化合物的分析決定殘留的沒用的菌絲體濾餅是棄除或者再萃取。使合併的液相放置2小時。然後，分離水相併棄除，真空下濃縮有機相，直到殘留體積是大約500ml。然後將靜止的瓶冷卻到大約15℃，緩慢攪拌大約1小時。通過蒸發從結晶中棄除溶劑，結晶產物在50℃真空下乾燥。
實施例5赭色麴黴ATCC18500的凍幹的孢子懸浮於實施例4描述的玉米漿生長培養基(2ml)中。製備10個瓊脂平板，也是實施例4的方法。根據實施例4的描述培養並收集平板，含有主細胞庫的小瓶在-130℃在液氮冷凍器的氣相中貯存。
由一個主細胞庫的小瓶製備工作細胞庫，根據實施例4的描述製備工作細胞庫。在-130℃在液氮冷凍器中貯存。
向一個有擋板的2L燒瓶中加入具有表19列出組成的生長培養基(300ml)。向燒瓶中加入一等份(3ml)工作細胞懸浮液。接種的混合物在28℃在旋轉振蕩器上(200rpm，5cm移動度)保溫20-24小時，產生合併的菌絲體體積百分數大約是45％的第一代菌種培養物。目測培養物，發現含有直徑1-2mm的類小丸狀菌絲體；顯微鏡觀察發現其是純的培養物。
通過向14L玻璃發酵罐中加入具有表19列出組成的8L生長培養基開始第二代菌種培養物的培養，用160-200ml該實施例的第一代菌種培養物接種發酵罐，第一代菌種培養物的製備如上所述。
接種的混合物在28℃培養18-20小時，200rpm攪拌，通氣速度是0.5vvm。繁殖後，該培養物具有如上對於第一代菌種培養物描述的相同的性質。
基本上根據實施例4說明的方法在一個60L發酵罐中進行轉化，除了生長培養基具有表20列出組成，並且第二代菌種培養物的初始量是350ml至700ml。攪拌速度開始是200rpm，根據要保持溶解的氧氣高於10％體積的需要增加到500rpm。對於20g/L烯睪丙內酯，大約的生物轉化時間是80-160小時。
實施例6使用根據實施例4描述的方法產生的工作細胞庫的孢子懸浮液，還是基本上用實施例4描述的方法製備第一代和第二代菌種培養物。使用該方法產生的第二代菌種培養物，根據圖1詳述的改進的方法類型進行兩個生物轉化，並且根據圖2詳述的改進的方法類型進行兩個生物轉化。表21給出了進行這些轉化的轉化生長培養基，烯睪丙內酯加入方案，收集時間，和轉化程度。進行R2A使用了以實施例3的相同原理為基礎的烯睪丙內酯加入方案，同時，進行R2C通過只加入兩次烯睪丙內酯，一次在一個批量開始時，一次在24小時之後，來改變實施例3的方案。進行R2B和R2D時，在一次生產批量開始時加入全部的烯睪丙內酯的量，該過程一般以實施例4描述的方法進行，除了在加入到發酵罐之前，烯睪丙內酯進料在分開的容器中滅菌，並且隨著一次生產批量的進行加入葡萄糖。使用韋林氏摻合器來減少滅菌中產生的塊。進行R2A和R2B時，向批量的甲醇溶液中加入烯睪丙內酯，其中預期這些操作分別進一步不同於實施例3和實施例4的操作。
*OSA意指由美國OSI Specialties Company，Sistersville，West Virginia製造的抗泡沫劑SAG471。在進行R2A和R2B時，發酵液中甲醇濃度積累到大約6.0％，發現其抑制培養物的生長和生物轉化。但是，以這些操作的結果為基礎，認為甲醇或其它水互溶性溶劑可以在低濃度下有效作用，來提高烯睪丙內酯量，並且以細顆粒沉澱物提供烯睪丙內酯，提供大的界面面積，向反應提供烯睪丙內酯。
證明烯睪丙內酯在滅菌條件下(121℃)穩定，但是凝集成塊。使用韋林氏摻合器將這些塊破碎成細小顆粒，其成功地轉化成產物。
實施例7使用根據實施例4描述的方法產生的工作細胞庫的孢子懸浮液，還是基本上用實施例4描述的方法製備第一代和第二代菌種培養物。實施例7的說明和結果在表22中給出。使用該方法產生的第二代菌種培養物，基本上根據實施例3的描述進行一次生物轉化(R3C)，並根據實施例5概述的方法進行3次生物轉化。在後三次中(R3A，R3B和R3D)，烯睪丙內酯與除了葡萄糖以外的生長培養基一起在輕便型容器中滅菌。葡萄糖由另一個容器無菌加入。在接種之前或在生物轉化早期階段向發酵罐加入滅菌的烯睪丙內酯懸浮液。在R3B操作中，在46.5處加入補充的滅菌烯睪丙內酯和生長培養基。滅菌時形成的烯睪丙內酯塊通過韋林氏摻合器破碎，這樣生產出進入到發酵罐的細小顆粒懸浮液。表22和23列出了轉化生長培養基，烯睪丙內酯加入方案，營養物加入方案，收集時間，和這些操作的轉化程度。
因為是絲狀生長，所以在該實施例所有4種操作中可見高粘度發酵肉湯。為了克服高粘度產生的有關通氣，混合，pH控制和溫度控制的障礙，在這些操作中提高了通氣速度和攪拌速度。轉化在更嚴格的條件下令人滿意地進行，但是在液態肉湯表面上形成緻密的塊狀物。一些未反應的肉湯通過這種塊狀物帶出肉湯。
實施例8實施例8的說明和結果總結於表24。進行4種發酵操作，其中通過烯睪丙內酯的生物轉化產生11α-羥基烯睪丙內酯。在兩次發酵中(R4A和R4D)，基本上以實施例6的R3A和R3D操作相同的方法進行生物轉化。在R4C操作中，烯睪丙內酯一般以實施例3描述的方法轉化成11α-羥基烯睪丙內酯。在R4B操作中，一般以實施例4描述的方法進行轉化，即在接種前在發酵罐中將烯睪丙內酯和生長培養基滅菌，在一批生產量開始時加入所有的氮和磷營養物，並且向發酵罐加入只含有葡萄糖的補充溶液來保持隨著生產進行期間的葡萄糖的水平。在後一過程中(R4B操作)，每6小時監測葡萄糖濃度，根據控制葡萄糖水平在0.5-1％範圍內的指示加入葡萄糖溶液。表25給出了進行這些操作的烯睪丙內酯加入的方案。
在大多數發酵周期中所有的發酵物在高攪拌和通氣下進行工作，因為發酵液在接種後一天內或左右變得高度粘稠。
實施例9表26列出了該實施例這些操作的轉化生長培養基，烯睪丙內酯加入方案，收集時間，和轉化程度。
除了下面說明外，基本上根據對於實施例8R4B操作說明的方法進行4次生物轉化。在R5B操作中，用向下抽吸船用葉輪[葉輪(impeller)是一種機械裝置，由與發酵罐的攪拌軸同心相連的轂(hub)相連的葉片構成。葉輪能使發酵罐中的流體移動並混合而且還能分散空氣。船用葉輪(marine impeller)具有船螺漿形狀的葉片，能使液體以特定的方向、主要是向上或向下流動]代替在其它操作中用於攪拌的頂部渦輪圓輪。向下抽吸軸向作用將肉湯倒向發酵物中心，並減少了塊的形成。在R5D操作中接種後立即加入甲醇(200ml)。因為烯睪丙內酯是在發酵罐中滅菌的，除了葡萄糖外的所有營養物在一批生產量開始時加入，避免了一連串加入氮源，磷源或抗生素。
為了保持液體表面生長的固相的浸入，在一批生產量開始96小時後向每個發酵罐加入生長培養基(2L)。通過加入生長培養基或者使用向下抽吸葉輪(R5B操作)者不能完全克服混合問題，但是操作結果證明該方法的可行性和優點，並且指明根據常規操作可以提供令人滿意的混合。
實施例10基本上以實施例9中說明的方法進行三次生物轉化。表27列出了轉化生長培養基，烯睪丙內酯加入方案，收集時間，和該實施例這些的轉化程度
在R6A操作71小時後加入生長培養基(1.3L)和滅菌水(0.8L)，以浸沒液體肉湯表面生長的菌絲體塊。為了相同的目的，在R6B操作95小時後加入生長培養基(0.5L)和滅菌水(0.5L)。物料平衡數據表明，液體表面形成塊最少情況下，測得更好的質量平衡。
實施例11進行幾輪發酵操作來比較烯睪丙內酯的預滅菌作用和轉化發酵罐中烯睪丙內酯和生長基的滅菌作用。在R7A中，根據圖2的說明，在類似於R2C，R2D，R3A，R3B，R3D，R4A和R4D的條件下進行該方法。R7B操作根據圖3的詳細說明在類似於實施例4，9和10，及R4B操作的條件下進行。表28列出了該實施例各操作的轉化生長培養基，烯睪丙內酯加入方案，收集時間，和轉化程度
以從R7B操作取出的最終樣品為基礎的質量平衡是89.5％，表明生物轉化中沒有明顯的底物損失或降解。認為混合對於兩種操作是適當的。
最初80小時期間殘留的葡萄糖的濃度高於期望的5-10gpl控制範圍。處理效率明顯不受兩個發酵罐上方空間中蓄積的輕餅的影響。
實施例12在表29中總結的一系列1L提取操作中測定提取效率。在這些操作的每一種操作中，用乙酸乙酯(1L/L發酵體積)從菌絲體中提取甾類化合物。在每一種操作中進行兩次連續提取。以RP-HPLC為基礎，第一次提取中回收了總的甾類化合物的大約80％；第二次提取回收率提高到95％。第三次提取又回收了3％甾類化合物。損失上清液含水相中殘留的2％。使用真空使提取液至幹，而不使用任何其他溶劑洗滌。如果通過工藝經濟學證明是正確的，則用溶劑處理會提高自初始提取物的回收率。
作為在1L肉湯規模時11α-羥基烯睪丙內酯的提取/結晶溶劑，評定甲基異丁基酮(MIBK)和甲苯。使用如上所述的提取方案，MIBK和甲苯在提取效率和結晶效率方面與乙酸乙酯類似。
實施例13作為圖2和3方法的評價的一部分，對這些方法的每一個中的發酵循環開始時提供的烯睪丙內酯底物進行了顆粒大小研究。如上所述，在加入發酵罐中之前，將向圖1方法加入的烯睪丙內酯微粒化。在該方法中，烯睪丙內酯沒有被滅菌，而通過加入抗生素來控制不期望的微生物的生長。在圖2和3的方法中，在反應前將烯睪丙內酯滅菌。在圖2方法中，在將烯睪丙內酯加入到發酵罐之前，在一個摻合器中滅菌。在圖3方法中在一批生產量開始時，將烯睪丙內酯在生長基中的懸浮液滅菌。如上所討論的，滅菌作用有引起烯睪丙內酯顆粒團聚的趨勢。因為烯睪丙內酯在含水培養基有限的溶解度，該方法的產率取決於從固相轉移的質量，因此預期取決於固體顆粒底物存在的界面面積，接著取決於顆粒大小分布。這些考慮最初作為圖2和3的方法的阻礙。
但是發現圖2的摻合器和圖3的發酵罐中的攪拌作用以及圖2中一批生產量的轉移所使用的剪切泵的作用，共同將結塊降解成顆粒大小範圍合理，類似於向圖1方法中加入的未滅菌和微粒化的烯睪丙內酯的大小。這可通過三種方法的每一種中反應周期開始時得到的烯睪丙內酯的顆粒大小的分布來進行詳細說明。參見表30和圖4和5。
由表30數據注意到，攪拌器和剪切泵有效地將滅菌烯睪丙內酯平均顆粒大小減小到和未滅菌底物相同級別，但是未滅菌底物保持明顯的大小差異。儘管存在該差別，但是反應效率數據表明預先滅菌方法至少與圖1方法一樣有效果。通過進一步減小和控制顆粒大小的一些步驟，例如滅菌的烯睪丙內酯的溼磨，和/或通過巴斯德氏消毒而不是滅菌，可以顯示出表圖2方法的進一步的優點。
實施例14根據實施例5描述的方法製備菌種培養物。20小時時，種菌發酵罐中的菌絲體是漿狀，PMV是40％。其pH是5.4，並且14.8gpl葡萄糖保留沒有使用。
製備具有表20所示組成的轉化生長基(35L)。在製備進料培養基中，葡萄糖和酵母抽提物分開滅菌，並混合成單一進料，初始濃度為30％重量葡萄糖和10％重量酵母抽提物。進料的pH調至5.7。
使用該培養基，(表20)，進行兩輪烯睪丙內酯向11α-羥基烯睪丙內酯的生物轉化。每一輪在安裝有帶有一個Rushton渦輪葉輪和兩個Lightnin』A315葉片的攪拌器的60L發酵罐中進行。
最初加入到發酵罐中的生長基是35L。加入微粒化和未滅菌的烯睪丙內酯，使初始濃度是0.5％。以初始接種比例是2.5％的比例，用在實施例5描述的方法中製備的菌種培養物接種發酵罐中的培養基。發酵在28℃的溫度下進行，攪拌速度是200-500rpm，通氣速度是0.5vvm，背壓足以保持溶解的氧氣的水平至少是20％體積。在生產操作中，轉化作用培養物生長成非常小的橢圓形小丸(大約1-2mm)。基本上以實施例1描述的方法向發酵罐中連續加入烯睪丙內酯和補充營養。每4小時加入營養物，比例是每升發酵罐中肉湯有3.4g葡萄糖和0.6g酵母抽提物。
表31列出的是該實施例各輪中的通氣速度，攪拌速度，溶解的氧氣，PMV，和所述時間間隔時實現的pH，以及每批生產量期間的葡萄糖的加入。表32給出烯睪丙內酯轉化曲線。46小時後終止R11A操作；R11B操作持續96小時。在後一操作中，81小時時達到93％轉化率；84小時時又加入進料；然後終止進料。注意進料終止時間和該操作終止時間之間發生的粘度的明顯變化。
實施例15根據上面概述的方法，對各種培養物測定烯睪丙內酯向11α-羥基烯睪丙內酯生物轉化中的效率。
根據實施例5的方法製備各黑色麴黴ATCC11394，無根根黴ATCC11145和葡枝根黴ATCC6227b的工作細胞庫。用來自工作細胞庫的孢子懸浮液(1ml)接種表18所示組成的生長基(50ml)並且放置在恆溫箱中。通過在26℃發酵大約20小時在恆溫箱中製備菌種培養物。對恆溫箱的振蕩速度是200rpm。
用各微生物菌種培養物等份(2ml)接種含有表18生長基(30ml)的轉化瓶。每個培養物用來接種兩個瓶，共六個瓶。在36℃將烯睪丙內酯(200mg)溶解於甲醇(4ml)，向各瓶中加入0.5ml等份該溶液。一般情況下，在實施例5描述的條件下，每天加入50％重量葡萄糖溶液(1ml)進行生物轉化。頭72小時後，在各轉化發酵瓶中生長的菌絲體上發現ATCC11394-很好均勻生長ATCC11145-頭48小時中很好生長，但是菌絲體聚成球；最後24小時中沒用明顯生長；ATCC6227b-很好生長，菌絲體質聚成球。取肉湯樣品分析生物轉化程度。三天後，使用ATCC11394的發酵向11α-羥基烯睪丙內酯的轉化達80-90％；ATCC11145提供50％的轉化；以及ATCC6227b提供80-90％的轉化。
