從剛果錐蟲獲得的轉唾液酸酶的製作方法

2023-09-16 12:16:50 4

專利名稱：：從剛果錐蟲獲得的轉唾液酸酶的製作方法發明主題本發明涉及將唾液酸從供體分子(如寡糖、聚唾液酸、糖基化蛋白、糖基化肽、糖基化脂(如神經節苷脂)和其他糖基化的低或高分子量分子)轉移到受體分子(如寡糖和多糖、糖基化蛋白、糖基化肽、糖基化脂和其他糖基化的低或高分子量分子)的新酶(轉唾液酸酶)。所述酶分離自原生動物剛果錐蟲(Trypanosomacongolense)。本發明還涉及所述酶的功能等同物；編碼這些酶及其功能性等同物的核酸序列；含有所述序列的表達構建體和載體；攜帶本發明的編碼核酸序列的重組微生物；重組生產本發明的酶的方法；從剛果錐蟲分離本發明所述酶的方法；使用本發明的酶對受體分子進行酶促唾液酸化的方法；本發明的轉唾液酸酶的效應子；所述核酸序列、酶、效應子或唾液酸化產物在製備疫苗，藥物、食品或食品添加劑中的應用；及根據本發明的方法產生的製劑。
背景技術：
：轉唾液酸酶能將唾液酸優選為α-2，3-結合的唾液酸，從供體分子轉移到受體分子，由此再次形成α-2，3-糖苷鍵，優選形成於半乳糖殘基的β-端。術語唾液酸包括神經氨酸的所有N和O衍生物(Blix等，1957)。神經氨酸(5-氨基-3，5-二脫氧-D-甘油基-D-半乳糖基-nonulo-pyranosonic酸)是帶有9個碳原子組成骨架的氨基糖，由於2號C原子上的羧基使其具有pK值2.2的較高酸度值，因此在生理條件下帶負電荷。未取代的形式是非常不穩定的，並且在自然條件下不以游離形式存在(Schauer，1982)。不過，超過40種神經氨酸的衍生物是已知的(Schauer和Kamerling，1997)。自然界出現最頻繁的兩種唾液酸是所有糖苷鍵結合的唾液酸的前體(Schauer，1991)N-乙醯神經氨酸(Neu5Ac)，以及N-乙醇醯神經氨酸(Neu5Gc)，其通過CMP-Neu5Ac的N-乙醯殘基的甲基羥基化而得到(ShawandSchauer，1988)。這兩個神經氨酸的羥基可被乙醯基、乳醯基、甲基、磺酸和磷酸殘基以不同的組合取代，而這將產生唾液酸結構的廣泛的多樣性(Schauer，1991；Schauer和Kamerling，1997)。絕大多數天然存在的唾液酸結合作為寡糖、多糖，尤其是糖綴合物的組成部分(Schauer，1982)。不過，聚唾液酸也已知可從轉基因微生物產生。唾液酸化的糖綴合物主要出現在細胞外膜中，但也是黏膜漿液的重要組分(TravingandSchauer，1998)。唾液酸保護糖蛋白和細胞免受蛋白酶和其他酶的攻擊，從而免於降解(Reuter等，1988)。含有唾液酸的胃腸道黏膜不僅形成對消化酶的有效保護，也保護位於這些黏膜之間的組織不被致病性細菌侵入(Kalm和Schauer，1997)。唾液酸在分子和細胞鑑定方法中起重要的功能。它們隱藏受體並由此防止受體和配體的相互作用(Schauer，1985；KelmandSchauer，1997)。因此唾液酸通過隱藏所存在的半乳糖殘基保護例如血清糖蛋白和紅細胞免受降解和胞吞作用。如果末端的唾液酸被分離，亞末端的半乳糖殘基可通過凝集素結合到肝細胞或巨嗜細胞上，而導致對血清蛋白或紅細胞的胞吞作用。另一個例子是保護免疫系統識別之前的機體自身組織，以及高度唾液酸化的腫瘤(Pilatte等，1993)。如果保護性的唾液酸層缺失，則發生自身免疫反應。唾液酸還用作機體自身細胞和激素的鑑別點，並在細胞間相互作用中起著重要作用(Kelm和Schauer，1997)。在產生炎症時，內皮細胞在其表面表達能識別白細胞上特定唾液酸化結構(如唾液酸LewisX)的凝集素，以使其結合到內皮細胞並透入到組織中((Lasky，1995)。此外，體液免疫防衛的T細胞活化受轉唾液酸酶的影響(Gao等，2001)。唾液酸粘附素(siglecs)如髓磷脂相關的糖蛋白(MAG)也高度特異地結合到唾液酸化的多糖上(Kelm等，1996；Crocker等，1998)。在神經系統中，髓磷脂相關的糖蛋白尤其參與髓鞘形成和軸突生長調控。因此，最近發現轉唾液酸酶通過轉移唾液酸參與神經細胞和神經膠質細胞的分化就沒有什麼可驚訝的了(Chuenkova等，2001)。CD-22是出現在淋巴細胞上並且幫助實現T細胞和B細胞之間的「對話」的另一種唾液酸結合受體。Siglecs家族由大約超過10個的分子生物學特徵性代表分子組成。然而，唾液酸不僅是對機體的自身鑑定過程有用，同時也是某些細菌、病毒和毒素的受體。例如，通過唾液酸破傷風毒素結合到神經突觸的神經節苷脂(Schauer等，1995)。通過微生物的凝集素進行的唾液酸特異性黏附常常是感染性疾病的重要步驟，例如一些大腸桿菌(E.coli)引起的新生兒腦膜炎或通過幽門螺桿菌(helicobacterpylori)產生的胃黏膜感染。尤其是，流感病毒A和B病毒通過唾液酸結合到受感染的細胞上(Schauer，2000)。唾液酸的修飾，尤其是O-乙醯化對於分子和細胞識別的調控非常重要(Schauer，1991)。流感病毒因此特異性結合到支氣管上皮的9-O-乙醯化唾液酸(Herrier等，1985)，而O-乙醯化阻止流感病毒A和B的結合(Higa等，1985)。然而，首先唾液酸的O-乙醯化對不同組織的形態發生和發育是非常重要的(Varki等，1991)隨著神經外胚層腫瘤中含量的增加(Hubi等，2000；Fahr和Schauer，2001)，在結腸癌中其含量下降(Corfield等，1999)。唾液酸是腫瘤生物學行為的關鍵性調節物(Schauer，2000)。圖1顯示本發明的轉唾液酸酶TS1和TS2的部分胺基酸序列的比較。兩個序列中相同的胺基酸表示為黑體，兩個部分序列對應(相同的)程度只為大約50％。圖2顯示唾液酸酶、唾液酸轉移酶和轉唾液酸酶的不同反應。圖3顯示從蘭戈爾氏錐蟲(Trypanosomarangeli(T.r.s))得到的唾液酸酶，從克魯斯氏錐蟲(Trypanosomacruzi(T.cr.TS))得到的轉唾液酸酶和從布魯斯氏錐蟲(TrypanosomabruceibruceiT.b.br.TS)得到的轉唾液酸酶的胺基酸序列與本發明的從剛果錐蟲(TrypanosomacongelenseT.con.TS1和T.con.TS2)得到的轉唾液酸酶的部分序列比較的結果。在全部序列中同一的胺基酸表示為在暗灰背景下的白色。5個序列中至少4個一致的胺基酸表示為暗灰背景下的黑色，而對應於5個序列中至少3個胺基酸表示為淡灰色。發明簡述本發明的目的是提供能影響由唾液酸調控的生物或致病生物過程的新方法。令人驚訝的是，有可能通過提供具有轉唾液酸酶活性的新酶和來自剛果錐蟲的該酶的編碼序列來實現上述目的。本發明的第一個主題領域涉及編碼具有轉唾液酸酶活性並能從剛果錐蟲分離得到的蛋白的多核苷酸，由此這些蛋白優選催化唾液酸從供體向受體分子轉移。優選的多核苷酸包括至少一種SEQIDNO1或3的核酸序列，或者是其包括至少15個連續的核苷酸殘基的片段。本發明的主題還包括與這些序列互補的多核苷酸和片段，以及通過簡併遺傳密碼子從這些多核苷酸衍生的核苷酸序列。本發明的主題還包括與本發明的多核苷酸雜交的寡核苷酸，尤其是在嚴格條件下雜交。本發明的主題還包括與上述定義的寡核苷酸雜交，尤其是在嚴格條件下雜交，以及編碼錐蟲屬微生物的基因產物的多核苷酸。本發明的主題還包括具有下列特徵的多肽及其具有轉唾液酸酶活性的功能等同物含有上述定義的核酸序列的多核苷酸編碼的多肽；或具有含有SEQIDNO2或4的至少10個連續胺基酸的胺基酸序列多肽。本發明的主題尤其包括轉唾液酸酶或其具有轉唾液酸酶活性的功能性等同物，其特徵在於具有下列的部分胺基酸序列的一種TDTVAKYSTDGGRTWKREVIIPNGR(對應於SEQIDNO2的1到25位)FRIPSLVEIDGVLIATFDTRYLRASDSSLI(對應於SEQIDNO4的1到30位)。優選的轉唾液酸酶1(TS1)特徵在於具有至少下列一種特性部分核苷酸序列SEQIDNO1部分胺基酸序列SEQIDNO2最適溫度30-40℃最適pHpH6.5-8.5等電點pH4-5天然分子量400-600kDa還原性SDS-PAGE中的分子量90kDa另一種優選的轉唾液酸酶2(TS2)特徵在於具有至少下列一種特性核苷酸序列SEQIDNO3部分胺基酸序列SEQIDNO4最適溫度30-40℃最適pHpH6.5-8.5等電點pH5-6天然分子量120-180kDa還原性SDS-PAGE中的分子量90kDa上述的本發明的多核苷酸和多肽，尤其是編碼核酸序列和胺基酸序列可從剛果錐蟲中得到。然而，它們也可以通過合成尤其是化學、生化、酶學、基因技術和轉基因方法得到。本發明的主題還包括本發明的轉唾液酸酶的功能性等同物。本發明的主題還包括含有與至少一個調節核酸序列操作性連接的上述定義的核酸序列的表達盒。此外，本發明還包括含有至少一種這些表達盒的重組載體。本發明的主題還包括用至少一種上述定義的載體轉化的原核或真核宿主。此外，本發明涉及上述定義的表達盒、載體或宿主在重組製備具有轉唾液酸酶活性的蛋白中的應用。本發明的主題還包括對受體分子進行酶法唾液酸化的方法，特徵在於將受體分子與含有唾液酸殘基的供體分子在上述定義的轉唾液酸酶存在的條件下溫育，並分離唾液酸化的受體。這類方法的特徵在於至少具有下列之一的特性a)供體選自連接到寡糖、多糖、聚唾液酸、糖蛋白和糖脂，如尤其是乳鐵蛋白、糖基化乳清蛋白和酪蛋白及其片段的唾液酸；b)受體選自含有β-半乳糖的聚合物，諸如β-半乳糖寡糖、乳糖醇、乳糖酸、甲基-β-乳糖苷、乙醯乳糖胺、半乳糖吡喃糖苷、轉-半乳糖寡糖、聚半乳糖和其他末端結合β(1-3)或β(1-4)半乳糖的糖綴合物或半乳糖。本發明的另一方面涉及本發明的轉唾液酸酶、編碼該酶的核酸序列或根據本發明方法製備的唾液酸化產物在製備藥物、食品或食品添加劑中的應用，用於通過唾液酸預防或治療寄生蟲、細菌或病毒感染，用於治療腫瘤疾病，用於治療與組織的發育幹擾相關的疾病，用於治療免疫系統疾病，用於治療自身免疫反應，用於治療細胞通訊障礙的疾病；和/或用於治療炎症。尤其是，本發明的主題包括本發明的上述定義的轉唾液酸酶在開發錐蟲疫苗中的應用或在開發酶抑制劑中的應用，用於治療或預防錐蟲感染。此外，本發明涉及轉唾液酸酶、編碼所述酶的核酸序列或根據本發明製備的唾液酸化產物在製備藥物、食品添加劑或食品以在酶作用之前保護機體的自身細胞或組織或糖蛋白中的應用。本發明的主題還包括轉唾液酸酶、編碼所述酶的核酸序列或根據本發明製備的唾液酸化的產物在製備藥物、食品添加劑或食品以影響機體組織的發育和/或形態發生中的應用。此外，本發明涉及轉唾液酸酶的轉唾液酸酶活性的效應子，選自a)與上述的本發明轉唾液酸酶作用的多肽配體；b)調節上述定義的轉唾液酸酶的生物活性的低分子量效應子；c)上述定義的核酸序列的反義核酸序列。此外，本發明涉及這類效應子在製備藥物、食品添加劑或食品以治療或預防與轉唾液酸酶活性相關的疾病中的應用。本發明的主題還包括分離具有轉唾液酸酶活性的酶的方法，包括a)在培養基中培養剛果錐蟲，以及b)通過鹽梯度利用離子交換層析從培養物上清中分離所需產物，如果必要隨後進行等電聚焦、凝膠過濾、親和層析和/或蛋白沉澱。最後，本發明涉及在藥物或基因治療的合適載體中含有至少一種上述定義的效應子的藥物或基因治療介質。發明詳述i)發明的重要性本發明的重要性在於通過本發明可影響由唾液酸控制的寄生蟲、細菌和病毒的感染機制，影響細胞信息交流和免疫系統，以及對人和動物組織和腫瘤的調控和發育機制的改變。這通過在本文描述的轉唾液酸酶的作用下將唾液酸靶向轉移到生物相關的糖結構(多糖、多糖衍生物和糖綴合物)進行。