一種含有egcg的微乳注射劑的製作方法
2023-04-25 18:08:36 1
專利名稱：一種含有egcg的微乳注射劑的製作方法
技術領域：
本發明屬於藥物新技術領域，涉及一種用於治療癌症、腫瘤疾病的藥物製劑及其製備方 法，具體地說是一種含有EGCG(表沒食子兒茶素沒食子酸酯)的微乳注射劑及其製備方法。
背景技術：
惡性腫瘤是嚴重威脅人類健康的常見病和多發病，每年全球腫瘤死亡總數達700萬人。 WHO最近宣稱，到2020年全世界腫瘤發病率將是現在的2倍。目前全世界每年有1000萬新 增癌症患者。隨著我國人口老齡化以及現代化進程加劇，我國腫瘤發病率逐年增高，每年新 增腫瘤病人超過200萬人，腫瘤已成為我國居民的第一大死因。其中肺癌的發病率居所有癌 症之首。
目前癌症的治療仍然以化、放療、手術治療為主。近年來，抗腫瘤新藥的研發取得極大 的進展，近十年來，美國FDA批准的新藥中，抗腫瘤藥一直是主要的品種之一，抗腫瘤藥作 用的靶點涉及更多、更深。出現很多針對新靶點的藥物，如新型酶的抑制劑、新生血管抑制 劑、基因治療等。
綠茶提取物經過進一步的分離提純，使EGCG (表沒食子兒茶素沒食子酸酯)的純度可 以達到95%左右，甚至可以到99%。
(-)-表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)是從中國綠茶中提取的一種成份，它是綠茶主 要的活性和水溶性成份，是兒茶素中含量最高的組分，因為具有特殊的立體化學結構，EGCG 具有非常強的抗氧化活性，其抗氧化活性至少是維生素C的100多倍，是維生素E的25倍， 能夠保護細胞和DNA免受損害，在抗癌和心血管疾病方面擔當了重要的角色。此外，它也 用作腫瘤多藥耐藥性的逆轉劑，能夠改善癌細胞對化療的敏感性並減輕對心臟的毒性。EGCG 的機構式如下 '
名稱 (2R，3R)-2-(3，4,5-Trihydroxyphenyl)-3，4-dihydro-l(2H)-benzopyraii-3,5,7-trio1
3-(3，4,5-trihydroxybenzoate);
CAS號 989-51-5分子式 C22H18Ou 分子量 458.38
一、 EGCG作用機理研究
(1)靶向攻擊，強力分解複合化合物茶多酚含有EGCG、 ECG、 EGC、 EC等，能自動識 別癌細胞。其獨有的EGCG成份作用癌細胞組織可抑制癌細胞生長所需的酵素(Nox)及尿激酶 的活性。並對癌細胞進行化學分解，不傷害正常健康細胞；(2)抑制合成EGCG能阻止增 殖，與健康細胞的腫瘤受體結合，阻止致癌性苯並芘類誘導體及亞硝基化合物的形成，抑制 致癌基因與DNA的共價結合，阻止癌細胞增殖；(3)誘導凋亡EGCG通過抑制合成及化學
分解作用，破壞癌細胞生存環境，切斷癌細胞的增殖途徑，殺死癌細胞，即誘導癌細胞凋亡；
(4)增強免疫，對抗輻射EGCG能清除人體內的自由基。延緩衰老，增強機體非特異性免
疫能力。能明顯消除放、化療的白細胞減少症，具有很強的升白作用。 (5)興奮中樞神 經EGCG能興奮中樞神經，消除疲勞，恢復精神。並有神奇鎮痛作用，其與黃酮可共同減輕 或消除放、化療後出現的噁心、嘔吐、食欲不振、腹瀉等不良反應。
二、 EGCG的生物學活性和藥理作用
