用於成像的基於聚蘋果酸的納米綴合物的製作方法

2023-09-20 19:30:35 2

用於成像的基於聚蘋果酸的納米綴合物的製作方法
【專利摘要】納米綴合物，該納米綴合物包括基於聚蘋果酸的分子骨架，連接到所述骨架上的一個或多個成像部分和一個或多個靶向模塊。至少一個成像部分和至少一個靶向模塊連接到所述基於聚蘋果酸的分子骨架上。納米綴合物的合成方法包括提供包含多個羧基側基的聚蘋果酸。所述方法使含有巰基和胺基酸基團的化合物起反應，使巰基通過羧基側基加成到聚蘋果酸上，以形成活化的聚蘋果酸。所述方法使至少一個含有巰基結合基團的成像部分與活化的聚蘋果酸反應以形成綴合物前體。所述方法可以包括對受試者給藥包括基於聚蘋果酸的分子骨架、至少一個成像部分和至少一個靶向模塊的納米綴合物。
【專利說明】用於成像的基於聚蘋果酸的納米綴合物
[0001]本申請要求2011年4月6日提交的美國臨時申請N0.61/472,362的優先權，該臨時申請在此以全文援引方式納入本文。
[0002]政府權力
[0003]本發明的一部分是在來自美國國立衛生研究院的R01CA123495和U01CA151815的資助支持下完成的。政府對本發明享有一定的權利。
【技術領域】
[0004]本發明涉及納米綴合物，所述納米綴合物含有連接到基於聚蘋果酸的分子骨架上的成像部分和靶向模塊。本發明還涉及合成納米綴合物的方法，以及通過對受試者進行納米綴合物的給藥來使藥物靶向病變細胞或組織的方法。
【背景技術】
[0005]影像診斷(diagnostic imaging)允許通過確認不同病理狀況的性質來避免不必要的侵入性外科手術幹預，所述不同病理狀況包括:水腫和腫瘤的區分，多發性轉移病灶(multiple metastases)的檢測,或者精神病或痴呆症的檢測。非侵入性成像可能特別適用於對通過許多常規的探測方法(例如活檢和光成像)難以達到的人腦部的疾病或病理狀況的診斷。阿爾茨海默症(Alzheimer disease,AD)是在65歲以上的人群中發現的最常見的痴呆症類型，其診斷也需要非侵入性成像。
[0006]最古老的診斷AD的方法是死後通過使用小化合物證實人體組織中的阿爾茨海默症斑塊，所述小化合物能夠與所述斑塊特異性結合，並通過體外染色或體內的放射性閃爍掃描能夠使其可視化(Newberg A B et al.2006 J Nuc Med 47:748)。
[0007]在小鼠模型可用於 AD和癌症(如三陰性乳腺癌，HER2陽性乳腺癌，成膠質細胞瘤)之後，體內成像方法逐漸成熟起來。體內成像方法是利用可特異性結合病變細胞或組織的組分的螢光劑或標記抗體，或者使用正電子發射斷層掃描(PET;Raymond SB et al.2008Plos One 3:e2175, I ；Klunk WE et al.2004 Annals Neurol 55:306)。
[0008]雖然上述其中的一些方法可以證實病變組織的存在，但是其應用需要較長的曝光時間，且解析度不足以清楚地區分細節，或小的阿爾茨海默症斑塊。突破性的成像技術使用磁共振成像(MRI)。由於含有禮(Gd)的高解析度造影劑(contrast agents)的應用，MRI成為最先進的非侵入性的成像系統之一。然而，MRI不能區分發生在腦內的病理狀況。例如，MRI不能區分癌症的類型，甚至不能區分癌症與其他惡性腫瘤。許多體內成像方法，例如MRI，效率低的原因源於造影劑(例如，釓)不能穿越血腦屏障(BBB)，並且造影劑會通過腎臟被迅速清除。

【發明內容】

[0009]—方面，本發明涉及一種納米綴合物(nanoconjugate),所述納米綴合物含有基於聚蘋果酸的分子骨架、至少一個成像部分(imaging moiety)和至少一個祀向模塊(targeting module)。所述至少一個成像部分中的一個或多個以及所述至少一個祀向模塊中的一個或多個綴合到所述基於聚蘋果酸的分子骨架上。
[0010]一方面，本發明涉及一種用於促進受試者的細胞或組織成像的試劑盒。所述試劑盒包括納米綴合物，所述納米綴合物含有基於聚蘋果酸的分子骨架、至少一個成像部分和至少一個靶向模塊。所述至少一個成像部分中的一個或多個以及所述至少一個靶向模塊中的一個或多個綴合到所述基於聚蘋果酸的分子骨架上。
[0011]一方面，本發明涉及一種靶向受試者的細胞或組織的方法。該方法包括對受試者進行組合物的給藥，所述組合物包括基於聚蘋果酸的分子骨架、至少一個成像部分和至少一個靶向模塊。所述至少一個成像部分中的一個或多個以及所述至少一個靶向模塊中的一個或多個綴合到所述基於聚蘋果酸的分子骨架上。
[0012]一方面，本發明涉及一種合成納米綴合物的方法。該方法包括:提供具有多個羧基側基(pendant carboxyl group)的聚蘋果酸。該方法還包括:使含有巰基和胺基酸基團的化合物反應，通過羧基側基使巰基添加到聚蘋果酸上，以形成活化的聚蘋果酸。該方法包括使含有巰基結合基團的至少一個成像部分與活化的聚蘋果酸反應以形成綴合物前體。該方法還包括使含有巰基結合基團的至少一個靶向模塊與所述綴合物前體反應。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0013]結合附圖閱讀將會更好地理解以下優選實施方式的詳細說明。出於圖解的目的，圖中顯示的是目前優選的實施方式。然而，應當理解的是，本發明並不局限於這些具體的設計和方法。附圖中:
[0014]圖1為設計的便於對轉移到腦部的三陰性乳腺癌(TNBC)進行成像的納米綴合物的示意圖。
[0015]圖2 為,L (Gd)-1, 4, 7, 10-四氣環十二燒(tetraazocyclododecane)-1, 4, 7, 10-四乙酸(DOTA)胺的合成圖。
[0016]圖3為Gd-DOTA-Polycefin納米綴合物的合成圖。
[0017]圖4顯示了含有西妥昔單抗的Gd-DOTA-Polycefin納米綴合物的HPLC洗脫曲線。
[0018]圖5為一組線性圖，顯示了含有聚蘋果酸(P )，12%的Gd-DOTA和15%的2_巰基-乙燒-1-胺(MEA)的Polycefin納米綴合物的Tl-弛豫率的計算。
[0019]圖6為一組線性圖，顯示了通過飽和酶聯免疫吸附試驗(ELISA)測定對小鼠轉鐵蛋白受體(抗MsTfR單抗(抗-MsTfR mAb))特異性的單克隆抗體的親和力。實線表示游離的抗-MsTfR mAb。虛線表示結合到Gd-DOTA-Polycefin納米綴合物上的MsTfR mAb,所述綴合物還含有西妥昔單抗和AlexaFluor 680。
[0020]圖7為一組螢光激活細胞分選(FACS)柱形圖，顯示了羅丹明標記的含西妥昔單抗的Gd-DOTA-Polycefin納米綴合物與在MDA-MB-468細胞中表達的表皮生長因子受體(EGFR)的結合，及其與游離的西妥昔單抗和磷酸鹽緩衝液(PBS)的對比。
[0021]圖8為顯示了具有TNBC轉移性腫瘤的小鼠的腦切片的一組MRI圖像。左側圖像是未對動物進行造影劑給藥的條件下獲得的。右側圖像是動物接受Polycefin-Gd納米綴合物靜脈注射後獲得的。比例尺=50 μ m。
[0022]圖9為顯示了具有TNBC轉移性腫瘤的小鼠腦中腫瘤的切片的一組MRI圖像。上部圖像是對動物進行市售的Gd (III)增強劑給藥後15分鐘(左)和I小時45分鐘(右)後獲得的。下部圖像是對動物進行含有聚蘋果酸、Gd-DOTA、MsTfR、西妥昔單抗和Alexa Fluor680染料的Polycefin納米綴合物給藥後15分鐘(左)和3小時15分鐘(右)後獲得的。比例尺=50 μ m。
[0023]圖1OA和IOB為注射含有Gd-DOTA、MsTfR、西妥昔單抗和Alexa Fluor 680染料的Polycefin-Gd-DOTA納米綴合物的動物的Xenogen突光圖像。
[0024]圖11是一組線性圖，示出了對動物注射臨床使用的Gd (III)(空心圓圈)和含有Gd-DOTA, MsTfR，西妥昔單抗和Alexa Fluor 680的納米綴合物(實心圓圈)後，腫瘤的MRI動力學。
[0025]圖12A和12B顯示了對受試者注射臨床使用的Gd(III)(圖12A)和含有Gd-DOTA、MsTfR、西妥昔單抗和Alexa Fluor 680的Gd-DOTA-Polycefin納米綴合物(圖12B)後，具有腫瘤的腦部(實線)與健康的腦部(虛線)比較的MRI動力學。
[0026]圖13A到13D為一組示意圖,說明了設計的用於祀向原發性腦瘤(primary brain)和轉移至腦部的TNBC (圖13A)、轉移至腦部的HER2陽性乳腺癌(圖13B)和膠質細胞瘤(圖13C)的納米綴合物，以及與缺乏特異性靶向模塊的對照分子(圖13D)的比較。
[0027]圖14為設計的便於阿爾茨海默症斑塊成像的納米綴合物的示意圖。
[0028]圖15為薑黃素-PEGltl。。-胺的合成圖。
[0029]圖16示出了在聚蘋果酸上薑黃素和Gd-DOTA模塊的結合。
[0030]圖17為用20 μ M的游離薑黃素染色(右)和20μ M的Polycef in_薑黃素納米綴合物染色(左)的具有AD的人 腦部切片(頂部圖片)和正常的人腦部切片(底部圖片)的一組螢光顯微鏡照片。
【具體實施方式】
[0031]以下描述中使用的某些術語只為方便而非限制。詞語「右」，「左」，「上部」和「下部」用於指代在所參照的附圖中的方向。
[0032]在權利要求中和說明書的相應部分中所用的詞語「一種」和「一個」，除非特別聲明外，被定義為包括一個或多個所引用的項目。該術語包括上面具體提到的詞語、它們的衍生詞，以及相似詞(similar import)。短語「至少一個」後面跟有兩個或兩個以上的項目，例如「A，B或C」時，是指單獨的A，B或C及其任意組合。
[0033]一種實施方式提供了一種納米綴合物，所述納米綴合物可以含有基於聚蘋果酸的分子骨架、一種或多種成像部分和一種或多種靶向模塊。至少一種所述成像部分和至少一種所述靶向模塊可以綴合到基於聚蘋果酸的分子骨架上。所有的成像部分都可以綴合到所述基於聚蘋果酸的分子骨架上。所有的靶向模塊都可以綴合到所述基於聚蘋果酸的分子骨架上。