將唾液酸轉移到選定的載體結構產生，例如改變炎性反應的產物，改變人和動物體細胞相互作用的產物，保護機體的自身組織免受自身免疫系統攻擊(自身免疫反應)的產物，「暴露」病人體內的癌細胞以使其被機體的自身免疫系統攻擊(癌症治療和癌症預防)的產物，抵抗致病性細菌侵入人或動物體內的產物、預防和抵抗病毒感染的產物，抵抗幽門螺桿菌感染胃黏膜的產物，抵抗細菌和病毒引起的新生兒腦膜炎的產物，對真核和原核致病性生物、細菌、病毒和毒素受體的預防性和治療性影響以阻止其在人和動物體具有活性的產物，抑制霍亂毒素結合到人和動物消化道黏膜的產物，開發抗錐蟲的疫苗的產物，開發抵抗錐蟲感染的酶抑制劑的產物，影響人和動物體的分子和細胞識別過程的產物，保護糖蛋白和細胞免受蛋白酶和其他酶攻擊的產物，以及保護分子免受人和動物消化道酶降解的產物，影響機體組織發育和形態發生的產物。本發明的轉唾液酸酶的特徵在於具有下列的DNS和部分胺基酸序列以及其他DNS同源序列，例如與上述部分序列具有60％以上的一致性(同一性)的序列。ii)優選的轉唾液酸酶的序列詳細資料(1)TS1酶序列的信息TS1部分序列的DNS特徵長度1491鹼基對類型核酸鏈形式雙鏈來源剛果錐蟲TS1酶的DNS部分序列(SEQIDNO1)5』ACCGACACCGTTGCTAAATACAGCACTGACGGTGGGAGAACGTGGAAGAGGGAGGTTATAATTCCGAATGGTCGTGTGGATGCCCACTACTCCCGCGTCGTTGATCCCACTGTTGTTGCGAAGGGTAATAACATTTATGTTCTCGTTGGGCGGTACAATGTCACGCGGGGCTACTGGCACAATAGGAACAACAAGGCTGGCATAGCCGATTGGGAGCCCTTCGTGTACAAGGGCACGGTGAACGTGGGCACGAAGGGCAATGCCACTGATGTGTCGATCAGCTGGGAGAGGACTGCACTGAAGTCGCTGTACAACTTCCCGGTTTCGGGAAGCCCTGGCACGCAGTTCCTTGGAGGGGCTGGGGGTGGTGTTGTAACATCCAACGGGACGATTGTGCTGCCAGTGCAGGCAAGGAACAAGGCCAACCGTGTTGTGAGCATGATCCTGTACTCGGCTGACGATGGAAAGTCATGGCACTTTGGGAAGGGTGAGGCCGGTGTAGGCACGTCCGAGGCTGCCCTCACTGAGTGGGACGGCAAGCTGCTGATTAGTGCACGATCCGATGGTGGACAGGGCTACCGCATGATATTCGAATCGAGTGACCTTGGTGCGACGTGGAAAGAGATGCTCAACAGCATCTCCCGCGTGATTGGCAACTCTCCGGGTCGCAGTGGTCCTGGCAGCTCGAGTGGCTTCATCACGGTGACAGTGGAGGGTGTGCCTGTGATGCTGATTACCCACCCGAAGAACCTTAAGGGCTCGTATTATCGGGACCGTCTGCAGCTGTGGATGACGGACGGCAATCGTATGTGGCATGTCGGGCAGGTCTCTGAGGGCGACGATAACAGCGCTTACAGCTCCCTGCTGTACACTCCGGACGGGGTCCTGTACTGCTTGCATGAGCAGAACATTGATGAGGTGTACAGCCTCCACCTTGTGCGCCTTGTGGACGAGCTGAAAAGCATTAAATCAACGGCTCTGGTGTGGAAGGCACAGGACGAGCTTCTCCTGGGCAACTGCCTCCCGGGCGATAAATACGATCCCGGGTGTGACGGCATCCCCACCGCTGGGCTTGCCGGGCTGCTGGTAGGACCCCTGACGGAGAAGACGTGGCCCGACGCGTATCGGTGCGTGAACGCTGCAACCAGCGGCGCTGTGAGCACTGCTGAAGGCGTGCGGCTGGACGTGGGTGGCGGTGGCCATGTTGTGTGGCCCGTGAGTGAGCAGGGGCAGGACCAGCGGTATTACTTTACCAACAGCGAGTTCACGCTCGCCGTCACGGTGCGGTTTGACGAGATGCCACGGGGGGAGCTCCCGTTGCTGGGGTTTGTGAACCGCAAAGGGAAGGTGAAGAAGATACTGAAGGTGTCGCTGAGCGGGGTGGAGTGGCTCCTGGCATACGGGAATGAGTACAACAGCACAGCCGCTGAGCCGCTGGACGTGAACGAGAGCCACCAGGTGGTGCTAGCGCTTCACGACGGGATCGTCTCC3』TS1酶的胺基酸部分序列(SEQIDNO2)TDTVAKYSTDGGRTWKREVIIPNGRVDAHYSRVVDPTVVAKGNNIYVLVGRYNVTRGYWHNRNNKAGIADWEPFVYKGTVNVGTKGNATDVSISWERTALKSLYNFPVSGSPGTQFLGGAGGGVVTSNGTIVLPVQARNKANRVVSMILYSADDGKSWHFGKGEAGVGTSEAALTEWDGKLLISARSDGGQGYRMIFESSDLGATWKEMLNSISRVIGNSPGRSGPGSSSGFITVTVEGVPVMLITHPKNLKGSYYRDRLQLWMTDGNRMWHVGQVSEGDDNSAYSSLLYTPDGVLYCLHEQNIDEVYSLHLVRLVDELKSIKSTALVWKAQDELLLGNCLPGDKYDPGCDGIPTAGLAGLLVGPLTEKTWPDAYRCVNAATSGAVSTAEGVRLDVGGGGHVVWPVSEQGQDQRYYFTNSEFTLAVTVRFDEMPRGELPLLGFVNRKGKVKKILKVSLSGVEWLLAYGNEYNSTAAEPLDVNESHQVVLALHDGIVS(2)TS2酶的序列信息TS2的DNS部分序列的特徵831個鹼基對類型核酸鏈形式雙鏈來源剛果錐蟲TS2酶的DNS部分序列(SEQIDNO3)5』TTCCGAATTCCCTCACTTGTTGAGATAGACGGCGTGCTTATCGCGACATTCGATACACGTTATCTTCGCGCTTCCGACAGCAGTCTCATAGACACAGCTATGAAATACAGTGCCGATCAGGGGAAGACGTGGAAAACTGAAATCATAATAAAAAATGCTAGACTAACTGATAACTTTTCCCGCGTCGTTGATCCAACGGTTGTTGTTAAGGGTGATAACTTGTTTATTTTTGTTGGGAGGTACAACACCTCATCTGCCCCATGGGTCTGGCAGGAAAACGGTAAAGACTGGGATGTACTGTTGTACAAGGCCAAGGTGAGGAAGGAATCAGCGGGTGGGGTACCATCAGTGAGCTTTACATGGGACGAACCCCTATACCTGAAGCATCTGCTCACCTCTGTCGGTAAAATAGACGGCAGGTCCCTCATACAATACATTGGTGGCGTTGGAAATGGTATTGTAACACCGAAAGGTACTATCGTGTTTCCAGTTCAGGTTTTAAACACCAACAAATCCGTCATGAACATGCTTCTGTATTCAAGTAACGACGGAAAAACCTGGGAGTTCAGCAAAACTTCCACACCCGCGGGCACAACTGAGGCCTCCCTTGTTTGGTGGGATGGACAACTACTTCTCACAAGCAGAACAACTCCGGATGTCGGCAGCCGCAAAGTATATTTAACAAGCGACCTCGGAACTTCATGGAATGAAGCGATCGGAAGTATCTCTCGTGTAATTGGTAACTCGCGGTACCGTAACGATCCTGGGGGGTCAGGTAGCTCAATTGCCATAACTGTGGAGGGAGTACCGGTGATGCTGATTACCCACCCG3』TS2酶的胺基酸部分序列(SEQIDNO4)FRIPSLVEIDGVLIATFDTRYLRASDSSLIDTAMKYSADQGKTWKTEIIIKNARLTDNFSRVVDPTVVVKGDNLFIFVGRYNTSSAPWVWQENGKDWDVLLYKAKVRKESAGGVPSVSFTWDEPLYLKHLLTSVGKIDGRSLIQYIGGVGNGIVTPKGTIVFPVQVLNTNKSVMNMLLYSSNDGKTWEFSKTSTPAGTTEASLVWWDGQLLLTSRTTPDVGSRKVYLTSDLGTSWNEAIGSISRVIGNSRYRNDPGGSGSSIAITVEGVPVMLITHPTS1酶和TS2酶的部分胺基酸序列的一致性(一致性)只為大約50％。因此該部分序列清晰地定義了兩者不同的物質(參見圖1)iii)新發現的酶TS1和TS2的特徵描述a)所述物質的物理/化學性質表1兩種轉唾液酸酶TS1和TS2的基本數據性質TS1TS2最適溫度30-40℃30-40℃最適pHpH6.5-8.5pH6.5-8.5等電點pH4-5pH5-6天然分子量400-600kDa120-180kDa還原性SDS-PAGE中的分子量90kDa90kDa鹽的影響1MKCl和NaCl降低兩種酶50％的活性，脫鹽方法再生酶活力金屬離子的影響20mMCa2+，Mg2+，Mn2+無影響5mMCu2+，Zn2+，Fe2+，Co2+很少的影響假定抑制劑的影響10mMN-(4-硝基苯基)草氨酸很少的抑制10mMN-乙醯-2，3-雙脫氫-2-脫氧神經氨酸很少抑制b)所述物質的生物學性質這裡談到的兩種物質是將唾液酸從供體分子轉移到受體分子的兩種酶。唾液酸在兩種酶的作用下，結合到聚糖，例如寡糖、多糖、聚唾液酸、糖蛋白和糖脂上作為供體。糖蛋白中，尤其是乳鐵蛋白(來自人、牛、山羊、綿羊、馬、駱駝和其他動物)，糖基化乳清蛋白(來自人、牛、山羊、綿羊、馬、駱駝和其他動物)，和酪蛋白(來自人、牛、山羊、綿羊、馬、駱駝和其他動物)，其他來自人、動物或植物的糖基化的蛋白，如酪蛋白的部分(來自人、牛、山羊、綿羊、馬、駱駝和其他動物)，人、動物和植物來源的其它糖蛋白及其部分，諸如例如來自酪蛋白的部分(來自人、牛、山羊、綿羊、馬、駱駝和其他動物)，諸如例如來自這些動物的酪蛋白的糖巨肽，是可在酶的作用下被轉移的良好的唾液酸的供體。神經節苷脂也可用作供體兩種轉唾液酸酶都具有對半乳糖寡糖良好的受體特異性，特別是對β-半乳糖寡糖，諸如例如由BorculoDomoIngredients(BDI)公司生產的VivinalGOS和由Yakult.公司生產的Oligomate55。此外，乳糖醇、乳糖酸、甲基β-乳糖苷、乙醯乳糖胺、半乳糖吡喃糖苷、轉-半乳糖寡糖、聚半乳糖和其他帶有末端結合的β(1-3)或β(1-4)-半乳糖的糖綴合物也可用作受體。半乳糖殘基的甲基化使受體功能下降。葡萄糖殘基的甲基化(例如與乳糖)對受體的功能具有較小的影響。單糖半乳糖也可以用作受體，只是特異性較低。TS1酶顯示出將唾液酸轉移到對應的受體上的效率上是TS2酶的大約兩倍。底物可以自由地結合，即溶解地，或也可是細胞膜結合的。克魯斯氏錐蟲(Schenkman等，1991；Vadekerckhove等，1992；Scudder等，1993)和布魯斯氏錐蟲(Engstler等，1992，1993，1995)已知在將α-2，3-結合的末端唾液酸轉移到β-1，4結合的末端半乳糖殘基的過程中起作用。由於不同的DNS和胺基酸序列，TS1和TS2與已知的酶有差異。TS1和TS2被因此清楚表徵為新物質(轉唾液酸酶)。進一步的區別，參見下一段敘述。iv)本發明與其他轉唾液酸酶、唾液酸酶和唾液酸轉移酶的區別「轉唾液酸酶」首次在美國錐體蟲克魯斯氏錐蟲中描述(Schenkmann等，1991)。不久以後，該酶也在非洲型的甘比亞布氏錐蟲(Trypanosomabruceigambiense)、羅德西亞布氏錐蟲(Trypanosomabruceirhodesiense)和布魯斯氏錐蟲(Trypanosomabruceibrucei)中發現(Engstler等，1993，PontesdeCarvalho等，1993，Engstler等，1995)。