黃垸醇類易被氧化為相應的0-醌類，二者可作為氫受體和氫供體。在黃烷醇的結構中， 5位和7位二羥基團和1位氧能使6位和8位碳原子產生強烈的親核性，C-0或C-C骨架的形 成可使黃烷醇發生氧化聚合。EGCG對金屬離子、生物鹼和生物大分子，如脂類、碳氫化合物、 蛋白質和核酸有高度的親和力。這是EGCG多種作用的結構基礎。
EGCG有高於VITC、 E的強烈抗氧化、清除自由基的作用，主要通過以下四個機制
因EGCG具有"CATECHOL"結構，從而是很強的金屬離子合劑，能結合併降低在Fenton 和Haber weiss反應中產生反應氧自由基所必須的游離鐵和鐵離子；
EGCG是超氧陰離子自由基和羥自由基很強的捕獲劑這兩種自由基引起DNA和其它細胞內 分子的損傷及脂質過氧化反應；
反應氧化自由基能操作DNA，改變基因表達，在腫瘤發生中起重要作用。黃烷醇類能與 過氧自由基發生反應，從而終止脂質過氧化鏈反應；
增強穀胱甘肽過氧化物酶、過氧化氫酶、酯還原酶、穀胱甘肽-S-轉移酶的活性。
EGCG能誘導腫瘤細胞凋亡。謝冰芬等用流式細胞術發現EGCG可使鼻咽癌CNE2細胞停滯 於Gl期，並誘導其凋亡。另有學者發現EGCG誘導人肺癌細胞PC-9停滯於G2-M期，誘導molt4B 人淋巴細胞性白血病細胞的凋亡。EGCG中的咖啡因對不同的腫瘤細胞凋亡有雙向性的作用。 EGCG也能誘導細胞凋亡。
腫瘤的形成是多因素、多階段、多基因突變的過程。已知有許多化學致癌物及物理因素 能誘發和促進腫瘤的形成。人們發現EGCG對多種腫瘤形成的各個階段都有預防和抑制作用。在大量動物模型中，EGCG不僅可抑制各種致癌物的致癌的發生率，還可降低已形成腫瘤的大 小、數目及其侵襲和轉移。
另外，EGCG還有阻止亞硝基化反應、抗突變、放射防護、抑菌、提高免疫力、抗老化、 降壓、降脂、抗菌素血栓和體外殺精等作用。劉示潮等證實經營提取物對DNA拓樸異構酶II、 DNA引物酶、多聚酶a複合體有抑制作用，與其抗腫瘤作用有密切關係。
三、 EGCG防癌作用的分子機制
EGCG防癌作用目前的研究進展有增強抗氧化酶(穀胱肽過氧化物酶、過氧化氫酶和醌 還原酶)和II相酶(如光胱甘肽-S-轉移酶)的活性；抑制放射線或TPA誘導的上皮鳥氨酸脫羧
酶(ODC)和環氧化酶；抑制蛋白激酶C和細胞增殖；抗炎活性和加強細胞間和縫隙連接等；抑
制上皮生長因子(EGF)與其受體的相互作用，抑制腫瘤細胞的核苷轉運，阻斷外源性核苷對於 代謝藥的抵消作用，增強阿糖胞苷、氨甲喋呤對腫瘤細胞的殺傷作用，另外，最近還有報導 EGCG還能強烈抑制端粒酶的活性，引起腫瘤細胞端粒的縮短、染色體的改變和對與細胞壽命 相關的B半乳糖苷酶表達的抑制。
四、 EGCG抑制——氧化氮合成酶(N0S)的誘導
亞硝酸鹽能引起亞硝基化，是醃製食品中的致癌物。哺乳動物也能產生內源性的亞硝酸 鹽。N0在體內由L—精氨酸在NAPDH和氧原子參與下經N0S催化合成。分子克隆及序列分析 示N0S至少存在3種異構體I和III異構體由Ca2+鈣調素激活，產生生理條件下的低水平 的N0。它有廣泛的生物學效應。II異構體即IN0S(誘導性N0合成酶)， 一旦產生就能長期激 活，持續產生高濃度的NO。後者在體外使脫氧核苷酸和鹼基發生脫氧基，在體內是致突變的。 胞內高濃度的NO導致基因毒性的機制是N0與氧原子反應形成N02，再聚合為N204，並在 水中自發歧化為硝酸鹽與亞硝酸鹽。硝酸鹽在體內也能還原為亞硝酸鹽。亞硝酸鹽與食物中 胺基酸或醯胺反應生成致癌物N亞硝酸鹽複合物，直接對DNA鹼基亞硝基化而脫氨基、DNA 鏈的斷裂和過氧化亞硝酸鹽和/或羥自由基的形成而氧化DNA。