實施例16基本上使用實施例15說明的方法，對附加的微生物測定烯睪丙內酯向11α-烯睪丙內酯生物轉化中的效能。試驗的微生物和試驗結果在表33中列出
1培養基CSL-玉米漿；TSB-胰蛋白酶大豆肉湯；P CSL-腖和玉米漿；BP-牛肉浸液和腖。
實施例17對各種微生物測定烯睪丙內酯向9α-烯睪丙內酯生物轉化中的效能。進行該實施例的發酵培養基根據表34所示製備表34
真菌在大豆粉培養基和腖-酵母抽提物葡萄糖中生長；atinomycetes和真桿菌在大豆粉(加0.9％重量甲酸鈉用於生物轉化)和Mueller-Hinton肉湯中生長。
用凍幹的孢子原種(在250mlErlenmayer瓶中的20ml大豆粉)接種起始培養物。瓶上蓋上乳濾器和生物屏蔽。用起始培養物(24或48小時生長)接種代謝培養物(也是在在250mlErlenmayer瓶中的20ml)-10％-15％雜交體積(指相對於接種的培養基體積的接種物體積)-後者在加入用於轉化反應的甾類化合物之前溫育24-48小時。
烯睪丙內酯溶解於/懸浮於甲醇(20mg/ml)，過濾滅菌，加入到培養物中使終濃度為0.1mg/ml。所有的轉化發酵瓶在溫度控制在26℃和60％溼度的室內在250rpm(2」擺度)振蕩。
加入底物後5和48小時，或24小時，收集生物轉化產物。向發酵瓶中加入乙酸乙酯(23ml)或二氯甲烷開始進行收集。然後發酵瓶振蕩2分鐘，將每個瓶中的物質倒入50ml錐形瓶。為了分離各相，在室溫下以4000rpm將試管離心20分鐘。將有機層從各試管中轉移到20ml硼矽酸鹽玻璃管形瓶中，在真空速(speed vac)(這是一個用於從少量樣品中除去溶劑的裝置用術語。該裝置通常對樣品施加真空，同時進行離心以加快溶劑蒸發)下蒸發。將管形瓶蓋蓋並且在-20℃儲存。
為了獲得用於結構測定的物質，通過將發酵振蕩瓶的數目增加到25個使生物轉化規模達到500ml。收集時(加入底物後24小時或48小時)，分別向每個瓶中加入乙酸乙酯，將瓶子蓋蓋，放回到振蕩器振蕩20分鐘。然後將瓶子中的物質倒入聚丙烯瓶，並離心分離固相，或者倒入分液漏鬥中通過重力使各相分離。乾燥有機相，得到包含在反應混合物中的甾類化合物的粗提取物。
首先在以螢光為背景的矽膠(250μm)板上(254nm)用薄層色譜分析反應產物。。向含有從反應混合物中提取出來的乾燥的乙酸乙酯提取物的各管形瓶中加入乙酸乙酯(500μl)。用高效液相色譜和質譜作進一步的分析。平板在95∶5v/v氯仿/甲醇介質中展開。
用高效液相色譜和質譜作進一步的分析。使用Millennium軟體，光電二極體陣列檢測器和自動取樣器的Waters HPLC。反相HPLC使用Waters NovaPakC-18(4μm顆粒度)RadialPak 4mm柱體。用水∶乙腈(75∶25)開始，水∶乙腈(25∶75)結束，開始25分鐘的線性溶劑梯度洗脫。接著是3分鐘梯度達到100％乙腈的洗脫，並且在初始條件下再生柱子之前進行4分鐘等度洗脫。
對於LC/MS，以2nM濃度向乙腈和水相加入乙酸銨。色譜不被明顯影響。將來自柱子的洗脫液分為22∶1，大部分材料送入PDA檢測器。剩餘的4.5％材料送入Sciex API III質譜儀的電子噴射離子化室。以陽極方式(positive mode)(它是一種以化學離子化陽離子模式更完全地描繪的質譜)進行質譜。來自HPLC上PDA檢測器的同係數據線將單波長色譜轉移給質譜用於UV和MS的共同分析。
質譜裂解方式圖用來將羥基化的底物分類。預期的兩種羥基化烯睪丙內酯，11α-羥基和9α-羥基，以一致方式在不同的頻率失水，其可以用作一種診斷劑。而且9α-羥基烯睪丙內酯比11α-羥基烯睪丙內酯更容易生成銨加成物。表35給出的是烯睪丙內酯發酵的TLC，HPLC/UV和LC/MS數據的總結，表明哪一種試驗的微生物在烯睪丙內酯向9α-羥基烯睪丙內酯的生物轉化中是有效的。其中優選的微生物是山扁豆生棒孢(Corynespora cassiicola)ATCC16718。
實施例18根據上文概述的方法對各種培養物測試雄甾烯二酮向11α-羥基雄甾烯二酮生物轉化的效率。
基本上根據實施例4描述的方法製備各赭色麴黴NRRL405(ATCC18500)；黑色麴黴ATCC11394和構巢麴黴ATCC11267；米根黴ATCC11145；葡枝根黴ATCC6227b；玫瑰單端孢ATCC12519和ATCC8685的工作細胞庫。用來自工作細胞庫的孢子懸浮液接種表18所示組成的生長基(50ml)，並且放置在恆溫箱中。通過在26℃發酵大約20小時在恆溫箱中製備菌種培養物。恆溫箱的振蕩速度是200rpm。
用各微生物菌種培養物等份(2ml)接種含有表15生長基(30ml)的轉化瓶。每個培養物用來接種兩個瓶，共十六個瓶。在36℃將雄甾烯二酮(300mg)溶解於甲醇(6ml)，向各瓶中加入0.5ml等份該溶液。一般情況下，在實施例6描述的條件下，生物轉化進行48小時。48小時後將肉湯樣品收集並根據實施例17用乙酸乙酯提取。蒸發濃縮乙酸乙酯，用薄層色譜分析樣品，確定是否存在具有類似於11α-羥基雄甾烯二酮標準(Sigma Chemical Co.，St.Louis)色譜遷移率的產物。結果見表36，正結果標記為「+」。
表36的數據證明所列的每一種培養物都能從雄甾烯二酮產生具有與11α-羥基雄甾烯二酮標準相同的Rf值的化合物。
用上述相同的方法對赭色麴黴NRRL405(ATCC18500)再次測定，通過常規相矽膠柱色譜用甲醇作為溶劑將培養物產物分離並純化。用薄層色譜分析級分。TLC板是Whatman K6F矽膠60埃，10×20大小，250μ厚的板。溶劑體系是甲醇∶氯仿，5∶95，v/v。用LC-MS和NMR光譜分析結晶產物和11α-羥基雄甾烯二酮標準物。兩種化合物得到相似的曲線和分子量。
實施例19對各種微生物測試mexrenone向11β-羥基mexrenone生物轉化的效率。根據表34製備用於該實施例的發酵培養基。
發酵條件與分析方法與實施例17相同。TLC板和溶劑體系與實施例18描述的相同。色譜分析原理如下11α-羥基mexrenone和11α-羥基烯睪丙內酯具有相同的色譜遷移率。11α-羥基烯睪丙內酯和9α-羥基烯睪丙內酯具有與11α-羥基雄甾烯二酮和11β-羥基雄甾烯二酮相同的遷移方式。因此，11β-羥基mexrenone應該具有與9α-羥基烯睪丙內酯相同的遷移率。因此從生長基中提取的化合物應該以9α-羥基烯睪丙內酯為標準進行操作。結果見表36。
1M＝Mueller-HintonP＝PYG(腖/酵母抽提物/葡萄糖)S＝大豆粉SF＝大豆粉加甲酸鹽2？＝與沒用底物對照的有疑問的區別。
這些數據表明該表中大部分微生物產生與從mexrenone得到的11β-羥基mexrenone相似或相同的產物。
實施例20方法1步驟1製備5』R(5』α)，7』β-20』-氨基十六氫-11』β-羥基-10』a，13』α-二甲基-3』，5-二氧螺[呋喃-2(3H)，17』α(5』H)-[7，4]亞甲基(metheno)[4H]環戊[a]菲]-5』-腈。
攪拌下向50加侖搪玻璃反應器中加入61.2L(57.8kg)DMF，接著加入23.5Kg 11-羥基烯睪丙內酯1。向反應物中加入7.1kg氯化鋰。將反應混合物攪拌20分鐘，加入16.9kg丙酮氰醇，接著加入5.1kg三乙胺。將混合物加熱到85℃並在此溫度下保持13-18小時。反應後加入353L水，接著加入5.6kg碳酸氫鈉。混合物冷卻到0℃，轉移到200加侖搪玻璃反應器中用130kg 6.7％次氯酸鈉溶液緩慢地中止。過濾產物並用3×40L水洗滌，得到21.4kg產物烯胺。

實施例21方法1步驟2製備4』S(4』α)，7』α-十六氫-11』α-羥基-10』β，13』β-二甲基-3』，5，20』-三氧螺[呋喃-2(3H)，17』β-[4，7]亞甲基[17H]環戊[a]菲]-5』β(2』H)-腈。
向200加侖搪玻璃反應器中加入50kg烯胺2，大約445L 0.8N稀鹽酸和75L甲醇。混合物加熱到80℃反應5小時，冷卻到0℃反應2小時。過濾固體產物得到36.5kg乾燥產物二酮。
實施例22方法1步驟3A製備11α，17α-二羥基-3-氧代孕甾-4-烯-7α，21-二羧酸氫甲酯，γ-內酯。
在4口5L圓底燒瓶上安裝機械攪拌子，帶有氮氣導管的等壓添加漏鬥，溫度計和帶有擴散器的冷凝管。擴散器通過聚乙烯管與兩個2L阱連接，第一個阱是空的，其是為了防止第二個阱中的物質(1L濃次氯酸鈉溶液)倒吸到反應器中。向裝有3L甲醇的燒瓶中加入二酮3(79.50g；[重量沒用對純度校正，其是85％])。將25％甲醇鈉的甲醇溶液(64.83g)裝載到漏鬥裡並滴加，在氮氣下攪拌，歷時10分鐘。加完後，將亮橙黃色反應混合物加熱到回流，反應20小時。然後通過添加漏鬥向仍然回流的反應混合物中滴加167ml，4N HCl(注意，HCN在此刻蒸發)。反應混合物顏色變淺為淺金黃色。然後用接取柱頭代替冷凝器，並且在通過漏鬥向燒瓶同時加入1.5L水的同時通過蒸餾去除1.5L甲醇，加入水的速度與蒸餾速度一致。反應混合物冷卻到室溫並且用2.25L等份的二氯甲烷萃取兩次。合併的萃取物依次用750ml等份的冷的飽和的氯化鈉溶液，1N氫氧化鈉和飽和的氯化鈉洗滌。有機層用硫酸鈉乾燥過夜，過濾真空下使體積減少到約250ml。加入甲苯(300ml)，減壓去除殘留的二氯甲烷，期間，產物開始在燒瓶壁上以白色固體形成。將燒瓶中的物質冷卻過夜，並過濾去除固體。用250ml甲苯洗滌一次，用250ml等份乙醚洗滌兩次，在真空漏鬥上乾燥，得到58.49g白色固體，HPLC測定純度是97.3％。濃縮母液時，得到了另外的6.76g 77.1％純度的產物。校正純度後總產率是78％。
實施例23方法1步驟3B由11α，17α-二羥基-3-氧代孕甾-4-烯-7α，21-二羧酸氫甲酯，γ-內酯轉化成17α-羥基-11α-(甲基磺醯基)氧-3-氧代孕甾-4-烯-7α，21-二羧酸氫甲酯，γ-內酯。
象上面的實施例一樣安裝5-L四口燒瓶，除了沒有捕集系統安裝在擴散器外面。通氮氣，攪拌下向燒瓶中加入定量138.7g羥基酯，接著加入1425ml二氯甲烷。用鹽/冰浴將反應混合物冷卻到-5℃。快速加入甲磺醯氯(51.15g，0.447摩爾)，接著緩慢滴加在225ml二氯甲烷中的三乙胺(54.37g)。需要大約30分鐘的進料期間，控制加入速度使反應溫度不升高到5℃。加入後持續攪拌1小時，將反應物轉移到12-L分液漏鬥中，並加入2100ml二氯甲烷。連續用700ml等份的冷1N鹽酸，1N氫氧化鈉，和飽和的氯化鈉的氯化鈉水溶液洗滌溶液。合併水相併用3500ml二氯甲烷反萃。所有的有機相合併到9-L罐中，加入500g中性氧化鋁，II級活性，和500g無水硫酸鈉。將罐中物質充分混合30分鐘，過濾。真空使濾液至幹，得到粘性黃色泡沫。將其溶解於350ml二氯甲烷，並且攪拌下滴加1800ml乙醚。調節加入速度使大約一半乙醚在30分鐘內加入。加入大約750ml後，產物開始分離出結晶固體。剩餘的醚在10分鐘內加入。過濾取出固體，濾餅用2L乙醚洗滌，在50℃真空烘箱中乾燥，得到144.61g(88％)幾乎白的固體，m.p.149-150℃。用該方法製備的物質一般HPLC(面積％)純度是98-99％。在一次操作中，得到熔點153-153.5℃的物質，根據HPLC測定，純度是99.5％。
實施例24
方法1步驟3C方法A製備17α-羥基-3-氧代孕甾-4，9(11)-二烯-7α，21-二羧酸氫甲酯，γ-內酯。
象第二個實施例一樣安裝1-L四口燒瓶。通氮氣，攪拌下向燒瓶中加入甲酸(250ml)和乙酸酐(62ml)。加入甲酸鉀(6.17g)，用油浴將反應混合物內部溫度加熱到40℃(稍後在70℃重複這樣做會得到更好的結果)反應16小時。16小時後，加入甲磺酸鹽5，內部溫度升至100℃。持續加入攪拌2小時，然後在rotavap上真空去除溶劑。殘餘物與500ml冰水一起攪拌15分鐘，然後用500ml等份的乙酸乙酯萃取兩次。合併有機相，依次用冷的250ml等份飽和的氯化鈉溶液(兩次)，1N氫氧化鈉溶液，和飽和的氯化鈉洗滌。有機相用硫酸鈉乾燥，過濾，真空至幹，得到亮黃白色泡沫，當用刮勺刮時，其呈粉末玻璃狀。形成粉末14.65g，分析為82.1％6，7.4％8和5.7％9(HPLC面積百分比)。
實施例25方法1步驟3C方法B製備17α-羥基-3-氧代孕甾-4，9(11)-二烯-7α，21-二羧酸氫甲酯，γ-內酯。
象上述實施例一樣安裝5-L 4口燒瓶。通氮氣，攪拌下向燒瓶中加入228.26g乙酸和41.37g乙酸鈉。用油浴將反應混合物內部溫度加熱到100℃。加入甲磺酸鹽(123.65g)，繼續加熱30分鐘。該階段完成後，停止加熱，並加入200ml冰水。溫度降至40℃，並繼續攪拌1小時，然後將反應混合物緩慢倒入5-L攪拌的燒瓶中的1.5L冷水中。分離成膠質油狀產物。將油溶解於1L乙酸乙酯。用1L等份冷的飽和的氯化鈉溶液，1N氫氧化鈉溶液，和飽和的氯化鈉洗滌。有機相用硫酸鈉乾燥，過濾，濾液真空至幹，得到泡沫，癟成膠質油。用乙醚研製並最終固化。過濾固體並用乙醚洗滌，得到79.59g黃白色固體。由70.4％期望的Δ9，11烯酯6，12.3％Δ11，12烯酯8，10.8％7-α，9-α內酯9和5.7％未反應5組成。