此外，轉唾液酸酶也在腸錐蟲(感染樹懶的寄生蟲)型(Medina-Acosta等，1994)、白喉棒狀桿菌(Corynebacteriumdiphtheriae)(Mattos-Guaraldi等，1998)和人血漿中(Tertov等，2001)發現。通常所稱的唾液酸酶在發現轉唾液酸酶之前已經是公知的。它們是特異性將唾液酸從供體分子轉移到水，並將唾液酸從寡糖和糖綴合物中脫水的糖苷水解酶。此外，一些含有胞嘧啶核苷單磷酸(CMP)活化的唾液酸的酶能轉移到其他糖殘基，主要是半乳糖和N-乙醯半乳糖。這些酶稱作唾液酸轉移酶(參見圖2.)。此處討論的轉唾液酸酶不像純的唾液酸酶可以將唾液酸特異性地從供體分子轉移到水中。然而，如果沒有合適的受體，此處討論的轉唾液酸酶會像基本的唾液酸酶一樣水解唾液酸。此處討論的轉唾液酸酶不需要上述提到的唾液酸轉移酶在其轉移反應所需要的活化的唾液酸，因此可以以非常廣泛的方式使用。因此此處討論的轉唾液酸酶比純唾液酸酶和唾液酸轉移酶更具有工業實用性。到目前為止，只知道克魯斯氏錐蟲和布斯氏錐蟲轉唾液酸酶的DNS和胺基酸序列，及蘭戈爾氏錐蟲(Trypanosomarangeli)純唾液酸的DNS和胺基酸序列。此處討論的TS1酶具有與布斯氏錐蟲轉唾液酸酶的部分胺基酸序列小於60％的一致性(同一性)，以及與克魯斯氏錐蟲的部分胺基酸序列小於50％的一致性(同一性)。此處討論的TS2酶具有與布斯氏錐蟲轉唾液酸酶的部分胺基酸序列小於50％的一致性(同一性)，以及與克魯斯氏錐蟲的部分胺基酸序列小於50％的一致性(同一性)(參見圖3)。此外，已知錐蟲轉唾液酸酶與已知的細菌及病毒的唾液酸酶和轉唾液酸酶的胺基酸對應程度為20％到30％(Chuenkova等，1999，Montagna等，2002)。因此此處描述的酶是新定義的物質(酶)，其與其他已知相似功能的酶的DNS和胺基酸序列一致性(同一性)小於60％。v)本發明進一步陳述a)多肽和功能性等同物本發明的「多肽」包括本發明的胺基酸序列的特徵性部分片段和本發明的酶及其功能性等同物的胺基酸序列。還包括本發明精確揭示的新多肽和酶的「功能性等同物」或「同源體」。本發明範圍內精確揭示的多肽的「功能性等同物」或類似物是與具有上述定義的所需生物學活性(如底物特異性)不同的多肽。本發明的「功能性等同物」應該理解為，尤其是，上述定義的序列至少一個位置的胺基酸具有與上述精確定義的序列不同，但具有此處確定的生物功能中的一種的突變體。因此「功能性等同物」包括通過一種或多種胺基酸添加、替換、刪除和/或倒置的方法得到的突變體，其中這些指定的改變可以發生在序列的任何位置，只要產生的突變體具有本發明的特徵。如果突變體和未改變的多肽之間的反應性模式是定量對應的，即例如同樣底物的改變具有不同的速度，則由此功能性等同物是特別地存在的。上述意義上的「功能性等同物」也包括所描述多肽的前體和多肽的功能性衍生物和鹽。術語「鹽」理解為羧基的鹽和本發明的蛋白質分子的氨基的酸加成鹽。羧基的鹽可以通過已知的方式生產並包括無機鹽，諸如例如鈉鹽、鈣鹽、銨鹽、鐵鹽和鋅鹽及有機鹼鹽，諸如例如胺鹽如三乙醇胺鹽、精氨酸鹽、賴氨酸鹽、哌啶鹽等。酸加成鹽，諸如例如，無機酸的鹽，諸如鹽酸鹽或硫酸鹽及有機酸的鹽，諸如乙酸鹽和草酸鹽也包括在本發明的主題之內。本發明的多肽「功能性衍生物」可在現有技術下在功能性胺基酸側鏈基團或其N-或C-末端上產生。這種類型的衍生物包括，例如，羧酸基團的脂肪族酯、通過用含氨的或與初級或二級胺的轉化得到的羧酸基團的醯胺；通過用乙醯基團的轉化得到的游離氨基的N-乙醯衍生物、或通過用乙醯基團的轉化得到的游離羥基的O-醯基衍生物。當然，「功能性等同物」還包括來自其他生物體的多肽以及天然存在的變體。例如，根據本發明的精確細節可以通過序列比較確定同源序列區域和酶的等同物。「功能性等同物」還包括本發明多肽的具有所需生物學功能的片段，優選獨立結構域或序列結構。此外，「功能性等同物」為具有上述確定的多肽序列之一或其功能性等同物以及至少一種其它的功能不同的N-或C-末端連接的異源序列(即，對另一部分不具有任何實質性的負面功能影響的融化蛋白部分)的融合蛋白。這種異源序列的非限制型的例子，如信號肽、酶、免疫球蛋白、表面抗原、受體或受體配體。本發明的轉唾液酸酶「功能性等同物」具體的是使用Pearson和Lipman，Proc.Natl.Acad，Sci，(USA)85(8)，1988，2444-2448算法，與SEQIDNO2或4的相應胺基酸序列或部分序列具有至少60％，尤其是65％或至少70％，諸如，例如75％，80％，85％，90％，95％，98％或99％的序列同一性(序列同源性)的胺基酸序列或部分序列的酶。在可能的蛋白糖基化的例子中，本發明的等同物包括上述蛋白去糖基化或糖基化的形式和對糖基化模式進行改變得到的修飾的形式。本發明的蛋白或多肽的同源體可通過致突變的方法產生，例如，通過點突變，加長或縮短該蛋白。此處使用的術語「同源體」涉及用作蛋白活性的激動劑或拮抗劑的蛋白的變體形式。本發明的蛋白的同源體可通過篩選突變體的組合庫而鑑定，例如縮短的突變體。例如，蛋白突變體的多樣化庫可通過在核酸水平進行組合的突變而產生，例如通過酶連接合成的寡核苷酸的混合物。有多種方法可用於從簡併的寡核苷酸序列生產潛在的同源體的庫。簡併基因序列的化學合成可以在DNA合成儀上進行，並且合成的基因然後可以與合適的表達載體連接。使用簡併的基因集合可以在一個編碼所需集合成為潛在的蛋白序列的混合物中提供所有的序列。合成簡併寡核苷酸的方法是本領域技術人員公知的(如Narang，S.A.(1983)Tetrahedron393；Itakura等(1984)Annu.Rev.Biochem.52323；Itakura等，(1984)Science1981056；Ike等(1983)NucleicAcidsRes.11477)。b)多核苷酸本發明的「多核苷酸」包括編碼本發明酶胺基酸部分序列的本發明核酸序列的特徵性部分片段，和編碼酶及其功能性等同物的核酸序列。多核苷酸優選含有大約20個以上，尤其是大約30個以上，諸如例如大約45個以上或大約60個以上的核酸殘基。「寡核苷酸」包括尤其少於大約60個核酸殘基的序列，優選少於大約45個，特別少於大約30個或少於大約20個核酸殘基。此處提到的所有「核酸序列」可以常規的方法從核苷酸構建單元通過化學合成而製備，例如通過單個的重疊的、雙螺旋的互補核酸構建單元的片段濃縮的方法製備。寡核苷酸的化學合成可以採用已知的phosphoamidite方法進行(Voet，Voet，第二版，WileyPressNewYork，p896-897)。使用DNA聚合酶的Klenow片段進行合成的寡核苷酸的吸附和間隙的填補，連接反應和通常的克隆方法描述於Sambrook等(1989)，分子克隆實驗室手冊，冷泉港實驗室出版社。本發明的主題還包括編碼上述多肽及其功能性等同物之一的核酸序列(單鏈-和雙鏈DNA和RNA序列，諸如，例如cDNA和mRNA)，如其還可以使用合成的核苷酸類似物得到。本發明涉及編碼本發明的多肽或蛋白或其生物活性部分的分離的核酸分子，及可用作例如鑑定或擴增本發明的編碼核酸片段的雜交探針或引物。本發明的核酸分子可另外含有編碼基因範圍的3』端和/或5』端的非翻譯序列。「分離的」核酸分子分離自天然來源的核酸中存在的其他核酸分子，並且如果是通過重組技術生產的還基本不含任何其它細胞物質或培養基，或者如果是化學合成的，不含化學前體物質或其他化合物。本發明的核酸分子可通過分子生物學標準技術和本發明提供的序列信息而分離到。例如，可以利用精確描述的全序列或其部分之一用作雜交探針和標準的雜交技術(如描述於Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.分子克隆實驗室手冊，第二版，冷泉港實驗室，冷泉港實驗室出版社，冷泉港，NY，1989).從合適的cDNA庫分離cDNA。此外含有一種揭示序列或部分序列的核酸分子可以利用聚合酶鏈式反應得到，其中使用到根據上述序列製備的寡核苷酸引物。這種方法擴增的核酸能克隆到合適的載體中並通過DNA序列分析而確定其特徵。本發明的寡核苷酸還可以通過標準的合成方法而製備，如利用自動DNA合成設備。本發明進一步包括精確描述的核酸序列或其部分序列的「互補」核酸分子。本發明的核苷酸序列可以幫助製備用於在其他細胞類型和生物體中鑑定和/或克隆同源序列的探針和引物。這種類型的探針和引物通常包括在嚴格條件下與至少大約12，優選至少大約25，諸如例如大約40，50或70個本發明的核酸序列的有義鏈或對應的反義鏈的連續核苷酸雜交的核苷酸序列區段。此外，本發明的核酸序列來自SEQIDNO1和3，並通過添加、替換、插入或缺失單個或數個核苷酸而與之相區別，但編碼具有所需特性的多肽。本發明還包括含有稱作沉默突變或與根據特定來源或宿主生物體的使用的密碼子精確描述的序列相比的改變，及天然存在的例如剪接突變體或等位基因突變體的那些核酸序列。本發明主題還包括通過保守核苷酸替換的方法(即胺基酸被另一種相同電荷、分子量大小、極性和/或溶解性的胺基酸替換)獲得的序列。本發明的主題還包括通過序列多態性方法從精確揭示的核酸產生的分子。這些遺傳多態性由於天然的變異能在種群內的個體間存在。這些天然的改變通常在基因的核苷酸序列內產生大約1到5％的差異。此外，本發明還包括與上述指定的編碼序列或其互補序列雜交的核酸序列。這些多核苷酸能通過對基因組或cDNA庫取樣而定位，如果需要，能夠使用合適的引物通過PCR方法從此處擴增，並然後能用合適的探針分離到。另外，還有可能利用本發明的多核苷酸或載體轉化合適的微生物，通過擴增該微生物而擴增該多核苷酸，並隨後分離該多核苷酸。此外，本發明的多核苷酸能通過化學方法合成。可以「雜交」到多核苷酸的性質應當理解為多核苷酸或寡核苷酸在嚴格條件下結合到接近互補的序列的能力，而在這些條件下，不發生非互補配對之間非特異性的結合。為此，所述序列應當70-100％互補，優選90-100％互補。互補序列能互相特異性結合的性質被用於，例如Northern或Southern印跡技術或與PCR或RT-PCR中與引物結合。總的來說，使用長度至少為30鹼基對的寡核苷酸。「嚴格」條件應當理解為當，例如，在Southern或Northern印跡之後，DNA或RNA片段在膜上與探針在特定條件下雜交，即溫度60-70℃(38-42℃，含有50％甲醯胺的50％雜交液)。此外，當在雜交後為洗脫非特異性雜交的DNA或RNA探針而進行的洗滌步驟也特異性進行時，條件也是特異性或嚴格的。特異性洗滌步驟通常是在20-25℃用含0.1％SDS(十二烷基磺酸鈉)的2×SSC緩衝液洗滌5-10分鐘，兩次，隨後用低離子強度的緩衝液(如含有0.1％SDS的0.1×SSC)在更高的溫度(如64℃)洗滌兩次。[20×SSC3MNaCl，0.3M檸檬酸鈉，pH7.0]。這樣，只有那些很大程度上互補的核酸還彼此結合。嚴格條件的設置是本領域技術人員公知的技術，並描述於Ausubel等，分子生物學最新操作，JohnWileySons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6。本發明的另一方面涉及「反義」核酸。其包括與編碼的「有義」核酸互補的核苷酸序列。該反義核酸可以與整個編碼鏈互補或只與其一部分互補。通過另一個實施方案，反義核酸分子是核苷酸序列的編碼鏈的非編碼區域的反義鏈。術語「非編碼區」指鑑定為5』和3』非翻譯區的序列區段。反義寡核苷酸可以是例如大約5，10，15，20，25，30，35，40，45或50核苷酸長度。本發明的反義核酸可以使用此專門領域的技術通過化學合成或酶連接來構建。反義核酸可以是化學合成的，如果天然存在的或不同修飾的核苷酸的形式提高該分子的生物穩定性或提高反義和有義核酸的雙螺旋的物理穩定性，則也可以使用。