高產普魯蘭酶的重組枯草芽孢桿菌的構建方法與流程
2023-09-11 14:26:25 1
本發明屬於製糖工業用酶安全生產菌株的構建技術領域，涉及一種高產普魯蘭酶的重組枯草芽孢桿菌的構建方法。
背景技術：
普魯蘭酶是食品行業製糖生產技術中不可或缺的一類酶，主要由原核微生物分泌表達的糖鏈解枝酶。生產應用中多使用這類酶中的i型普魯蘭酶，其能夠專一性切開澱粉原料中由α-1,6糖苷鍵構成的支鏈分支，因此普魯蘭酶與其它澱粉水解酶共同作用，可以讓澱粉得以完全酶解，得到單分子葡萄糖分子，其在澱粉加工等食品行業中有著廣闊的市場前景。近年來，國內外對普魯蘭酶生產菌株的研發投入大量人力物力，許多工業酶生產企業先後開發出多種不同類型的重組生產菌株或誘變菌。在適合工業生產應用的多種普魯蘭酶蛋白中，來自長野芽胞桿菌(bacillusnaganoensis)的普魯蘭酶（bnpulb），其酶學特徵，包括最適反應溫度及ph等均非常適合澱粉工業加工的需求，但該酶的原產菌的表達水平不高，因此其基因常被用於構建於重組表達生產，在適合食品工業用酶的宿主細胞中。枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)因為其不表達致熱源和毒素因子，且其分泌途徑強大，因此被列為安全生產菌株（gras）之一，常被用於許多胞外酶發酵生產的首選宿主細胞。枯草芽孢桿菌有許多種，其各自的轉化性能、分泌能力等相關很大，其中a164以其營養需求不高，發酵密度高，蛋白分泌水平高等原因被視為蛋白生產的理想宿主細胞。
為了提高生產菌株的遺傳穩定性，外源表達通常被整合到宿主細胞的基因組中，而抗生素基因常用作篩選標記來使用，但是在食品工業中，攜帶抗生素基因的重組菌株會帶來生物安全性的問題，因此，有必要在完成外源基因的整合後再通過二次重組或者特異性重組的方式，將抗生素基因去除，得到無抗的生產菌株。
技術實現要素：
本發明的目的是提供一種高產普魯蘭酶的重組枯草芽孢桿菌cnp2的構建方法—通過兩次基因操作，將兩份拷貝普魯蘭酶基因整合到枯草芽孢桿菌的基因組中，並通過特異性重組系統，將抗生素基因去除，從而獲得了一株安全的普魯蘭酶高產菌株。
為了實現上述目的，本發明所採用的技術方案具體如下：
將人工合成的普魯蘭酶基因表達框tpu1及tpu2分別原位替代枯草芽孢桿菌的鹼性蛋白酶基因apre以及澱粉酶基因amye，並將抗性基因ermc和kan敲除後得到所述重組枯草芽孢桿菌，具體步驟如下：
a.設計並基因合成線性dna片段tpu1及tpu2；
b.以枯草芽孢桿菌a164為出發菌株進行分子構建，將tpu1與枯草芽孢桿菌a164感受態細胞混合，進行轉化，獲得具有紅黴素抗性的重組菌株cnp1；
所述枯草芽孢桿菌a164，最開始分離自德國馬爾堡，該菌種可以通過美國國家菌種保藏中心購買得到，菌種保藏號為atcc6051a；
c.將tpu2與枯草芽孢桿菌cnp1感受態細胞混合，進行轉化，獲得具有紅黴素/卡那黴素雙抗性的重組菌株cnp2ek；
d.轉入cre表達質粒，進行紅黴素/卡那黴素雙抗性的消除，得到重組枯草芽孢桿菌cnp2，即重組枯草芽孢桿菌。
所述基因表達框tpu1及tpu2分別經密碼子優化、基因合成後獲得，tpu1的核苷酸序列為：
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tpu2的核苷酸序列為：
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所術基因表達框tpu1和tpu2分別包含一份拷貝的普魯蘭酶編碼基因pulb，所述pulb基因的核苷酸序列如下：
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tacgttacatctcatgataactacacactttgggataaaatcgctcaatctaaccctaac1920
gattctgaagctgatcgtatcaaaatggatgaacttgctcaagctatcgttatgacatct1980
caaggcatccctttcatgcaaggcggcgaagaaatgcttcgtacaaaaggcggcaacgat2040
aactcttacaacgctggcgatgttgttaacgaattcgattggtctcgtaaagctcaatac2100
cctgatgttttcaactactactctggccttatccatcttcgtcttgatcatcctgctttc2160
cgtatgacaacagctaacgaaatcaactctcatcttcaattccttaactctcctgaaaac2220
acagttgcttacgaactttctgatcatgctaacaaagatacatggggcaacatcgttgtt2280
atctacaaccctaacaaaacagctgaaacaatcaaccttccttctggcaaatgggaaatc2340
aacgctacatctggcaaagttggcgaatctacacttggccaagctgaaggctctgttcaa2400
gttcctggcatctctatgatgatccttcatcaagaagtttctccttctgatggcaaataa2460。
所述基因表達框tpu1含有用於敲除apre基因的同源片斷，其核苷酸序列如下：