實施例26方法1步驟3D製備9，11α-環氧-17α-羥基-3-氧代孕甾-4-烯-7α，21-二羧酸氫甲酯，γ-內酯。
4口加套的500ml反應器安裝機械攪拌子，冷凝管/擴散器，溫度計，帶有氮氣導管的添加漏鬥。通氮氣，攪拌下向反應器中加入83ml二氯甲烷中8.32g粗產物烯酯。向其中加入4.02g二鹼價磷酸鉀，接著加入12ml三氯乙腈。外部冷卻水通過反應器加套，反應混合物冷卻到8℃。在10分鐘內通過添加漏鬥加入36ml 30％過氧化氫。完全加入後最初淺黃色的反應混合物幾乎變得沒有顏色。自始至終添加的反應混合物保持在9±1℃，並且連續攪拌過夜(共23小時)。向反應混合物中加入二氯甲烷(150ml)。將全部內含物加入到大約250ml冰水中。用150ml等份二氯甲烷萃取三次。合併的二氯甲烷萃取液用400ml冷的3％亞硫酸鈉溶液洗滌以分解殘留的過氧化物。接著用330ml冷的1N氫氧化鈉洗滌，400ml冷的1N鹽酸洗滌，最終用400ml鹽水洗滌。有機相用硫酸鎂乾燥，過濾，濾餅用80ml二氯甲烷洗滌。真空去除溶劑得到9.10g淺黃色固體粗產物。從大約25ml 2-丁酮重結晶，得到5.52g幾乎白的結晶。最終從丙酮(大約50ml)中重結晶，得到3.16g長針狀結晶，mp.241-243℃。
實施例27方法1步驟3選擇1由4』S(4』α)，7』α-十六氫-11』α-羥基-10』β，13』β-二甲基-3』，5，20』-三氧螺[呋喃-2(3H)，17』β-[4，7]亞甲基[17H]環戊[a]菲]-5』β(2』H)-腈製備9，11α-環氧-17α-羥基-3-氧代孕甾-4-烯-7α，21-二羧酸氫甲酯，γ-內酯。
向乾淨乾燥的反應器中加入二酮(20g)，接著加入820ml甲醇和17.6ml 25％甲醇鈉/甲醇溶液。反應混合物加熱到回流條件(大約67℃)反應16-20小時。用40ml 4N鹽酸中止反應。常壓蒸餾去除溶劑。加入100ml甲苯，與甲苯共沸蒸餾去除殘留的甲醇。濃縮後，將粗產物羥基酯4溶解於206ml二氯甲烷並冷卻到0℃。加入甲磺醯氯(5ml)後緩慢加入10.8ml三乙胺。產物攪拌45分鐘。真空蒸餾去除溶劑得到粗產物甲磺酸鹽5。
在分離的乾燥的反應器中加入5.93g甲酸鉀，240ml甲酸，接著加入118ml乙酸酐。混合物加熱到70℃反應4小時。
向上述製備的濃甲磺酸鹽溶液5中加入甲酸混合物。將混合物加熱到95-105℃反應2小時。產物混合物冷卻到50℃，在50℃真空蒸餾去除揮發成分。產物分配在275ml乙酸乙酯和275ml水中。用137ml乙酸乙酯反萃水層，用240ml冷的1N氫氧化鈉溶液然後用120ml飽和的氯化鈉洗滌。相分離後，真空蒸餾濃縮有機相，得到粗產物烯酯。
將產物溶解於180ml二氯甲烷並冷卻到0-15℃。加入8.68g磷酸氫二鉀後加入2.9ml三氯乙腈。3分鐘內向混合物中加入78ml 30％過氧化氫溶液。反應混合物在0-15℃攪拌6-24小時。反應後，分離兩相混合物。有機層用126ml 3％亞硫酸鈉溶液，126ml 0.5N氫氧化鈉溶液，126ml 1N鹽酸和126ml 10％鹽水洗滌。產物用無水硫酸鎂乾燥，並通過Celite過濾，常壓蒸餾去除溶劑二氯甲烷。產物從甲基乙基酮中結晶兩次，得到7.2g eplerenone。
實施例28方法1步驟3方法2由1』S(4』α)，7』α-十六氫-11』α-羥基-10』β，13』β-二甲基-3』，5，20』-三氧螺[呋喃-2(3H)，17』β-[4，7]亞甲基[17H]環戊[a]菲]-5』β(2』H)-腈轉化成9，11α-環氧-17α-羥基-3-氧代孕甾-4-烯-7α，21-二羧酸氫甲酯，γ-內酯，沒有中間體。
在4口5L圓底燒瓶上安裝機械攪拌子，帶有氮氣導管的添加漏鬥，溫度計和帶有擴散器的冷凝管，其與次氯酸鈉洗滌器連接。將3.05L甲醇中的二酮(83.20g)加入到燒瓶中。添加漏鬥中裝入67.85g 25％(w/w)甲醇鈉的甲醇溶液。氮氣攪拌下經15分鐘向燒瓶中滴加甲醇化物。產生暗橘/黃色漿液。將反應混合物加熱至回流反應20小時，持續回流的同時滴加175ml 4N鹽酸(注意，HCN在該操作中蒸發)。用接取柱頭代替回流冷凝器，並且在通過漏鬥滴加1.6L 10％氯化鈉水溶液的同時通過蒸餾去除1.6L甲醇，加入速度與蒸餾速度一致。反應混合物冷卻到室溫並且用2.25L等份的二氯甲烷萃取兩次。合併的萃取物用750ml等份的冷的1N氫氧化鈉和飽和的氯化鈉溶液洗滌。有機層在1大氣壓下與甲醇共沸蒸餾乾燥，使終體積為1L(取出總量的0.5％用於分析)。
將濃縮的有機溶液(羥基酯)加回到沒有HCN阱的如前所配製的原反應瓶中。燒瓶冷卻到0℃，氮氣攪拌下加入30.7g甲磺醯氯。添加漏鬥裝有32.65g三乙胺，保持5℃溫度，經15分鐘滴加。持續攪拌2小時，同時反應混合物升至室溫。製備由250gDowex 50W×8-100酸離子交換樹脂組成的柱子，並在使用前用250ml水，250ml甲醇和500ml二氯甲烷洗滌。反應混合物經柱子流下並收集。製備新柱子並重複上面的過程。製備第三個250g柱子，由Dowex 1×8-200鹼性離子交換樹脂組成，象上述酸樹脂處理一樣預處理。反應混合物經柱子流下並收集。製備第四個鹼性樹脂柱，反應混合物又經柱子流下並收集。每次通過柱子後兩次用250ml二氯甲烷洗滌柱子，每次流經柱子的時間是大約10分鐘。溶劑洗液與反應混合物合併，真空將體積減小到大約500ml，取出2％用於qc.。剩餘的進一步減小到150ml終體積(粗產物甲磺酸鹽溶液)。
向原5-L反應裝置加入960ml甲酸，472ml乙酸酐和23.70g甲酸鉀。氮氣攪拌下將該混合物加熱到70℃反應16小時。然後將溫度升至100℃，通過添加漏鬥經30分鐘加入粗產物甲磺酸鹽溶液。隨著二氯甲烷蒸餾出反應混合物，溫度降至85℃。所有二氯甲烷去除後，溫度升至100℃，在100℃反應2.5小時。反應混合物冷卻到40℃減壓去除甲酸直到達到最小攪拌體積(大約150ml)。殘餘物冷卻到室溫，加入375ml二氯甲烷。稀釋的殘餘物用冷的1L等份的飽和的氯化鈉溶液，1N碳酸鈉，及又一次氯化鈉溶液洗滌。有機相用硫酸鎂(150g)乾燥，過濾得到暗紅棕色溶液(粗產物烯酯溶液)。
在4口加套的1L反應器上安裝機械攪拌子，冷凝管/擴散器，溫度計和帶有氮氣導管的添加漏鬥。氮氣攪拌下向反應器中加入600ml二氯甲烷中粗產物烯酯溶液(大約60g)。向其中加入24.0g二鹼價磷酸鉀，接著加入87ml三氯乙腈。外部冷卻水通過反應器加套，反應混合物冷卻到10℃。在30分鐘內通過添加漏鬥加入147ml 30％過氧化氫。完全加入後，最初暗紅棕色的反應混合物變成淺黃色。添加的反應混合物自始至終保持在10±1℃，並且連續攪拌過夜(共23小時)。相分離，含水部分用120ml等份二氯甲烷萃取兩次。接著合併的有機相加入210ml 3％亞硫酸鈉溶液洗滌，重複第二次，此後，通過澱粉/碘化物試紙檢測，有機相和水相都對過氧化物呈陰性。有機相依次用210ml等份冷的1N氫氧化鈉，1N鹽酸洗滌，最終用鹽水洗滌兩次。有機相共沸乾燥至大約100ml體積，加入新鮮溶劑(250ml)並且共沸蒸餾至相同100ml體積，。真空去除殘留的溶劑得到57.05g粘性黃色泡沫粗產物。一部分(51.01g)進一步乾燥至恆重44.3g，並用HPLC定量分析。在27.1％EPX測定。
實施例29氮氣下向反應器中加入11α-羥基雄甾烯二酮(429.5g)和甲苯磺酸水合物(7.1g)。向反應器中加入乙醇(2.58L)，得到的溶液冷卻到5℃。在0-15℃經15分鐘向溶液中加入原甲酸三乙酯(334.5g)。加完原甲酸三乙酯後，反應混合物升至40℃，並在該溫度下反應2小時，然後溫度升至回流，反應在回流下繼續3小時。真空下冷卻反應混合物，真空去除溶劑得到3-乙氧基雄甾-3，5-二烯-17-酮。
實施例30--由11α-羥基烯睪丙內酯形成烯胺 向裝有機械攪拌器的25ml 3-口燒瓶中加入氰化鈉(1.72g)。加入水(2.1ml)，加熱下攪拌混合物直到固體溶解。加入二甲基甲醯胺(15ml)後加入11α-羥基烯睪丙內酯(5.0g)。向混合物中加入水(0.4ml)和硫酸(1.49g)的混合物。混合物加熱到85℃反應2.5小時，此時HPLC分析說明產物的轉化完全。反應混合物冷卻到室溫。加入硫酸(0.83g)，攪拌混合物0.5小時。將反應混合物加入到冰浴中冷卻的60ml水中。燒瓶用3mlDMF和5ml水洗滌。將漿液攪拌40分鐘並過濾。濾餅用40ml水洗滌兩次，在60℃真空烘箱中乾燥過夜，得到11α-羥基烯胺，即5』R(5』α)，7』β-20』-氨基十六氫-11』β-羥基-10』α，13』α-二甲基-3』，5-二氧螺[呋喃-2(3H)，17』α(5』H)-[7，4]亞甲基(metheno)[4H]環戊[a]菲]-5』-腈(4.9g)。
實施例31--11α-羥基烯睪丙內酯向二酮的轉化 向裝有機械攪拌器的50ml 3-口燒瓶中加入氰化鈉(1.03g)。加入水(1.26ml)，稍微加熱燒瓶以使固體溶解。加入二甲基乙醯胺(或二甲基甲醯胺)(9ml)後加入11α-羥基烯睪丙內酯(3.0g)。攪拌下向反應燒瓶中加入水(0.25ml)和硫酸(0.47ml)的混合物。混合物加熱到95℃反應2小時，HPLC分析表明反應完全。加入硫酸(0.27ml)，攪拌混合物30分鐘。加入另外的水(25ml)和硫酸(0.90ml)，反應混合物攪拌16小時。然後混合物在冰浴中冷卻到5-10℃。通過多孔玻璃過濾器過濾後用水(20ml)洗滌兩次來分離固體。固體二酮即4』S(4』α)，7』α-十六氫-11』α-羥基-10』β，13』β-二甲基-3』，5，20』-三氧螺[呋喃-2(3H)，17』β-[4，7]亞甲基[17H]環戊[a]菲]-5』β(2』H)-腈在真空烘箱中乾燥得到3.0g固體。
實施例32實施例31描述的方法製備的5.0g二酮的甲醇(100ml)的懸浮液加熱至回流，經1分鐘加入25％甲醇鉀的甲醇溶液(5.8ml)。混合物變得均勻。15分鐘後，出現沉澱。回流下加熱混合物，大約4小時後又變得均勻。回流下加熱一共持續了23.5小時，加入4.0N鹽酸(10ml)。蒸餾去除一共60ml氰化氫的甲醇溶液。經15分鐘向蒸餾殘餘物中加入水(57ml)。在加入水期間溶液溫度升至81.5℃，通過蒸餾去除了另外的4ml氰化氫/甲醇溶液。加完水後，混合物變混濁，去除熱源。將混合物攪拌3.5小時，產物緩慢結晶。過濾懸浮液，用水洗滌收集的固體。在漏鬥上經空氣風乾，92℃下(26英寸汞柱)乾燥16小時，得到2.98g灰白色固體。該固體是91.4％重量羥基酯，即11α，17α-二羥基-3-氧代孕甾-4-烯-7α，21-二羧酸氫甲酯，γ-內酯。產率是56.1％。
實施例33向裝有溫度計，Dean Stark阱和機械攪拌器的乾淨乾燥的3-口反應燒瓶中加入實施例31描述的方法製備的二酮。室溫下(22℃)向反應器加入甲醇(24ml)，將得到的漿液攪拌5分鐘。向反應器加入25％重量甲醇鈉的甲醇溶液(52.8ml)。室溫下將混合物攪拌10分鐘，期間反應混合物變成淺棕色澄清溶液，發現反應微放熱(2-3℃)。控制加入速度，防止反應器溫度超過30℃。然後將反應混合物加熱到回流條件(大約67℃)，繼續在回流條件下反應16小時。然後取樣品，用HPLC分析轉化作用。反應在回流下繼續，直到殘留的二酮不超過二酮加入量的3％。回流期間向反應器加入4N鹽酸(120ml)，產生HCN，其被洗滌器吸收。
反應完全後，常壓下從反應混合物中蒸餾出90-95％甲醇溶劑。蒸餾期間上方溫度從67℃變化為75℃，鹼處理含有HCN的蒸餾液，並且在處理前漂白。去除甲醇後將反應混合物冷卻到室溫，當混合物在40-45℃範圍冷卻時，開始沉澱固體產物。向冷卻的漿液中加入任選地含有5％重量碳酸氫鈉(1200ml)(25℃)的水溶液，然後將得到的反應混合物大約1小時冷卻到0℃。碳酸氫鈉處理有效地從反應混合物中消除了殘留的未反應的二酮。漿液在0℃攪拌2小時，以完成沉澱和結晶，然後，過濾回收固體產物，濾餅用水(100ml)洗滌。產物在26」汞柱真空80-90℃乾燥至恆重。乾燥後的水含量小於0.25％重量。得到的摩爾產率大約77-80％重量。
實施例34在碘化鋅(1當量)存在下，根據實施例31製備的二酮(1當量)與甲醇鈉(4.8當量)在甲醇溶劑中反應。或者根據這裡所描述的提取方法或者根據其中沒有二氯甲烷萃取，鹽水和鹼洗滌，和硫酸鈉乾燥步驟的非提取方法處理反應產物。在非提取方法中用5％重量碳酸氫鈉溶液代替甲苯。