例如，使用phosphorthioate衍生物和吖啶取代的核苷酸。修飾的核苷酸可用於構建反義核酸的例子如5-氟尿嘧啶，5-溴尿嘧啶，5-氯尿嘧啶，5-碘尿嘧啶，次黃嘌呤，黃嘌呤，4-乙醯胞嘧啶等。本發明的反義核酸分子通常施用到細胞或在原位產生，以使其與細胞內mRNA和/或編碼DNA雜交或結合，以抑制蛋白的表達，如通過抑制轉錄或翻譯。在本發明中，術語「表達」或「增強」或「過量表達」描述在微生物中生產或提高一種或多種由對應的DNA編碼的酶的細胞內活力。為此，例如，可以向生物體內引入基因，用另外的基因代替存在的基因，提高一個或多個基因的拷貝數，或使用編碼具有高活性的酶的基因，即可以在需要的情況下組合這些方案。在本發明中，術語「減弱」和「降低」描述微生物中由相應的DNA編碼的一種或者多種酶的細胞內活性的減弱或降低。為此，例如，在生物體中刪除基因，用另一基因取代現有的基因，降低一個或多個基因轉錄本的拷貝數，使用弱的啟動子或使用編碼具有低活性的對應酶的基因，以及如果需要可以組合這些方案。c)構建體和載體的表達本發明的主題還包括表達構建體，包括在調控性核酸序列的遺傳控制下的編碼本發明的多肽的核酸序列；及含有至少一個上述表達構建體的載體。優選地，這些本發明的構建體包括各編碼序列5』上遊的啟動子和3』下遊的終止子序列，及如果需要，另外的常規調控元件並分別操作性連接到編碼序列上。「操作性連接」理解為啟動子，編碼序列、終止子和如果需要，其他這類的調控元件按順序排列，以使每個調控元件能根據編碼序列的表達的條件實現其功能。可操作性連接的序列的例子是目標序列和增強子、多聚腺苷酸信號等。另外的調控元件包括可選的標記、擴增信號、複製起始點等。合適的調控序列描述於Goeddel，基因表達技術酶學方法，185，AcademicPress，SanDiego，CA(1990)。除人工調控序列之外，天然調控序列也可以出現在目前的結構基因前面。通過遺傳改變，如果需要可以拋棄天然調控並提高或降低基因的表達。該基因構建體還能更簡單地構建，即在結構基因前不插入另外的調控信號，也沒有除去其天然的啟動子及其調控序列。此外，天然調控序列以不再發生調控，並且基因表達增強和降低的方式突變。在基因構建體中可以含有一個或多個該核酸序列的拷貝。可用的啟動子的例子是可有利地用於革蘭氏陰性細菌的cos-，tac-，trp-，tet-，trp-tet-，lpp-，lac-，lpp-lac-，laclq-，T7-，T5-，T3-，gal-，trc-，ara-，SP6-，λ-PR-或imλ-PL啟動子；及革蘭氏陽性啟動子amy和SP02，酵母啟動子ADC1，MFalpha，AC，P-60，CYC1，GAPDH或植物啟動子CaMV/35S，SSU，OCS，lib4，usp，STLS1，B33，not或泛素或菜豆蛋白啟動子。特別優選使用誘導啟動子如光和尤其是溫度誘導的啟動子，如PrP1啟動子。一般來說，所有天然啟動子可以與其調控序列一起使用。此外，合成的啟動子也可以有利的使用。特定的調控序列應該可以使核酸序列靶向表達並表達蛋白。這表明，例如，隨宿主生物的不同，基因只在誘導後表達或過量表達，或立即表達和/或過量表達。這裡的調控序列和因子優選能具有正面影響並因此提高或降低表達。因此，調控元件的增強可有利地發生在轉錄水平，其中可使用強轉錄信號，例如啟動子和/或「增強子」。此外，也可能增強翻譯，例如通過提高mRNA的穩定性。通過將合適的啟動子與合適的編碼核苷酸序列和終止子或多聚腺苷酸信號融合的方式產生表達盒。為此，可以使用現有的重組和克隆技術，如描述於T.Maniatis，E.F.Fritsch和J.Sambrook，分子克隆實驗室手冊，冷泉港實驗室，冷泉港，NY(1989)和T.J.Silhavy，M.L.Berman和L.W.Enquist，基因融合實驗，冷泉港Laboratory，冷泉港，NY(1984)和Ausubel，F.M.等，分子生物學最新操作，GreenePublishingAssoc.andWileyInterscience(1987)。為在合適的宿主生物中的表達，重組核酸構建體或基因構建體有利地插入到宿主特異性的能使基因在宿主中最優化表達的載體。「載體」是本領域技術人員公知的，例如，來自「克隆載體」(PouwelsP.H.等，Hrsg，Elsevier，Amsterdam-NewYork-Oxford，1985)。除質粒外，載體被理解為本領域技術人員公知的所有其他載體，例如噬菌體、病毒如SV40，CMV，杆狀病毒和腺病毒，轉座子，IS元件，噬菌粒，粘粒和線性或環狀DNA。這些載體可以在宿主中自動複製或隨染色體複製。下面所述可指定作為合適的表達載體的例子。常見的融合表達載體，如pGEX(PharmaciaBiotechInc；Smith，D.B.和Johnson，K.S.(1988)Gene6731-40)，pMAL(NewEnglandBiolabs，Beverly，MA)和pRIT5(Pharmacia，Piscataway，NJ)可以通過這些載體將穀胱甘肽-S-轉移酶(GST)，麥芽糖E結合蛋白或蛋白A與重組的靶蛋白融合。非融化蛋白表達載體如pTrc(Amann等，(1988)Gene69310-315)和pET11d(Studier等基因表達技術酶學方法，185，AcademicPress，SanDiego，California(1990)60-89)。在釀酒酵母(S.cerevisiae)中表達的酵母表達載體，如pYepSecl(Baldari等，(1987)EmboJ.6229-234)，pMFa(KurjanandHerskowitz(1982)Cell30933-943)，pJRY88(Schultz等(1987)gene54113-123)和pYES2(InvitrogenCorporation，SanDiego，CA)。適合用在其他真菌中如絲狀真菌的載體和構建載體的方法，包括那些具體描述於vandenHondel，C.A.M.J.J.Punt，P.J.(1991)「絲狀真菌的基因轉移系統和載體發展」(「Genetransfersystemsandvectordevelopmentforfilamentousfungi)，inAppliedMolecularGeneticsofFungi，J.F.Peberdy等，Hrsg.，pages1-28，CambridgeUniversityPressCambridge。可以在培養的昆蟲細胞(例如，Sf9細胞)中表達蛋白的杆狀病毒載體包括pAc序列(Smith等，(1983)Mol.CellBiol..32156-2165)和pVL序列(LucklowandSummers(1989)Virology17031-39)。植物表達載體如那些具體描述於Becker，D.，Kemper，E.，Schell，J.和Masterson，R.(1992)「在靠近左端定位有選擇性標記的新的植物二元載體」(「Newplantbinaryvectorswithselectablemarkerslocatedproximaltotheleftborder」)，PlantMol.Biol.201195-1197和Bevan，M.W.(1984)「用於植物轉化的二元土壤桿菌載體」(「BinaryAgrobacteriumvectorsforplanttransformation」)，Nucl.AcidsRes.128711-8721。哺乳動物表達載體如pCDM8(Seed，B.(1987)Nature329840)和pMT2PC(Kaufman等，(1987)EMBOJ.6187-195)。其他原核和真核細胞合適的表達系統描述於Sambrook，J.，Fritsch，E.F.andManiatis，T.，分子克隆實驗室手冊，第二版，冷泉港Laboratory，冷泉港實驗室出版社，冷泉港，NY，1989的第16和17章。d)重組的微生物利用本發明的載體，可以生產重組微生物，例如被至少一個本發明的載體轉化並可以用於生產本發明的多肽。上面描述的本發明的重組構建體被有利地引入到合適的宿主中並在其中表達。為此，優選使用本領域技術人員公知的通常使用的克隆和轉染方法，例如共沉澱、原生質體融化、電穿孔、逆轉錄病毒轉染等以將指定的核酸引入到各自的表達系統中表達。合適的系統描述於，例如分子生物學最新操作，F.Ausubel等，Hrsg.，WileyInterscience，NewYork1997或Sambrook等分子克隆實驗室手冊，第二版，冷泉港實驗室，冷泉港實驗室出版社，冷泉港，NY，1989。根據本發明，也可以製備同源重組的微生物。為此，製備含有本發明的基因的至少一個片段的載體，或含有至少一個編碼序列的載體，如果需要，其中引入至少一個胺基酸缺失、添加或置換以改變本發明的序列，例如破壞其功能(「敲除」載體)。引入的序列還可以是來自相關的微生物的同源體或來自哺乳動物，酵母或昆蟲。用於同源重組的載體可以任選的是這樣的形式，即在同源重組中內源的基因以另一種方式突變或改變，但還是編碼功能蛋白(如位於上遊的調控區可以改變內源蛋白表達的方式被改變)。改變的本發明的基因部分位於同源重組載體中。適合用於同源重組的載體的構建描述於Thomas，K.R.和Capecchi，M.R.(1987)Cell51503。作為宿主生物，原則上所有生物體都適合於表達本發明的核酸或其等位基因變體、其功能性等同物或衍生物。宿主生物理解為，例如，細菌、真菌、酵母、植物或動物細胞。優選的生物為細菌，例如埃希氏菌屬，如大腸桿菌，鏈黴菌、桿菌或假單孢菌，真核微生物如釀酒酵母，麴黴，來自動物或植物的高等真核細胞，例如Sf9或CHO細胞。成功轉化的生物體的選擇可以利用包含在載體或表達盒內的標記基因進行。這類標記基因的例子是抗生素抗性基因和使轉化的細胞著色的催化生色反應的酶的基因。可以通過自動細胞分選的方式來選擇。成功轉化有攜帶相應抗生素抗性基因(如G418或潮黴素)載體的微生物可以採用含有抗生素或瓊脂的相應培養基來選擇。細胞表面的標記蛋白可以用於親和層析方式的篩選。宿主生物體和適合該生物體的載體的組合形成表達系統，所述載體例如為質粒、病毒或噬菌體，如帶有RNA聚合酶/啟動子系統的質粒，噬菌體8或7，或其他溫和噬菌體或轉座子和/或其他有益的調控序列。術語「表達系統」應當理解為，例如，哺乳動物細胞的組合，例如CHO細胞和載體，例如適合哺乳動物細胞的pcDNA3neo載體。如果需要，基因產物還可以引入到轉基因生物體中表達，如轉基因動物，特別使小鼠、綿羊或轉基因植物。e)重組生產多肽此外，本發明的主題還包括重組生產本發明的多肽或其功能性生物活性片段的方法，其中培養生產多肽的微生物，如果需要誘導多肽的表達並從培養物分離多肽。如果需要，多肽也可以這種方式大規模生產。重組微生物可以採用已知的方法培養和發酵。細菌可以，例如在TB或LB培養基中在20到40℃，pH值6到9的條件下擴增。合適的培養條件具體描述於，例如T.Maniatis，E.F.Fritsch和J.Sambrook，分子克隆實驗室手冊，冷泉港Laboratory，冷泉港，NY(1989)。如果多肽沒有分泌到培養基中，則裂解細胞並利用已知的蛋白分離方法從裂解物中得到產物。如果這樣，細胞通過高頻超聲波、高壓例如在弗氏壓碎器(Frenchpressure)中、通過滲透、通過去汙劑、裂解酶或有機溶劑、通過勻漿或通過以上數種方式的組合進行裂解。多肽的純化可以通過使用已知的層析方法，例如分子篩層析(凝膠過濾)，例如Q-Sepharose層析，離子交換層析和疏水層析，以及使用其他常規的方法例如超濾，結晶，鹽析、透析和非變性凝膠電泳進行。合適的方法描述於，例如Cooper，F.G.，生物化學工作方法，VerlagWalterdeGruyter，Berlin，NewYork或Scopes，R.，蛋白純化，SpringerVerlag，NewYork，Heidelberg，Berlin。