caaatgcgctgaatgcctatgttacaggaattggggccaataaacggattgtattgtggg60
atacgacgctgaacaaacttgacgattcagaaattctgtttattatgggccacgaaatgg120
gccattatgtcatgaagcacgtttacatcggtctggctggctatttgctcgtgtcgctcg180
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atataaaacacagtcaaaactttattacttcaaaacataatatagataaaataatgacaa1080
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aaatatttacaaaaaatcaatttaacaattccttaaaacatgcaggaattgacgatttaa1680
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tacatatgcccgggggtaccgaattccctgctggtcgccattttggctctttaccctctc1920
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aaatagacatgagtaaatgttcattatgctgaaatgtcatgcttttttaggttaaatgct2160
cctgagtcccggcaaattcctgtcgaaaaaattcgttcaaatgacctgcgtgtgcttccg2220
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aaataaactttacagaaaagggatagaatgaaaaaattattgagagggaggaagaaataa2340
gatgaacattcgccaagcaaagacatcagatgcggccgccattgcgccgctgtttaacca2400
atatcgggaattttatagacaggcatccgatttgcaaggggcagaggcttttttgaaagc2460
tcgtttggaaaatcacgagtctgttattttgatagcagaagaaaatg2507；
所述基因表達框tpu2含有用於敲除amye基因的同源片斷，其核苷酸序列如下：
atgtttgcaaaacgattcaaaacctctttactgccgttattcgctggatttttattgctg60
tttcatttggttctggcaggaccggcggctgcgagtgctgaaacggcgaacaaatcgaat120
gagcttacagcaccgtcgatcaaaagcggaaccattcttcatgcatggaattggtcgttc180
aatacgttaaaacacaatatgaaggatattcatgatgcaggatatacagccattcagaca240
tctccgattaaccaagtaaaggaagggaatcaaggagataaaagcatgtcgaactggtac300
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tttaaagaaatgtgtgcagccgctgaagaatatggcataaaggtcattgttgacgcggtc420
atcaatcataccaccagtgattatgccgcgatttccaatgaggttaagagtattccaaac480
tggacacatggaaacacacaaattaaaaactggtctgatcgcctgcactgcagggatcca540
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tgaagattagatgctataattgttattaaaaggattgaaggatgcttaggaagacgagtt660
attaatagctgaataagaacggtgctctccaaatattcttatttagaaaagcaaatctaa720
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aggctattggtgtttatggctctcttggtcgtcagactgatgggccctattcggatattg900
agatgatgtgtgtcatgtcaacagaggaagcagagttcagccatgaatggacaaccggtg960
agtggaaggtggaagtgaattttgatagcgaagagattctactagattatgcatctcagg1020
tggaatcagattggccgcttacacatggtcaatttttctctattttgccgatttatgatt1080
caggtggatacttagagaaagtgtatcaaactgctaaatcggtagaagcccaaacgttcc1140
acgatgcgatttgtgcccttatcgtagaagagctgtttgaatatgcaggcaaatggcgta1200
atattcgtgtgcaaggaccgacaacatttctaccatccttgactgtacaggtagcaatgg1260