實施例35根據實施例34製備的羥基酯(1.97g)與四氫呋喃(20ml)合併，得到的混合物冷卻到-70℃。加入磺醯氯(0.8ml)，混合物攪拌30分鐘，之後加入咪唑(1.3g)。反應混合物升至室溫並再攪拌2小時。然後用二氯甲烷稀釋混合物並用水萃取。濃縮有機相，得到粗產物烯酯(1.97g)。一小部分粗產物樣品用HPLC分析。分析表明9，11-烯烴∶11，12-烯烴∶7，9-內酯比例是75.5∶7.2∶17.3。根據上述但是在0℃下進行時，反應得到一種產物，其中9，11-烯烴∶11，12-烯烴∶7，9-內酯分布是77.6∶6.7∶15.7。該方法合併成一步，引入離去基團，並消除該離去基團，產生烯酯9，11-烯烴結構，即反應是由磺醯氯引起式V羥基酯的11α-羥基基團被滷化物置換，接著脫滷化氫產生Δ-9，11結構。進行這樣的烯酯生成反應不使用強酸(例如甲酸)或乾燥劑例如乙酸酐。也消除了另外的產生一氧化碳的方法的回流步驟。
實施例36向裝有機械攪拌器，添加漏鬥和熱電偶的乾淨乾燥的3-口圓底燒瓶中加入根據實施例34製備的羥基酯(20g)和二氯甲烷(400ml)。得到的混合物在室溫下攪拌直到獲得完全的溶液。用冰浴將溶液冷卻到5℃。向含有羥基酯的二氯甲烷溶液中加入甲磺醯氯(5ml)，很快接著緩慢滴加三乙胺(10.8ml)。調節加入速度使反應溫度不超過5℃。反應極端放熱；因此必需冷卻。反應混合物在大約5℃攪拌1小時。當反應完全時(HPLC和TLC分析)，混合物在大約0℃在26英寸汞柱真空下濃縮，直到變成稠的漿液。得到的漿液用二氯甲烷(160ml)稀釋。混合物在大約0℃在26英寸汞柱真空下濃縮得到濃縮物。發現濃縮物(式IV甲磺酸鹽產物，其中R3＝H，-A-A-和-B-B-都是-CH2-CH2-，即11α，17α-二羥基-3-氧代孕甾-4-烯-7α，21-二羧酸氫甲酯，γ-內酯轉化成17α-羥基-11α-(甲基磺醯基)氧-3-氧代孕甾-4-烯-7α，21-二羧酸氫甲酯，γ-內酯)純度是82％(HPLC面積百分比)。該物質不用分離即可用於下一步反應。
向裝有機械攪拌器，添加漏鬥和熱電偶和加熱罩的乾淨乾燥的反應器中加入甲酸鉀(4.7g)，甲酸(16ml)和乙酸酐(8ml，0.084mol)。所得溶液加熱到70℃並攪拌大約4-8小時。乙酸酐的加入是放熱的並產生氣體(CO)，因此要調節加入速度，控制溫度和氣體的產生(壓力)。製備活性消除劑的反應時間取決於反應中存在的水的量(甲酸和甲酸鉀分別含有大約3-5％的水)。消除反應對水存在量敏感；如果大於0.1％水(KF)，可能提高7，9內酯雜質量。這種副產物難於從終產物中去除。當KF表明小於0.1％水時，活性消除劑被轉移到先前步驟中製備的甲磺酸鹽濃縮物(0.070mol)。得到的溶液加熱到95℃，蒸餾揮發性物質並收集在DeanStark阱中。當停止放出揮發性物質時，用冷凝管代替Dean Stark阱，反應混合物在95℃又加熱1小時。完成時(TLC和HPLC分析少於0.1％起始物)，將內含物冷卻到50℃，並開始真空蒸餾(26英寸汞柱/50℃)。混合物濃縮成粘稠的漿液後冷卻到室溫。得到的漿液用乙酸乙酯(137ml)稀釋，攪拌溶液15分鐘。用水(137ml)稀釋。分離各相，用乙酸乙酯(70ml)再次萃取下面的水相。合併的乙酸乙酯溶液用鹽水(120ml)洗滌一次，用冰冷卻的1N氫氧化鈉溶液洗滌兩次(每次120ml)。測定水相pH，如果用過的洗液pH小於8，則再次洗滌有機層。當發現用過的洗液pH大於8時，用鹽水溶液(120ml)洗滌乙酸乙酯層一次，使用50℃水浴通過旋轉蒸發濃縮至幹。得到的固體產物烯酯，即17α-羥基-3-氧代孕甾-4，9(11)-二烯-7α，21-二羧酸氫甲酯，γ-內酯重92g(77％摩爾產率)。
實施例37向裝有機械攪拌器，添加漏鬥和熱電偶的2-L 3-口圓底燒瓶中加入根據實施例34製備的羥基酯(100g；0.22mol)。使用自動控制溫度的循環冷卻浴。反應前乾燥燒瓶，因為甲磺醯氯對水敏感。
向燒瓶中加入二氯甲烷(1L)，攪拌下羥基酯溶解於其中。該溶液冷卻到0℃，通過添加漏鬥向燒瓶加入甲磺醯氯(25ml，0.32mol)。通過添加漏鬥向燒瓶加入三乙胺(50ml，0.59mol)，用另外的二氯甲烷(34ml)淋洗漏鬥。三乙胺的加入是高度放熱的。攪拌和冷卻下加入時間是10分鐘左右。混合物冷卻到0℃，在該溫度下攪拌下進行附加的45分鐘，期間，反應瓶上方通入氮氣。然後用薄層色譜和高效液相色譜分析反應混合物樣品來檢查反應是否完全。然後混合物在0℃又攪拌30分鐘，並再次檢查反應是否完全。分析表明反應在此刻基本上完全；在0℃在26」汞柱真空去除溶劑二氯甲烷。蒸餾液的氣相色譜分析表明存在甲磺醯氯和三乙胺兩者。然後向反應器中加入二氯甲烷(800ml)，在0-15℃溫度下攪拌得到的混合物5分鐘。又在0-5℃在26」汞柱真空去除溶劑，得到式IV甲磺酸鹽，其中R3＝H，-A-A-和-B-B-都是-CH2-CH2-及R1是甲氧羰基。產物的純度是大約90-95面積％。
為了製備消除劑，在分開的乾燥的反應器中混合甲酸鉀(23.5g，0.28mol)，甲酸(80ml)和乙酸酐(40ml)。甲酸和乙酸酐被泵入到反應器中，在加入乙酸酐期間保持溫度不超過40℃。加熱消除劑混合物到70℃，從反應體系中棄除水。繼續該反應，直到根據Karl Fisher分析水含量少於0.3％重量。然後將消除劑溶液轉移到含有根據上述製備的濃縮的粗產物甲磺酸鹽溶液的反應器中。得到的混合物被加熱到95℃最大溫度，收集揮發的蒸餾物直到不再產生蒸餾物。在大約90℃停止蒸餾。蒸餾完成後，反應混合物在95℃又攪拌2小時，用薄層色譜檢查反應是否完全。當反應完全後，反應器冷卻到50℃在50℃26」汞柱真空下從反應混合物中去除甲酸和溶劑。濃縮物冷卻到室溫，然後加入乙酸乙酯(688ml)，乙酸乙酯和濃縮物的混合物攪拌15分鐘。此時，加入12％鹽水溶液(688ml)，有助於從有機相去除水可溶性雜質。然後用20分鐘使各相分離。水相轉移到另一個容器中，向其中加入附加量的乙酸乙酯(350ml)。將水相反萃30分鐘，然後使各相分離，合併乙酸乙酯層。向合併的乙酸乙酯層加入飽和的氯化鈉溶液(600ml)，攪拌30分鐘。使各相分離。去除水相。進行又一次氯化鈉(600ml)洗滌。從第二次餘下的洗液中分離有機相。然後在攪拌下用1N氫氧化鈉(600ml)洗滌有機相30分鐘。各相靜置30分鐘，去除水相。測定水相pH，發現大於7。用飽和的氯化鈉(600ml)又一次洗滌15分鐘。最後在50℃26」汞柱真空下濃縮有機相，過濾回收產物。乾燥時終產物是泡沫狀棕色固體。在45℃減壓下進一步乾燥24小時，得到95.4g烯酯產物，產率68.8％。校正起始羥基酯和終產物烯酯得摩爾產率是74.4％。
實施例38重複實施例37的方法，除了通過用離子交換樹脂處理反應溶液而避免了多次洗滌步驟。鹼性氧化鋁或鹼性二氧化矽。用鹼性二氧化矽處理的條件在表38中給出。發現每一種處理，沒有實施例44的多次洗滌，對於去除雜質是有效的。
實施例39在100ml反應器中混合乙酸鉀(4g)和三氟乙酸(42.5ml)。以保持溫度在加入期間低於30℃的控制速度下向混合物中加入三氟乙酸酐(9.5ml)。然後將溶液加熱到30℃反應30分鐘，得到用於將式IV甲磺酸鹽轉化成式II的烯酯的消除劑。
向預先製備的式IV甲磺酸鹽溶液中加入預先形成的TFA/TFA酸酐消除劑。得到的混合物在40℃加熱4個半小時，用TLC或HPLC周期性檢查轉化程度。反應完全後，混合物轉移到1-口燒瓶中並室溫(22℃)減壓下濃縮至幹。向混合物中加入乙酸乙酯(137ml)使固相物質完全溶解，然後加入水/鹽水混合物(137ml)，攪拌得到的兩相混合物10分鐘。使各相分離20分鐘。鹽水濃度是24％重量。水相中加入附加量的乙酸乙酯(68ml)，將這樣製備的兩相混合物攪拌10分鐘，此後使靜置15分鐘使相分離。合併兩次萃取的乙酸乙酯層並用24％重量鹽水(120ml)，另一等份24％重量鹽水(60ml)，1N氫氧化鈉溶液(150ml)和另一份鹽水(60ml)洗滌。加入各水相後，混合物攪拌10分鐘並靜置15分鐘使分離。用水吸氣器在45℃減壓下濃縮得到的溶液至幹。HPLC分析固體產物(8.09g)，發現含有83.4面積％的烯酯，2.45面積％11，12-烯烴，1.5％7，9-內酯，和1.1％未反應的甲磺酸鹽。
實施例40具有實施例23製備的結構的甲磺酸鹽(1.0g)，乙酸異丙烯酯(10g)和對甲苯磺酸(5mg)置於50ml燒瓶中，攪拌下加熱到90℃。5小時後，混合物冷卻到25℃，在10mmHg真空下濃縮。殘餘物溶解於二氯甲烷(20ml)，用5％碳酸氫鈉水溶液洗滌。真空濃縮二氯甲烷層，得到1.47g褐色油。該物質從二氯甲烷/乙醚中重結晶，得到0.50g式IV(Z)烯醇的乙酸酯。
攪拌下向預先加熱到100℃的乙酸鈉(0.12g)和乙酸(2.0ml)的混合物中加入該物質。60分鐘後混合物冷卻到25℃，並用二氯甲烷(20ml)稀釋。溶液用水(20ml)洗滌，硫酸鎂乾燥。過濾去除乾燥劑，真空濃縮濾液，得到0.4g期望的9，11-烯烴，IV(Y)。粗產物含有少於2％的7，9-內酯雜質。
實施例41--甲磺酸鹽在DMSO中的熱消除。

燒瓶中2g甲磺酸鹽和5mlDMSO的混合物在80℃加熱22.4小時。對反應混合物的HPLC分析表明沒有檢測到起始物。向反應中加入水(10ml)，用二氯甲烷萃取沉澱三次。合併的二氯甲烷層用水洗滌，硫酸鎂乾燥，濃縮得到烯酯。
實施例42在50ml梨形燒瓶中攪拌下將式IIA(1.07g，74.4％烯酯)，三氯乙醯胺(0.32g)，作為固體的磷酸氫二鉀與二氯甲烷(15.0ml)混合。得到澄清的溶液。用移液管經1分鐘加入過氧化氫(30％重量；5.0ml)。得到的混合物在室溫下攪拌6小時，此刻，HPLC分析表明反應混合物中epoxymexrenone與烯酯的比是大約1∶1。向反應混合物中加入附加的三氯乙醯胺(0.32g)，反應在攪拌下再持續8小時，之後顯示殘留的烯酯部分減少到10％。加入附加的三氯乙醯胺(0.08g)，反應混合物靜置過夜，此刻混合物中相對於epoxymexrenone，只保留5％未反應烯酯。
實施例43向100ml反應器中加入式IIA烯酯(5.4g，74.4％烯酯)。向烯酯中加入固體形式的三氯乙醯胺(4.9g)，和磷酸氫二鉀(3.5g)後加入二氯甲烷(50ml)。混合物冷卻到15℃，經10分鐘加入30％過氧化氫(25g)。使反應混合物達20℃，並在該溫度下攪拌6小時，此刻用HPLC檢測轉化作用。測定出剩餘的烯酯少於1％重量。
反應混合物加入到水中(100ml)，使各相分離，取出二氯甲烷層。向二氯甲烷層中加入氫氧化鈉(0.5N；50ml)。20分鐘後各相分離，向二氯甲烷層中加入鹽酸(0.5N；50ml)。然後各相分離，有機相用飽和的鹽水洗滌(50ml)。二氯甲烷層用無水硫酸鎂乾燥並去除溶劑。得到白色固體(5.7g)。氫氧化鈉水層被酸化和萃取處理得到另外的0.2g產物。epoxymexrenone產率是90.2％。
實施例44根據實施例43的方法將式IIA烯酯轉化成epoxymexrenone，有下面的不同初始加料由烯酯(5.4g，74.4％烯酯)，三氯乙醯胺(3.3g)和磷酸氫二鉀(3.5g)組成。加入過氧化氫溶液(12.5ml)。反應在20℃進行過夜，HPLC表明90％烯酯轉化成epoxymexrenone。加入另外的三氯乙醯胺(3.3g)和30％過氧化氫(5.0ml)，反應又進行6小時，此時殘留的烯酯只是烯酯加入量的2％。根據實施例43後處理後得到5.71gepoxymexrenone。
實施例45根據實施例43的概述的方法將式IIA烯酯轉化成epoxymexrenone。在該實施例的反應中，烯酯加入量是5.4g(74.4％烯酯)，三氯乙醯胺加入量是4.9g，過氧化氫加入量是25g，和磷酸氫二鉀加入量是3.5g。反應在20℃進行18小時，殘留的烯酯少於2％。後處理後得到5.71g epoxymexrenone。
實施例46根據實施例43的描述的方法將式IIA烯酯轉化成epoxymexrenone，只是該實施例中的反應溫度是28℃。反應器中加入的材料包括烯酯(2.7g)，三氯乙醯胺(2.5g)，磷酸氫二鉀(1.7g)，過氧化氫(17.0g)和二氯甲烷(50ml)。反應4小時後，未反應的烯酯只是烯酯加入量的2％。根據實施例43後處理後得到3.0g epoxymexrenone。
實施例47式IIA烯酯(17g，72％烯酯)溶解於二氯甲烷(150ml)，然後緩慢攪拌下加入三氯乙醯胺(14.9g)。混合物溫度調至25℃，400rpm攪拌下將磷酸氫二鉀(10.6g)的水(10.6ml)溶液攪拌著加入到烯酯底物溶液中。經3-5分鐘向底物/磷酸鹽/三氯乙醯胺中加入過氧化氫(30％重量溶液；69.4ml)。發現沒有放熱或放出氧氣。這樣製備的反應混合物以400rpm攪拌，在25℃反應18.5小時。反應期間沒有氧氣逸出。用水(69.4ml)稀釋反應混合物，混合物在大約250rpm攪拌15分鐘。該操作不需要控制溫度，基本上在室溫下進行(5-25℃範圍內的任何溫度可以接受)。分離水層和有機層，取出下面的二氯甲烷層。
在250rpm攪拌下用二氯甲烷(69.4ml)反萃水層15分鐘。分離水層和有機層，取出下面的二氯甲烷層。水層(177g；pH＝7)進行過氧化氫測定。結果(12.2％)表明反應中消耗僅僅0.0434mol過氧化氫是0.0307烯烴。用小體積二氯甲烷反萃足以保證水相中不損失epoxymexrenone。應用第二次大量二氯甲烷萃取，其中只回收三氯乙醯胺，證明了該結果。