EGCG是目前第一個同時抑制INOS基因的表達和酶活性的複合物。EGCG以濃度依賴關係 特異地抑制INOSmRNA的表達。EGCG對激活NFkB的信號傳導通路的主要作用機制為
抑制LPS等與其受體的相互作用(sealingeffeet);
清除ROLs;
抑制蛋白激酶。而且，EGCG還可阻斷信號誘導lkB的磷酸化；阻斷N亞硝酸鹽複合物、 過氧化亞硝酸或羥自由基的形成。另外，N0D的結構在氨基端相似於細胞色素P450氧化酶， 在羧基端相似於細胞色素P450的各功能，所以它能抑制NOS的酶活性。
五、 EGCG的封閉作用EGCG抑制腫瘤的促進劑TPA激活PKC是通過以下三方面抑制TPA與受體的作用；EGCG 與磷脂雙分子層相互作用；EGCG阻礙一三磷酸腺苷和TPA結合到PKC的能力。
綠茶提取物、EGCG抑制腫瘤促進劑TELEOCIDIN對PKC的激活。EGCG抑制依賴雌激素的 乳腺癌MCF-7細胞中雌激素與其受體的作用。KOMORI等把綠茶提取物、EGCG阻止腫瘤促進劑、 激素、生長因子與受體的相互作用，稱為Sealingeffect。
六、 EGCG藥理作用和藥用價值
興奮作用EGCG興奮提神作用是人們所熟知的，主要是咖啡鹼具有興奮中樞神經系統的 功效。因此喝茶可以幫助人們消除疲勞，振奮精神，增進思維，提高工作效率。
利尿作用EGCG中的咖啡鹼和茶鹼都具有利尿作用。利用紅茶糖水的利尿解毒作用治療 黃膽性肝炎就是一例。
強心解痙作用由於EGCG中的咖啡鹼具有強心解痙、鬆弛平滑的功效，因此在解除支氣 管痙攣、促進血液循環，治療心肌梗塞中可作為一種良好的輔助藥物。
增強毛細血管的作用茶多酚中的EGCG，具有增強微血管壁韌性的作用。在有些國家， 己作為臨床治療藥物使用。 '
活血化瘀抑制動脈硬化這主要是茶多酚中的EGCG.和維生素C具有這種功效，因此，EGCG 防治動脈硬化的效果更好。
抗菌、抑菌作用試驗表明，EGCG的水提取液對於傷寒、痢疾、副痢疾、金黃色葡萄球 菌、傷寒沙門氏桿菌、霍亂桿菌和腸膜狀明串球菌等均有抑制作用。
抗輻射作用EGCG中具有防輻射的有效成份主要是脂多糖、維生素C和某些胺基酸，因 此EGCG的水提取物片劑(速溶茶片)可以說是一種防輻射的良好複方。
抑制癌細胞的作用IO類黃酮物質有不同程度的體外抗癌作用，藥效作用較強的有三種 牡荊鹼、桑色素和D-兒茶素。EGCG的藥理作用很值得進一步深入研究。
七、 EGCG對腫瘤啟動劑誘導的和細胞轉化的抑制
近來，人們發現絲/蘇氨酸家族的絲原激活蛋白激酶(MAPKs)是蛋白激酶級聯反應的中間 體，是細胞內重要的激酶系統。MAPK包括胞外信號調節蛋白激酶(ERKs)和C一JunN —未端激 酶。ERKs主要由生長因子激活，部分也被細胞應激信號和激活。部分也被細胞應激信號激活。 JNKs即應激激活蛋白激酶(SAPK)。正常情況下，核內無F0S，僅有少量JUN。 FOS和JUN均屬 即早基因。在GFs(生長因子)刺激後15分鐘即呈現F0SmRNA增高。30分鐘達到高峰，迅速合 成F0S。 JUN是由331個胺基酸組成，可由PKC催化其SER63、 SER73磷酸化而激活。