相同的方法也適用於非重組生產的多肽。為分離重組蛋白，特別有利的是使用通過特定的核酸序列延長cDNA以編碼改變的多肽或融合蛋白，其例如利於純化的載體系統或寡核苷酸。這類合適的修飾可以是，例如，用作錨的「標記」，例如，已知為六-組氨酸錨或能被確定為抗體的抗原的表位的修飾(描述於，例如Harlow，E.和Lane，D.，1988，抗體實驗室手冊.冷泉港(N.Y.)出版社)。這些錨可以用於將蛋白附著到固體載體如聚合物基質上，其例如能填充到層析柱中或用在微孔板或一些其他的載體上。同時，這些錨可以用於鑑定蛋白。為鑑定蛋白，可以使用常規的標記，例如螢光染料、酶標記，其在與底物反應後形成可檢測的反應產物，或放射標記，這些標記單獨地或與錨一起可以衍生蛋白。f)從培養物中純化所需的唾液酸化產物所需的產物可以從微生物體或培養上清液中通過本領域公知的不同方法來獲得。如果所需的產物沒有與細胞分離，則通過低速離心從培養物中收集細胞，用標準的方法裂解細胞，例如機械力或超聲波處理。通過離心除去細胞碎片，含有可溶性蛋白的上清級分用於進一步純化所需的化合物。如果產物是與細胞分離的，通過低速離心從培養物中除去細胞，將上清級分用於進一步純化。兩種純化方法的上清液級分都可進行採用合適樹脂的層析，其中所需的比雜質具更高選擇性的分子或是被層析樹脂保留住，或是通過該樹脂。這些層析步驟，如果需要可以重複，其中可以使用相同的或其他的層析樹脂。本領域的技術人員可以熟練選擇合適的層析樹脂並將其最有效地應用於待純化的特定分子。純化的產物可以通過過濾或超濾濃縮並在使產物保持最大穩定性的溫度下保存。許多純化方法是現有技術已知的。這些純化技術描述於Bailey，J.E.Ollis，D.F.基礎生物化學工程，McGraw-HillNewYork(1986)。分離的化合物的同一性和純度可以通過現有技術的方法鑑定。這些技術包括高效液相色譜(HPLC)，分光鏡方法，著色方法，薄層層析，NIRS，酶法檢測或微生物學檢測。這些分析方法綜述於Patek等(1994)Appl.Environ.Microbiol.60133-140；Malakhova等(1996)Biotekhnologiya11，27-32；Schmidt等(1998)BioprocessEngineer.1967-70.Ullmann’s工業化學百科全書(EncylopediaofIndustrialChemistry)(1996)Bd.A27，VCHWeinheim，p89-90，p521-540，p540-547，p559-566，575-581和p581-587；Michal，G(1999)生物化學途徑生物化學和分子生物學圖冊(BiochemicalPathwaysAnAtlasofBiochemistryandMolecularBiology)，JohnWileyandSons；Fallon，A.等(1987)HPLC在生物化學中的應用生物化學和分子生物學實驗室技術(ApplicationsofHPLCinBiochemistryinLaboratoryTechniquesinBiochemistryandMolecularBiology)，Bd.17。下面非限制性的實施例描述了本發明的具體實施方案。本文描述的轉唾液酸酶的生產、純化和應用的實施例。總述本發明範圍內進行的克隆步驟，如限制性酶切、瓊脂糖凝膠電泳、DNA片段純化、核酸向硝酸纖維素膜和尼龍膜的轉移、DNA片段的連接、轉化細胞、細菌培養、噬菌體擴增和重組DNA序列分析，按照Sambrook等(1989)loc.Cit的描述進行。實施例1從剛果錐蟲培養物中分離酶剛果錐蟲(保存於瑞士巴賽爾熱帶研究所(STIB)，株系號249)的前循環型可以在含10％胎牛血清和氯高鐵血紅素的SM/SDM79培養基中於27℃無CO2的條件下培養。培養三到四天後，細胞數量從1×106增加到大約7×106/mL，並通過離心分離培養上清液，過濾並通過超濾濃縮。這種方法獲得的培養上清中，可以觀察到84％的酶活性，而另外16％的酶活性被發現存在於細胞沉澱上。濃縮的培養上清液直接用作用於轉唾液酸酶反應的酶濃縮液。反應後可以從培養上清液分離所需的唾液酸化的分子。實施例2酶的純化將濃縮的培養上清液引入到離子交換柱(QSepharose)中分離純的酶。該柱在洗滌後用鹽離子梯度洗脫。用最大為0.2M的鹽濃度洗脫TS2，用最小為0.2M的鹽濃度洗脫TS1。洗脫後，兩種酶都通過等電聚焦，凝膠過濾(SephadesG150SF)、親和層析或蛋白沉澱的方式分離以純化到具有顯著同質性的產物。Example3酶活性的測定將25μL的酶的50mMBisTris緩衝液溶液，pH7.0與作為供體的1mMNeufAc-α(2-3)乳糖和0.5mM的4-甲基傘形糖基半乳糖苷作為受體以終體積50μL在37℃一起溫育2小時，測定轉唾液酸酶的轉移活性。加入1mL冰水終止溫育。將反應物引入到預填充有0.3mLQSepharoseFF(乙酸鹽形式)和用水預平衡的柱中。在用水洗去受體和去除死體積(200μL1NHCl)後，唾液酸化的產物用1NHCI(700μL)洗脫。用酸在95℃水解該產物45分鐘並在冰上冷卻後，探針用250-290μL2NNaOH和300μL1M甘氨酸/NaOH緩衝液pH10.0中和。釋放的甲基傘形酮的螢光用365nm的激發波長和450nm的發射波長在黑色96孔板(Microfluor，Dynex，U.S.A.)中測量。酶的活性對應於檢測到的螢光強度，並以先前建立的校準曲線讀取其值(根據Engstler等1992的方法)。實施例4培養用於生產酶的轉基因生物(細菌、酵母、真菌、植物)此處描述的TS1和TS2的DNA部分序列首次使得利用通常的標準技術建立酶的全DNS序列(尤其是由於此處使用的DNS序列不含有任何非編碼的內含子)。對應的標準技術為如「聚合酶鏈式反應」技術(PCR技術)、使用基因組DNS或cDNA和mRNA的「Southern印跡」技術，其可以使用市售的試劑盒，例如Invitrogen或Clontech公司生產的試劑盒來進行。該技術是本領域技術人員公知的，描述於Ausubel等，分子生物學最新操作，Edition1989和2001等。各酶的全部DNS或其功能性部分序列通過標準的轉化技術(Ausubel等)引入到所需的生產生物體中。轉基因生物生產TS1和TS2，並可以從轉基因生物和/或其培養上清中分離。作為編碼TS1或TS2的DNS的受體生物，可以使用原核的細菌、真核的微生物、酵母和其他真菌、真核的細胞培養物、藻類、植物、種子、動物、動物的部分、組織、雜交瘤、轉基因生物和基因生物學、基因治療及轉基因重組子和生物體，從其產生器官、組織和細胞。本文的酶可以從相應的轉基因生物的全部或部分、其培養物上清液，器官、組織、細胞、生物液體、分泌物、eiern、血液、淋巴、乳汁、植物、藻類和種子及其部分中分離到。實施例5酶反應的例子6kg糖巨肽(glycomacropeptide)(GMP)與1kg鏈長度為6-10個糖基的半乳糖寡糖共同溶解於通常使用的50mMBisTris緩衝液pH7.0(如Merk，Darmstadt公司生產的)。用1L含有轉唾液酸酶的剛果錐蟲的培養上清取代上述溶液，並在37℃溫育3小時。經過溫育，轉唾液酸酶將唾液酸從GMP轉移到半乳糖寡糖。唾液酸化的產物可以利用常規的層析方法(Ausubel等)或過濾技術分離和純化，並以純的形式用於產物製劑。糖巨肽(glycomacropeptide)(GMP)是從牛奶生產奶酪的廢棄產物。在製備奶酪的酪蛋白沉澱後，其可以從剩餘的乳清蛋白中通過過濾技術分離到。當乳糖通過市售的β-半乳糖苷酶轉化時產生半乳糖寡糖。通過這一轉化，一方面，β-半乳糖苷酶將乳糖分解成其單體糖。另一方面，通過這一轉化，在轉化的副反應中，同時可以生產帶有長鏈的半乳糖寡糖，其可以被分離並用作轉唾液酸酶反應的受體。實施例6酶的應用兩種分離的酶可以例如，用於對含有β-半乳糖的聚合物(如阿拉伯膠等Gumarabicum)進行唾液酸化，並且尤其用於聚乳糖胺和半乳聚糖，及用於半乳糖寡糖(GOS)，尤其是用於β-半乳糖寡糖，如BorculoDomoIngredients(BDI)公司生產的VivinalGOS和Yakult.公司生產的Oligmate55。這些半乳糖聚合物和新產生的半乳糖寡糖(如實施例5中的描述產生)可以在本發明的轉唾液酸酶的作用下被唾液酸化。可以使用上述的所有供體，尤其是來自酪蛋白(人、牛、山羊、綿羊、馬、駱駝和其他動物)的糖巨蛋白(glycomacropeptide)作為唾液酸的供體。唾液酸化的糖結構顯示與在人體中發現的並具有多種功能的酸糖的相似性增加。參考文獻Blix，F.G.，Gottschalk，A.undKlenk，E.(1957).Proposednomenclatureinthefieldofneuraminicandsialicacids.Nature1791088ChuenkovaM.，PereiraM.，(1999).TaylorG.trans-sialidaseofTrypanosomacruziLocationofgalactose-bindingsite(S).BIOCHEMBIOPHYSRESCOMMUN；262549-556.ChuenkovaM.V.，PereiraM.A.(2001).TheT.cruzitrans-sialidaseinducesPC12celldifferentiationviaMAPK/ERKpathway.Neuroreport123715-3718.CorfieldA.P.，MyerscoughN.，WarrenB.F.，DurdeyP.，ParaskevaC.andSchauerR.(1999).ReductionofsialicacidO-acetylationinhumancolonmucinsintheadenoma-carcinomasequence，GlycoconjugateJ.16307-317Crocker，P.R.，Clark，E.A.，Filbin，M.，Gordon，S.，Jones，Y.，Kehri，J.H.，Kelm，S.，LeDouarin，N.，Powell，L.，Roder，J.，Schnaar，R.L.，Sgroi，D.C.，Stamenkovic，K.，Schauer，R.，Schachner，M.，vandenBerg，T.K.，vanderMerwe，P.A.，Watt，S.M.undVarki，A.(1998).Siglecsafamilyofsialic-acidbindinglectins.Glycobiology8，V.Engstler，M.，Reuter，G.undSchauer，R.(1992).PurificationandcharacterizationofanovelsialidasefoundinprocycliccultureformsofTrypanosomabrucei.Mol.Biochem.Parasitol.5421-30.EngstlerM.，ReuterG.，SchauerR.(1993).Thedevelopmentallyregulatedtrans-sialidasefromTrypanosomabruceisialylatestheprocyclicacidicrepetitiveprotein.MolBiochemParasitol；611-13.EngstlerM.，SchauerR.，BrunR.(1995).Distributionofdevelopmentallyregulatedtrans-sialidasesintheKinetoplastidaandcharacterizationofashedtrans-sialidaseactivityfromprocyclicTrypanosomacongolense.ActaTrop；59117-129.FahrC.andSchauerR.