caggtgccatgttgattggtctgcatcatcgcatctgttatacgacgagcgcttcggtct1320
taactgaagcagttaagcaatcagatcttccttcaggttatgaccatctgtgccagttcg1380
taatgtctggtcaactttccgactctgagaaacttctggaatcgctagagaatttctgga1440
atgggattcaggagtggacagaacgacacggatatatagtggatgtgtcaaaacgcatac1500
cattttgaacgatgacctctaataattgttaatcatgttggttacgtatttattaacttc1560
tcctagtattagtaattatcatggctgtcatcccgggataacttcgtatagcatacatta1620
tacgaacggtacatatgcccgggggtaccgaattccctgctggtcgccattttggctcga1680
catggatgagcgatgatgatatccgtttaggctgggcggtgatagcttctcgttcaggca1740
gtacgcctcttttcttttccagacctgagggaggcggaaatggtgtgaggttcccgggga1800
aaagccaaataggcgatcgcgggagtgctttatttgaagatcaggctatcactgcggtca1860
atagatttcacaatgtgatggctggacagcctgaggaactctcgaacccgaatggaaaca1920
accagatatttatgaatcagcgcggctcacatggcgttgtgctggcaaatgcaggttcat1980
cctctgtctctatcaatacggcaacaaaattgcctgatggcaggtatgacaataaagctg2040
gagcgggttcatttcaagtgaacgatggtaaactgacaggcacgatcaatgccaggtctg2100
tagctgtgctttatcctgatgatattgcaaaagcgcctcatgttttccttgagaattaca2160
aaacaggtgtaacacattctttcaatgatcaactgacgattaccttgcgtgcagatgcga2220
atacaacaaaagccgtttatcaaatcaataatggaccagacgacaggcgtttaaggatgg2280
agatcaattcacaatcggaaaaggagatccaatttggcaaaacatacaccatcatgttaa2340
aaggaacgaacagtgatggtgtaacgaggaccgagaaatacagttttgttaaaagagatc2400
cagcgtcggccaaaaccatcggctatcaaaatccgaatcattggagccaggtaaatgctt2460
atatctataaacatgatgggagccgagtaattgaattgaccggatcttggcctggaaaac2520
caatgactaaaaatgcagacggaatttacacgctgacgctgcctgcggacacggatacaa2580
ccaacgcaaaagtgatttttaataatggcagcgcccaagtgcccggtcagaatcagcctg2640
gctttgattacgtgctaaatggtttatataatgactcgggcttaagcggttctcttcccc2700
attga2705。
所述基因表達框tpu1及tpu2均含有普魯蘭酶分泌信號肽編碼序列以及用於重組的同源臂序列，tpu1中所述信號肽的核苷酸序列如下：
atgcttacattccatcgtatcatccgtaaaggctggatgttccttcttgctttccttctt60
acagcttctcttttctgccctacaggccaacatgctaaagctgctgct108；
tpu2中所述信號肽的核苷酸序列如下：
atgcttatcaacaaatctaaaaaattcttcgttttctctttcatcttcgttatgatgctt60
tctctttctttcgttaacggcgaagttgctaaagctgct99。
所述基因表達框tpu1中含有啟動子pamy-cryiii及澱粉酶分泌的信號肽序列spamyl，核苷酸序列如下：
atcgattgtttgagaaaagaagaagaccataaaaataccttgtctgtcatcagacagggt60
attttttatgctgtccagactgtccgctgtgtaaaaaaaaggaataaaggggggttgaca120
ttattttactgatatgtataatataatttgtataagaaaatggagtcgaaacgtaagatg180
aaaccttagataaaagtgctttttttgttgcaattgaagaattattaatgttaagcttaa240
ttaaagataatatctttgaattgtaacgcccctcaaaagtaagaactacaaaaaaagaat300
acgttatatagaaatatgtttgaaccttcttcagattacaaatatattcggacggactct360