活化的 JUN和新生成的FOS聚合為雜二聚體(即AP-1--。 FOS和JUN均含有"LZ"(亮氨酸拉鏈)保守 序列，可結合於TRE，促進許多基因的轉錄。EGCG或茶黃素對ERKL或ERK2無抑制作用，而是在SER73位點抑制C-JUN蛋白的磷酸化。 EGCG還抑制JNK的活性。因此，EGCG抑制了腫瘤促進劑誘導的AP-1活性的升髙。有學者用 兒茶素3種同系物對TPA誘導鼠成纖維細胞的轉化的抑制很弱。因此，EGCG、茶黃素，而不 是咖啡因，抑制了TPA-或EGF-誘導的細胞轉化。
八、 EGCG的藥代動力學
1997年，CHENL.S.等首次報導了 EGCG、 EGC和EC在齧齒動物中的吸收、分布、代謝、 排洩過程。儘管EGCG、 EGC、 EC化學結構相似，但藥代動力學卻不盡相同。它們在血漿、組 織中的水平採用HPLC測定。靜脈注射DGT(去咖啡因的綠茶)25MG/KG後，EGCG、 EGC和EC的 血漿濃度符合二室模型。它們的B相半衰(T1/2B)分別是212、 45和41MIN，清除率(CL)分別 是2. 0、 7. 0和13. 9ML細/KG，表現分布容積(VD)分別為1. 5、 2. 1和3. 6DL/KG。 EGC和EC 和K12和K21(中央室與周圍室間的分布速率常數)相似，但EGCG的K12比K21高3倍，提示 EGCG更易分布於周圍室。EGCG的T1/2B較長，CL較小，提示EGCG比EGC和EC在體內能停 留在更長時間。當用EGCG靜注時，T1/2B為135MIN,清除率為72 5ML/MIN/KG， VD為 22. 5DL/KG，提示在DGT中有其他物質影響EGCG的濃度和排洩。DGT灌胃給藥(200ML/KG)時， EGCG、 EGC和EC的生物利用度分別為13.7%、 31.2%、 0.1%。靜脈注射DGT(25MG/KG)後，EGCG 在小腸組織中濃度最高，其半衰期(Tl/2)為175MIN。 EGC和EC在腎中濃度最高，T1/2分別 為29MIN和28MIN。 EGCG經加入飲水中給藥比灌胃給藥吸收更好。去咖啡因的綠茶提取物中 的EGCG的吸收速率常數(KD)比純EGCG高3. 6倍。基於每單位EGCG產生的AUC和CMAX， DGT 似乎比純EGCG更有效。值得一提的是YANG發現把1. 5G、 3. 0G、 4. 5G去咖啡因的綠茶溶於 500ML水後給人飲用，隨劑量由1. 5G升到3. 0G時，EGCG的血漿C區X也增加2. 7 — 3. 4倍， 但當劑量增至4. 5G時CMAX卻不能明顯增加。這被稱為飽和現象。
九、 EGCG的八大功能
(1) 耙向攻擊作用綠金子中的EGCG、黃酮等抗癌成分，能自動識別、黏附、包裹癌 細胞，直接進入其心臟，殺傷癌細胞。
(2) 攔截轉移作用綠金子中的有效組分黃酮，可消除細胞對血管內壁的黏附作用， 攔截癌細胞擴散。
(3) 阻斷分裂作用癌細胞通過不斷的有絲分裂得以迅速增殖。綠金子中黃酮化合物 能誘導癌細胞拓樸異構酶n依賴型DNA斷裂，直接阻斷有絲分裂，有效阻止癌細胞增殖。
(4) 抑制合成作用EGCG通過阻斷癌細胞有絲分裂，影響癌細胞DNA、 RNA及蛋白質的 合成，使癌細胞無法繁殖，失去活性，從而抑制腫瘤生長。