(2001).DetectionofSialicAcidsandGangliosideswithSpecialReferenceto9-O-AcetylatedSpeciesinBasaliomasandNormalHumanSkin，J.Invest.Dermatol.116254-260GaoW，PereiraMA.(2001).Trypanosomacruzitrans-sialidasepotentiatesTcellactivationthroughantigen-presentingcellsroleofIL-6andBruton′styrosinekinase.EurJImmunol311503-1512.Herrler，G.，Rott，R.，Klenk，H.D.，Müller，H.P.，Shukla，A.K.undSchauer，R.(1985).Thereceptor-destroyingenzymeofinfluenzaCvirusisneuraminate-O-acetylesterase.EMBOJ.4，1503-1506.Higa，H.H.，Rogers，G.N.undPaulson，J.C.(1985).InfluenzavirushemagglutininsdifferentiatebetweenreceptordeterminantsbearingN-acetyl-，N-glycolyl-，andN，O-diacetyl-neuraminicacids.Virology144279-282.HublU.，IshidaH.，KisoM.，HasegawaA.，andSchauerR.(2000).StudiesontheSpecificityandSensitivityoftheInfluenzaCVirusBindingAssayforO-AcetylatedSialicAcidsandItsApplicationtoHumanMelanomas，J.Biochem.1271021-1031Kelm，S.undSchauer，R.(1997).Sialicacidsinmolecularandcellularinteractions.Int.Rev.Cytol.175137-240.Kelm，S.，Schauer，R.undCrocker，P.R.(1996).TheSialoadhesins-afamilyofsialicacid-dependentcellularrecognitionmoleculeswithintheimmunoglobulinsuperfamily.Glycoconj.J.13913-926.Lasky，L.A.(1995).Selectin-carbohydrateinteractionsandtheinitiationoftheinflamma-toryresponse.Ann.Rev.Biochem.64，113-139.Mattos-Guaraldi，A.L.，Formiga，L.C.D.andAndrade，A.F.B.(1998).FEMSMicrobiologyLetters，168167-172Medina-AcostaE.，PaulS.，TomlinsonS.，Pontes-de-CarvalhoL.C.(1994).Combinedoccurrenceoftrypanosomalsialidase/trans-sialidaseactivitiesandleishmanialmetalloproteinasegenehomologuesinEndotrypanumsp.MolBiochemParasitol；64273-282.MontagnaG，CremonaML，ParisG，AmayaMF，BuschiazzoA，AlzariPM，FraschAC(2002).Thetrans-sialidasefromtheafricantrypanosomeTrypanosomabrucei.EurJBiochem；2692941-2950.Pilatte，Y.，Bignon，J.undLambré，C.R.(1993).Sialicacidsasimportantmoleculesintheregulationoftheimmunesystempathophysiologicalimplicationsofsialidasesinimmunity.Glycobiology3201-218.PontesdeCarvalhoL.C.，TomlinsonS.，VandekerckhoveF.，BienenE.J.，ClarksonA.B.，JiangM.S.，HartG.W.，NussenzweigV.(1993).Characterizationofanoveltrans-sialidaseofTrypanosomabruceiprocyclictrypomastigotesandidentificationofprocyclinasthemainsialicacidacceptor.JExpMed；177465-474.Reuter，G.undSchauer，R.(1988).Nomenclatureofsialicacids.Glycoconj.J.5133-135.Reuter，G.，Kelm，S.undSchauer，R.(1988).Chemistryandbiologyofcellsurfaceglyco-conjugates.ActaHistochem.Suppl.3651-79.SchauerR.(2000)，Achievementsandchallengesofsialicacidresearch，GlycoconjugateJ.17485-499Schauer，R.(1982).Chemistry，metabolism，andbiologicalfunctionsofsialicacids.Adv.Carbohydr.Chem.Biochem.40131-234.Schauer，R.(1985).Sialicacidsandtheirroleasbiologicalmasks.TrendsBiochem.Sci.10，357-360.Schauer，R.(1991).BiosynthesisandfunctionofN-andO-substitutedsialicacids.Glyco-biology1449-452.Schauer，R.undKamerling，J.P.(1997).Chemistry，biochemistryandbiologyofsialicacids.InGlycoproteinsII.J.Montreuil，J.F.G.Vliegenthart，undH.Schachter，eds.(AmsterdamElsevier)，pp.243-402.Schauer，R.，Kelm，S.，Reuter，G.，Roggentin，P.undShaw，L.(1995).Biochemistryandroleofsialicacids.InBiologyofsialicacids.A.Rosenberg，ed.(NewYorkPlenumPress)，pp.7-67.Schenkman，S.，Jiang，M.S.，Hart，G.W.undNussenzweig，V.(1991).Anovelcellsurfacetrans-sialidaseofTrypanosomacruzigeneratesastage-specificepitoperequiredforinvasionofmammaliancells.Cell651117-1125.Sharon，N.undLis，H.(1997).Microbiallectinsandtheirglycoproteinreceptors.InGlyco-proteinsII.J.Montreuil，J.F.G.VliegenthartundH.Schachter，eds.(AmsterdamElsevier)，pp.475-506.Shaw，L.undSchauer，R.(1988).ThebiosynthesisofN-glycoloylneuraminicacidoccursbyhydroxylationoftheCMP-glycosideofN-acetylneuraminicacid.Biol.Chem.Hoppe-Seyler369477-486.TertovV.V.，KaplunV.V.，SobeninI.A.，Boytsova，E.Y.，BovinN.V.OrekhovA.N.(2001).Humanplasmatrans-sialidasecausesatherogenicmodificationoflowdensitylipoprotein.Atherosclerosis159103-115Traving，C.undSchauer，R.(1998).Structure，functionandmetabolismofsialicacids.CMLS，Cell.Mol.LifeSci.541330-1349.Varki，A.，Hooshmand，F.，Diaz，S.，Varki，N.M.undHedrick，S.M.(1991).Developmentalabnormalitiesintransgenicmiceexpressingasialicacid-specific9-O-acetylesterase.Cell6565-74.序列表110N.V.努特裡西阿(N.V.Nutricia)120從剛果錐蟲獲得的轉唾液酸酶(Trans-SialidasesobtainedfromTyrpanosomacongolense)130SCT052215-66150DE10258400.11512002-12-131604170PatentInversion3.121012111491212DNA213Trypanosomacongolense220221CDS222(1)..