[0034]綴合(conjugate)是指共價結合。
[0035]在一種實施方式中，所述納米綴合物可以是Polycefin。本文中所使用的術語「Polycefin」是指以聚蘋果酸作為基礎、附著各種特定殘基的用於治療性靶向的化合物家族。Polycefin可以包括來源於黏菌的聚蘋果酸。Polycefin的大小可以為20_30nm並可以作為藥物。Polycefin可以被設計為轉運其它治療性分子。聚蘋果酸(PMLA)可以包括含有酯鏈主鏈(main chain ester linkage)的同聚物。聚蘋果酸可以從多頭絨泡菌(Physarum polycefallum)的培養物中獲得。所述聚蘋果酸可以具有任意的長度和任意的分子量。所述聚蘋果酸可以具有的分子量為10、20、30、40、50、60、70、80、90、95、100kDa或更大。所述聚蘋果酸可以具有在下述任意兩個分子量之間範圍的分子量:10、20、30、
40、50、60、70、80、90、95或lOOkDa。所述聚蘋果酸可以具有下述屬性中的至少一種:可生物降解和具有高分子彈性、溶於水(當電離時)和有機溶劑(以其酸的形式)、無毒，或無免疫原性(Lee Bs et al., ffater-soluable aliphatic polyesters:poly (malic acid)s,in:Biopolymers, vol.3a(Doi Y, Steinbuchel A eds., pp 75-103, ffiley-VCH, New York2002，在此以全文援引的方式納入本文)。
[0036]在一種實施方式中，聚蘋果酸可被用作攜帶靶向模塊的分子骨架。在一種實施方式中，靶向模塊可具有除靶向以外的功能。可用於本發明實施方式的基於聚蘋果酸的分子骨架在以下專利申請中有所記載:2004年12月3日提交的PCT申請N0.PCT/US04/40660、2009年4月10日提交的PCT申請N0.PCT/US09/40252、2010年12月10日提交的PCT申請 N0.PCT/US10/59919.2010 年 12 月 30 日提交的 PCT 申請 N0.PCT/US10/62515、2007 年 3月12日提交的美國申請N0.10/580,999(授權的美國專利為7，935，677)，以及2010年9月28日提交的美國申請N0.12/935，110，所有上述PCT申請和美國申請在此以全文援引的方式納入本文。
[0037]基於聚蘋果酸的分子骨架可以是具有至少兩個或多個連接到基於聚蘋果酸的分子骨架上的靶向模塊的分子。所述靶向模塊也可以將藥物或其它治療實體轉運至靶組織。
[0038]在一種實施方式中，所述基於聚蘋果酸的分子骨架可以基於聚(β-L-蘋果酸)。聚(β -L-蘋果酸)可以通過其羧基，以化學方法與各種模塊以確定的比例綴合。
[0039]在一種實施方式中，具有基於聚蘋果酸的分子骨架的納米綴合物可以高特異性地靶向細胞或組織。作為藥物載體的納米綴合物的高特異性可以在靶組織中引起增強的通透性和保留(可能是由於其較 大的分子量，所述分子量可大於20000) (Duncan R.1999Research Focus 2:441;Seymour Lff et al., 1995 Eur J Cancer Res 31A:766)。
[0040]在一種實施方式中，所述一個或多個成像部分可以包括適宜的有助於成像過程的化合物。所述化合物可以是造影劑。成像可以是用作臨床診斷工具的任何成像過程。成像可以是MRI過程，所述MRI過程可以對光學不透明的物體進行非侵入性成像，並且可以提供在高空間解析度下軟組織之間的對比。在所述一個或多個成像部分中的成像部分可以為用於MRI的螯合分子。所述螯合分子可以是但不限於:1，4，7，10-四氮環十二烷-1，4，7，10-四乙酸(1,4，7，10-tetraazocyclododecane-l, 4, 7, 10-tetraacetic acid,D0TA)、二苯並-D0TA(dibenzo-DOTA)、二乙烯三胺五乙酸(DTPA)、1，4，7，10-四氮環十二烷 _1，4，7，10-四(2-丙酸)(DOTMA)U, 4, 8, 11-四氮環十四烷 _1，4，8，11-四乙酸(1，4，8，11-tetrazacyclotetradecane-1, 4, 8, 11-tetra acetic acid, TETA)、1，4，7，-三羧基甲基-1, 4，7，10-四氮環十二烷-三乙酸(D03A)、1，4，7，10-四氮環十二烷_1_(2-羥丙基)-4，7，10-三乙酸(HP-D03A)、乙二胺四乙酸(EDTA)、雙-2 (羥基苯甲基)-乙二胺二乙酸(bis_2 (hydroxybenzyl)-ethylenediamine diacetic acid,HBED)或 1，4，7_ 三氮環壬燒-N, N ' , N "-三乙酸(1，4，7-triazacyclo-nonane N, N' ，N" -triacetic acid, ΝΟΤΑ)。
[0041]在一種實施方式中，所述螯合分子可以與順磁性離子形成複合物。順磁性離子可以是與磁場平行或反相平行的磁化的金屬離子。所述順磁性離子可以是順磁金屬的多價離子。所述順磁金屬可以選自但不限於鑭系元素和過渡金屬元素。過渡金屬元素可以包括但不限於錳、鐵、鉻、鎳和鈷。鑭系元素可以包括但不限於鐠、釹、釤、釓、鋱、鏑、欽、鉺、銪及鐿。
[0042]在一種實施方式中，所述造影劑可以是釓，釓是一種高度順磁的離子。該實施方式可以應用於MRI過程。釓(Gd)可以與螯合分子結合。釓可以與(2,2' ,2" -(2-(2-(2-疏基乙胺基)_2_氧乙基)_1，4，7-四氮環十二燒-1，4，7-二基)三乙酸)(2,2' ,2〃 -(2-(2-(2-mercapto ethylamino)-2-oxoethyl)-1, 4, 7-tetraaza-cyclododecane-1, 4, 7-triyl) triacetic acid, DOTA)結合，並可以形成 Gd-DOTA 複合物。Gd-DOTA可以形成穩定的造影劑。Gd-DOTA可用於人類。
[0043]本文中的納米綴合物具有高分子量，並且包括可以改善BBB穿透效果和延長循環時間的Gd-DOTA分子。由於納米綴合物的高分子量，可以改善在腦腫瘤區域內或具有病理狀況的其他區域內造影劑的積累。
[0044]所述連接到基於聚蘋果酸的分子骨架上的一個或多個靶向模塊可以包括除靶向之外的生物活性。所述一個或多個靶向模塊可以被設計為進行藥物前體的送遞。所述一個或多個靶向模塊可以包括可釋放的在細胞質中開始生效的功能模塊。所述一個或多個靶向模塊可以被設計為，通過能夠與細胞表面結合，指導納米綴合物至特定組織。所述一個或多個靶向模塊可以被設計為有助於納米綴合物通過核內體內化到靶細胞中。所述一個或多個靶向模塊可以被設計為通過疏水性功能單元促進所述綴合物從核內體逸出，所述疏水性功能單元被整合到核內體膜上並破壞核內體膜。所述一個或多個靶向模塊可以被設計為增加核內體到溶酶體的酸化過程的有效性。所述一個或多個靶向模塊可以被設計為免受降解酶，例如肽酶和蛋白酶的活性的影響。
[0045]在一種實施方式中，祀向模塊可以為但不限於:抗體、多肽、寡核苷酸、化學治療劑或噬菌體。所述一個或多個靶向模塊可能能夠靶向病變細胞或組織的組分。
[0046]在一種實施方式中，靶向模塊可以是抗體。所述抗體可以具有識別並特異性結合到靶標的能力。所述靶標可以為 但不限於:蛋白質、多肽、肽、碳水化合物、多核苷酸，脂質，或至少前述兩種的組合，所述結合通過抗體可變區內的至少一種抗原識別位點進行。
[0047]在一種實施方式中，靶向模塊可以是一類被稱為拮抗抗體(antagonistantibodies)的抗體,所述拮抗抗體特異性地結合癌幹細胞標記蛋白，並且幹擾,例如,配體結合、受體二聚化(receptor dimerization)、癌幹細胞標記蛋白的表達和/或癌幹細胞標記蛋白的下遊信號傳導。
[0048]在一種實施方式中，靶向模塊可以是一類被稱為激動劑抗體(agonistantibodies)的抗體,所述激動劑抗體特異性結合癌幹細胞標記蛋白並且促進如配體結合、受體二聚化和/或癌幹細胞標記蛋白的信號傳導。在一種實施方式中，靶向模塊可以一種抗體，該抗體既不幹擾或也不促進癌幹細胞標記蛋白的生物活性，而是可以通過例如抗體的內化和/或免疫系統的識別而具有抑制腫瘤生長的功能。
[0049]靶向模塊可以選自任何類型的抗體。所述抗體可以是多克隆抗體、完整的單克隆抗體、抗體片段，所述抗體片段可以為但不限於Fab、Fab'、F(ab' )2、Fv片段、單鏈Fv(scFv)突變體、嵌合抗體或多特異性抗體。多特異性抗體可以是從至少兩種完整的抗體產生的雙特異性抗體。祀向模塊可以是人源化抗體(humanized antibody)或人源抗體(humanantibody)。靶向模塊可以是包括抗體的抗原決定部分的融合蛋白。靶向模塊可以是含有抗原識別位點的抗體片段。選擇的抗體可以包括五大類免疫球蛋白的任意種類:IgA、IgD、IgE、IgG 和 IgM，或者其子類(亞型)(例如，IgGl, IgG2、IgG3、IgG4、IgAl 和 IgA2)，基於其重鏈恆定區的同一性被稱為α、δ、ε、Y或μ。靶向模塊可以是裸露的抗體或與其他分子綴合的抗體。靶向模塊可以為與例如毒素或放射性同位素綴合的抗體。
[0050]在一種實施方式中，靶向模塊可以是單克隆抗體。在一種實施方式中，靶向模塊可以是多克隆抗體。在一種實施方式中，靶向模塊可以是特異性針對細胞中的至少一種脈管蛋白的抗體。所述脈管蛋白可以是轉鐵蛋白受體蛋白。本文中所用的轉鐵蛋白受體蛋白是指在內皮細胞表面上表達、並在某些腫瘤細胞上水平升高的受體(Lee JH et al.2001 EurJ Biochem 268:2004 ；Kovar MK et al., 2003 J Drug Targeting 10:23)。單克隆抗體革巴向模塊(TfR-mAb)可以結合轉鐵蛋白受體蛋白，並通過內皮細胞與BBB結合而實現轉胞吞作用。一種實施方式包括連接到含有禮的納米綴合物上的Tfr-mAb,所述Tfr_mAb可以特異性結合到位於腦毛細血管腔面的內皮細胞表面上的轉鐵蛋白受體上，從而將所述納米綴合物結合於此。一旦結合，所述納米綴合物可以通過轉胞吞作用而有效地穿過BBB內皮細胞。含Tfr-mAb的納米綴合物的大小可以是20_30nm (分子量100，000),眾所周知,這遠高於腎排出極限。