acctcaaatgcttatctaactatagaatgacatacaagcacaaccttgaaaatttgaaaa420
tataactaccaatgaacttgttcatgtgaattatcgctttatttaattttctcaattcaa480
tatataatatgccaatacattgttacaagtagaaattaagacacccttgatagccttact540
atacctaacatgatgtagtattaaatgaatatgtaaatatatttatgataagaagcgact600
tatttataatcattacatatttttctattggaatgattaagattccaatagaatagtgta660
taaattatttatcttgaaaggagggatgcctaaaaacgaagaacattaaaaacatatatt720
tgcaccgtctaatggatttatgaaaaatcattttatcagtttgaaaattatgtattatgc780
ttacattccatcgtatcatccgtaaaggctggatgttccttcttgctttccttcttacag840
cttctcttttctgccctacaggccaacatgctaaagctgctgct884；
所述基因表達框tpu2中含有啟動子pxyla-cryiii及來自幾丁質酶分泌的信號肽序列spchit，核苷酸序列如下：
tagaatctaatattataactaaattttctaaaaaaaacattggaatagacatttattttg60
tatatgatgaaataaagttagtttattggataaacaaactaactttattaaggtagttga120
tggataaacttgttcacttaaatcaatcgaaacgtaagatgaaaccttagataaaagtgc180
tttttttgttgcaattgaagaattattaatgttaagcttaattaaagataatatctttga240
attgtaacgcccctcaaaagtaagaactacaaaaaaagaatacgttatatagaaatatgt300
ttgaaccttcttcagattacaaatatattcggacggactctacctcaaatgcttatctaa360
ctatagaatgacatacaagcacaaccttgaaaatttgaaaatataactaccaatgaactt420
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ggagggatgcctaaaaacgaagaacattaaaaacatatatttgcaccgtctaatggattt720
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attcttcgttttctctttcatcttcgttatgatgctttctctttctttcgttaacggcga840
agttgctaaagctgct856。
本發明的有益效果是：與現有的菌株誘變或者分子生物學構建技術相比，本發明綜合利用枯草芽孢桿菌表達系統的特點和優勢，以基因設計結合基因合成的方式獲取線性的人工dna片斷；dna片斷中含有分子生物學操作後期所需的抗性基因及重組序列，利用不同抗性基因的篩選，獲得雙拷貝的表達基因，再利用特異性重組，一次性地將抗性基因敲除；設計的表達元件中充分利用了rna穩定因子、高效分泌肽等元素，將重組枯草芽孢桿菌高分泌的優勢儘量發揮出來；最終得到產普魯蘭酶的、無抗的重組枯草芽孢桿菌cnp2，該重組菌株經生物反應器發酵證實可以高產普魯蘭酶，發酵32h的酶活大於1000u/ml。
附圖說明
圖1為重組枯草芽孢桿菌的構建示意圖；
圖2為重組枯草芽孢桿菌cnp2的發酵酶活隨發酵時間變化的示意圖。
具體實施方式
下面結合實施例對本發明的技術方案進行詳細說明。以下採用的試劑和生物材料如未特別說明，均為商業化產品。
實施例1：重組枯草芽孢桿菌cnp2的構建
1.整合型dna的獲得
普魯蘭酶表達的操縱子有兩個，第一個pulb1包括人工串聯啟動子pamy-cryiii、密碼子優化的澱粉酶分泌的信號肽序列spamyl以及密碼子優化的普魯蘭酶編碼基因pulb，pulb序列見seqidno.3，pulb1序列見seqidno.10；第二個pulb2包括人工串聯啟動子pxyla-cryiii、密碼子優化的幾丁質酶分泌的信號肽序列spchit以及密碼子優化的普魯蘭酶編碼基因pulb，pulb2序列見seqidno.11。
用於apre敲除的重組臂及紅黴素抗性片段的基因表達框apr-erm-apr如seqidno.8所示，用於amye敲除的重組臂及卡那黴素抗性片段的基因表達框amy-kan-amy如seqidno.9所示。
把pulb1插入apr-erm-apr的psti和bamhi位點，通過人工合成的方式獲得基因表達框tpu1，把pulb2插入amy-kan-amy的psti和bamhi位點，通過人工合成的方式獲得基因表達框tpu2。tpu1和tpu2的序列分別見seqidno.4和seqidno.5。
2.重組枯草芽孢桿菌的構建