(1491)2234001accgacaccgttgctaaatacagcactgacggtgggagaacgtggaag48ThrAspThrValAlaLysTyrSerThrAspGlyGlyArgThrTrpLys151015agggaggttataattccgaatggtcgtgtggatgcccactactcccgc96ArgGluValIleIleProAsnGlyArgValAspAlaHisTyrSerArg202530gtcgttgatcccactgttgttgcgaagggtaataacatttatgttctc144ValValAspProThrValValAlaLysGlyAsnAsnIleTyrValLeu354045gttgggcggtacaatgtcacgcggggctactggcacaataggaacaac192ValGlyArgTyrAsnValThrArgGlyTyrTrpHisAsnArgAsnAsn505560aaggctggcatagccgattgggagcccttcgtgtacaagggcacggtg240LysAlaGlyIleAlaAspTrpGluProPheValTyrLysGlyThrVal65707580aacgtgggcacgaagggcaatgccactgatgtgtcgatcagctgggag288AsnValGlyThrLysGlyAsnAlaThrAspValSerIleSerTrpGlu859095aggactgcactgaagtcgctgtacaacttcccggtttcgggaagccct336ArgThrAlaLeuLysSerLeuTyrAsnPheProValSerGlySerPro100105110ggcacgcagttccttggaggggctgggggtggtgttgtaacatccaac384GlyThrGlnPheLeuGlyGlyAlaGlyGlyGlyValValThrSerAsn115120125gggacgattgtgctgccagtgcaggcaaggaacaaggccaaccgtgtt432GlyThrIleValLeuProValGlnAlaArgAsnLysAlaAsnArgVal130135140gtgagcatgatcctgtactcggctgacgatggaaagtcatggcacttt480ValSerMetIleLeuTyrSerAlaAspAspGlyLysSerTrpHisPhe145150155160gggaagggtgaggccggtgtaggcacgtccgaggctgccctcactgag528GlyLysGlyGluAlaGlyValGlyThrSerGluAlaAlaLeuThrGlu165170175tgggacggcaagctgctgattagtgcacgatccgatggtggacagggc576TrpAspGlyLysLeuLeuIleSerAlaArgSerAspGlyGlyGlnGly180185190taccgcatgatattcgaatcgagtgaccttggtgcgacgtggaaagag624TyrArgMetIlePheGluSerSerAspLeuGlyAlaThrTrpLysGlu195200205atgctcaacagcatctcccgcgtgattggcaactctccgggtcgcagt672MetLeuAsnSerIleSerArgValIleGlyAsnSerProGlyArgSer210215220ggtcctggcagctcgagtggcttcatcacggtgacagtggagggtgtg720GlyProGlySerSerSerGlyPheIleThrValThrValGluGlyVal225230235240cctgtgatgctgattacccacccgaagaaccttaagggctcgtattat768ProValMetLeuIleThrHisProLysAsnLeuLysGlySerTyrTyr245250255cgggaccgtctgcagctgtggatgacggacggcaatcgtatgtggcat816ArgAspArgLeuGlnLeuTrpMetThrAspGlyAsnArgMetTrpHis260265270gtcgggcaggtctctgagggcgacgataacagcgcttacagctccctg864ValGlyGlnValSerGluGlyAspAspAsnSerAlaTyrSerSerLeu275280285ctgtacactccggacggggtcctgtactgcttgcatgagcagaacatt912LeuTyrThrProAspGlyValLeuTyrCysLeuHisGluGlnAsnIle290295300gatgaggtgtacagccrccaccttgtgcgccttgtggacgagctgaaa960AspGluValTyrSerLeuHisLeuValArgLeuValAspGluLeuLys305310315320agcattaaatcaacggctctggtgtggaaggcacaggacgagcttctc1008SerIleLysSerThrAlaLeuValTrpLysAlaGlnAspGluLeuLeu325330335ctgggcaactgcctcccgggcgataaatacgatcccgggtgtgacggc1056LeuGlyAsnCysLeuProGlyAspLysTyrAspProGlyCysAspGly340345350atccccaccgctgggcttgccgggctgctggtaggacccctgacggag1104IleProThrAlaGlyLeuAlaGlyLeuLeuValGlyProLeuThrGlu355360365aagacgtggcccgacgcgtatcggtgcgtgaacgctgcaaccagcggc1152LysThrTrpProAspAlaTyrArgCysValAsnAlaAlaThrSerGly370375380gctgtgagcactgctgaaggcgtgcggctggacgtgggtggcggtggc1200AlaValSerThrAlaGluGlyValArgLeuAspValGlyGlyGlyGly385390395400catgttgtgtggcccgtgagtgagcaggggcaggaccagcggtattac1248HisValValTrpProValSerGluGlnGlyGlnAspGlnArgTyrTyr405410415tttaccaacagcgagttcacgcrcgccgtcacggtgcggtttgacgag1296PheThrAsnSerGluPheThrLeuAlaValThrValArgPheAspGlu420425430atgccacggggggagctcccgttgctggggtttgtgaaccgcaaaggg1344MetProArgGlyGluLeuProLeuLeuGlyPheValAsnArgLysGly435440445aaggtgaagaagatactgaaggtgtcgctgagcggggtggagtggctc1392LysValLysLysIleLeuLysValSerLeuSerGlyValGluTrpLeu450455460ctggcatacgggaatgagtacaacagcacagccgctgagccgctggac1440LeuAlaTyrGlyAsnGluTyrAsnSerThrAlaAlaGluProLeuAsp465470475480gtgaacgagagccaccaggtggtgctagcgcttcacgacgggatcgtc1488ValAsnGluSerHisGlnValValLeuAlaLeuHisAspGlyIleVal485490495tcc1491Ser2102211497212PRT213Trypanosomacongolense4002ThrAspThrValAlaLysTyrSerThrAspGlyGlyArgThrTrpLys151015ArgGluValIleIleProAsnGlyArgValAspAlaHisTyrSerArg202530ValValAspProThrValValAlaLysGlyAsnAsnIleTyrValLeu354045ValGlyArgTyrAsnValThrArgGlyTyrTrpHisAsnArgAsnAsn505560LysAlaGlyIleAlaAspTrpGluProPheValTyrLysGlyThrVal65707580AsnValGlyThrLysGlyAsnAlaThrAspValSerIleSerTrpGlu859095ArgThrAlaLeuLysSerLeuTyrAsnPheProValSerGlySerPro100105110GlyThrGlnPheLeuGlyGlyAlaGlyGlyGlyValValThrSerAsn115120125GlyThrIleValLeuProValGlnAlaArgAsnLysAlaAsnArgVal130135140ValSerMetIleLeuTyrSerAlaAspAspGlyLysSerTrpHisPhe145150155160GlyLysGlyGluAlaGlyValGlyThrSerGluAlaAlaLeuThrGlu165170175TrpAspGlyLysLeuLeuIleSerAlaArgSerAspGlyGlyGlnGly180185190TyrArgMetIlePheGluSerSerAspLeuGlyAlaThrTrpLysGlu195200205MetLeuAsnSerIleSerArgValIleGlyAsnSerProGlyArgSer210215220GlyProGlySerSerSerGlyPheIleThrValThrValGluGlyVal225230235240ProValMetLeuIleThrHisProLysAsnLeuLysGlySerTyrTyr245250255ArgAspArgLeuGlnLeuTrpMetThrAspGlyAsnArgMetTrpHis260265270ValGlyGlnValSerGluGlyAspAspAsnSerAlaTyrSerSerLeu275280285LeuTyrThrProAspGlyValLeuTyrCysLeuHisGluGlnAsnIle290295300AspGluValTyrSerLeuHisLeuValArgLeuValAspGluLeuLys305310315320SerIleLysSerThrAlaLeuValTrpLysAlaGlnAspGluLeuLeu325330335LeuGlyAsnCysLeuProGlyAspLysTyrAspProGlyCysAspGly340345350IleProThrAlaGlyLeuAlaGlyLeuLeuValGlyProLeuThrGlu355360365LysThrTrpProAspAlaTyrArgCysValAsnAlaAlaThrSerGly370375380AlaValSerThrAlaGluGlyValArgLeuAspValGlyGlyGlyGly385390395400HisValValTrpProValSerGluGlnGlyGlnAspGlnArgTyrTyr405410415PheThrAsnSerGluPheThrLeuAlaValThrValArgPheAspGlu420425430MetProArgGlyGluLeuProLeuLeuGlyPheValAsnArgLysGly435440445LysValLysLysIleLeuLysValSerLeuSerGlyValGluTrpLeu450455460LeuAlaTyrGlyAsnGluTyrAsnSerThrAlaAlaGluProLeuAsp465470475480ValAsnGluSerHisGlnValValLeuAlaLeuHisAspGlyIleVal485490495Ser2103211831212DNA213Trypanosomacongolense220221CDS222(1)..