[0051]TfR mAb祀向模塊可以為人源化抗體(hu-Tgr-mA)或嵌合抗體。為了研究阿爾茨海默症(AD模型)或轉移至腦的TNBC的大鼠和小鼠模型的體內成像，可以用小鼠或大鼠的TfR mAb代替納米綴合物的hu-TfR mAb。所述納米綴合物可以包括用於類似目的的其他多肽。
[0052]靶向模塊可以包括對轉鐵蛋白受體特異性的凝集素或另一種配體。靶向模塊可以是任意數量的細胞表面受體或抗原的其中一種的配體。
[0053]靶向模塊可以是在構建納米綴合物過程中共價綴合到聚蘋果酸上的小藥物分子或發色團分子或蛋白質分子或凝 集素。
[0054]靶向模塊可以是被設計為特異性結合蛋白的抗體，所述蛋白選自但不限於:表皮生長因子受體(EGFR)、人類表皮生長因子(HER)、層粘連蛋白411、胰島素樣生長因子(IGF)和腫瘤壞死因子-α (TNF-α )0結合EGFR的抗體可以是西妥昔單抗。結合HER的抗體可以是Herceptin⑧。結合層粘連蛋白411的抗體可以結合層粘連蛋白β I亞基或層粘連蛋白a 4亞基,或其兩者。
[0055]靶向模塊可以是寡核苷酸。寡核苷酸可以是抑制靶核酸分子表達的反義寡核苷酸。寡核苷酸可以是抑制層粘連蛋白411 (Iamin 411)表達的反義寡核苷酸的一種,所述寡核苷酸在2004年9月13日提交的PCT申請PCT/US04/29956和2007年I月30日提交的美國申請N0.10/570, 747 (作為美國專利N0.7，547，511授權)以及2009年5月28日提交美國申請N0.12/473, 992中有所記載，上述文獻以全文援引的方式納入本文。
[0056]靶向模塊可以包括如2009年4月10日提交的PCT申請PCT/US09/40252中所描述的核內體逸出單元(endosomal escape unit),該文獻以全文援引的方式納入本文。核體內逸出單元可以為連接到基於聚蘋果酸的骨架上的載體模塊,通過核內體囊泡(endosomalvesicles)成熟為溶酶體的過程中的酸化而變得有活性。所述載體模塊可以包括通過醯胺鍵連接到基於聚蘋果酸的分子骨架上的多肽中的多個亮氨酸殘基。所述載體模塊可以包括通過醯胺鍵連接到基於聚蘋果酸的分子骨架上的多肽中的多個纈氨酸殘基。所述載體模塊可包括通過醯胺鍵連接到基於聚蘋果酸的分子骨架上的亮氨酸乙酯。在核內體到溶酶體的酸化過程中，這一系列載體模塊可以使電荷中和並具有疏水性，並能夠破壞細胞膜。在構建含有聚蘋果酸和核內體逸出單元的組合物時，可以使用其他在溶酶體PH值條件下成為電中性的分子來代替亮氨酸或纈氨酸殘基或亮氨酸乙酯。
[0057]靶向模塊可以是用於防止被網狀內皮系統(RES)再吸收和/或酶降解的模塊。例如，所述用於防止被再吸收的模塊可以為但不限於聚乙二醇(PEG)分子。聚乙二醇可用於增加綴合蛋白的體內半衰期，以延長循環時間，並增強向祀實體瘤的外滲(Arpicco S etal.2002 Bioconjugate Chem 13:757 ；Maruyama K et al.，1997 FEBS Letters 413:1771，在此以全文援引的方式納入本文)。其它已知的能夠增加納米綴合物的半衰期的分子也可以用於設計本文的納米綴合物。
[0058]圖1顯示了包括連接到聚蘋果酸平臺上的Gd-DOTA複合物的典型納米綴合物。所述納米綴合物可以在轉移到腦部的人類TNBC的小鼠模型中，用於腫瘤類型特異性的MRI。連接到聚蘋果酸上的模塊可包括MRI造影劑(Gd-DOTA)、靶向模塊(嵌合的鼠-人單克隆抗體西妥昔單抗(Erbituxt?)，特異性針對由腫瘤細胞呈現的EGFR和用於穿透BBB的MsTfR)，和用於提高溶解性的羧基。在用於人類時，抗小鼠TfR mAb可以被替換為抗人TfR mAb。
[0059]可以使用任意分子量(Mw)的聚蘋果酸作為攜帶一個或多個靶向模塊以及一個或多個成像部分的平臺。本文中所使用的聚蘋果酸可以具有的分子量為10，000、15，000、20，000,30, 000,40, 000,50,000,60,000,70,000,80,000,90,000,100,000,110,000、120，000、130，000、140，000、150，000或更大，或在前述的任意兩個值(含端點)之間範圍內的任意值。分子量80，000的聚蘋果酸可以作為用於攜帶共價結合的MsTfR mAb和腫瘤特異性mAb，以及多個共價結合的Gd-DOTA的納米綴合物的平臺。所述平臺可能包括任意數量的可衍生的(derivatisable)羧基。在實施方式中，所述平臺可包括700個或更多個可衍生的羧基和大量的能夠被負載的以產生強MRI信號的Gd-DOTA單元。
[0060]在一種實施方式中， 一個或多個靶向模塊能夠靶向病變細胞或組織的組分。所述組分可以是但不限於，被認為促進腦中的神經元退化和隨後的阿爾茨海默症的症狀的β_澱粉樣蛋白斑。一個或多個靶向模塊可以包括用於特異性結合阿爾茨海默症的澱粉樣蛋白斑的薑黃素(5-羥基-1，7-雙(4-羥基-3-甲氧基苯基)-1，4，6-庚三烯(h印tatrien)-3-酮(on))。薑黃素可以特異性地緊密結合到β澱粉樣斑塊上，從而可以使腦內的納米綴合物積累並具有高度的染色強度。所述納米綴合物可以包括一個或多個薑黃素分子。納米綴合物上多個薑黃素分子的存在導致所述納米綴合物牢固結合地在β_澱粉樣斑塊的周圍，有助於形成高對比度的尖峰(sharp contours)。
[0061]含有薑黃素的納米綴合物分子中可以攜帶任意數量的釓離子。納米綴合物可以攜帶單個禮離子。納米綴合物可以攜帶多個禮離子。納米綴合物可以攜帶1、5、10、20、30、40、50或60個或更多個釓離子。納米綴合物可以攜帶多個釓離子，每分子納米綴合物可以攜帶的釓離子的數量可以在1、5、10、20、30、40、50或60的任意兩值之間。靶組織，例如，澱粉樣斑塊上高濃度的Gd可以使得通過MRI以高對比度和高質量的解析度成像。
[0062]所述一個或多個靶向模塊可包括治療性多肽。
[0063]在實施方式中，所述一個或多個靶向模塊可以包括額外的治療劑。在實施方式中，額外的一種或多種治療劑選自由生長因子，抗炎劑，血管加壓劑，膠原酶抑制劑，類固醇(topical steroid),基質金屬蛋白酶抑制劑,抗壞血酸鹽,血管緊張素II,血管緊張素III，鈣網蛋白，四環素類，纖連蛋白，膠原蛋白，血小板反應蛋白，轉化生長因子(TGF)，角質細胞生長因子(KGF)，成纖維細胞生長因子(FGF)，胰島素樣生長因子(IGF)，表皮生長因子(EGF),血小板衍化生長因子(PDGF),神經鞘分化因子(neu differentiation factor,NDF)，肝細胞生長因子(HGF)和透明質酸。
[0064] 在一種實施方式中，納米綴合物可以包括跟蹤螢光染料，以追蹤在受試者體內納米綴合物的分布。跟蹤染料可以便於通過使用除MRI以外的成像系統來對納米綴合物在體內的分布進行總的監測。在不使用Gd的情況下，在對受試者疾病或狀況的第一階段的調查中，跟蹤染料可以確認薑黃素聚蘋果酸綴合物進入腦部。跟蹤染料也可以確認在腦內薑黃素是否連接到了聚蘋果酸上。因此，跟蹤染料可用於實驗的優化。追蹤可以通過使用例如Xenogen突光成像系統來執行。
[0065]在一種實施方式中，提供了便於細胞或組織成像的試劑盒。所述細胞可以是病變細胞。所述組織可以是病變組織。所述試劑盒可以通過用於可視化病理狀況的方法實現。所述試劑盒可以包括納米綴合物，所述納米綴合物包括基於聚蘋果酸的分子骨架，一個或多個成像部分和一個或多個靶向模塊。所述試劑盒可以包括本文描述的任何一種或多種納米綴合物。至少一個成像部分和至少一個靶向模塊可以綴合到基於聚蘋果酸的分子骨架上。所有的成像部分均可以綴合到基於聚蘋果酸的分子骨架上。所有的靶向模塊均可以綴合到基於聚蘋果酸的分子骨架上。
[0066]試劑盒中的模塊和部分的具體性質的設計取決於其預定目的。在實施方式中，所述試劑盒可以設計為實現阿爾茨海默症或其他涉及異常的腦功能、活性或病理狀況的可視化、治療或監測的目的。為此，所述試劑盒可以包括含有用於結合β澱粉樣斑塊和MRI成像的模塊的納米綴合物。在實施方式中，所述試劑盒可以設計為用於癌症的可視化、處理或監測。
[0067]在實施方式中，所述試劑盒出於治療哺乳動物受試者的目的可以進行特別的配置。所述試劑盒也可以為了治療人類受試者的目的進行特別的配置。所述試劑盒可以配置用於獸醫應用。所述試劑盒可以被配置為但並不限於治療農場動物，家畜或實驗室動物。所述試劑盒中可以包括使用說明。所述使用說明可以包括使用所述試劑盒組分的方法的具體描述，以實現期望的結果。例如，所述說明可以描述用於可視化β澱粉樣斑塊或腫瘤細胞或細胞類型的方法。所述試劑盒還可以包括其它有用的成分。例如，所述試劑盒可包括本領域的技術人員公知的稀釋劑，緩衝劑，藥學上可接受的載體，注射器，導管，噴頭(applicators ),移液或測量工具,包紮材料或其他有用的器具。
[0068]實際操作者(practitioner)可以將試劑盒中組裝的材料或成分以任何方便的和合適的方式存儲，以保持其可操作性和可用性。例如，所述成分可以以溶解的，脫水的或凍幹的形式提供。這些成分可以在室溫、冷藏或冷凍的溫度下提供。這些成分可以包裝在合適的包裝材料中。如本文所用的，術語「包裝材料」指的是一種或多種物理結構，用於容納試劑盒的內含物，如本發明的組合物等等。包裝材料可以由公知的方法，優選在能提供無菌，無汙染物的環境下構建。如本文所用的，術語「包(package)」指的是合適的固體基質或材料，如玻璃，塑料，紙，箔等，能夠容納單獨的試劑盒成分。包裝材料可以具有指示試劑盒的內含物和/或目的和/或其成分的外部標籤。