合併來自上述萃取的合併的二氯甲烷溶液，並以250rpm用3％重量亞硫酸鈉溶液(122ml)洗滌至少15分鐘。在攪拌期終了時發現陰性澱粉碘化物試驗(KI試紙；沒有發現顏色；陽性試驗中紫色表明存在過氧化物)。
分離水層和有機層，取出下面的二氯甲烷層。棄除水層(pH＝6)。注意亞硫酸鈉溶液的加入引起稍微放熱，因此應該在控制溫度下加入。
二氯甲烷層用0.5N氫氧化鈉(61ml)以大約250rpm在15-25℃範圍內洗滌45分鐘(pH＝12-13)。在該過程中去除三氯乙醯胺衍生的雜質。酸化鹼性水部分，接著用二氯甲烷萃取保證在該操作中幾乎沒有epoxymexrenone損失。
二氯甲烷層用0.1N鹽酸(61ml)以250rpm攪拌在15-25℃範圍內洗滌一次15分鐘。分離水層和有機層，取出下面的二氯甲烷層。再次用10％重量氯化鈉水溶液(61ml)以大約250rpm在15-25℃範圍內洗滌15分鐘。分離水層和有機層，取出下面的有機層。有機層通過Solkafloc板過濾後減壓蒸發至幹。用65℃水浴使乾燥完全。得到米色固體(17.95g)，進行HPLC分析。測得epoxymexrenone是93.1％。
產物溶解於熱的甲基乙基酮(189ml)，常壓蒸餾得到的溶液直到去除95ml酮溶劑。使溫度降至50℃，產物結晶，在50℃繼續攪拌1小時。然後使溫度降至20-25℃，又繼續攪拌2小時。過濾固體並用MEK洗滌(24ml)，固體乾燥到恆重9.98g，HPLC分析含有93.63％epoxymexrenone。該產物再次溶解於熱的MEK(106ml)，壓力下熱溶液通過10微米在線過濾器過濾。加入又18mlMEK淋洗，常壓蒸餾過濾的MEK溶液，直到去除53ml溶劑。使溫度降至50℃，產物結晶，在50℃繼續攪拌1小時。然後使溫度降至20-25℃，在該溫度下反應，同時繼續攪拌2小時。過濾固體產物並用MEK淋洗(18ml)。固體產物乾燥至恆重8.32g，定量HPLC分析其含有99.6％epoxymexrenone。乾燥時的最終損失少於1.0％。根據該實施例的反應和後處理，epoxymexrenone總的產率是65.8％。該總產率反映出93％反應產率，78.9％初始結晶收率和89.5％重結晶收率。
實施例48--使用甲苯的式IIA的環氧化作用根據實施例46概述的方法將式IIA烯酯轉化成eplerenone，除了使用甲苯為溶劑。反應器中加入的材料包括烯酯(2.7g)，三氯乙醯胺(2.5g)，磷酸氫二鉀(1.7g)，過氧化氫(17.0g)和甲苯(50ml)。反應放熱到28℃，反應4小時完成，得到的三相混合物冷卻到15℃，過濾，用水洗滌，真空乾燥，得到2.5g產物。
實施例49--9，11-二烯酮的環氧化作用在1L 3-口燒瓶中，稱之為XVIIA的化合物(化合物XVII，其中-A-A-和-B-B-兩者是-CH2-CH2-)(40.67g)溶解於二氯甲烷(250ml)，冰鹽混合物外部冷卻。加入磷酸二鉀(22.5g)和三氯乙腈(83.5g)，混合物冷卻到2℃，然後經1小時緩慢加入30％過氧化氫(200g)。反應混合物在12℃攪拌8小時，在室溫下攪拌14小時。取出一滴有機物，測定是否含有起始烯酮，發現少於0.5％。加入水(400ml)，攪拌15分鐘，分離各相。有機相連續用200ml碘化鉀(10％)，200ml硫代硫酸鈉(10％)，和100ml飽和的碳酸氫鈉溶液洗滌，每次分離各相。有機層用無水硫酸鎂乾燥並濃縮，得到粗環氧化物(41g)。產物從乙酸乙酯二氯甲烷中結晶，得到14.9g純產物。
實施例50--使用間-氯代過苯甲酸的化合物XVIIA的環氧化作用化合物XVIIA(18.0g)溶解於250ml二氯甲烷並冷卻到10℃。攪拌下在15分鐘內加入固體間-氯代過苯甲酸(50-60％純度，21.86g)。發現沒有溫度提高。反應混合物攪拌3小時，檢測是否存在二烯酮。反應混合物依次用亞硫酸鈉(10％)，氫氧化鈉溶液(0.5N)，鹽酸溶液(5％)和最後用50ml飽和的鹽水溶液處理。用無水硫酸鎂乾燥後蒸發，得到17.64g環氧化物，直接用於下面的步驟。發現產物包含Baeyer-Villiger氧化產物，通過從乙酸乙酯研製後從二氯甲烷中重結晶將其去除。在500g規模下，將沉澱的間-氯代苯甲酸過濾後常規後處理。
實施例51--使用三氯乙醯胺的化合物XVIIA的環氧化作用化合物XVIIA(2g)溶解於25ml二氯甲烷。加入三氯乙醯胺(2g)，磷酸二鉀(2g)。室溫攪拌下加入30％過氧化氫(10ml)，繼續攪拌18小時，得到環氧化物(1.63g)。沒有生成Baeyer-Villiger產物。
實施例52室溫下向2000ml燒瓶中加入氫氧化鉀(56.39g，1005.03mmol；3.00當量)，與二甲亞碸(750.0ml)混合成漿液。向燒瓶中與THF(956.0ml)一起加入相應於式XX的三烯酮(其中R3是氫，A-A-和-B-B-兩者是-CH2-CH2-)(100.00g；335.01mmol；1.00當量)。向燒瓶中加入甲基硫酸三甲基硫鹽(126.14g；670.02mmol；2.00當量)。得到的混合物在80-85℃加熱回流1小時。用HPLC檢查向17-螺氧亞甲基的轉化作用。真空下從反應混合物中去除大約1LTHF，然後在30分鐘內加入水(460ml)，同時反應混合物冷卻到15℃。過濾得到的混合物。固體環氧乙烷產物用200ml等份水洗滌兩次。發現產物高度結晶，容易進行過濾。然後產物在40℃真空下乾燥，分離得到104.6g3-甲基烯醇醚Δ-5，6，9，11，-17-環氧甾類化合物產物。
實施例53氮氣層下向乾燥的500ml反應器中加入乙醇鈉(41.94g；616.25mmol；1.90當量)。向反應器中加入乙醇(270.9ml)，將甲醇鈉在乙醇中製成漿液。向漿液中加入丙二酸二乙酯(103.90g；648.68mmol；2.00當量)，之後加入用實施例52描述的方法製備的環氧甾類化合物(104.60g；324.34mmol；1.00當量)，得到的混合物加熱回流，即80-85℃。加熱繼續4小時，然後用HPLC檢查反應的完全程度。經30分鐘向反應混合物加入水(337.86ml)，同時將混合物冷卻到15℃。繼續攪拌30分鐘，然後將反應漿液過濾，得到含有細孔粉末的濾餅。濾餅用水(每次200ml)洗滌兩次，然後室溫真空下乾燥。分離得到133.8g 3-甲基-烯醇醚-Δ-5，6，9，11，-17-螺內酯-21-甲氧羰基中間體。
實施例54與氯化鈉(27.50g；470.52mmol；1.5當量)二甲基甲醯胺(709ml)一起向反應器中加入實施例53製備的3-甲基-烯醇醚-Δ-5，6，9，11，-17-螺內酯-21-甲氧羰基中間體(式XVIII，其中R3是氫，A-A-和-B-B-兩者是-CH2-CH2-，133.80g，313.68mmol；1.00當量)，並且攪拌下向2000ml反應器中加入水(5ml)。得到的混合物在138-142℃加熱回流3小時。然後用HPLC檢查反應混合物的完全程度。然後在30分鐘內向混合物中加入水，同時反應混合物冷卻到15℃。攪拌繼續30分鐘，反應漿液過濾後回收無定形固體反應產物，為濾餅。濾餅用200ml等份水洗滌兩次後乾燥。得到91.6g(82.3％產率；96面積％)產物3-甲基烯醇醚-17-螺內酯。
實施例55向2000ml反應器中加入根據實施例54製備的烯醇醚(91.60g，258.36mmol；1.00當量)，乙醇(250ml)，乙酸(250ml)，和水(250ml)，得到的漿液加入到回流2小時。在30分鐘內向混合物中加入水(600ml)，同時反應混合物冷卻到15℃。過濾反應漿液，濾餅用水洗滌兩次(每次200ml等份)。然後乾燥濾餅；分離得到84.4g產物3-酮Δ4，5，9，11，-17-螺內酯(化合物XVII，其中R3是氫，A-A-和-B-B-兩者是-CH2-CH2-；產率95.9％)。
實施例56向22L 4-口燒瓶中與四氯化碳(3.2L)一起加入化合物XVIIA(1kg，2.81摩爾)。向混合物中加入N-溴代琥珀醯胺(538g)後加入乙腈(3.2L)。得到的混合物加熱至回流並保持在68℃回流溫度下反應大約3小時，產生澄清的橙色溶液。加熱5小時後，溶液變暗。加熱6小時後移去熱源，對反應混合物取樣。真空去除溶劑，向底部殘餘物中加入乙酸乙酯(6L)。攪拌得到的混合物，然後加入5％碳酸氫鈉溶液(4L)，將混合物攪拌15分鐘，後使相分離。取出水層，向混合物中加入飽和的鹽水溶液(4L)，然後攪拌15分鐘。再使相分離，真空去除有機層，得到粘稠的漿液。然後加入二甲基甲醯胺(4L)，繼續去除至55℃。使靜止的底部靜置過夜，並加入DABCO(330g)和溴化鋰(243g)。然後將混合物加熱到70℃。加熱1.5小時後，取出液相色譜樣品，加熱3.50小時後，加入另外的DABCO(40g)。加熱4.5小時後，加入水(4L)，得到的混合物冷卻到15℃。過濾漿液，濾餅用水(3L)洗滌，並學過濾器上乾燥過夜。將溼的濾餅(978g)放回到22L燒瓶中並加入二甲基甲醯胺(7L)。將這樣製備的混合物加熱到105℃，在此點，濾餅完全溶解於溶液。停止加熱，攪拌燒瓶中的混合物並冷卻。向反應器加套中加入冰水，反應器中的混合物冷卻到14℃並保持2小時。得到的漿液過濾並用2.5L等份的水洗滌兩次。濾餅在真空下乾燥過夜。得到510g淺棕色固體產物。
實施例57向2L四口燒瓶中加入實施例56的產物9，11-環氧烯睪丙內酯(100.00g；282.1mmol；1.00當量)，二甲基甲醯胺(650.0ml)，氯化鋰(30.00g；707.7mmol；2.51當量)，和丙酮氰醇(72.04g；77.3ml；846.4mmol；3.00當量)。機械攪拌得到的懸浮液，並用四甲基胍(45.49g；49.6ml；395.0mmol；1.40當量)處理。過濾該體系，使用水冷凝器和乾冰冷凝器(裝入乾冰丙酮溶液)防止HCN逸出。乾冰冷凝器的通風線通過裝有大大過量氯氣漂白劑的洗氣器。混合物加熱到80℃。
18小時後，得到暗紅棕色溶液，其在攪拌下冷卻到室溫。冷卻期間向溶液中通入氮氣，以去除殘留的HCN，通風線通過阱中的漂白劑。2小時後，用乙酸(72g)處理溶液並攪拌30分鐘。然後攪拌下將粗混合物倒入冰水(2L)。攪拌的懸浮液進一步用10％鹽酸水溶液(400ml)處理並攪拌1小時。然後過濾混合物，得到暗磚紅色固體(73g)。濾液置於4L分液漏鬥中，並用二氯甲烷(3×800ml)萃取；合併有機層，並用水反萃(2×2L)。真空濃縮二氯甲烷溶液，得到61g暗紅色油狀物。
水洗級分放置過夜後，出現大量沉澱。過濾收集沉澱，測定為純產物烯胺(14.8g)。
乾燥原紅色固體(73g)後進行HPLC分析，測得主要成分是9，11-環氧烯胺。進一步HPLC分析表明烯胺是二氯甲烷後處理得到的紅色油狀物的主要成分。烯胺摩爾產率計算值是46％。
實施例58向1000ml圓底燒瓶中加入根據實施例57製備的9，11-環氧烯胺(4.600g；0.011261mol；1.00當量)。向混合物中加入甲醇(300ml)和0.5％重量鹽酸水溶液(192ml)，然後回流17小時。然後真空去除甲醇，將物質的量在蒸餾瓶中減少到50ml，形成白色沉澱。向漿液中加入水(100ml)後過濾，得到白色濾餅，用水洗滌三次。固體9，11-環氧二酮產物產率是3.747g(81.3％)。
實施例59將根據實施例58製備的環氧二酮(200mg；0.49mmol)懸浮於甲醇(3ml)中，向混合物加入1，8-二氮雜雙環[5.4.0]十一-7-烯(DBU)。回流加熱24小時，混合物變均勻。然後在30℃在旋轉蒸發器上濃縮至幹，殘餘物分配在二氯甲烷和3.0N鹽酸中。濃縮有機相得到黃色固體(193mg)，測得其是22％重量epoxymexrenone。產率20％。
實施例60向懸浮於1.5ml甲醇中的100mg二酮中加入10毫升(0.18當量)25％(w/w)甲醇鈉的甲醇溶液。將溶液加熱回流。30分鐘後，沒有剩下二酮，存在5-氰基酯。向混合物中加入46毫升25％(w/w)甲醇鈉的甲醇溶液。混合物在回流下加熱23小時，根據HPLC分析，此時主要產物是eplerenone。
實施例61向懸浮於30ml無水甲醇的2g二酮中加入0.34ml三乙胺。懸浮液在回流下加熱4.5小時。混合物在25℃攪拌16小時。過濾得到的懸浮液，得到1.3g 5-氰基酯，為白色固體。
向懸浮於80ml甲醇的6.6g二酮中加入2.8ml三乙胺。混合物在回流下加熱4小時，並在25x攪拌88小時，此間產物從溶液中結晶出來。過濾後用甲醇洗滌得到5.8g氰基酯，為白色固體。從氯仿/甲醇中重結晶，得到3.1g結晶產物，HPLC測定其是均勻的。
由此可見，實現了本發明的目的，也獲得了其它有益結果。
只要不脫離本發明範圍對上述組合物和方法可以進行各種各樣的改變，上述描述中涉及的所有內容和附圖所示內容只是為了詳細說明而不是為了限制本發明。
權利要求