首先挑取a164單菌落於含有3ml液體lb培養基的試管中，37℃、200r/min過夜培養；然後取3ml過夜培養菌液轉接到新鮮的40ml富集培養基中37℃、200r/min培養至od600=0.85-0.95，富集培養基的配方為lb+90g/l山梨醇；再將菌液冰水浴10min，然後5000g，5min，4℃離心後收集菌體；接著用30ml預冷的電轉培養基，重新懸浮菌體，5000g離心5min，4℃離心去上清，如此操作3次，電轉培養基的配方為10g/l葡萄糖+92.5g/l甘露醇+90g/l山梨醇；洗三次後，利用未完全除去的電轉培養基將菌體重懸後，然後分裝到1.5ml無菌離心管中，每管分裝100μl，冰上操作；最後在100μl感受態細胞中加入2μg線性dna片段tpu1，冰上孵育2min，加入預冷的電轉杯(1mm)中，設置電壓2.5kv，電擊一次；電擊完畢取出杯子並立即加入500μl復甦培養基，37℃、200r/min培養，復甦培養基的組分為lb+90g/l山梨醇+70g/l甘露醇；復甦3h後，分別塗紅黴素抗性板，37℃恆溫箱過夜培養，其中，紅黴素(erm)濃度為10μg/ml。
對篩選得到的轉化子，採用菌落pcr的方式進行驗證，所用的引物序列見下。
上遊引物1p-f：cacccttgatagccttactatacctaac
下遊引物1p-r：gatgttatcagaagggtaagaagg
反應體系如下：
pcr程序如下：
1)98℃，2min
2)98℃，30sec
3)52℃，30sec
4)72℃，30sec
5)循環從2)到4)，30次
6)72℃，5min
7)4℃，保存。
經驗證為陽性的轉化子命名為cnp1，然後採取上述相同的轉化方法，用線性片段tpu2轉化cnp1，紅黴素和卡那黴素雙抗性板篩選，其中，卡那黴素(kan)的濃度為10μg/ml。
對篩選得到的轉化子，採用菌落pcr的方式進行驗證，所用的引物序列見下。
上遊引物2p-f：cggacggactctacctcaaatgc
下遊引物2p-r：gcgttagaaacagcaggttgagc
反應體系如下：
反應程序和cnp1的驗證方法一致。
經驗證為陽性的轉化子命名為cnp2ek，然後採用上述相同的方法，用cre酶表達質粒pmk4-cre轉化cnp2ek，氯黴素抗性板篩選，其中，氯黴素(cm)的濃度為5μg/ml。
對於篩選得到的轉化子，採用傳代的方式丟失質粒pmk4-cre，取10μl菌液接種到新鮮的3ml液體lb培養基中，37℃、200r/min培養，每隔8h轉接1次，總共轉接5次，然後取培養液梯度稀釋至106倍，塗lb平板，置於恆溫培養箱37℃、200r/min培養；待長出新鮮菌落，分別印章至氯黴素、紅黴素和卡那黴素平板進行抗性反篩。在3種抗性平板上均不能生長的菌，其在無抗lb平板上對應的菌落為消除質粒的菌株，為目的菌株。再對其進行菌落pcr驗證，第一對引物為1p-f/1p-r，第二對引物為2p-f/2p-r。經驗證均為陽性的菌株，命名為cnp2，為帶有兩份拷貝pulb的無抗的普魯蘭酶生產菌株。
實施例2：重組枯草芽孢桿菌cnp2的發酵產酶
以重組枯草芽孢桿菌cnp2為生產菌種，做搖瓶發酵：用接種環挑取重組枯草芽孢桿菌cnp2接種到裝有25ml液體培養基的200ml擋板瓶中，37℃、200r/min進行發酵培養，其中，培養基的主要組分為玉米漿、麥芽糖漿、葡萄糖、酵母粉和無機鹽離子等。發酵20h取樣測定酶活，普魯蘭酶酶活測定方法為：取1.0ml的ph=4.5的醋酸-醋酸鈉緩衝液配製酶樣或稀釋樣品（對照組為沸水浴滅活的樣品），將其加到1.0ml0.5%的普魯蘭多糖溶液中，於60℃水浴鍋中水浴30min，再加入3,5-二硝基水楊酸溶液（dns）3.0ml，沸水浴10min，取出後流水冷卻，於550nm測吸光值。一個酶活力單位定義為：在上述反應條件下，每分鐘分解普魯蘭多糖釋放出1μmol葡萄糖所需的酶量。測得的搖瓶發酵20h的酶活力約為225u/ml。
採用上罐補料的方式進行發酵，在20l罐中，以流加麥芽糖漿和氨水控制發酵罐的ph在5.80左右，通風攪拌，溶氧控制為30%左右，還原糖控制為10g/l左右。取樣並測定酶活，普魯蘭酶的活力隨發酵時間變化曲線的結果如圖例2所示。其中，在32h左右，酶活力超過1000u/ml。
上述僅為本發明的部分優選實施例，本發明並不僅限於實施例的內容。對於本領域中的技術人員來說，在本發明技術方案的構思範圍內可以有各種變化和更改，所作的任何變化和更改，均在本發明保護範圍之內。
sequencelisting
白銀賽諾生物科技有限公司
高產普魯蘭酶的重組枯草芽孢桿菌的構建方法
12
patentinversion3.3
1
108
dna
artificial
spchit
1
atgcttacattccatcgtatcatccgtaaaggctggatgttccttcttgctttccttctt60
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2
99
dna
artificial
spamyl
2
atgcttatcaacaaatctaaaaaattcttcgttttctctttcatcttcgttatgatgctt60
tctctttctttcgttaacggcgaagttgctaaagctgct99
3
2460
dna
artificial
pulb
3
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5885
dna
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