[0069]在一種實施方式中，提供了一種靶向受試者細胞或組織的方法。所述細胞可以是病變細胞。所述組織可以是病變組織。所述方法可以包括對受試者進行含有基於聚蘋果酸的分子骨架，至少一個成像部分和至少一個靶向模塊的納米綴合物的給藥。所述至少一個成像部分和至少一個靶向模塊可以綴合到基於聚蘋果酸的分子骨架上。所有成像部分均可以綴合到基於聚蘋果酸的分子骨架上。所有靶向模塊均可以綴合到基於聚蘋果酸的分子骨架上。所述納米綴合物可以是本文中描述的任何納米綴合物。所述方法還可以包括提供使得納米綴合物與病變細胞或病變組織的組分發生相互作用的條件。
[0070]所述受試者可以是患者。如本文所用的，術語「患者」是指人類。所述患者可以是具有疾病或狀況的一種或多種症狀的人。所述患者可能需要在臨床環境中治療疾病或狀況。疾病或狀況的症狀可能會因為治療而變化，或自發緩解，或隨疾病的進展而進一步發展。術語「患者」也可指非人類生物。所述患者可以是實驗動物，農場動物或動物園的動物。所述患者可以是小鼠、大鼠、豚鼠、倉鼠、馬、兔子、山羊或牛。
[0071]在一種靶向細胞或組織的方法的實施方式中，可以通過任何適當的途徑對受試者進行納米綴合物的給藥。所述納米綴合物可通過靜脈內注射給藥。所述納米綴合物也可以通過選自由肌內注射、皮下注射、靜脈注射、皮內注射、鼻內注射、吸入、口服給藥、舌下給藥、口腔含化給藥(buccal administration)或局部給藥所組成的組中的方法進行運送。
[0072]在一種靶向細胞或組織的方法的實施方式中，所述至少一個成像部分可以是促進成像技術的分子。可通過任何技術進行成像，所述技術包括但不限於X射線成像，計算機斷層攝影(CT)掃描和MRI。所述成像部分可以包括成像造影劑。所述成像造影劑可以為Gd-DOTA。所述方法可包括在受試者中進行成像造影劑的可視化。可視化可以通過成像技術進行，例如，通過X-射線，CT或MRI。
[0073]在一種實施方式中，靶向細胞或組織的方法還可以包括對受試者的疾病或其他狀況(conditions)的診斷。診斷可以基於病變細胞或病變組織的圖像。診斷可以包括與健康個體的正常細胞或組織的圖像 進行比較。所述圖像可以通過任何非侵入性的臨床影像診斷方式獲得。例如，可以通過MRI獲得所述圖像。MRI裝置利用核磁共振現象，可以形成待呈像的細胞或組織的橫截面的圖像。所述MRI可以測量來自接受成像的受試者的細胞或組織中存在的水分子的質子的信號。MRI圖像的強度可以取決於特定的組織的物理性質。MRI信號的強度可以取決於質子密度，自旋晶格弛豫時間(Tl)，和自旋-自旋弛豫時間(T2)。
[0074]「異常狀況(abnormail condition)」是指患者體內細胞和組織的機能偏離機體正常機能的機能。異常狀況可以指疾病。異常狀況可以包括腦失調。腦失調可以為但不限於:阿爾茨海默症、多發性硬化症、帕金森氏病、亨廷頓氏病、精神分裂症、焦慮症、痴呆症、智力低下和焦慮。異常狀況可以包括增殖性疾病(proliferative disorder)。術語「增殖性病變」和「增殖性疾病(proliferative disease)」是指與異常細胞增殖相關的疾病(disorders)。增殖性疾病可以是但不限於:癌症、血管發生、牛皮癬和纖維變性病(fibrotic disorders)。癌症是哺乳動物體內以細胞群生長失調為特徵的生理狀況。癌症的實例包括但不限於，腫瘤(carcinoma)、淋巴瘤、胚細胞瘤、肉瘤和白血病。這種癌症的更具體的例子包括鱗狀細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、肺鱗狀細胞癌、腹膜癌(cancer of the peritoneum)、肝細胞癌、胃腸癌、胰腺癌、膠質細胞瘤、宮頸癌、卵巢癌、肝癌(liver cancer)、膀胱癌、肝細胞瘤(hepatoma)、乳腺癌、結腸癌、結直腸癌、子宮內膜癌或子宮癌、唾液腺癌、腎癌、肝癌、前列腺癌、外陰癌、甲狀腺癌、肝腫瘤(hepaticcarcinoma)和不同類型的頭頸部癌。乳腺癌可以包括TNBC和HER2陽性乳腺癌。
[0075]癌症可以是原發癌或轉移性癌。術語「原發癌」是指癌症起源的原始位點。例如，起源於乳腺的癌症被稱為原發性乳腺癌。如果其轉移，即擴散至腦，所述癌症就被稱為轉移至腦部的原發性乳腺癌。
[0076]術語「轉移」指癌症從原始位點擴散或轉移到機體其他部位的過程，並發展為相似的癌症病變，即在新的位置具有相同或大致相同的生化標誌物。一種「轉移的」或「正轉移的」細胞是一種具有與相鄰細胞接觸的粘度活性降低，並通過血液或淋巴內從疾病的原發部位遷移到遠端的其他位點，例如，侵入鄰近的身體結構或遠端結構。
[0077]異常狀況還可以包括糖尿病、類風溼關節炎、哮喘、牛皮癬、動脈粥樣硬化、心血管疾病、青光眼和視網膜病變(rethinopathy)。術語「疾病」是指所有的異常狀況。診斷可以包括除異常狀況以外的其他狀況的診斷。所述其他狀況可以與異常狀況相關。所述其他狀況可以與異常狀況不相關。例如，除診斷阿爾茨海默症之外也可以診斷精神分裂症。
[0078]術語「腫瘤」，是指任何由於細胞過度生長或增殖而產生的組織塊，無論是良性(非癌)或包括癌前期病變的惡性腫瘤(癌)。腫瘤細胞可能來自腫瘤或包括非致瘤性細胞和致瘤性細胞(即癌幹細胞)的癌前期病變。
[0079]—種實施方式包括腫瘤特異性納米綴合物，其可用於MRI的增強和促進影像診斷。增強包括這樣一種方法。具體而言，腫瘤特異性納米綴合物可用於區分普通MRI過程無法區分的腦部的腫瘤和非腫瘤性病變。納米綴合物可以用來區分發生在相同個體同側(side-by side)的不同類型的腫瘤。納米綴合物可用於癌症患者腦部的MRI增強，所述癌症患者有下列病史:原發性乳腺癌、來自原發性乳腺癌的轉移性腦腫瘤，來自不同類型的癌轉移瘤，原發性腦腫瘤和/或化療併發症的免疫系統損害引起的感染。
[0080]本發明的納米綴合物被 設計為增強基於MRI的對特定狀況的診斷。在一種實施方式中，納米綴合物(MRI增強劑)可以包括在特異性針對腫瘤細胞表面的腫瘤標誌物的抗體。所述抗體可以特異性針對過表達的細胞表面抗原，例如EGFR、HER2、B淋巴細胞抗原CD20或層粘連蛋白。所述抗體可通過靶向腫瘤毛細血管內皮上的轉鐵蛋白受體，利用轉胞吞作用，跨越BBB而進入腫瘤間質，從而促進進入腫瘤組織。一旦連接，所述增強劑可以保留的時間尺度遠遠超過通過腎臟清除的未結合的游離MRI增強劑的。由於其在腦部或其他腫瘤中延長的保留時間，使得提供自旋的朝向MRI裝置的外部磁場的脈衝後，通過發射作為水分子周圍的試劑的縮短的弛豫時間Tl的信號，MRI能夠識別標記腫瘤。Tl倒數的縮短與MRI增強劑的濃度成比例(proportional)，因此，信號的增強可能是由於腫瘤的特異性結合導致的累積的結果。腫瘤的非特異性MRI信號可以通過用於腦部健康部分測量的Tl的測量而獲得。可以測量腫瘤腦部和健康腦部之間Tl值的差異，並作為反映特異性腫瘤保留增強劑的時間函數，而健康腦部內和其他地方的試劑可能已通過腎臟被清除。腫瘤類型特異性MRI掃描可以在健康腦部的Tl接近零值時進行。
[0081]本文所述的納米綴合物中可以包括大量的造影劑，以提高MR圖像的解析度。造影劑可以是適於在體內產生對比效果的分子。造影劑可形成金屬蛋白複合物。造影劑可以形成影響弛豫時間Tl或T2或兩者的複合物。影響Tl的造影劑可以是鑭系金屬離子。造影劑可以是與低分子量的分子螯合以限制其毒性的釓。影響T2的造影劑可由小顆粒的磁鐵礦(Fe0_Fe203)組成。造影劑可以與組織中的自由水(mobile water)互相作用而形成對比。
[0082] 在一種實施方式中，疾病或狀況的診斷可能會涉及具有異常的腦功能、活性或病理的患者。阿爾茨海默症的診斷可以基於患者腦部的β澱粉樣斑塊的存在來進行。
[0083]可以通過對患者進行含有基於聚蘋果酸的納米綴合物的組合物的給藥，並獲取在患者機體的特定組織類型中所述納米綴合物的位置的圖像來進行診斷，所述基於聚蘋果酸的納米綴合物包含用於結合的β澱粉樣斑塊的靶向模塊和用於MRI成像的成像部分。
[0084]所述納米綴合物可以通過ΒΒΒ，然後靶向斑塊(阿爾茨海默症的標誌物)，所述納米綴合物同時連接有能結合斑塊的薑黃素和TfR mAb。接近β_澱粉樣斑塊的成像可以使得確定阿爾茨海默症的狀態並在治療該疾病的過程中對患者進行跟蹤。可以使用含有薑黃素和/或其它活性化合物的類似的Polydefin納米綴合物來治療阿爾茨海默症。
[0085]在一種實施方式中，納米綴合物的應用可以提高BBB滲透的效率，並可以延長含釓造影劑的循環時間。由於薑黃素與阿爾茨海默症澱粉樣斑塊的緊密結合，納米綴合物的應用還可以提高在含有斑塊的腦部區域內的積累。
[0086]在一種實施方式中，靶向病變細胞或組織可以導致所述疾病或狀況的至少一種症狀的減少或消除，從而治療受試者的所述疾病或狀況。靶向病變細胞或組織可以作為一種治療手段，以促進癌症的消退或者防止進一步發展或轉移；或者作為一種預防手段，以使與腫瘤或癌症的發展相關的併發症最小化。
[0087]在一種實施方式中，被監測或治療的狀況和/或疾病可以是阿爾茨海默症。在一種實施方式中，提供了治療患者狀況的方法。所述方法可以包括，進行含有納米綴合物的組合物的給藥，所述納米綴合物包括用於結合β澱粉樣斑塊的靶向模塊和用於MRI成像的成像部分。所述方法還可以包括用所述組合物治療患者。
[0088]為了達到所需效果，即抑制至少一種靶受體的配體的表達，可進行治療有效量的組合物的給藥。所述組合物的「治療有效量」可以是用於有效防止癌症的進一步發展或轉移生長甚至是使癌症達到消退效果的劑量。
[0089]可以由臨床醫生根據待治療的患者的需要選擇確切的劑量。可調節劑量和給藥方式以提供足夠的活性劑水平或維持所需的效果。加以考慮的其他因素包括疾病狀態的嚴重程度，例如，腫瘤的大小和位置，年齡，患者的體重和性別，飲食，給藥的時間和頻率，藥物組合，反應敏感性，和對治療的耐受性/應答。長效(Long acting)組合物的給藥可以為每3至4天、每周或每兩周一次，這取決於具體組合物的半衰期和清除速率。
[0090]在一種實施方式中，所述一個或多個靶向模塊可以包括用於治療患者疾病或狀況的活性劑。活性劑可配製成便於給藥和劑量均勻的單位劑型(dosage unit form)。在本文中的表述「單位劑型」，是指用於待治療患者的活性劑的物理上獨立的單位。