1.一種製備相應於下式mexrenone衍生物的方法 其中-A-A-代表基團-CHR4-CHR5-或-CR4＝CR5-，R3，R4和R5各自獨立地選自氫，滷素，羥基，低級烷基，低級烷氧基，羥基烷基，烷氧基烷基，羥基羰基，氰基，芳基氧基，R1代表α-取向的低級烷氧羰基或羥基羰基殘基，-B-B-代表基團-CHR6-CHR7-或α-取向或β-取向的基團 其中R6和R7各自獨立地選自氫，滷素，低級烷氧基，醯基，羥基烷基，烷氧基烷基，羥基羰基，烷基，烷氧羰基，醯氧基烷基，氰基，芳基氧基，該方法包括使式XIV化合物與相應於式R10OM的鹼金屬烷氧化物反應，其中M是鹼金屬，R10O-相應於R1的烷氧基取代基，所述式XIV化合物具有下面的結構 其中-A-A-，R3，和-B-B-如上所定義。
2.權利要求1的方法，其中所述式XIV化合物是4』S(4』α)，7』α-1』，2』，3』，4，4』，5，5』，6』，7』，8』，10』，12』，13』，14』，15』，16』-十六氫10β-，13』β-二甲基-3』，5，20』-三氧代螺[呋喃-2(3H)，17』β-[4，7]亞甲基[17H]環戊[a]菲]-5』-腈。
3.一種製備式XIV化合物的方法 其中-A-A-代表基團-CHR4-CHR5-或-CR4＝CR5-，R3，R4和R5各自獨立地選自氫，滷素，羥基，低級烷基，低級烷氧基，羥基烷基，烷氧基烷基，羥基羰基，氰基，芳基氧基，-B-B-代表基團-CHR6-CHR7-或α-取向或β-取向的基團 其中R6和R7各自獨立地選自氫，滷素，低級烷氧基，醯基，羥基烷基，烷氧基烷基，羥基羰基，烷基，烷氧羰基，醯氧基烷基，氰基，芳基氧基，該方法包括水解相應於式XV的化合物 其中-A-A-，R3，和-B-B-如上所定義。
4.權利要求3的方法，其中所述式XIV化合物是4』S(4』α)，7』α-1』，2』，3』，4，4』，5，5』，6』，7』，8』，10』，12』，13』，14』，15』，16』-十六氫-10β-，13』β-二甲基-3』，5，20』-三氧代螺[呋喃-2(3H)，17』β-[4，7]亞甲基[17H]環戊[a]菲]-5』-腈，和所述式XV的化合物是5』R(5』α)，7』β-20』-氨基-1』，2』，3』，4，5，6』，7』，8』，10』，12』，13』，14』，15』，16』-十四氫-10』α，13』α-二甲基-3』，5，-二氧代螺[呋喃-2(3H)，17』α[5』H]-[7，4]亞甲基[4H]環戊[a]菲]-5』-腈。
5.一種製備相應於式XV化合物的方法 其中-A-A-代表基團-CHR4-CHR5-或-CR4＝CR5-，R3，R4和R5各自獨立地選自氫，滷素，羥基，低級烷基，低級烷氧基，羥基烷基，烷氧基烷基，羥基羰基，氰基，芳基氧基，-B-B-代表基團-CHR6-CHR7-或α-取向或β-取向的基團 其中R6和R7各自獨立地選自氫，滷素，低級烷氧基，醯基，羥基烷基，烷氧基烷基，羥基羰基，烷基，烷氧羰基，醯氧基烷基，氰基，芳基氧基，該方法包括在一種鹼金屬鹽存在下，使式XVI化合物與氰化物離子源反應，所述式XVI化合物具有下面的結構 其中-A-A-，R3，和-B-B-如上定義。
6.權利要求5的方法，其中所述式XV化合物是5』R(5』α)，7』β-20』-氨基-1』，2』，3』，4，5，6』，7』，8』，10』，12』，13』，14』，15』，16』-十四氫-10』α，13』α-二甲基-3』，5-二氧代螺[呋喃-2(3H)，17』α(5』H)-[7，4]亞甲基(metheno)[4H]環戊[α]菲]-5』-腈。
7.一種製備相應於下式化合物的方法 其中-A-A-代表基團-CHR4-CHR5-或-CR4＝CR5-，R3，R4和R5各自獨立地選自氫，滷素，羥基，低級烷基，低級烷氧基，羥基烷基，烷氧基烷基，羥基羰基，氰基，芳基氧基，R1代表α-取向的低級烷氧羰基或羥基羰基殘基，-B-B-代表基團-CHR6-CHR7-或α-取向或β-取向的基團 其中R6和R7各自獨立地選自氫，滷素，低級烷氧基，醯基，羥基烷基，烷氧基烷基，羥基羰基，烷基，烷氧羰基，醯氧基烷基，氰基，芳基氧基，該方法包括使式XXI化合物與相應於式R10OM的鹼金屬烷氧化物反應，其中M是鹼金屬，R10O-相應於R1的烷氧基取代基，所述式XXI化合物具有下面的結構 其中-A-A-，R1，R3，和-B-B-如上所定義。
8.權利要求7的方法，其中所述式XXI化合物是4』S(4』α)，7』α-9』，11α-環氧十六氫-10β-，13』β-二甲基-3』，5，20』-三氧代螺[呋喃-2(3H)，17』β-[4，7]亞甲基[17H]環戊[a]菲]-5』-腈。
9.一種製備相應於式XXI化合物的方法 其中-A-A-代表基團-CHR4-CHR5-或-CR4＝CR5-，R3，R4和R5各自獨立地選自氫，滷素，羥基，低級烷基，低級烷氧基，羥基烷基，烷氧基烷基，羥基羰基，氰基，芳基氧基，-B-B-代表基團-CHR6-CHR7-或α-取向或β-取向的基團 其中R6和R7各自獨立地選自氫，滷素，低級烷氧基，醯基，羥基烷基，烷氧基烷基，羥基羰基，烷基，烷氧羰基，醯氧基烷基，氰基，芳基氧基，該方法包括水解相應於式XXII的化合物 其中-A-A-，R3，和-B-B-如上所定義。
10.權利要求9的方法，其中所述式XXI化合物是4』S(4』α)，7』α-9』，11α-環氧十六氫-10β-，13』β-二甲基-3』，5，20』-三氧代螺[呋喃-2(3H)，17』β-[4，7]亞甲基[17H]環戊[a]菲]-5』-腈，和所述式XXII的化合物是5』R(5』α)，7』β-20』-氨基-9，11β-環氧十六氫-10』，13』-二甲基-3』，5，-二氧代螺[呋喃-2(3H)，17』α(5』H)-[7，4]亞甲基[4H]環戊[a]菲]-5』-腈。
11.一種製備相應於式XXII化合物的方法 其中-A-A-代表基團-CHR4-CHR5-或-CR4＝CR5-，R3，R4和R5各自獨立地選自氫，滷素，羥基，低級烷基，低級烷氧基，羥基烷基，烷氧基烷基，羥基羰基，氰基，芳基氧基，-B-B-代表基團-CHR6-CHR7-或α-取向或β-取向的基團 其中R6和R7各自獨立地選自氫，滷素，低級烷氧基，醯基，羥基烷基，烷氧基烷基，羥基羰基，烷基，烷氧羰基，醯氧基烷基，氰基，芳基氧基，該方法包括在一種鹼金屬鹽的存在下，使式XXIII化合物與氰化物離子源反應，所述式XXIII化合物具有下面的結構 其中-A-A-，R3，和-B-B-如上所定義。
12.權利要求11的方法，其中所述式XXII化合物是5』R(5』α)，7』β-20』-氨基9，11β-環氧十六氫-10』，13』-二甲基-3』，5，-二氧代螺[呋喃-2(3H)，17』α(5』H)-[7，4]亞甲基[4H]環戊[a]菲]-5』-腈，和所述式XXII化合物是9，11α-環氧-17α-羥基-3-氧代孕甾-4，6-二烯-21-羧酸，γ-內酯。
13.一種製備相應於式XXIII化合物的方法 其中-A-A-代表基團-CHR4-CHR5-或-CR4＝CR5-，R3，R4和R5各自獨立地選自氫，滷素，羥基，低級烷基，低級烷氧基，羥基烷基，烷氧基烷基，羥基羰基，氰基，芳基氧基，R1代表α-取向的低級烷氧羰基，-B-B-代表基團-CHR6-CHR7-或α-取向或β-取向的基團 其中R6和R7各自獨立地選自氫，滷素，低級烷氧基，醯基，羥基烷基，烷氧基烷基，羥基羰基，烷基，烷氧羰基，醯氧基烷基，氰基，芳基氧基，該方法包括從相應於下式的化合物的6位和7位去除氫 其中-A-A-，R3，和-B-B-如上所定義。
14.一種製備式XIV化合物的方法 其中-A-A-代表基團-CHR4-CHR5-或-CR4＝CR5-，R3，R4和R5各自獨立地選自氫，滷素，羥基，低級烷基，低級烷氧基，羥基烷基，烷氧基烷基，羥基羰基，氰基，芳基氧基，-B-B-代表基團-CHR6-CHR7-或α-取向或β-取向的基團 其中R6和R7各自獨立地選自氫，滷素，低級烷氧基，醯基，羥基烷基，烷氧基烷基，羥基羰基，烷基，烷氧羰基，醯氧基烷基，氰基，芳基氧基，該方法包括水解相應於式XXV的化合物 其中Rx是羥基保護基，-A-A-，R3，-B-B-，R8和R9如上所定義。
15.權利要求14的方法，其中所述式XIV化合物是4』S(4』α)，7』α-1』，2』，3』，4，4』，5，5』，6』，7』，8』，10』，12』，13』，14』，15』，16』-十六氫-10β-，13』β-二甲基-3』，5，20』-三氧代螺[呋喃-2(3H)，17』β-[4，7]亞甲基[17H]環戊[a]菲]-5』-腈，和所述式XXV的化合物是5』R(5』α)，7』β-20』-氨基-十六氫-9』β-羥基-10』α，13』α-二甲基-3』，5，-二氧代螺[呋喃-2(3H)，17』α(5』H)-[7，4]亞甲基(metheno)[4H]環戊[a]菲]-5』-腈。
16.一種製備相應於式XXV化合物的方法 其中-A-A-代表基團-CHR4-CHR5-或-CR4＝CR5-，R3，R4和R5各自獨立地選自氫，滷素，羥基，低級烷基，低級烷氧基，羥基烷基，烷氧基烷基，羥基羰基，氰基，芳基氧基，-B-B-代表基團-CHR6-CHR7-或α-取向或β-取向的基團 其中R6和R7各自獨立地選自氫，滷素，低級烷氧基，醯基，羥基烷基，烷氧基烷基，羥基羰基，烷基，烷氧羰基，醯氧基烷基，氰基，芳基氧基，和R8和R9各自獨立地選自氫，滷素，低級烷氧基，醯基，羥基烷基，烷氧基烷基，羥基羰基，烷基，烷氧羰基，醯氧基烷基，氰基，芳基氧基，或者R8和R9一起構成一個碳環或雜環結構，其中RX是羥基保護基團，該方法包括在一種鹼金屬鹽存在下，使式XXVI化合物與氰化物離子源反應，所述式XXVI化合物具有下面的結構 其中-A-A-，R3，和-B-B-如上所定義。
17.權利要求16的方法，其中所述式XXV的化合物是5』R(5』α)，7』β-20』-氨基-十六氫-9』β-羥基-10』a，13』α-二甲基-3』，5，-二氧代螺[呋喃-2(3H)，17』α(5』H)-[7，4]亞甲基(metheno)[4H]環戊[a]菲]-5』-腈，和所述式XXVI化合物是9α，17α-二羥基-3-氧代孕甾-4，6-二烯-21-羧酸，γ-內酯。
18.一種製備相應於式XXVI化合物的方法 其中-A-A-代表基團-CHR4-CHR5-或-CR4＝CR5-，R3，R4和R5各自獨立地選自氫，滷素，羥基，低級烷基，低級烷氧基，羥基烷基，烷氧基烷基，羥基羰基，氰基，芳基氧基，-B-B-代表基團-CHR6-CHR7-或α-取向或β-取向的基團 其中R6和R7各自獨立地選自氫，滷素，低級烷氧基，醯基，羥基烷基，烷氧基烷基，羥基羰基，烷基，烷氧羰基，醯氧基烷基，氰基，芳基氧基，其中RX是羥基保護基團，該方法包括從相應於下式的化合物的6位和7位去除氫(脫氫作用) 其中-A-A-，R3，和-B-B-如上所定義。
19.權利要求18的方法，其中所述式XXVI化合物是9α，17α-二羥基-3-氧代孕甾-4，6-二烯-21-羧酸，γ-內酯，和式XXVII化合物是9α，17α-二羥基-3-氧代孕甾-4-烯-21-羧酸，γ-內酯。
20.一種製備相應於式VIII化合物的方法 其中-A-A-代表基團-CHR4-CHR5-或-CR4＝CR5-，R3選自氫，滷素，羥基，低級烷基，低級烷氧基，羥基烷基，烷氧基烷基，羥基羰基，氰基，芳基氧基，-B-B-代表基團-CHR6-CHR7-或α-取向或β-取向的基團 其中R6和R7各自獨立地選自氫，滷素，低級烷氧基，醯基，羥基烷基，烷氧基烷基，羥基羰基，烷基，烷氧羰基，醯氧基烷基，氰基，芳基氧基，和R8和R9各自獨立地選自氫，滷素，低級烷氧基，醯基，羥基烷基，烷氧基烷基，羥基羰基，烷基，烷氧羰基，醯氧基烷基，氰基，芳基氧基，或者R8和R9一起構成一個碳環或雜環結構，或者R8或R9與R6或R7一起構成一個與五元環D環稠合的碳環或雜環結構，該方法包括氧化相應於式104的化合物 其中-A-A-，R3，和-B-B-如上所定義，且R11是C1-C4烷基。
21.權利要求20的方法，其中式VIII的化合物與一種氧化劑接觸。
22.權利要求21的方法，其中所述氧化劑是苯醌衍生物。
23.權利要求22的方法，其中所述氧化劑選自2，3-二氯-5，6-二氰基-1，4-苯醌和四氯苯醌。
24.權利要求20的方法，其中所述式104化合物與一種滷化劑接觸產生滷化的中間體；並且使所述滷化的中間體與脫氫滷化物劑接觸，來使所述的滷化的中間體脫氫滷化並生成所述104化合物。
25.一種製備相應於式104化合物的方法 其中-A-A-代表基團-CHR4-CHR5-或-CR4＝CR5-，R3選自氫，滷素，羥基，低級烷基，低級烷氧基，羥基烷基，烷氧基烷基，羥基羰基，氰基，芳基氧基，R11是C1-C4低級烷基；-B-B-代表基團-CHR6-CHR7-或α-取向或β-取向的基團 其中R6和R7各自獨立地選自氫，滷素，低級烷氧基，醯基，羥基烷基，烷氧基烷基，羥基羰基，烷基，烷氧羰基，醯氧基烷基，氰基，芳基氧基，該方法包括在一種鹼金屬滷化物存在下，將相應於式103的化合物熱分解，所述式103的化合物具有下面的結構 其中-A-A-，R3，R11，和-B-B-如上所定義，且R12是C1-C4烷基。