(5) 誘導凋亡作用綠金子內含的TP-EGCG(誘導癌細胞凋亡反應因子)，能攻擊癌細胞的細胞核(心臟)，誘導癌細胞凋亡反應。
(6) 清除毒質作用EGCG能顯著激活吞噬細胞，將壞死癌細胞及致癌物質吞噬清除， 排出體外。
(7) 防止感染作用EGCG能夠促進白細胞增生，防止病菌感染，強化放、化療作用， 減輕放、化療的毒副反應，降低腫瘤病人的感染率。
(8) 增強免疫作用EGCG能夠顯著激活具有抗癌作用的特異性T細胞，促使T細胞浸 潤腫瘤塊；誘導免疫細胞產生數十種調節腫瘤免疫的細胞因子(如白細胞介素、腫瘤壞死因子、 幹擾素等)，充分調動人體自身免疫功能，殺傷並清除癌細胞。
微乳液首先由schulman等發現並命名。微乳是由水、油、表面活性劑和助表面活性劑按 適當比例混和，自發形成的各向同性、透明、熱力學穩定的分散體系。微乳由於除了具有乳 劑的一般特性之外，還具有粒徑小、透明、穩定等特殊優點，在藥物製劑及臨床方面的應用 也日益廣泛。
微乳是由水相，油相，表面活性劑與助表面活性劑在適當比例自發形成的一種透明或半 透明的，低粘度的，各向同性且熱力學穩定的油水混合系統。由表面活性劑與助表面活性劑 共同起穩定作用。助表面活性劑通常為短鏈醇、氛或其他較弱的兩性化合物。微乳液液滴可 以是分散在水中的油溶脹粒子(0 / W微乳液)也可以是分散在油中的水溶脹粒子(W/0)微乳液) 或是一種無序的隨機結構。
微乳作為藥物載體具有極大的應用潛力。主要具有以下幾個優點(l)呈具各向同性的透 明液體、熱力學穩定，且可以過濾，易於製備和保存；(2)可同時增溶不同脂溶性的藥物；(3) 粘度低，注射時不會引起疼痛；(4)藥物分散性好，利於吸收、可提高藥物的生物利用度；(5) 對易於水解的藥物製成油包水型微乳可起到保護作用；(6)可延長水溶性藥物的釋藥時間。 微乳注射劑除具有一般注射劑的特點外，還有一定的緩釋作用。水溶性藥物製成w/0型微乳 注射液，油溶性藥物可製成0/w型微乳注射劑。注射後，藥物需經過微乳內部向介質再分配 的過程，延長藥物的釋放，提高了藥物生物利用度。微乳注射液的刺激性小，可減輕注射時 的疼痛。微乳是一種很理想的藥物釋放體系。它具有吸收迅速、完全，能增強療效，減少毒 副作用等優點。
發明內容
本發明目的在於提供一種穩定性好、質量高、療效顯著、不良反應小的含有EGCG的微 乳注射劑及其製備方法，應用該方法製得的一種含有EGCG的微乳注射劑同時具有靶向性。 本發明的一種含有EGCG的微乳注射劑由下述組分組成EGCG 0.1% 大豆油 5%
助乳化劑 0.2%
維生素E 0.8%
卵磷脂 1.2%
甘油 2.5%
注射用水加至 100ml
本發明的一種含有EGCG的微乳注射劑是通過以下技術方案實現的
(1) 將卵磷脂、甘油分散於100ml水中成水相；
(2) EGCG、大豆油、助乳化劑及維生素E組成油相B;
(3) 兩相分別預熱至7(TC;
(4) 將油相緩慢加入水相，高速攪拌後製得初乳；
(5) 將初乳過高壓乳勻機，先調解二步閥150 180kg/cm 過3 — 5次，再調節一級閥至 總壓力為520 600 kg/cm2,過10 — 15次，至粒經符合要求；
(6) 將勻化後的乳劑過G4垂熔漏鬥，灌裝、衝氮、熔封，滅菌。
本發明得到的一種含有EGCG的微乳注射劑具有方法簡單、穩定性好、質量高、具有緩 控釋特點。
實施例l:規格100瓶
