保護與修複線粒體及促進幹細胞增生的方法與流程

2023-08-12 11:10:41 2

本發明涉及一種保護與修複線粒體(粒線體)及促進幹細胞增生的方法，特別是一種利用餘甘子(Emblica Officinalis)萃取物保護與修複線粒體及促進幹細胞增生的方法。

背景技術：

線粒體(Mitochondria)是細胞內進行氧化磷酸化和合成三磷酸腺苷(ATP)的主要場所。由於三磷酸腺苷為細胞活動的能量來源，所以線粒體又有「細胞能量工廠」之稱。除了為細胞提供能量外，線粒體還參與細胞分化、細胞信息傳遞和細胞凋亡等過程，並擁有調控細胞生長周期的能力。

然而，線粒體在進行氧化磷酸化反應時產生的部份副產物對於線粒體的內膜是有害的。長期累積下來，嚴重受損的線粒體內膜將觸發線粒體崩解，進而觸發細胞凋亡。因此，如何修補與保護線粒體以減緩線粒體崩解所觸發的細胞凋亡的速度已成為一個重要的課題。

技術實現要素：

本發明的目的在於提供一種保護與修複線粒體及促進幹細胞增生的方法，使其可以利用餘甘子(Emblica Officinalis)萃取物保護與修複線粒體及促進幹細胞增生，藉此延緩線粒體崩解所觸發細胞凋亡的速度。

為實現上述目的，本發明提供一種保護與修複線粒體的方法，包含提供一餘甘子(Emblica Officinalis)萃取物予一細胞的步驟，用以提高該細胞內的多個線粒體進行氧化磷酸化反應與三磷酸線苷(ATP)合成的能力。

其中，該餘甘子萃取物的濃度為每毫升20至50微克(μg/ml)。

其中，提供該餘甘子萃取物予該細胞的步驟包含食用該餘甘子萃取物。

其中，食用的該餘甘子萃取物的有效劑量為216毫克(mg)至540毫克。

其中，該餘甘子萃取物提高該線粒體的預存耗氧能力(Spare Respiratory Capacity)。

其中，該餘甘子萃取物提高該線粒體進行該氧化磷酸化反應的基礎耗氧量。

其中，該餘甘子萃取物提高該線粒體進行該氧化磷酸化反應的基礎耗氧量中使用於合成三磷酸線苷的媒合效率(Coupling Efficiency)。

其中，該餘甘子萃取物降低該線粒體的氫離子洩漏(Proton Leakage)。

其中，該餘甘子萃取物提高該線粒體的三磷酸腺苷產量。

本發明還提供一種促進幹細胞增生的方法，包含提供一餘甘子萃取物予一幹細胞的步驟，用以增加該幹細胞進行細胞分裂的次數。

其中，該餘甘子萃取物的濃度為每毫升50至1200微克(μg/ml)。

其中，提供該餘甘子萃取物予該幹細胞的步驟包含食用該餘甘子萃取物。

其中，食用的該餘甘子萃取物的有效劑量為540毫克(mg)至12960毫克。

根據上述本發明所公開的保護與修複線粒體及促進幹細胞增生的方法，提供餘甘子萃取物予細胞可保護與修複線粒體的內膜以延緩線粒體發生崩解的時間，提供餘甘子萃取物予幹細胞可增加幹細胞進行細胞分裂次數。如此一來，可減緩線粒體崩解觸發細胞凋亡的速度以及提供更多的具有高分化潛能的幹細胞，以便進行細胞分化後取代受損或死去的細胞。

以下結合附圖和具體實施例對本發明進行詳細描述，但不作為對本發明的限定。

附圖說明

圖1為實施例一至實施例二、比較例一至比較例五與控制組的合成三磷酸線苷的耗氧量示意圖。

圖2為實施例一至實施例二、比較例一至比較例五與控制組的線粒體的基礎耗氧量示意圖。

圖3為實施例一至實施例二、比較例一至比較例五與控制組的克服自由基洩漏的耗氧量示意圖。

圖4為實施例一至實施例二、比較例一至比較例五與控制組的線粒體的最大耗氧能力示意圖。

圖5為實施例一至實施例二、比較例一至比較例五與控制組的線粒體的預 存耗氧能力示意圖。

圖6為實施例一至實施例二、比較例一至比較例五與控制組的線粒體的三磷酸線苷媒合效率示意圖。

圖7為實施例一至實施例二、比較例一至比較例五與控制組的非線粒體耗氧量示意圖。

圖8為實施例三至實施例十與比較例六至比較例七的幹細胞發出的螢光強度比示意圖。

具體實施方式

以下在實施方式中詳細敘述本發明的詳細特徵以及優點，其內容足以使本領域技術人員了解本發明的技術內容並據以實施，且根據本說明書所公開的內容、權利要求及圖式，本領域技術人員可輕易地理解本發明相關的目的及優點。以下的實施例進一步詳細說明本發明的觀點，但非以任何觀點限制本發明的範疇。