26.一種製備相應於式103化合物的方法 其中-A-A-代表基團-CHR4-CHR5-或-CR4＝CR5-，R3選自氫，滷素，羥基，低級烷基，低級烷氧基，羥基烷基，烷氧基烷基，羥基羰基，氰基，芳基氧基，R11是C1-C4低級烷基；-B-B-代表基團-CHR6-CHR7-或α-取向或β-取向的基團 其中R6和R7各自獨立地選自氫，滷素，低級烷氧基，醯基，羥基烷基，烷氧基烷基，羥基羰基，烷基，烷氧羰基，醯氧基烷基，氰基，芳基氧基，該方法包括在一種鹼的存在下，將式102的化合物與丙二酸二烷基酯縮合，所述式102的化合物具有下面的結構 其中-A-A-，R3，R11，和-B-B-如上所定義。
27.一種製備相應於式102化合物的方法 其中-A-A-代表基團-CHR4-CHR5-或-CR4＝CR5-，R3選自氫，滷素，羥基，低級烷基，低級烷氧基，羥基烷基，烷氧基烷基，羥基羰基，氰基，芳基氧基，R11是C1-C4低級烷基；-B-B-代表基團-CHR6-CHR7-或α-取向或β-取向的基團 其中R6和R7各自獨立地選自氫，滷素，低級烷氧基，醯基，羥基烷基，烷氧基烷基，羥基羰基，烷基，烷氧羰基，醯氧基烷基，氰基，芳基氧基，該方法包括在一種鹼存在下，將式101的化合物與sulfonium ylide反應，所述式101化合物具有下面的結構 其中-A-A-，R3和-B-B-如上所定義。
28.一種製備相應於式101化合物的方法 其中-A-A-代表基團-CHR4-CHR5-或-CR4＝CR5-，R3選自氫，滷素，羥基，低級烷基，低級烷氧基，羥基烷基，烷氧基烷基，羥基羰基，氰基，芳基氧基，R11是C1-C4烷基；-B-B-代表基團-CHR6-CHR7-或α-取向或β-取向的基團 其中R6和R7各自獨立地選自氫，滷素，低級烷氧基，醯基，羥基烷基，烷氧基烷基，羥基羰基，烷基，烷氧羰基，醯氧基烷基，氰基，芳基氧基，該方法包括在一種酸催化劑存在下，使式XXXVI化合物與一種醚化劑反應，所述式XXXVI的化合物具有下面的結構 其中-A-A-，R3，和-B-B-如上所定義。
29.權利要求28的方法，其中所述式101化合物通過在一種酸化的鏈烷醇溶劑中，使式XXXVI的化合物與原甲酸三烷基酯反應來製備。
30.一種製備式XXXVI化合物的方法 其中-A-A-代表基團-CHR4-CHR5-或-CR4＝CR5-，R3選自氫，滷素，羥基，低級烷基，低級烷氧基，羥基烷基，烷氧基烷基，羥基羰基，氰基，芳基氧基，-B-B-代表基團-CHR6-CHR7-或α-取向或β-取向的基團 其中R6和R7各自獨立地選自氫，滷素，低級烷氧基，醯基，羥基烷基，烷氧基烷基，羥基羰基，烷基，烷氧羰基，醯氧基烷基，氰基，芳基氧基，該方法包括在一種對於由所述底物向式XXXVI化合物轉化有效的微生物的存在下，通過發酵氧化式XXXVII的底物化合物 其中-A-A-，-B-B-，和R3如上定義，所述式XXXVII的底物化合物相應於下式 其中-A-A-，R1，R3，-B-B-如上定義，並且-D-D-是-CH2-CH2-或-CH＝CH-，且R13，R14和R15及R16各自獨立地選自C1-C4烷基；然後通過在一種對於11α-羥基化作用有效的微生物的存在下的發酵作用，在所述式XXXVI化合物中α-取向引入11-羥基。
31.一種製備相應於式II化合物的方法 其中-A-A-代表基團-CHR4-CHR5-或-CR4＝CR5-，R3，R4和R5各自獨立地選自氫，滷素，羥基，低級烷基，低級烷氧基，羥基烷基，烷氧基烷基，羥基羰基，氰基，芳基氧基，R1代表α-取向的低級烷氧羰基或羥基羰基殘基，-B-B-代表基團-CHR6-CHR7-或α-取向或β-取向的基團 其中R6和R7各自獨立地選自氫，滷素，低級烷氧基，醯基，羥基烷基，烷氧基烷基，羥基羰基，烷基，烷氧羰基，醯氧基烷基，氰基，芳基氧基，和R8和R9各自獨立地選自氫，滷素，低級烷氧基，醯基，羥基烷基，烷氧基烷基，羥基羰基，烷基，烷氧羰基，醯氧基烷基，氰基，芳基氧基，或者R8和R9一起構成一個碳環或雜環結構，該方法包括通過使式VI化合物與相應於式R10OM的鹼金屬烷氧化物反應，其中M是鹼金屬，R10O-相應於R1的烷氧基取代基，製備式V化合物， 其中-A-A-，R1，R3，-B-B-，R8和R9定義同上，所述式VI化合物具有下面的結構 其中-A-A-，R3，和-B-B-，R8和R9如上所定義；不用分離純化形式的所述式V化合物，使所述式V化合物與一種低級烷基磺醯化試劑或醯化試劑反應，產生式IV化合物 其中-A-A-，R1，R3，和-B-B-，R8和R9如上所定義，且R2是烷基磺醯基氧基，醯氧基離去基團或滷化物；不用分離純化形式的所述式IV化合物，通過與用於除去該基團的試劑進行反應從中去除11α-離去基團，來產生式II化合物。
32.權利要求31的方法，其中不用分離純化形式的所述式II化合物，所述式II化合物與環氧化試劑反應，生成式I產物 其中-A-A-，R1，R3，和-B-B-，R8和R9如上所定義。
33.權利要求32的方法，其中通過在一種鹼金屬烷氧化物的存在下，使所述式IV化合物與包括鏈烷酸的離去基團去除劑反應，生成所述式II化合物；從反應溶液中除去揮發成分；通過用含水洗液洗滌而從反應溶液中除去水溶性成分，從而得到適於式II化合物向式I化合物轉化的殘留的式II溶液；和過氧化物氧化劑與殘留的式II溶液混合，以實現式II化合物向式I化合物轉化。
34.權利要求32的方法，其中在一種有機溶劑中使所述式VI化合物與鹼金屬烷氧化物反應，生成所述式V化合物；使用有機溶劑從含有式V反應液的溶液中萃取式V化合物，從而製備式V萃取溶液；和為了製備式VI化合物，將低級烷基磺醯滷或醯滷加入到含有所述式V萃取液的溶液中。
35.權利要求32的方法，其中在一種有機溶劑中，使所述式V化合物與離去基團消除劑反應，生成式IV所述化合物；為了從中去除鹼性和酸性雜質，將含有式IV反應液的溶液通過酸性交換樹脂柱後通過鹼性交換樹脂柱，從而製備式IV洗脫液；為了製備所述式II化合物，將用於消除烷基磺醯基氧基或醯基氧基離去基團的試劑與含有所述式IV洗脫液的溶液混合。
36.一種生成環氧化物的方法，包括在一種過氧化物活化劑存在下，使具有烯烴雙鍵的底物化合物與過氧化物接觸，所述過氧化物活化劑相應於下式 其中R是拉電子強度不小於一氯代甲基的取代基。
37.權利要求36的方法，其中所述過氧化物活化劑相應於下式 其中X1，X2，和X3選自滷素，氫，烷基，滷代烷基，氰基和氰基烷基，RP選自亞芳基和-(CX4X5)n-，n是0或1，X1，X2，X3，X4和X5中至少一個是滷素或全滷代烷基。
38.權利要求36的方法，其中n是0，且X1，X2，和X3中至少兩個是滷素或全滷代烷基。
39.權利要求36的方法，其中X1，X2，X3，X4和X5全部是滷素或全滷代烷基。
40.權利要求36的方法，其中所述過氧化物活化劑是三滷代乙醯胺。
41.權利要求40的方法，其中所述過氧化物活化劑是三氯代乙醯胺。
42.權利要求36的方法，其中所述底物化合物相應於下式 其中-A-A-代表基團-CHR4-CHR5-或-CR4＝CR5-，R3，選自氫，滷素，羥基，低級烷基，低級烷氧基，羥基烷基，烷氧基烷基，羥基羰基，氰基，芳基氧基，R1代表α-取向的低級烷氧羰基或羥基羰基殘基，-B-B-代表基團-CHR6-CHR7-或α-取向或β-取向的基團 其中R6和R7各自獨立地選自氫，滷素，低級烷氧基，醯基，羥基烷基，烷氧基烷基，羥基羰基，烷基，烷氧羰基，醯氧基烷基，氰基，芳基氧基，和R8和R9各自獨立地選自氫，滷素，低級烷氧基，醯基，羥基烷基，烷氧基烷基，羥基羰基，烷基，烷氧羰基，醯氧基烷基，氰基，芳基氧基，或者R8和R9一起構成一個碳環或雜環結構，或者R8或R9與R6或R7一起構成一個與五元環D環稠合的碳環或雜環結構。
43.權利要求36的方法，其中所述底物化合物選自下組 以及環氧化作用反應的產物選自下組
44.一種式IV化合物 其中-A-A-代表基團-CHR4-CHR5-或-CR4＝CR5-，R3，R4和R5各自獨立地選自氫，滷素，羥基，低級烷基，低級烷氧基，羥基烷基，烷氧基烷基，羥基羰基，氰基，芳基氧基，R1代表α-取向的低級烷氧羰基或羥基羰基殘基，-B-B-代表基團-CHR6-CHR7-或α-取向或β-取向的基團 其中R6和R7各自獨立地選自氫，滷素，低級烷氧基，醯基，羥基烷基，烷氧基烷基，羥基羰基，烷基，烷氧羰基，醯氧基烷基，氰基，和芳基氧基，和R8和R9各自獨立地選自氫，滷素，低級烷氧基，醯基，羥基烷基，烷氧基烷基，羥基羰基，烷基，烷氧羰基，醯氧基烷基，氰基，和芳基氧基，或者R8和R9一起構成一個碳環或雜環結構，或者R8或R9與R6或R7一起構成一個與五元環D環稠合的碳環或雜環結構，和R2是低級烷基磺醯基氧基或醯基氧基或滷素。
45.權利要求44的式IV化合物，其中所述化合物相應於式IVA 其中-A-A-代表基團-CH2-CH2-或-CH＝CH-，R1代表α-取向的低級烷氧羰基，R2代表低級烷基磺醯基氧基或醯基氧基，-B-B-代表基團-CH2-CH2-或α-取向或β-取向的式IIIA基團 X代表兩個氫原子或氧代基團，Y1和Y2一起代表氧橋-O-，或Y1代表羥基，和Y2代表羥基，低級烷氧基，或者，如果X代表H2，則也可以代表低級烷醯氧基，和其中X代表氧代基團及Y2代表羥基的化合物的鹽。
46.權利要求44的式IV化合物，其中所述化合物是17α-羥基-11α-(甲基磺醯基)氧基-3-氧代孕甾-4-烯-7α，21-二羧酸氫甲酯，γ-內酯。
47.一種式V化合物 其中-A-A-代表基團-CHR4-CHR5-或-CR4＝CR5-，R3，R4和R5各自獨立地選自氫，滷素，羥基，低級烷基，低級烷氧基，羥基烷基，烷氧基烷基，羥基羰基，氰基，和芳基氧基，R1代表α-取向的低級烷氧羰基或羥基羰基殘基，-B-B-代表基團-CHR6-CHR7-或α-取向或β-取向的基團 其中R6和R7各自獨立地選自氫，滷素，低級烷氧基，醯基，羥基烷基，烷氧基烷基，羥基羰基，烷基，烷氧羰基，醯氧基烷基，氰基，和芳基氧基，和R8和R9各自獨立地選自氫，滷素，低級烷氧基，醯基，羥基烷基，烷氧基烷基，羥基羰基，烷基，烷氧羰基，醯氧基烷基，氰基，和芳基氧基，或者R8和R9一起構成一個碳環或雜環結構，或者R8或R9與R6或R7一起構成一個與五元環D環稠合的碳環或雜環結構。
48.權利要求47的式V化合物，其中化合物相應於式VA 其中-A-A-代表基團-CH2-CH2-或-CH＝CH-，R1代表α-取向的低級烷氧羰基，-B-B-代表基團-CH2-CH2-或α-取向或β-取向的式IIIA基團 X代表兩個氫原子或氧代基團，Y1和Y2一起代表氧橋-O-，或Y1代表羥基，和Y2代表羥基，低級烷氧基，或者，如果X代表H2，則也可以代表低級烷醯氧基，和其中X代表氧代基團及Y2代表羥基的化合物的鹽。
49.權利要求47的式V化合物，其中化合物是11α，17α-二羥基-3-氧代孕甾-4-烯-7α，21-二羧酸氫甲酯，γ-內酯。
50.一種式VI化合物 其中-A-A-代表基團-CHR4-CHR5-或-CR4＝CR5-，R3，R4和R5各自獨立地選自氫，滷素，羥基，低級烷基，低級烷氧基，羥基烷基，烷氧基烷基，羥基羰基，氰基，和芳基氧基，-B-B-代表基團-CHR6-CHR7-或α-取向或β-取向的基團 其中R6和R7各自獨立地選自氫，滷素，低級烷氧基，醯基，羥基烷基，烷氧基烷基，羥基羰基，烷基，烷氧羰基，醯氧基烷基，氰基，芳基氧基，和R8和R9各自獨立地選自氫，滷素，低級烷氧基，醯基，羥基烷基，烷氧基烷基，羥基羰基，烷基，烷氧羰基，醯氧基烷基，氰基，和芳基氧基，或者R8和R9一起構成一個碳環或雜環結構，或者R8或R9與R6或R7一起構成一個與五元環D環稠合的碳環或雜環結構。
51.權利要求50的式VI化合物，其中所述化合物相應於式VIA 其中-A-A-代表基團-CH2-CH2-或-CH＝CH-，-B-B-代表基團-CH2-CH2-或α-取向或β-取向的式IIIA基團 X代表兩個氫原子或氧代基團，Y1和Y2一起代表氧橋-O-，或Y1代表羥基，和Y2代表羥基，低級烷氧基，或者，如果X代表H2，則也可以代表低級烷醯氧基，和其中X代表氧代基團及Y2代表羥基的化合物的鹽。
52.權利要求50的式VI化合物，其中所述化合物是4』S(4』α)，7』α-十六氫-11』α-羥基-10』β，13』β-二甲基-3』，5，20』-三氧代螺[呋喃-2(3H)，17』β-[4，7]亞甲基[17H]環戊[a]菲]-5』β(2』H)-腈。
53.一種式VII化合物 其中-A-A-代表基團-CHR4-CHR5-或-CR4＝CR5-，R3，R4和R5各自獨立地選自氫，滷素，羥基，低級烷基，低級烷氧基，羥基烷基，烷氧基烷基，羥基羰基，氰基，和芳基氧基，-B-B-代表基團-CHR6-CHR7-或α-取向或β-取向的基團 其中R6和R7各自獨立地選自氫，滷素，低級烷氧基，醯基，羥基烷基，烷氧基烷基，羥基羰基，烷基，烷氧羰基，醯氧基烷基，氰基，和芳基氧基，和R8和R9各自獨立地選自氫，滷素，低級烷氧基，醯基，羥基烷基，烷氧基烷基，羥基羰基，烷基，烷氧羰基，醯氧基烷基，氰基，和芳基氧基，或者R8和R9一起構成一個碳環或雜環結構，或者R8或R9與R6或R7一起構成一個與五元環D環稠合的碳環或雜環結構。