(1) 將卵磷脂、甘油分散於100ml水中成水相；
(2) EGCG、大豆油、助乳化劑及維生素E組成油相B;
(3) 兩相分別預熱至7(TC;
(4) 將油相緩慢加入水相，高速攪拌後製得初乳；
(5) 將初乳過高壓乳勻機，先調解二步閥150 180kg/cm 過3 — 5次，再調節一級閥至 總壓力為520 600 kg/cm2,過10—15次，至粒經符合要求；
(6) 將勻化後的乳劑過G4垂熔漏鬥，灌裝、衝氮、熔封，滅菌。 實施例2:規格1000瓶
(1) 將卵磷脂、甘油分散於1000ml水中成水相；
(2) EGCG、大豆油、助乳化劑及維生素E組成油相B;(3) 兩相分別預熱至70'C;
(4) 將油相緩慢加入水相，高速攪拌後製得初乳；
(5) 將初乳過高壓乳勻機，先調解二步閥150 180kg/ci^,過3 — 5次，再調節一級閥至 總壓力為520 600 kg/cm夂過10—15次，至粒經符合要求；
(6) 將勻化後的乳劑過G4垂熔漏鬥，灌裝、衝氮、熔封，滅菌。
權利要求
1. 一種含有EGCG的微乳注射劑；EGCG為其特徵在於由EGCG(0.001～10％)和其它賦形劑組成的注射劑。
2. 根據權利要求l，EGCG大豆油助乳化劑維生素E卵磷脂甘油注射用水加至
3. 根據權利要求l，EGCG大豆油助乳化劑維生素E卵磷脂甘油注射用水加至
4. 根據權利要求l，EGCG大豆油 助乳化劑 維生素E 卵磷脂H EGCG (0.001-10%)和其它賦形劑組成的注射劑。 一種含有EGCG的微乳注射劑由下述組分組成: 0.001~腦 0.1~10% 0.01~5% 0.01~5% 0.01~10% 0.1 20% 100ml一種含有EGCG的微乳注射劑由下述組分組成: 0.01% 5% 0.2% 0.8% 1.2% 2.5% 100ml一種含有EGCG的微乳注射劑由下述組分組成: 0.1% 5% 0.2% 0.8% 1.2%甘油 2.5%注射用水加至 100ml
5.根據權利要求l， 一種含有EGCG的微乳注射劑由下述組分組成:EGCG 1%大豆油 8%助乳化劑 0.5%維生素E 0.8%卵磷脂 1.5%甘油 5%注射用水加至 100ml
6.根據權利要求l， 一種含有EGCG的微乳注射劑的製備方法，其特徵在於包括以下步驟(1) 將卵磷脂、甘油分散於100ml水中成水相；(2) EGCG、大豆油、助乳化劑及維生素E組成油相B;(3) 兩相分別預熱至7(TC;(4) 將油相緩慢加入水相，高速攪拌後製得初乳；(5) 將初乳過高壓乳勻機，先調解二步閥150 180kg/cn^,過3 — 5次，再調節一級閥至 總壓力為520 600 kg/cm2,過10—15次，至粒經符合要求；(6) 將勻化後的乳劑過G4垂熔漏鬥，灌裝、衝氮、熔封，滅菌。
全文摘要
本發明公開了一種含有EGCG的微乳注射劑；EGCG見右結構式，其特徵在於EGCG是由綠茶提取的有效成分製成，同時公開了該製劑的製備方法。應用該方法製得的一種含有EGCG的微乳注射劑製備方法簡單、穩定性好、靶向性、質量高、具有緩控釋特點。
文檔編號A61K9/107GK101422455SQ20071017915
公開日2009年5月6日 申請日期2007年12月11日 優先權日2007年12月11日
發明者王翰斌 申請人:北京琥珀光華醫藥科技開發有限公司