餘甘子(Phyllanthus Emblica或Emblica Officinale)，又稱餘柚子、油柑、庵摩勒(Amalaka)、馬六甲樹(Pokok Melaka)、印度醋慄(Indian Gooseberry)，屬於大戟科餘甘子屬(Emblica)的落葉亞喬木，分布於自印度至馬來西亞地區及中國南部，一般認為印度為原產地。

本發明使用的餘甘子萃取物的取得方式例如以二氧化碳作為超臨界流體萃取餘甘子果實，或者是以甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、重量百分濃度0.1至5％的氯化鈉水溶液、氯化鉀水溶液、氯化鈣水溶液、氯化鎂水溶液或重量百分濃度0.1至5％的氯化鈉乙醇溶液、氯化鉀乙醇溶液、氯化鈣乙醇溶液、氯化鎂乙醇溶液作為溶劑萃取餘甘子果實而得到一初萃液。接著，將初萃液過濾純化後得到本發明所使用的餘甘子萃取物。

當提供濃度為每毫升20至50微克(μg/ml)的餘甘子萃取物予細胞，進入細胞內的餘甘子萃取物可保護與修複線粒體的內膜。如此一來，於線粒體內膜進行的氧化磷酸化反應以合成三磷酸線苷的效率得到提升。詳細來說，經餘甘子萃取物修復的線粒體進行氧化磷酸化反應合成的三磷酸線苷數量提高，線粒體的基礎耗氧量提高，線粒體內膜的氫離子洩漏量下降，粒線體的最大耗氧能力提高，線粒體的預存耗氧能力提高，線粒體的三磷酸線苷媒合效率提高。

提供餘甘子萃取物予細胞的方法例如為以食用的方式由口攝取餘甘子萃取物。以食用的方式提供餘甘子萃取物予細胞時，餘甘子萃取物的有效劑量為216毫克(mg)至540毫克。此處的有效劑量根據細胞實驗的有效劑量與人體公斤數的換算公式進行換算得到。換算公式如下：人體有效劑量＝細胞實驗的有效劑量×小鼠體重×折算係數×人體公斤數。折算係數由動物與人體的每公斤體重劑量折算係數表查表得到。當小鼠體重為20克以及人體公斤數為60公斤時，折算係數為9.01。

再者，隨著線粒體的氧化磷酸化反應合成三磷酸線苷數量提升，可供細胞生長與分裂使用的能量也跟著提升，有利於細胞進行增生。因此，提供濃度為每毫升50至1200微克(μg/ml)的餘甘子萃取物予幹細胞後，幹細胞的增生速度得到提升。其中，當提供濃度為每毫升50至800微克(μg/ml)的餘甘子萃取物予幹細胞後，幹細胞的增生速度提升效果更為顯著。

提供餘甘子萃取物予幹細胞的方法例如為以食用的方式由口攝取餘甘子萃取物。以食用的方式提供餘甘子萃取物予幹細胞時，餘甘子萃取物的有效劑量為540毫克(mg)至12960毫克。當餘甘子萃取物的有效劑量為540毫克至8640毫克時，幹細胞的增生速度提升效果更為顯著。

為方便以食用的方式由口攝取餘甘子萃取物，餘甘子萃取物可製成例如液體狀、固體狀、顆粒狀、粉體狀、糊狀或凝膠狀的餘甘子萃取物加工品。餘甘子萃取物加工品中可搭配作為添加劑的賦形劑或呈味劑，以提升風味與方便食用。

賦形劑例如為小麥澱粉、米澱粉、玉米澱粉、馬鈴薯澱粉、糊精、環糊精等澱粉類；結晶纖維素類；乳糖、葡萄糖、砂糖、還原麥芽糖、飴糖、果寡糖、乳化寡糖等糖類；山梨糖醇、赤藻糖醇、木糖醇、乳糖醇、甘露醇等糖醇類。

呈味劑例如為龍眼萃取物、荔枝萃取物、柚子萃取物等各種果汁萃取物；蘋果汁、橘子汁、檸檬汁等各種果汁；桃子香料、梅子香料、酸奶酪香料等各種香料；乙醯磺胺酸鉀、蔗糖素、赤藻糖醇、寡糖類、甘露糖、木糖醇、異構化糖類等各種甜味劑；檸檬酸、蘋果酸、酒石酸、葡萄糖酸等各種酸味劑；綠茶、烏龍茶、巴拿巴茶(Banaba tea)、杜仲茶、鐵觀音茶、薏苡茶、七葉膽茶、茭白茶、昆布茶等各種茶成分等。