54.權利要求53的式VII化合物，其中所述化合物相應於式VIIA 其中-A-A-代表基團-CH2-CH2-或-CH＝CH-，-B-B-代表基團-CH2-CH2-或α-取向或β-取向的式IIIA基團 X代表兩個氫原子或氧代基團，Y1和Y2一起代表氧橋-O-，或Y1代表羥基，和Y2代表羥基，低級烷氧基，或者，如果X代表H2，則也可以代表低級烷醯氧基，和其中X代表氧代基團及Y2代表羥基的化合物的鹽。
55.權利要求53的式VII化合物，其中所述化合物是5』R(5』α)，7』β-20』-氨基十六氫-11』β-羥基-10』α，13』α-二甲基-3』，5，-二氧代螺[呋喃-2(3H)，17』α(5』H)-[7，4]亞甲基(metheno)[4H]環戊[a]菲]-5』-腈。
56.一種式VIII化合物 其中-A-A-代表基團-CHR4-CHR5-或-CR4＝CR5-，R3，R4和R5各自獨立地選自氫，滷素，羥基，低級烷基，低級烷氧基，羥基烷基，烷氧基烷基，羥基羰基，氰基，和芳基氧基，-B-B-代表基團-CHR6-CHR7-或α-取向或β-取向的基團 其中R6和R7各自獨立地選自氫，滷素，低級烷氧基，醯基，羥基烷基，烷氧基烷基，羥基羰基，烷基，烷氧羰基，醯氧基烷基，氰基，和芳基氧基，和R8和R9各自獨立地選自氫，滷素，低級烷氧基，醯基，羥基烷基，烷氧基烷基，羥基羰基，烷基，烷氧羰基，醯氧基烷基，氰基，和芳基氧基，或者R8和R9一起構成一個碳環或雜環結構，或者R8或R9與R6或R7一起構成一個與五元環D環稠合的碳環或雜環結構。
57.權利要求56的式VIII化合物，其中所述化合物相應於式VIIIA 其中-A-A-代表基團-CH2-CH2-或-CH＝CH-，-B-B-代表基團-CH2-CH2-或α-取向或β-取向的式IIIA基團 X代表兩個氫原子或氧代基團，Y1和Y2一起代表氧橋-O-，或Y1代表羥基，和Y2代表羥基，低級烷氧基，或者，如果X代表H2，則也可以代表低級烷醯氧基，和其中X代表氧代基團及Y2代表羥基的化合物的鹽。
58.權利要求56的式VIII化合物，其中所述化合物是11α，17α-二羥基-3-氧代孕甾-4，6-二烯-21-羧酸，γ-內酯。
59.一種式XIV化合物 其中-A-A-代表基團-CHR4-CHR5-或-CR4＝CR5-，R3，R4和R5各自獨立地選自氫，滷素，羥基，低級烷基，低級烷氧基，羥基烷基，烷氧基烷基，羥基羰基，氰基，和芳基氧基，-B-B-代表基團-CHR6-CHR7-或α-取向或β-取向的基團 其中R6和R7各自獨立地選自氫，滷素，低級烷氧基，醯基，羥基烷基，烷氧基烷基，羥基羰基，烷基，烷氧羰基，醯氧基烷基，氰基，和芳基氧基。
60.權利要求3的式XIV化合物，其中所述化合物是4』S(4』α)，7』α-1』，2』，3』，4，4』，5，5』，6』，7』，8』，10』，12』，13』，14』，15』，16』-十六氫-10β，13』β-二甲基-3』，5，20』-三氧代螺[呋喃-2(3H)，17』β-[4，7]亞甲基[17H]環戊[a]菲]-5』-腈。
61.一種相應於式XV的化合物 其中-A-A-代表基團-CHR4-CHR5-或-CR4＝CR5-，R3，R4和R5各自獨立地選自氫，滷素，羥基，低級烷基，低級烷氧基，羥基烷基，烷氧基烷基，羥基羰基，氰基，和芳基氧基，和-B-B-代表基團-CHR6-CHR7-或α-取向或β-取向的基團 其中R6和R7各自獨立地選自氫，滷素，低級烷氧基，醯基，羥基烷基，烷氧基烷基，羥基羰基，烷基，烷氧羰基，醯氧基烷基，氰基，和芳基氧基。
62.權利要求61的式XV化合物，其中所述化合物是9α，17α-二羥基-3-氧代孕甾-4-烯-7α，21-二羧酸氫甲酯，γ-內酯。
63.一種相應於式XXI的化合物 其中-A-A-代表基團-CHR4-CHR5-或-CR4＝CR5-，R4和R5各自獨立地選自氫，滷素，羥基，低級烷基，低級烷氧基，羥基烷基，烷氧基烷基，羥基羰基，氰基，和芳基氧基，-B-B-代表基團-CHR6-CHR7-或α-取向或β-取向的基團 其中R6和R7各自獨立地選自氫，滷素，低級烷氧基，醯基，羥基烷基，烷氧基烷基，羥基羰基，烷基，烷氧羰基，醯氧基烷基，氰基，和芳基氧基。
64.權利要求63的式XXI化合物，其中所述化合物是4』S(4』α)，7』α-9』，11α-環氧十六氫-10β-，13』β-二甲基-3』，5，20』-三氧代螺[呋喃-2(3H)，17』β-[4，7]亞甲基[17H]環戊[a]菲]-5』-腈。
65.一種相應於式XXII的化合物 其中-A-A-代表基團-CHR4-CHR5-或-CR4＝CR5-，R4和R5各自獨立地選自氫，滷素，羥基，低級烷基，低級烷氧基，羥基烷基，烷氧基烷基，羥基羰基，氰基，和芳基氧基，和-B-B-代表基團-CHR6-CHR7-或α-取向或β-取向的基團 其中R6和R7各自獨立地選自氫，滷素，低級烷氧基，醯基，羥基烷基，烷氧基烷基，羥基羰基，烷基，烷氧羰基，醯氧基烷基，氰基，和芳基氧基。
66.權利要求65的式XXII化合物，其中所述化合物是5』R(5』α)，7』β-20』-氨基9，11β-環氧十六氫-10』，13』-二甲基-3』，5，-二氧代螺[呋喃-2(3H)，17』α(5』H)-[7，4]亞甲基[4H]環戊[a]菲]-5』-腈。
67.一種相應於式XXIII化合物 其中-A-A-代表基團-CHR4-CHR5-或-CR4＝CR5-，R4和R5各自獨立地選自氫，滷素，羥基，低級烷基，低級烷氧基，羥基烷基，烷氧基烷基，羥基羰基，氰基，和芳基氧基，和-B-B-代表基團-CHR6-CHR7-或α-取向或β-取向的基團 其中R6和R7各自獨立地選自氫，滷素，低級烷氧基，醯基，羥基烷基，烷氧基烷基，羥基羰基，烷基，烷氧羰基，醯氧基烷基，氰基，和芳基氧基。
68.一種權利要求67的式XXIII的化合物，其中R8和R9與它們所連接的環碳原子一起形成下述結構 其中X代表兩個氫原子或氧代基團，Y1和Y2一起代表氧橋-O-，或Y1代表羥基，和Y2代表羥基，低級烷氧基，或者，如果X代表H2，則也可以代表低級烷醯氧基，和其中X代表氧代基團及Y2代表羥基的該化合物的鹽。
69.一種相應於式XXV的化合物 其中-A-A-代表基團-CHR4-CHR5-或-CR4＝CR5-，R4和R5各自獨立地選自氫，滷素，羥基，低級烷基，低級烷氧基，羥基烷基，烷氧基烷基，羥基羰基，氰基，和芳基氧基，-B-B-代表基團-CHR6-CHR7-或α-取向或β-取向的基團 其中R6和R7各自獨立地選自氫，滷素，低級烷氧基，醯基，羥基烷基，烷氧基烷基，羥基羰基，烷基，烷氧羰基，醯氧基烷基，氰基，和芳基氧基，R8和R9各自獨立地選自氫，滷素，低級烷氧基，醯基，羥基烷基，烷氧基烷基，羥基羰基，烷基，烷氧羰基，醯氧基烷基，氰基，和芳基氧基，或者R8和R9一起構成一個碳環或雜環結構，以及RX選自氫或羥基保護基團。
70.權利要求69的式XXV的化合物，其中所述化合物是5』R(5』α)，7』β-20』-氨基-十六氫-9』β-羥基-10』a，13』α-二甲基-3』，5，-二氧代螺[呋喃-2(3H)，17』α(5』H)-[7，4]亞甲基(metheno)[4H]環戊[a]菲]-5』-腈。
71.一種相應於式XXVI的化合物 其中-A-A-代表基團-CHR4-CHR5-或-CR4＝CR5-，R4和R5各自獨立地選自氫，滷素，羥基，低級烷基，低級烷氧基，羥基烷基，烷氧基烷基，羥基羰基，氰基，和芳基氧基，-B-B-代表基團-CHR6-CHR7-或α-取向或β-取向的基團 其中R6和R7各自獨立地選自氫，滷素，低級烷氧基，醯基，羥基烷基，烷氧基烷基，羥基羰基，烷基，烷氧羰基，醯氧基烷基，氰基，和芳基氧基，和RX選自氫或羥基保護基團。
72.權利要求71的式XXVI化合物，其中所述化合物是9α，17α-二羥基-3-氧代孕甾-4，6-二烯-21-羧酸，γ-內酯。
73.一種相應於式104的化合物 其中-A-A-代表基團-CHR4-CHR5-或-CR4＝CR5-，R3，R4和R5各自獨立地選自氫，滷素，羥基，低級烷基，低級烷氧基，羥基烷基，烷氧基烷基，羥基羰基，氰基，和芳基氧基，R11是C1-C4低級烷基；和-B-B-代表基團-CHR6-CHR7-或α-取向或β-取向的基團 其中R6和R7各自獨立地選自氫，滷素，低級烷氧基，醯基，羥基烷基，烷氧基烷基，羥基羰基，烷基，烷氧羰基，醯氧基烷基，氰基，和芳基氧基。
74.權利要求73的式104化合物，其中所述化合物是3-乙氧基-11α-17α-二羥基孕甾-3，5-二烯-21-羧酸，γ-內酯。
75.一種相應於式103化合物 其中-A-A-代表基團-CHR4-CHR5-或-CR4＝CR5-，R3，R4，和R5各自獨立地選自氫，滷素，羥基，低級烷基，低級烷氧基，羥基烷基，烷氧基烷基，羥基羰基，氰基，和芳基氧基，R11是C1-C4低級烷基；和-B-B-代表基團-CHR6-CHR7-或α-取向或β-取向的基團 其中R6和R7各自獨立地選自氫，滷素，低級烷氧基，醯基，羥基烷基，烷氧基烷基，羥基羰基，烷基，烷氧羰基，醯氧基烷基，氰基，和芳基氧基。
76.權利要求75的式103化合物，其中所述化合物是3-乙氧基-11α-17α-二羥基孕甾-3，5-二烯-21，21-二羧酸氫乙酯，γ-內酯。
77.一種相應於式102的化合物 其中-A-A-代表基團-CHR4-CHR5-或-CR4＝CR5-，R3，R4和R5各自獨立地選自氫，滷素，羥基，低級烷基，低級烷氧基，羥基烷基，烷氧基烷基，羥基羰基，氰基，和芳基氧基，R11是C1-C4烷基；-B-B-代表基團-CHR6-CHR7-或α-取向或β-取向的基團 其中R6和R7各自獨立地選自氫，滷素，低級烷氧基，醯基，羥基烷基，烷氧基烷基，羥基羰基，烷基，烷氧羰基，醯氧基烷基，氰基，和芳基氧基。
78.權利要求77的式102化合物，其中所述化合物是3-乙氧基螺[雄甾-3，5-二烯-17β，2』-環氧乙烷]-11α-醇。
79.一種相應於式101的化合物 其中-A-A-代表基團-CHR4-CHR5-或-CR4＝CR5-，R3，R4，R5各自獨立地選自氫，滷素，羥基，低級烷基，低級烷氧基，羥基烷基，烷氧基烷基，羥基羰基，氰基，和芳基氧基，R11是C1-C4烷基；-B-B-代表基團-CHR6-CHR7-或α-取向或β-取向的基團 其中R6和R7各自獨立地選自氫，滷素，低級烷氧基，醯基，羥基烷基，烷氧基烷基，羥基羰基，烷基，烷氧羰基，醯氧基烷基，氰基，和芳基氧基。
80.權利要求77的式102化合物，其中所述化合物是3-乙氧基-11α-羥基雄甾-3，5-二烯-17-酮。
81.一種相應於式IX的化合物 其中-A-A-代表基團-CHR4-CHR5-或-CR4＝CR5-，R3，R4和R5各自獨立地選自氫，滷素，羥基，低級烷基，低級烷氧基，羥基烷基，烷氧基烷基，羥基羰基，氰基，和芳基氧基，和-B-B-代表基團-CHR6-CHR7-或α-取向或β-取向的基團 其中R6和R7各自獨立地選自氫，滷素，低級烷氧基，醯基，羥基烷基，烷氧基烷基，羥基羰基，烷基，烷氧羰基，醯氧基烷基，氰基，和芳基氧基，和R8和R9各自獨立地選自氫，滷素，低級烷氧基，醯基，羥基烷基，烷氧基烷基，羥基羰基，烷基，烷氧羰基，醯氧基烷基，氰基，芳基氧基，或者R8和R9一起構成一個碳環或雜環結構，或者R8和R9一起構成一個碳環或雜環結構，或者R8或R9與R6或R7一起構成一個與五元環D環稠合的碳環或雜環結構。
82.權利要求81的式IX化合物，其中所述化合物相應於下式IXA 其中-A-A-代表基團-CH2-CH2-或-CH＝CH-，R4和R5各自獨立地選自氫，滷素，羥基，低級烷基，低級烷氧基，羥基烷基，烷氧基烷基，羥基羰基，氰基，和芳基氧基，R1代表α-取向的低級烷氧羰基殘基，-B-B-代表基團-CH2-CH2-或α-取向或β-取向的基團 X代表兩個氫原子或氧代基團，Y1和Y2一起代表氧橋-O-，或Y1代表羥基，和Y2代表羥基，低級烷氧基，或者，如果X代表H2，則也可以代表低級烷醯氧基，和其中X代表氧代基團及Y2代表羥基的化合物的鹽。
全文摘要
本發明提供了用於合成epoxymexrenone和其它式I化合物的多種新的反應方法，新的反應步驟和新的中間體，式I中各基團的定義如說明書所述。
文檔編號C07J71/00GK1903872SQ200610068139
公開日2007年1月31日 申請日期1996年12月11日 優先權日1995年12月11日
發明者J·S·吳, P·T·王, J·A·貝茲, 劉靖, D·K·安德森, J·P·勞森, D·艾爾布, J·維喬佐雷克, G·慕斯爾裡羅, F·范扎內拉, S·A·昆達, L·J·勒藤德雷, M·J·波佐, Y·-L·L·星 申請人:G.D.瑟爾公司