(831)2234003ttccgaattccctcacttgttgagatagacggcgtgcttatcgcgaca48PheArgIleProSerLeuValGluIleAspGlyValLeuIleAlaThr151015ttcgatacacgttatcttcgcgcttccgacagcagtctcatagacaca96PheAspThrArgTyrLeuArgAlaSerAspSerSerLeuIleAspThr202530gctatgaaatacagtgccgatcaggggaagacgtggaaaactgaaatc144AlaMetLysTyrSerAlaAspGlnGlyLysThrTrpLysThrGluIle354045ataataaaaaatgctagactaactgataacttttcccgcgtcgttgat192IleIleLysAsnAlaArgLeuThrAspAsnPheSerArgValValAsp505560ccaacggttgttgttaagggtgataacttgtttatttttgttgggagg240ProThrValValValLysGlyAspAsnLeuPheIlePheValGlyArg65707580tacaacacctcatctgccccatgggtctggcaggaaaacggtaaagac288TyrAsnThrSerSerAlaProTrpValTrpGlnGluAsnGlyLysAsp859095tgggatgtactgttgtacaaggccaaggtgaggaaggaatcagcgggt336TrpAspValLeuLeuTyrLysAlaLysValArgLysGluSerAlaGly100105110ggggtaccatcagtgagctttacatgggacgaacccctatacctgaag384GlyValProSerValSerPheThrTrpAspGluProLeuTyrLeuLys115120125catctgctcacctctgtcggtaaaatagacggcaggtccctcatacaa432HisLeuLeuThrSerValGlyLysIleAspGlyArgSerLeuIleGln130135140tacattggtggcgttggaaatggtattgtaacaccgaaaggtactatc480TyrIleGlyGlyValGlyAsnGlyIleValThrProLysGlyThrIle145150155160gtgtttccagttcaggttttaaacaccaacaaatccgtcatgaacatg528ValPheProValGlnValLeuAsnThrAsnLysSerValMetAsnMet165170175cttctgtattcaagtaacgacggaaaaacctgggagttcagcaaaact576LeuLeuTyrSerSerAsnAspGlyLysThrTrpGluPheSerLysThr180185190tccacacccgcgggcacaactgaggcctcccttgtttggtgggatgga624SerThrProAlaGlyThrThrGluAlaSerLeuValTrpTrpAspGly195200205caactacttctcacaagcagaacaactccggatgtcggcagccgcaaa672GlnLeuLeuLeuThrSerArgThrThrProAspValGlySerArgLys210215220gtatatttaacaagcgacctcggaacttcatggaatgaagcgatcgga720ValTyrLeuThrSerAspLeuGlyThrSerTrpAsnGluAlaIleGly225230235240agtatctctcgtgtaattggtaactcgcggtaccgtaacgatcctggg768SerIleSerArgValIleGlyAsnSerArgTyrArgAsnAspProGly245250255gggtcaggtagctcaattgccataactgtggagggagtaccggtgatg816GlySerGlySerSerIleAlaIleThrValGluGlyValProValMet260265270ctgattacccacccg831LeuIleThrHisPro2752104211277212PRT213Trypanosomacongolense4004PheArgIleProSerLeuValGluIleAspGlyValLeuIleAlaThr151015PheAspThrArgTyrLeuArgAlaSerAspSerSerLeuIleAspThr202530AlaMetLysTyrSerAlaAspGlnGlyLysThrTrpLysThrGluIle354045IleIleLysAsnAlaArgLeuThrAspAsnPheSerArgValValAsp505560ProThrValValValLysGlyAspAsnLeuPheIlePheValGlyArg65707580TyrAsnThrSerSerAlaProTrpValTrpGlnGluAsnGlyLysAsp859095TrpAspValLeuLeuTyrLysAlaLysValArgLysGluSerAlaGly100105110GlyValProSerValSerPheThrTrpAspGluProLeuTyrLeuLys115120125HisLeuLeuThrSerValGlyLysIleAspGlyArgSerLeuIleGln130135140TyrIleGlyGlyValGlyAsnGlyIleValThrProLysGlyThrIle145150155160ValPheProValGlnValLeuAsnThrAsnLysSerValMetAsnMet165170175LeuLeuTyrSerSerAsnAspGlyLysThrTrpGluPheSerLysThr180185190SerThrProAlaGlyThrThrGluAlaSerLeuValTrpTrpAspGly195200205GlnLeuLeuLeuThrSerArgThrThrProAspValGlySerArgLys210215220ValTyrLeuThrSerAspLeuGlyThrSerTrpAsnGluAlaIleGly225230235240SerIleSerArgValIleGlyAshSerArgTyrArgAsnAspProGly245250255GlySerGlySerSerIleAlaIleThrValGluGlyValProValMet260265270LeuIleThrHisPro27權利要求1.多核苷酸，其編碼具有轉唾液酸酶活性的蛋白，並可從剛果錐蟲(Trypanosomacongolense)分離得到。2.權利要求1的多核苷酸，其編碼具有轉唾液酸酶活性的蛋白並催化唾液酸從供體分子轉移到受體分子。3.權利要求1或2的多核苷酸，含有SEQIDNO1或3的核酸序列或其包含至少15個相連核苷酸殘基的片段；與其互補的多核苷酸和片段；及通過遺傳密碼的簡併來源於這些多核苷酸的核苷酸序列。4.寡核苷酸，其與上述權利要求之一的多核苷酸雜交，尤其是在嚴格條件下雜交。5.多核苷酸，其與權利要求4的寡核苷酸雜交，尤其是在嚴格條件下雜交，並編碼錐蟲屬微生物的基因產物。6.多肽，其由含有權利要求1-3或5任一項的核酸序列的多核苷酸編碼；或具有包含SEQIDNO2或4的至少10個相連的胺基酸的胺基酸序列；及其具有轉唾液酸酶活性的功能性等同物。7.轉唾液酸酶或其具有轉唾液酸酶活性的功能性等同物，其特徵在於具有下列之一的部分胺基酸序列TDTVKYSTDGGRTWKREVIIPNGR(SEQIDNO2的1到25位)FRIPSLVEIDGVLIATFDTRYLRASDSSLI(SEQIDNO4的1到30位)。8.轉唾液酸酶1(TS1)，其特徵在於具有至少一個下列特徵核苷酸序列SEQIDNO1胺基酸序列SEQIDNO2最適溫度30-40℃最適pHpH6.5-8.5等電點pH4-5天然分子量400-600kDa還原性SDS-PAGE中的分子量90kDa9.轉唾液酸酶2(TS2)，其特徵在於具有至少一個下列特徵核酸序列SEQIDNO3胺基酸序列SEQIDNO4最適溫度30-40℃最適pHpH6.5-8.5等電點pH5-6天然分子量120-180kDa還原性SDS-PAGE中的分子量90kDa10.權利要求1-9任一項的物質，源於剛果錐蟲。11.權利要求1-9任一項的物質，使用合成方法製備，尤其是使用化學、生物化學、酶學、基因技術和轉基因方法製備。12.權利要求8和9之一的轉唾液酸酶的功能性等同物，其胺基酸序列或部分序列根據Pearson和Lipman，Proc.Natl.Acad，Sci.(USA)85(8)，1988，2444-2448的算法與相應的SEQIDNO2或4的胺基酸序列或部分序列具有至少50％或至少60％，尤其是至少65％或至少70％，諸如例如75％，80％，85％，90％，95％，98％或99％的序列同一性；或含有一種或數種胺基酸殘基的一個或多個刪除、添加、置換或轉換，或顯示改變的糖基化模式；其中保持將唾液酸從供體轉移到受體的催化能力。13.表達盒，包含操作性連接至少一個調控性核酸序列的權利要求1到5任一項的核酸序列。14.重組載體，含有至少一個權利要求13的表達盒。15.原核或真核宿主，轉化有至少一個權利要求14的載體。16.權利要求13的表達盒，權利要求14的載體或權利要求15的宿主在重組生產具有轉唾液酸酶活性的蛋白中的應用。17.用酶使受體分子唾液酸化的方法，其特徵在於所述受體分子與含有唾液酸殘基的供體在權利要求6到12任一項的酶存在的條件下溫育，然後分離唾液酸化的受體。18.權利要求17的方法，其特徵在於具有至少一種下列特徵a)供體選自連接到寡糖、多糖、聚唾液酸、糖蛋白和糖脂，如尤其是乳鐵蛋白、糖基化乳清蛋白和酪蛋白及其片段的唾液酸，b)受體選自含有β-半乳糖的聚合物，諸如β-半乳糖寡糖，乳糖醇、乳糖酸、甲基-β-乳糖苷、乙醯乳糖胺、半乳糖吡喃糖苷、轉-半乳糖寡糖、聚半乳糖和其他末端結合β(1-3)或β(1-4)半乳糖的糖綴合物或半乳糖。19.權利要求6到12任一項的轉唾液酸酶，權利要求1到5任一項編碼所述酶的核酸序列或者根據權利要求18和19之一產生的唾液酸化產物在生產藥物、食品或食品添加劑中的應用，或生產預防或治療通過唾液酸控制的寄生蟲、細菌或病毒感染的食品添加劑中的應用；用於治療腫瘤疾病；用於治療與組織發育幹擾相關的疾病；用於治療免疫系統疾病；用於治療自身免疫反應；用於治療細胞通訊阻斷的疾病；或用於治療炎症。20.權利要求6到12任一項的轉唾液酸酶在開發錐蟲疫苗或開發用於治療或預防錐蟲感染的酶抑制劑中的應用。21.權利要求6到12任一項的轉唾液酸酶，權利要求1到5任一項編碼所述酶的核酸序列或權利要求18和19之一產生的唾液酸化產物在生產藥物、食品添加劑或食品以在酶作用前保護機體自身細胞或組織或糖蛋白中的應用。22.權利要求6到12任一項的轉唾液酸酶，權利要求1到5任一項編碼所述酶的核酸序列或權利要求17和18之一產生的唾液酸化產物在製備藥物、食品添加劑或食品以影響機體組織的發育和/或形態發生中的應用。23.權利要求6到12任一項的轉唾液酸酶的轉唾液酸酶活性的效應子，選自a)與權利要求6到12任一項的轉唾液酸酶作用的多肽配體；b)調節權利要求6到12任一項的轉唾液酸酶生物活性的低分子量效應子；以及c)權利要求1到5任一項的核酸序列的反義核酸序列。24.權利要求23的效應子在生產藥物或基因治療的裝置、食品添加劑或食品用於治療或預防與轉唾液酸酶活性相關的疾病中的應用。25.分離具有轉唾液酸酶活性的酶的方法，其中a)在培養基中培養剛果錐蟲，以及b)通過離子交換層析利用鹽梯度從培養物上清中分離所需產物，如果需要，其後可以進行等電聚焦、凝膠過濾、親核層析和/或蛋白沉澱。26.藥物或基因治療裝置，在藥物或基因治療合適的載體中含有至少一種權利要求23的效應子。全文摘要本發明涉及將唾液酸從供體分子轉移到受體分子的新酶(轉唾液酸酶)。所述酶分離自原生動物剛果錐蟲(Trypanosomacongolense)。本發明還涉及所述酶的功能性等同物，編碼所述酶及其功能性等同物的核酸序列和胺基酸序列，含有所述序列的表達構建體和載體，攜帶本發明的編碼核酸序列的重組微生物，重組生產本發明的酶的方法，從剛果錐蟲分離所述酶的方法，使用本發明的酶使受體分子酶促唾液酸化的方法，本發明的轉唾液酸酶的效應子，所述的核酸序列、胺基酸序列、酶、效應子或唾液酸化的產物在製備疫苗，藥物、食品或食品添加劑中的應用，及根據本發明的方法產生的後一種產物。文檔編號C12N5/00GK1726279SQ200380106002公開日2006年1月25日申請日期2003年12月11日優先權日2002年12月13日發明者喬基姆·施米特,甘特·伯姆,貝恩德·斯塔爾,羅蘭德·紹爾,埃韋林·蒂拉隆戈,西爾克·施拉德爾申請人:N·V·努特裡西阿