此外，著色劑、防腐劑、增黏劑、結合劑、崩解劑、分散劑、穩定劑、膠 化劑、抗氧化劑、界面活性劑、防腐劑、pH值調整劑等符合政府單位規定的添加物亦可依照政府單位規定的劑量標準與加工生產的需求添加於餘甘子萃取物加工品中。

以下藉由本發明實施例一至二與比較例一至五說明本發明所公開的保護與修複線粒體的方法，並且進行實驗測試以說明本發明所公開的保護與修複線粒體的方法的功效。

實驗使用的細胞為第六代(P6)的脂肪間葉幹細胞(ADSC)。實驗樣品準備方式為於孔盤的每一個孔中植入8000個脂肪間葉幹細胞後培養24個小時。實驗中，模擬線粒體受損狀況的方式為將細胞暴露於濃度200mM的H2O2中30分鐘，接著再以磷酸緩衝生理食鹽水(Phosphate buffered saline，PBS)清洗細胞。

於實驗過程中，首先將預定濃度的餘甘子萃取物加入孔中並浸泡24小時。接著，將濃度為200mM的H2O2加入孔中，使細胞浸泡於濃度為200mM的H2O2中30分鐘。接著，以磷酸緩衝生理食鹽水(Phosphate buffered saline，PBS)清洗細胞。最後，以海馬生物能量測定儀量測孔中細胞的氧氣消耗量。

海馬生物能量測定儀的測量原理與流程如下。首先，檢測孔中細胞的基礎耗氧量。接著，加入三磷酸線苷合成酶抑制劑以抑制粒線體產生三磷酸線苷，此時減少的耗氧量即為合成三磷酸線苷的耗氧量。接著，加入適當濃度的抗耦合劑，在不破壞線粒體內膜的電子傳遞鏈的情況下，讓粒線體以極限狀況空轉以評估粒線體的最大耗氧能力。最後，加入電子傳遞鏈抑制劑已完全關閉粒線體的耗氧，藉此確認量測的背景值，亦即是非線粒體耗氧量。線粒體的基礎耗氧量等於細胞的基礎耗氧量減去非線粒體耗氧量。線粒體的基礎耗氧量減去合成三磷酸線苷消耗的氧氣量等於克服自由基洩漏的耗氧量。線粒體的最大耗氧能力減去線粒體的基礎耗氧量等於線粒體的預存耗氧能力。線粒體的三磷酸線苷媒合效率等於合成三磷酸線苷耗氧量除以線粒體的基礎耗氧量。

實施例一至實施例二與比較例一至比較例五的餘甘子萃取物濃度與實驗量測結果如表一所示。表一中呈現的實驗量測結果為已對細胞量進行標準化後的實驗量測結果。

表一

請參照圖1至圖8與表一。圖1為實施例一至實施例二、比較例一至比較例五的合成三磷酸線苷的耗氧量示意圖。圖2為實施例一至實施例二、比較例一至比較例五的線粒體的基礎耗氧量示意圖。圖3為實施例一至實施例二、比較例一至比較例五的克服自由基洩漏的耗氧量示意圖。圖4為實施例一至實施例二、比較例一至比較例五的線粒體的最大耗氧能力示意圖。圖5為實施例一至實施例二、比較例一至比較例五的線粒體的預存耗氧能力示意圖。圖6為實施例一至實施例二、比較例一至比較例五的線粒體的三磷酸線苷媒合效率示意圖。圖7為實施例一至實施例二、比較例一至比較例五的非線粒體耗氧量示意圖。

如圖1所示，實施例一與實施例二的合成三磷酸線苷的耗氧量高於比較例一至比較例五。如圖2所示，實施例一與實施例二的線粒體的基礎耗氧量高於比較例一至比較例五。如圖3所示，實施例一與實施例二的克服氫離子洩漏的耗氧量低於比較例一至比較例五。如圖4所示，實施例一與實施例二的線粒體的最大耗氧能力高於比較例一至比較例五。如圖5所示，實施例一與實施例二的線粒體的預存耗氧能力高於比較例一至比較例五。如圖6所示，實施例一與實施例二的線粒體的三磷酸線苷媒合效率高於比較例一至比較例五。如圖7所示，實施例一、實施例二與比較例一至比較例五的非線粒體耗氧量無明顯變化，餘甘子萃取物主要對線粒體的耗氧量產生影響，對細胞中其它胞器的耗氧量無明顯影響。因此，由圖1至圖7可知實施例一與實施例二的線粒體增加的基礎耗氧量主要用作合成三磷酸線苷，使得三磷酸線苷的合成量增加，亦即是線粒體的三磷酸線苷媒合效率提高。同時，實施例一與實施例二的線粒體內膜的氫離子洩漏量下降，使得線粒體重新將氫離子輸送至膜間隙的所消耗氧氣量減少，代表的是線粒體內膜破損的情況受到餘甘子萃取物的修復而改善。