[0091]對於任何活性劑，可以在細胞培養實驗或動物模型中初步估算治療有效劑量，所述動物模型通常指如本文實施例中所示的鼠、兔、狗或豬。也可以使用動物模型來獲得所需的濃度範圍和給藥途徑。然後可以使用上述信息來確定用於人類給藥的有用劑量和途徑。治療有效劑量是指可以改善症狀或狀況的活性劑的量。活性劑的療效及毒性可通過標準製藥學程序在細胞培養或實驗動物中來確定，例如，ED 50 (對50%的群體有治療效果的劑量)和LD50 (使50%的群體致死的劑量)。毒性與治療效果的劑量比值比為治療指數，並可以表示為LD50/ED50的比值。本文的組合物可以呈現出很大的治療指數。從動物研究中獲得的數據可以用於制定供人類使用的劑量範圍。
[0092]如上文所討論的和在實施例中更詳細地描述的，本文所述的納米綴合物可以在防止癌症發展或轉移的方法中進行給藥。具體而言，納米綴合物可以用於防止特定的癌症類型的進一步生長，所述癌症類型包括但不限於:乳腺癌；皮膚癌；卵巢癌；宮頸癌；視網膜母細胞瘤；結腸癌和其他包括源於胃腸道黏膜的狀況；肺癌和呼吸道癌；腎細胞癌和其他源於腎小管內表面的腫瘤；白血病和淋巴瘤等血液疾病；以及其他類型的生殖系統癌症，包括與不同菌株的乳頭狀瘤病毒相關的生殖系統癌症；腦腫瘤；子宮癌、陰道癌和尿道癌。
[0093]在實施方式中，診斷、預測和治療的方法可以不限於治療人類的狀況，也可以用於治療任何哺乳動物的類似狀況，所述哺乳動物包括但不限於:牛、犬、貓、山羊、綿羊、豬、鼠和馬等物種。
[0094]在一種實施方式中，提供了一種監測受試者的疾病或狀況的治療效率的方法。監測可以包括，治療後在受試者的病變細胞或病變組織中獲得第一圖像，並且在一段時間之後，獲取病變細胞或組織的第二圖像。可以進行所述第一和第二圖像的對比以確定治療後的細胞和組織在臨床上的顯著差異。例如，可以將兩張或更多張圖像進行比較，以確定治療是否減少了腫瘤中癌細胞的數量或特定腫瘤的大小。
[0095]受試者可為需要MRI過程的患者。可以在將患者置於MRI裝置之前或之後的任何時候進行組合物的給藥，所述組合物包括基於聚蘋果酸的分子骨架、至少一個成像部分和至少一個靶向模塊。在產生圖像前，所述組合物可以靶向患者機體不同部位的細胞或組織。在這種情況下，所述組合物可在成像前在具體位置累積。圖像也可以在組合物在靶細胞或組織中積累的過程中產生。通過檢查一張或多張圖像可以確定所述組合物靶向的任何病變細胞或組織。一段時間後，可以對受試者進行所述組合物的再次給藥，時間間隔取決於具體的治療計劃，例如，可以每周，每兩周，每三周或每個月進行所述組合物的給藥。在所述組合物後續給藥期間或之後可以生 成圖像，並可以對不同階段期間獲取的圖像進行比較以評估療效。
[0096]本發明的方法可以包括提供足以使納米綴合物在靶細胞或組織中積累的一段時間。
[0097]在另一種實施方式中，提供了一種用於對具有異常的腦功能、活性或病理的個體的疾病和/或狀況的預測方法。所述方法可以包括對受試者進行含有納米綴合物的組合物的給藥，所述納米綴合物包括用於結合β澱粉樣斑塊的靶向模塊和用於MRI成像的模塊；並且基於在所述個體中相對正常受試者存在的高水平β澱粉樣斑塊，預測所述疾病和/或狀況的嚴重程度。
[0098]在一種實施方式中，包括基於聚蘋果酸的分子骨架、至少一個成像部分和至少一個靶向模塊的組合物還可以包括藥學上可接受的載體。如本文所用，術語「藥學上可接受的載體」包括適合所需的具體劑型的任何和所有的溶劑、稀釋劑或其它液體載體、分散或懸浮助劑、表面活性劑、等滲劑、增稠劑或乳化劑、防腐劑、固體粘合劑和潤滑劑。藥學上可接受的載體可為 Remington ' s Pharmaceutical Sciences Ed.by Gennaro, MackPublishing, Easton, PA, 1995中描述的載體,該文獻在此以全文援引方式納入本文,該文獻中還公開了用於配製藥物組合物的各種載體和用於製備它們的已知技術。可以作為藥學上可接受的載體的材料的一些例子，包括但不限於:糖類:乳糖、葡萄糖和蔗糖；澱粉:玉米澱粉和馬鈴薯澱粉；纖維素及其衍生物、羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素和乙酸纖維素；粉末狀黃蓍膠；麥芽；明膠；滑石粉；賦形劑:可可脂和栓劑蠟；油:花生油、棉子油、紅花油、芝麻油、橄欖油、玉米油和大豆油:乙二醇、丙二醇；酯類:油酸乙酯和月桂酸乙酯；瓊脂；緩衝劑:氫氧化鎂和氫氧化招；藻酸；無熱原水(pyrogen-free water);等滲鹽水；林格氏溶液；乙醇和磷酸鹽緩衝液；以及其他無毒的兼容潤滑劑、十二烷基硫酸鈉和硬脂酸鎂。所述組合物也可以含有著色劑、釋放劑、包衣劑、甜味劑、調味劑和香味劑、防腐劑和抗氧化劑。
[0099]在一種實施方式中，提供了一種合成納米綴合物的方法。所述方法可以包括提供具有多個羧基側基的聚蘋果酸。所述方法可以包括含巰基和氨基的化合物與羧基側基進行反應，以將巰基添加到聚蘋果酸上而形成活化的聚蘋果酸。所述方法還可以包括使至少一種含有巰基結合基團的成像部分與活化的聚蘋果酸進行反應，以形成綴合物前體。所述方法還可包括使至少一種含有巰基結合基團的定靶向模塊與活化的聚蘋果酸進行反應。
[0100]所述合成方法可以包括通過添加N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)到聚蘋果酸中對聚蘋果酸的羧基側基進行活化，以形成NHS-酯。所述方法還可以包括使活化的羧基與2-巰基乙烷-1-胺的氨基進行反應。所述方法還可以包括使至少一種含有氨基的成像部分與經NHS活化的羧基側基反應。所述方法還可以包括使至少一種含有巰基的靶向模塊與綴合物前體(preconjugate)反應。所述至少一種成像部分可包括造影劑的活化分子。造影劑的活化分子可以包括釓(Gd)-1，4，7，10-四氮環十二烷-1，4，7，10-四乙酸(DOTA)-胺。所述至少一個靶向模塊可以包括活化的抗體。所述活化的抗體可以包括抗體-聚乙二醇-馬來醯亞胺。所述抗體-聚乙二醇-馬來醯亞胺可以與綴合物前體進一步反應形成納米綴合物。
[0101]所述至少一個靶向模塊可以包括活化的薑黃素-聚乙二醇胺。所述至少一個靶向模塊可以特異性結合受試者病變細胞或組織的組分，所述組分選自由表皮生長因子受體(EGFR)、人受體生長因子(HER)、層粘連蛋白411、胰島素樣生長因子(IGF)、轉鐵蛋白受體蛋白、薑黃素和腫瘤壞死因子-α (TNF-α )所組成的組中。
[0102]具有一個或多個靶 向模塊的聚蘋果酸可通過任何已知的方法來合成。例如，連接有一個或多個靶向模塊的聚蘋果酸可以由衍生的蘋果酸內酯的開環聚合來合成。阿黴素-聚蘋果酸可以由聚-β -D, L-蘋果酸合成。
[0103]可以通過在本發明的實施方式中添加來自本文中任何一種或多種其它實施方式中的一種或多種元素，和/或用本文中的一種或多種其它實施方式的一種或多種元素替換一種實施方式中的一種或多種兀素，從而形成進一步的實施方式。
[0104]實施例
[0105]下文提供了非限制性實施例來說明具體的實施方式。所有的實施方式都可以添加來自以下一種或多種實施例的一種或多種細節，和/或，一種實施方式中的一種或多種兀素可以被以下實施例的一種或多種細節取代。
[0106]實施例1.用於MRI增強的組織特異性的納米綴合物的化學合成
[0107]材料將從多頭絨泡菌(Physarum polycephalum)的培養液中分離出的高純度聚蘋果酸(PMLA ；Mw 800, 000,多分散係數(polydispersity factor) P=L 2,通過 Sec-HPLC 測定)用作Polycefin平臺(Ljubimova JY et al.2007 Chem-Biol Interactions 171:195)。鼠抗人 TfR mAb RVSlO 購自 Southern Biotech 公司(Birmingham, AL,美國)，ERBITUX ?(西妥昔單抗)購自Bristol-Myers Squibb公司(紐約，NY,美國)。mPEG5(l(IQ-胺和馬來醯亞胺-PEG34qq-馬來醯亞胺購自Laysan Bio, Inc.(阿拉伯，AL，USA)。3-(2-吡啶基二硫代)-丙酸酯(PDP ； Car I s son J et al.1978 Biochem J 173:723)。Alexa Fluor? 680 C2 馬來醯亞胺(Alex680)購自 Invitrogen 公司(Carlsbad, CA, USA), 2_ 氛基乙基單酸胺-DOTA-三叔丁基酯購自(MaciOcyclics，Inc.TX, USA)。除非另有註明，最高純度的化學品和溶劑均購自美國 Sigma-Aldrich 公司(St.Louis, MO)。
[0108] 用於化學合成的分析方法Gd-DOTA-胺和2-MEA與聚蘋果酸進行綴合反應，然後在UV光和/或通過水合茚三酮染色條件下，在預塗矽膠60 F254鋁板(Merck, Darmstadt, Germany)上進行薄層色譜(TLC)。在帶有L2455 二極體陣列檢測器(Hitachi, Pleasanton, CA,美國)的Elite LaChrom分析系統上進行排阻色譜(Sizeexclusion chromatography), Mw 值通過 BioSep-SEC-S 3000 或 PolySep-GFC P4000(300X7.80mm ；Phenomenex, Torrance, CA,美國)，使用 ρΗ6.8、50mM 的磷酸鈉緩衝液為流動相(0.75毫升/分鐘),聚苯乙烯磺酸鹽(polystyrene sulfonates)作為分子量標準進行測定。疏基殘基通過 Ellman 法(Ellman GL 1959 Arch Biochem Biophys 82:70)測定。與聚蘋果酸綴合的抗小鼠TfR mAb的TfR的結合活性通過Protein Detector? ELISA試劑盒來測定(KPL，Inc.,Gaithersburg，MA，美國)。用作抗原的小鼠TfR的胞外域從加州理工學院(Pasadena，CA USA)蛋白表達中心獲得。綴合有西妥昔單抗的聚蘋果酸與三陰性乳腺癌細胞表達的EGFR的結合通過螢光激活細胞分選(FACS)分析來證實。釓在加州大學洛杉磯分校(洛杉磯，CA，美國)用ICP-MS進行測定。在不存在蛋白質的情況下，DOTA-Gd的反應通過其固有螢光以280nm的激發波長和316nm的發射波長進行跟蹤(Hagan JJ et al.1988Anal Biochem.60:514)。
[0109]實施例2合成-概述
[0110]腫瘤類型特異性的MRI增強劑的合成通過兩部分來完成:第一，Gd-DOTA-胺的合成(圖2);第二，Gd-DOTA-胺綴合到NHS-活化的PMLA上(圖3)。可選擇的路線包括:首先將DOTA-胺與PMLA綴合，然後加載Gd3+。合成的第一部分始於市售的DOTA的氨基衍生物的脫保護(圖2)。在圖3中所示的Gd-DOTA氨基與活化的聚蘋果酸的綴合，可以通過變異(variation)以進一步增加每條聚合物鏈上的禮的數量並進一步增加反應產率。
[0111]實施例3 Boc脫保護的一般程序
[0112]參考圖2，( I)將2-氨基乙基-單醯胺DOTA-三叔丁基酯(1.23克，1.77毫摩爾)溶解於三氟乙酸(TFA) (25ml)中，加入三異丙基矽烷(TIS) (1.12克，7.1毫摩爾)。將反應混合物在50°C下攪拌3小時並冷卻至室溫。在減壓條件下蒸發溶劑，得到粘稠的棕色油狀物。加入冰冷的乙醚(25ml)，過濾白色沉澱並用乙醚洗滌。將乾燥後的沉澱物溶解在純水中並冷凍乾燥。反應產率為97%。
[0113]實施例4製備金屬複合物的一般程序
[0114]參考圖2，將當量的DOTA胺(2) (295毫克，0.56毫摩爾)溶解在4毫升水中，將化學計量稍微過量的醋酸禮(III) (250暈克,0.61暈摩爾)逐滴加入到4毫升水中。在室溫(RT)下攪拌該溶液，同時持續加入IM KOH以使得pH保持在5.5。攪拌48小時後，加入EDTA (0.2當量)，在室溫下攪拌該混合物I小時，然後冷凍乾燥。反應產率為95%。[0115]實施例5綴合物前體[P/Gd-DOTA (15%) /MEA (5%)]的合成
[0116]將N-羥基琥珀醯亞胺(NHS) (0.62mmol)和N，N' -二環己基碳二亞胺(DCC，Immol)溶解在2mL 二甲基甲醯胺(DMF)中，然後連續加入到72mg溶於1.5mL無水丙酮中的PMLA (根據蘋果醯單位計算為0.62毫摩爾)中。在室溫下攪拌3小時以完成活化後，將混合物過濾，通過旋轉蒸發除去丙酮。在室溫下逐滴加入溶於二甲基甲醯胺(DMF) 15Mol-%(以蘋果醯(malyl)單位計)的Gd-DOTA溶液，在攪拌條件下加入0.15mmol的三乙胺(TEA)。根據TLC (茚三酮，聚合物綴合物的Rf=0，Gd-DOTA的Rf=0.2，正丁醇:乙酸:水=1:1:1)可知反應在2小時後完成。加入0.511111101溶於01^(10(^ I _，以蘋果醯單位計為5Mol_%)的2-巰基-乙烷-1-胺(MEA)，並在室溫下攪拌I小時，然後加入緩衝液(IOOmM的磷酸鈉和150mM的NaCl，pH為6.8)，並在室溫下繼續攪拌30分鐘。在1500Xg離心10分鐘後，將上清液過用去離子水(DI)平衡的 Sephadex 柱(PD-10, GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA)。將含有包括綴合物聚蘋果酸(P)、Gd-DOTA (15%)和2-巰基乙烷-1-胺(MEA ；5%)的級分(fractions)的產物凍幹(白色粉末)。反應產率為34.4%。
[0117]參考圖3，基於PMLA的綴合物前體含有25%的Gd-DOTA，70%的可衍生化羧基和5%的疏基。
[0118]實施例6合成抗體-PEG34tltl-馬來醯亞胺的一般程序
[0119]參考圖3,將抗體(抗-MsTfR mAb或西妥昔單抗的每一種；5mg-33nmol,Mr-150kD)溶解於2mL的pH5.5、含有150mM的NaCl的IOOmM磷酸鈉緩衝液中。加入三(2-羧乙基)憐化氫鹽酸鹽(Tris (2-carboxy ethyl) phosphine hydrochloride, TCEP, 50mM 水溶液)使其最終濃度為5mM。在室溫下放置30分鐘。然後通過S印hadex HHO柱除去TCEP，立即將還原的抗體逐滴加入至溶於5mL的無菌磷酸鈉緩衝液(lOOmM，pH5.5、含有150mM的NaCl，總是在臨用前新配)中的馬來醯亞胺(MAL)-PEG34qq-MAL (IOmmol)中。4°C攪拌過夜後，將混合物通過離心薄膜過濾器(Vivascience,截留值(cut off) 30kD,置於20mL的ρΗ5.5、含有150mM的NaCl的IOOmM磷酸鈉緩衝液中)濃縮，並通過經pH6.2、含有150mM的NaCl的IOOmM磷酸鈉緩衝液平衡的S 印hadex G75柱純化。反應產率為75%_85%。
[0120]實施例7合成Gd-DOTA-Polycefin納米綴合物的一般程序
[0121]將總共6mg (2mg/mL)的抗小鼠轉鐵蛋白受體單抗(抗-MsTfR mAb)和西妥昔單抗(每種都綴合有PEG35tltl/馬來醯亞胺)溶於IOOmM磷酸鈉緩衝液/150mM氯化鈉(pH6.2)中，將該溶液加入至含IOmg (2-3mg/mL)的溶於相同緩衝液的綴合物前體P/Gd-D0TA (15%)/MEA(5%)中。室溫下放置I小時後，通過SEC-HPLC分析反應的延伸。加入溶於ImL DMF的ImgAlexa Fluor ? 680 C2-馬來醯亞胺(Alx 680)，常溫下攪拌I小時。通過加入過量的吡啶基(二硫代)丙酸酯(PDP)並在室溫下反應30分鐘，以封閉剩餘的-SH基團。用離心薄膜過濾器(Vivaspin 20,截留值 30kDa, 20mL 的離心膜)(Sartorius Stedim Biotech,Concord,CA，美國)以1500 X g濃縮後，在使用經pH值7.4的PBS平衡的S印hadex G-75純化前，調節最終體積至2ml。分離出含有產物的級分，合併後通過膜過濾濃縮。反應產率為80-90%。圖3顯示了一種合成的Gd-DOTA-Polycefin納米綴合物，所述納米綴合物含15%的Gd-DOTA，
0.25% 的西妥昔單抗(Cetuxumab),0.25% 的抗-MsTfR mAb, 1% 的 Alexa Fluor'、? 680 (Alx680)，3.5%的PDP和70%的羧基側基。Gd分析結果表明:相對於聚蘋果酸的羧基而言加載量為12%。12%的加載量相當於平均每個增強劑分子上加載了 82分子的Gd。[0122]實施例8共價結合有西妥昔單抗的Gd-DOT-Polycefin的表徵
[0123]用HPLC圖譜評估所合成的納米綴合物的純度。圖4顯示了攜帶有共價結合的西妥昔單抗的Gd-DOTA-Polycefin分子的洗脫曲線。在220nm波長處進行檢測。參照圖4，作為早期級分(8分鐘)，其洗脫峰的位置表示納米綴合物具有高純度和高分子量(Mw為470000)。
[0124]圖5 示出了 Polycefin-Gd-DOTA (12%) -MEA (5%)的 Tl 弛豫率的計算。弛豫率是指在核磁共振應用中，磁性化合物增加周圍水質子自旋的弛豫速率的能力的量度。參照圖5，計算出的Tl弛豫率值等於Ts-1HiM'計算的值小於使用1.4特斯拉靜磁場強度的臨床MRI系統的值。所用的Siemens Microscan系統的靜磁場強度為9.4特斯拉。弛豫率通過測量1/T1相對於Gd濃度(μ Μ)的斜率(slope)來計算。使用方程Y=7E_.6x+0.0004可以將在OD 450處的吸光度直接換算為μ M濃度。R2值等於0，9989，表明計算精度很高(R2等於I是完美的)。
[0125]抗-小鼠TfR mAb與靶抗原(小鼠-TfR)的親和力通過飽和ELISA測定(圖6)。數據顯示，含有西妥昔單抗、MsTfR和Alexa Fluor 680的Gd-DOTA-Polycefin納米綴合物的結合力(binding)與游離的抗小鼠TfR mAb相當。如圖6所示,觀察到抗原-抗體複合物的解離常數值是相似的，並且在0.03-0.08 μ g/mL (相當於0.2nM至0.5nM)的範圍內。這些值接近公布的數值，並表明抗-鼠TfR mAb的抗原結合力不受其連接到Gd-DOTA-Polycefin納米綴合物的影響。
[0126]西妥昔單抗對EGFR受體的特異性通過螢光激活細胞分選(FACS)測定，所述測定基於將帶羅丹明標記的Gd-DOTA-Polycefin-西妥昔單抗(2.5微克/毫升)與MDA-MB-468細胞(數量為30，000)中的EGFR的結合，並與磷酸鹽緩衝液(PBS)(陰性對照)的數值和游離西妥昔單抗(陽性對照)的數值進行比較(圖7)。在該圖中，右側的峰值對應於帶羅丹明標記的Gd-DOTA-Polycefin-西妥昔單抗與EGFR的結合。作為比較，發現直方圖中間的峰值對應於游離的未標記且未與EGFR結合的西妥昔單抗(25 μ g/mL)。對應於游離的未標記的西妥昔單抗的峰值的位置 和對應於陰性對照PBS的峰值的位置是非常接近的。
[0127]分析數據表明與Polycefin-Gd-DOTA綴合的抗小鼠TFR mAb和西妥昔單抗均保留了其功能活性，並且可以在體內MRI中具有活性。
[0128]實施例9腫瘤類型特異性MRI的材料和方法
[0129]細胞系和培養條件。人乳腺癌細胞系MDA-MB-468 (TNBC，EGFR陽性)和人肺癌細胞系A549 (EGFR陽性)獲自美國典型培養物保藏中心(Manassas, VA)。將細胞分別在添加有10%FBS和抗生素/抗真菌劑的L-15和F-12K培養基中培養。
[0130]裸鼠腫瘤移植。所有動物實驗都依照Cedars-Sinai醫學中心實驗動物管理與使用委員會(IACTC)批准的方案進行。無胸腺NCr-nu/nu小鼠從NC1-Frederick獲得。MDA-MB-468細胞以1.5X IO6或2.5X IO6定向(stereotactically)植入到小鼠右側基底神經節區域中。A549細胞以5X105定向植入。