根據上述實驗測試結果，以濃度為20μg/ml至50μg/ml的餘甘子萃取物處理後的線粒體受到餘甘子萃取物的保護而降低線粒體內膜受到氧化劑的破壞。同時，線粒體內膜也受到餘甘子萃取物的修復，使得自膜間隙穿過破損的內膜洩漏至基質中的氫離子量下降，進而使得線粒體重新將氫離子輸送至膜間隙所消耗氧氣量減少。

以下藉由本發明實施例三至實施例十與比較例六至比較例七說明本發明所公開的促進幹細胞增生的方法，並且進行實驗測試以說明本發明所公開的促進 幹細胞增生的方法的功效。

實驗使用的細胞為脂肪間葉幹細胞。實驗樣品準備方式為於孔盤的每一個孔中植入2000個脂肪間葉幹細胞後培養24個小時。

於實驗過程中，首先將預定濃度的餘甘子萃取物加入孔中並浸泡24小時。接著，孔中的培養基更換為含有10％Alamar Blue試劑的培養基並培養4小時。幹細胞中線粒體內的酵素(NADH)將原本深藍色無熒旋光性的Alamar Blue還原成粉紅色高熒旋光性的產物。最後，判讀孔中的螢光強度。

實施例三至實施例十與比較例六至比較例七的餘甘子萃取物濃度如表二所示。

表二

請參照圖8與表二。圖8為實施例三至實施例十與比較例六至比較例七的幹細胞發出的螢光強度比示意圖。如圖8所示，以比較例六的未給予餘甘子萃取物的幹細胞發出的螢光強度作為基準，實施例三浸泡濃度為50μg/ml的餘甘子萃取物的幹細胞發出的螢光強度為比較例六的1.20倍。實施例四浸泡濃度為100μg/ml的餘甘子萃取物的幹細胞發出的螢光強度為比較例六的1.22倍。實施例五浸泡濃度為200μg/ml的餘甘子萃取物的幹細胞發出的螢光強度為比較例六的1.27倍。實施例六浸泡濃度為400μg/ml的餘甘子萃取物的幹細胞發出的螢光強度為比較例六的1.28倍。實施例七浸泡濃度為600μg/ml的餘甘子萃取物的幹細胞發出的螢光強度為比較例六的1.28倍。實施例八浸泡濃 度為800μg/ml的餘甘子萃取物的幹細胞發出的螢光強度為比較例六的1.23倍。實施例九浸泡濃度為1000μg/ml的餘甘子萃取物的幹細胞發出的螢光強度為比較例六的1.12倍。實施例十浸泡濃度為1200μg/ml的餘甘子萃取物的幹細胞發出的螢光強度為比較例六的1.10倍。螢光強度越強代表被幹細胞線粒體內的酵素還原成粉紅色高熒旋光性產物的Alamar Blue的數量越多，代表線粒體的數量越多進而可推得幹細胞的數量越多。因此，由圖8的螢光強度比可知提供濃度50μg/ml至1200μg/ml的餘甘子萃取物予幹細胞可增加幹細胞進行細胞分裂的次數以得到更多的幹細胞，且當餘甘子萃取物濃度為50μg/ml至800μg/ml時，可達到更佳的細胞增生效果。

根據上述本發明所公開的保護與修複線粒體的方法，提供餘甘子萃取物予細胞以保護與修複線粒體的內膜以延緩線粒體發生崩解的時間。如此一來，可減緩線粒體崩解觸發細胞凋亡的速度。

再者，根據上述本發明所公開的促進幹細胞增生的方法，提供餘甘子萃取物予幹細胞以增加幹細胞進行細胞分裂次數。如此一來，可提供更多的具有高分化潛能的幹細胞，以便進行細胞分化後取代受損或死去的細胞。

當然，本發明還可有其它多種實施例，在不背離本發明精神及其實質的情況下，熟悉本領域的技術人員可根據本發明作出各種相應的改變和變形，但這些相應的改變和變形都應屬於本發明權利要求的保護範圍。