[0131]Xenogen螢光成像。為進行對健康腦部和腫瘤組織中的造影劑累積的MRI和近紅外研究，將小鼠置於吸氣室內通過吸入異氟烷(2-4%有效)進行麻醉。一旦麻醉就將老鼠從吸氣室中取出，將其尾部浸泡在溫水中以使得靜脈(vain)擴張，並置於小鼠尾部照明器(Braintree Scientific Inc, Braintree, MA)中，以避免由於意外從麻醉中快速復甦而造成注射失敗。使用30號針頭的Iml注射器，將溶於PBS的造影劑以0.1mmol Gd/kg的劑量、5秒100μ I的速率經尾靜脈注射給藥(每隻小鼠單獨注射)。然後，在圖像檢測前再次將小鼠置於吸氣室內通過吸入異氟烷(2-4%有效)進行麻醉。MRI測量過程中放置鼻錐管(nosecone)以保持麻醉。在測量過程中，維持1.8%的異氟烷。將鼠床加熱以防止小鼠在麻醉過程中冷卻。
[0132]MRI測量。細胞孵育45天後(對於A549)和27天、48和52天後(對於MDAMB468)，當腫瘤直徑約為4mm時，在Siemens Microscan System 9.14 Tesla上進行MRI系列測量(sessions)。獲得了整個腦部的自旋迴波和Tl圖像。軸向切片定位於整個腦部。使用TR=900毫秒的多面回波序列。對於1.8 X 1.8釐米的區域和196 X 196的矩陣大小，獲得了50張0.5毫米的厚度的切片。平面內解析度為92X92 μ m/像素。通過利用用於不同重複次數掃描的強度的單指數擬合，以測得目的區域的樣品的Tl值。在這種情況下，平面內的解析度為234 X 234 μ m/像素。
[0133]Xenogen IVIS 200成像。為評估藥物在裸鼠體內的分布和定位，在不同時間點(給藥前和注射藥物24小時後)用Xenogen IVIS 200成像儀在異氟烷麻醉下對動物進行研究。給藥二十四小時後安樂處死小鼠。進行PBS動脈內灌注以洗出血管內的循環藥物。獲取腫瘤和主要器官以用於螢光信號的檢測。腫瘤和不同器官的螢光信號強度通過XenogenLiving ImageH 軟體 2.50 版(WaveMetrix,美國)進行分析。
[0134]實施例10 由 Gd-DOTA-Polycefin 引起的 MRI 增強
[0135]由於沒有足夠的Gd-DOTA結合到Polycefin納米綴合物的聚蘋果酸上(低於5%)，TNBC腫瘤A549的初步實驗為陰性，％是指共價結合Gd-DOTA的聚蘋果酸平臺中總羧基的分數(fraction)。隨後的實驗使用加載12_13%Gd的Gd-DOTA-Polycefin進行。圖8示出了注射有人TNBC-特異性MRI增強劑納米綴合物的兩隻代表TNBC小鼠模型的動物的成像結果。腫瘤接種後27天，對小鼠進行人TNBC的MRI成像。參考圖8，觀察到經Polycefin-Gd納米綴合物注射的動物顯示，在腫瘤內有顯著的Polycefin-Gd積累，從而使得腫瘤可見。與此相反，在未注射造影劑的動物的圖像上未觀察到可見的腫瘤。數據表明了使用Polycefin-Gd納米綴合物進行MR成像的可行性。
[0136]圖9示出了使用Polycefin-Gd納米綴合物和市售的Gd (III)增強劑，與圖8所示的具有相同類型腫瘤的動物的MR圖像。但是，Gd (III)增強劑的注射時間為腫瘤接種後49-52天。該腫瘤的MRI用於進行時間依賴性評估。上部圖像顯示了臨床使用的Gd (III)給藥。左上圖為試劑注射後15分鐘得到的，顯示出可見的腫瘤。右上圖是注射Gd(III)後I小時40分鐘得到的，並沒有顯示出腫瘤影像，因為Gd(III)增強劑已通過腎臟被清除。下部圖像顯示特異性針對TNCB細胞上表達的EGFR的Gd-DOTA-Polycefin納米綴合物的給藥。左下圖為P/Gd-D0TA/MsTfR/Cetux/Alx680納米綴合物注射後15分鐘得到的，顯示出可見的腫瘤。右下圖為注射納米綴合物後3小時15分鐘得到的。數據表明，Gd-DOTA-Polycefin的增強效果的保留時間比常規應用於臨床的Gd (III)試劑長得多。這種延長可被解釋為腎臟較慢的清除作用，因為由於納米綴合物高於清除限(clearance cut-off )的高分子量，以及由於腫瘤特異性結合而使得結合Gd (III)的聚合物得以保留，從而使得腎臟需要更長的時間以清除所述納米綴合物。
[0137]為了評估實驗動物體內所累積的增強劑的特異性定位,將Alexa Fluor 680連接到Gd-DOTA-Polycefin的納米綴合物上，以用於螢光Xenogen成像。參照圖10A-10B，圖1OA中的圖像顯示在動物的腎臟和肝臟中積累了高劑量的顯像劑。圖1OB中的圖像顯示在中間被藍色螢光識別的腫瘤以及Polycefin-Gd-Alexa Fluor 680的累積。
[0138]實施例11 MRI增強劑的特異性評估
[0139]為了區分由於與靶標結合而產生的保留效果和由於通過腎臟延長的自然清除效果，對Tl值的動力學作出了評估。
[0140]圖11顯示了使用帶有共價結合的西妥昔單抗的Gd-DOTA-Polycefin納米綴合物的製劑和臨床使用的Gd (III)製劑分別對受試者注射後的MR成像的動力學。成像的動力學不是解卷積的(deconvoluted),並包括在通過共價結合的西妥昔單抗與腫瘤細胞表面的EGFR相互作用導致的Gd-DOTA-Polycefin保留的情況下，由於不同分子量對不同血液清除時間的影響。參照圖11，觀察到Polycefin-Gd-DOTA的高1/T1值可保持幾個小時，而臨床用Gd (III)的曲線達到最大值後迅速衰減。動力學曲線的差異可以通過以下的事實來解釋:1/T1值取決於循環血液中臨床用Gd (III)或Polycefin結合的Gd (III)的量；以及取決於Polycefin-Gd-DOTA在腫瘤中的保留時間。臨床用Gd (III)不能穿透BBB,也不能保留在腫瘤中，只可以在腫瘤毛細血管中循環。臨床使用的Gd (III)和Polycefin-Gd-DOTA水平都會因為腎臟的清除而下降。但是由於大分子量的緣故，Polycefin-Gd-DOTA的清除要慢於臨床使用的Gd (III)的，例如Polycefin-Gd-DOTA被清除得就比較慢。
[0141]圖12Α和12Β比較了分別經臨床用Gd (III)增強劑和含有西妥昔單抗的Gd-DOTA-Polycefin納米綴合物注射後,腦部的健康區域和腫瘤區域的MRI的Tl馳豫時間(relaxation)的動力學。圖12A顯示，在應用Gd (III)後，然後注射造影劑，50分鐘後獲得的腦部的健康區域和腫瘤區域的1/T1值沒有顯著差異。該數據可歸因於Gd (III)製劑不能識別腫瘤的事實。圖12B顯示,在注射含西妥昔單抗的Gd-DOTA-Polycefin納米綴合物後，從腦部的健康區域和腫瘤區域所獲得的1/T1值顯著不同。在腦部的健康區域的納米綴合物的半衰期為20-30分鐘，而在腫瘤區域的為130分鐘。所獲得的納米綴合物在腫瘤區域中較長的半衰期值可歸因於由於EGFR與納米綴合物的特異性結合而使得納米綴合物被腫瘤所保留。
[0142]實施例12靶向不同類型的腫瘤的MRI增強劑
[0143]不同類型的腫瘤的成像與能夠特異性靶向腫瘤並區分不同類型腫瘤的納米綴合物製劑相關。圖13A-13D的顯示了設計的分子的示意圖，所述分子被設計為靶向原發性腦瘤和轉移至腦部的TNBC (圖13A)、轉移至腦部的HER-2陽性腦癌(圖13B)、膠質細胞瘤(圖3C)和缺乏特異性靶向模塊的對照分子(圖13D)。圖13A-13D中所有的納米綴合物都被設計為靶向特定腫瘤，連同對照分子均包括用於MRI的作為MRI造影劑的Gd-DOTA，以及用於提高溶解度的羧基C00H，其中，這些部分的每一種都被連接到聚蘋果酸平臺上。如圖13A所示，設計的用於原發性腦瘤和三陰性乳 腺癌轉移腦瘤的定位和成像的納米綴合物包括的用於靶向的mAbs:特異性針對層粘連蛋白β I的mAb，MsTfR mAb和特異性針對EGFR的西妥昔單抗。如圖13B所示，設計的用於轉移至腦部的HER2陽性乳腺癌的定位和促進成像的納米綴合物包括用於靶向的mAbs:特異性針對層粘連蛋白β I的mAb，特異性針對HER2的Herceptin電和TfR mAb。如圖13C所示,設計的用於膠質細胞瘤的定位和促進成像的納米綴合物包括的用於靶向的mAbs:特異性針對層粘連蛋白β I的mAb，特異性針對層粘連蛋白α 4 的 mAb 以及 MsTfR mAb。[0144]參照圖13D，設計的作為其他試劑對照的納米綴合物包括用於定位的小鼠mAbs:不結合腫瘤中特異性靶標的兩種IgGl單克隆抗體。
[0145]通過TNBC、轉移至腦部的HER2陽性乳腺癌和膠質細胞瘤的小鼠模型，對納米綴合物對MRI的特異性的影響進行驗證。上述模型也可用於區分納米綴合物對MRI的特異性和非特異性的影響。例如，雖然納米綴合物是被設計為結合特異性靶標，但通過被稱為典型腫瘤效應(typical tumor effect)的BBB的許可性(permissive)(受到損傷的)內皮，所述納米綴合物也可能發生非特異性的滲透，這是由於「增強的滲透和保留」(EPR)。將使用設計的用於特異性靶標的納米綴合物給藥後獲得的圖像與對照圖像進行比較。將結果總結在一起可以表明特異性強度以及用對照分子注射的「背景」效果，在對照分子中用IgGl mAbs代替特異性祀向模塊。所述背景效果在轉化為(translation into)人類系統時值得關注，這是因為在人類腫瘤中轉鐵蛋白受體通常存在於毛細血管內皮和腫瘤細胞的表面上。通過消除抗人Tfr mAb，並僅依靠用於BTB的EPR滲透和靶向癌組織的效應，可提高腫瘤特異性。
[0146]實施例13靶向阿爾茨海默症斑塊的MRI增強劑
[0147]設計了用於阿爾茨海默症斑塊成像的MRI增強納米綴合物。此前已表明薑黃素能結合 β_ 澱粉樣斑塊(Ryu EK et al.2006 J Med Chem 49:6111)。
[0148]設計了基於聚蘋果酸的納米綴合物，所述納米綴合物包括同時連接的薑黃素(5-羥基-1，7-雙(4-羥基-3-甲氧基苯基)-1, 4，6-庚三烯-3-酮)和Gd-DOTA(2, 2' , 2" - (2- (2- (2疏基乙基氣基)-2-氧乙基)-1，4，7_四氣環十二燒_1，4，7-取代基)三乙酸)，並被設計為用於在體內靶向阿爾茨海默症β_澱粉樣斑塊並成像(圖14)。所述納米綴合物是含有Polycefin特徵及以下化學功能模塊的複合分子,所述化學功能模塊包括:MRI造影劑Gd-DOTA、用於結合澱粉樣斑塊的薑黃素、羧基和連接到聚蘋果酸上的Tfr特異性mAb。每個薑黃素和TfR mAb模塊都通過PEG間隔物連接到所述聚蘋果酸上。
·[0149]為了研究小鼠和大鼠的阿爾茨海默症模型(AD模型)的體內成像，可以使用小鼠或大鼠的TfR mAb。可以將小鼠或大鼠的TfR替換為用於人類患者成像的人類TfR。納米綴合物可以攜帶多個薑黃素分子，這可以使得在β -澱粉樣斑塊周圍牢固地結合納米綴合物，以有助於形成高對比度的尖峰(sharp contours)。含有薑黃素的納米綴合物分子也可以攜帶大量共價連接的Gd-DOTA，通常為每分子納米綴合物連接40-60個或更多的Gd。澱粉樣斑塊上的高濃度Gd可以使得在高對比度和高解析度質量的條件下通過MRI成像。任選的共價結合的跟蹤染料可有利於通過除了使用MRI以外的Xenogen成像系統對納米綴合物的分布進行體內監測，並可以使得在合成/研究的第一階段，證實薑黃素-Polycefin (無釓離子)進入腦部。跟蹤染料也可以驗證在腦內薑黃素是否連接到Polycefin上。因此，在沒有Gd的情況下，跟蹤染料對於薑黃素-Polycefin的實驗優化是有用的。
[0150]如果薑黃素的結合作用不夠強，還可使用特異性地識別人類阿爾茨海默氏斑塊的抗體。可以通過連接抗轉鐵蛋白抗體(抗TfR mAb)來實現增強劑的滲透作用，該抗體可通過轉胞吞作用攜帶增強劑穿過BBB。因為BBB轉胞吞作用是可逆的，增強劑可以非常牢固地附著在斑塊上。如果薑黃素的結合作用不夠強，可以用斑塊特異性mAb代替薑黃素連接至所述平臺上。在平臺上連接多個薑黃素殘基可通過多重結合提高斑塊結合強度。如果設計的強度需要進一步增強，也可以使用抗體來進行替代。
[0151]實施例14 N-烷基化的一般程序[0152]圖15示出了薑黃素-PEGiqqq-胺的合成。將含有0.2毫摩爾B0c-PEGiqqq-NH2的2毫升乙腈溶液加入至含K2CO3 (1.2毫摩爾)的2ml乙腈懸液中，將反應混合物在室溫下攪拌10分鐘。將含有經修飾的薑黃素(0.2毫摩爾)的2毫升乙腈溶液加入到反應混合物中，並讓反應在室溫下繼續進行72小時。將反應混合物過濾以除去未溶解的固體，並用乙腈洗滌。將濾液濃縮，殘留物置於甲醇中通過交聯葡聚糖LH 20柱(sephadex LH 20)。收集含有產物的級分，除去甲醇。產物無需進一步純化而直接用於下一步。反應產率為73%。
[0153] 實施例15 Boc脫保護的一般程序
[0154]將9毫升3M鹽酸的甲醇溶液加入至B0c-NH-PEGiqqq-薑黃素中，並在室溫下攪拌反應混合物16小時。用旋轉蒸發器將溶劑蒸發乾。將緊實(thick)的固體溶解在水中並冷凍乾燥，得到所需產物，為暗黃色固體。反應產率96%。
[0155]將薑黃素衍生物以及2-巰基-1-乙胺和Gd-DOTA共價連接聚蘋果酸的經NHS激活的羧基上，以得到MRI增強劑，如圖16所示。該圖中顯示薑黃素和Gd-DOTA都連接到聚蘋果酸(PMLA，30KDa)上。薑黃素和Gd-DOTA各佔據了 5%的聚蘋果酸羧基側基。連接模塊的百分比可以增加至最多佔羧基側基的30%或以上，從而提高試劑(reagent)的MRI強度。
[0156]實施例15與聚蘋果酸結合的薑黃素(5%)的結合
[0157]與聚蘋果酸結合的薑黃素可用於離體的人腦組織斑塊的染色(圖17)。具有AD的人腦切片(上部圖像)和正常人腦切片(下部圖像)經20 μ MPolycefin-薑黃素(右側圖像)染色和20μ M游離薑黃素(左圖像)染色後通過螢光成像進行分析。參照圖17，觀察到左上圖比右上圖中的亮斑數目更多，表明從人類阿爾茨海默症(AD)患者獲得的腦切片中的阿爾茨海默症斑塊與聚蘋果酸-薑黃素的結合要強於游離薑黃素。在下部圖像中可見，在包括從健康個體獲得的腦部切片的對照中就沒有發生結合。聚蘋果酸薑黃素綴合物的濃度可以降低到2 μ Μ。使用聚蘋果酸-薑黃素比使用游離薑黃素更為有利，因為即使在高濃度(如高於200μ Μ)下也不會顯示染色背景。這表明，與聚蘋果酸的結合大大增強了薑黃素的溶解度。
[0158]實施例16阿爾茨海默症的診斷和監測
[0159]納米綴合物Gd-DOTA/聚蘋果酸/薑黃素(5%) /抗小鼠TfR mAb可用作對斑塊成像的MRI增強劑。成像的策略還可以包括用高螢光染料AlexaFluor 680代替Gd-DOTA，並且使用Xenogen成像系統，研究允許在阿爾茨海默症的小鼠腦中進行螢光檢測的條件。也可以使用抗斑塊mAb代替薑黃素。對於螢光檢測，使用Gd-DOTA (最高可能的％) /聚蘋果酸/薑黃素或抗斑塊抗體/抗TfR mAb用於MRI系統成像。
[0160]本申請通篇引用的文獻，均出於本文所有顯而易見的目的而被納入本文，並且對於文獻本身，如同將它們全文納入本文一樣。為了說明，這些參考文獻的特定部分被引用到本文特定的位置。文獻在特定位置的引用表明將參考文獻的教導的方法納入本文。然而，文獻在特定位置的引用，不限制將引用的參考文獻教導的所有方法，出於任何目的而納入本文。
[0161]因此，應當理解的是本發明不限於已公開的【具體實施方式】，旨在涵蓋如從屬權利要求、如上的說明和/或如附圖所示所定義的，在本發明的精神和範圍內的所有變型。
【權利要求】
1.一種納米綴合物，該納米綴合物含有基於聚蘋果酸的分子骨架、至少一個成像部分以及至少一個靶向模塊，其中，所述至少一個成像部分中的一個或多個綴合到基於聚蘋果酸的分子骨架上，並且，所述至少一個靶向模塊中的一個或多個綴合到所述基於聚蘋果酸的分子骨架上。
2.根據權利要求1所述的納米綴合物，其中，所述至少一個成像部分的每一個都綴合到所述基於聚蘋果酸的分子骨架上，並且，所述至少一個靶向模塊的每一個都綴合到所述基於聚蘋果酸的分子骨架上。
3.根據權利要求1所述的納米綴合物，其中，所述至少一個成像部分包括造影劑。
4.根據權利要求3所述的納米綴合物，其中，所述造影劑含有螯合分子。
5.根據權利要求4所述的納米綴合物，其中，所述螯合分子選自由1，4，7，10-四氮環十二烷-1，4，7，10-四乙酸、二乙烯三胺五乙酸、1，4，7，10-四氮環十二烷_1，4，7，10-四(2-丙酸)和1，4，8，11-四氮環十四烷-1，4，8，11-四乙酸所組成的組中。
6.根據權利要求5所述的納米綴合物，其中，所述造影劑還含有由所述螯合分子螯合的順磁性離子。
7.根據權利要求6所述的納米綴合物，其中，所述順磁性離子選自由釓、鉻、錳、鐵、鏑、銪和鋱所組成的組中。
8.根據權利要求7所述的納米綴合物，其中，所述造影劑包括Gd-DOTA。
9.根據權利要求1所述的納米綴合物，其中，所述至少一個靶向模塊中的每一個均獨立地選自由抗體、肽、多肽、寡核苷酸和化學治療劑所組成的組中。
10.根據權利要求9所`述的納米綴合物，其中，所述抗體特異性結合選自由表皮生長因子受體、粘連層蛋白411、胰島素樣生長因子、轉鐵蛋白受體蛋白和腫瘤壞死因子-α所組成的組中的蛋白。
11.根據權利要求9所述的納米綴合物，其中，所述抗體包括西妥昔單抗或赫賽汀中的至少一種。
12.根據權利要求1所述的納米綴合物，其中，所述至少一個靶向模塊能夠靶向病變細胞或病變組織的組分。
13.根據權利要求1所述的納米綴合物，其中，所述至少一個靶向模塊能夠靶向β澱粉樣斑塊。
14.根據權利要求13所述的納米綴合物，其中，所述至少一個靶向模塊包括薑黃素。
15.一種用於促進受試者的細胞或組織成像的試劑盒，該試劑盒包括含有基於聚蘋果酸的分子骨架、至少一個成像部分和至少一個靶向模塊的納米綴合物，其中，所述至少一個成像部分中的一個或多個綴合到基於聚蘋果酸的分子骨架上，並且，所述至少一個靶向模塊中的一個或多個綴合到基於聚蘋果酸的分子骨架上。
16.根據權利要求15所述的試劑盒，其中，該試劑盒還包括藥學上可接受的緩衝液。
17.根據權利要求15所述的試劑盒，其中，該試劑盒還包括使用說明書。
18.—種祀向受試者細胞或組織的方法,該方法包括 對受試者進行組合物的給藥，所述組合物包括基於聚蘋果酸的分子骨架、至少一個成像部分和至少一個靶向模塊，其中，所述至少一個成像部分中的一個或多個綴合到基於聚蘋果酸的分子骨架上，並且，所述至少一個靶向模塊中的一個或多個綴合到基於聚蘋果酸的分子骨架上。
19.根據權利要求18所述的方法，其中，所述至少一個成像部分包括造影劑。
20.根據權利要求19所述的方法，其中，所述造影劑含有螯合分子。
21.根據權利要求20所述的方法，其中，所述螯合分子選自由1，4，7，10-四氮環十二烷-1，4，7，10-四乙酸、二乙烯三胺五乙酸、1，4，7，10-四氮環十二烷_1，4，7，10-四(2-丙酸)和1，4，8，11-四氮環十四烷-1，4，8，11-四乙酸所組成的組中。
22.根據權利要求21所述的方法，其中，所述造影劑還含有螯合到所述螯合分子上的順磁性離子。
23.根據權利要求22所述的方法，其中，所述順磁性離子選自由釓、鉻、錳、鐵、鏑、銪和鋪所組成的組中。
24.根據權利要求19所述的方法，其中，成像造影劑包括Gd-DOTA。
25.根據權利要求20所述的方法，其中，該方法還包括使受試者中的成像造影劑可視化。
26.根據權利要求25所述的方法，其中，通過磁共振成像技術進行可視化。
27.根據權利要求26所述的方法，其中，該方法還包括，通過獲得病變細胞或病變組織的圖像，並將所述圖像與 健康個體的正常細胞或組織的對照圖像進行比較，以對疾病或其它狀況進行診斷。
28.根據權利要求27所述的方法，其中，所述疾病選自由阿爾茨海默症、癌症、風溼性關節炎和糖尿病性視網膜病變所組成的組中。
29.根據權利要求28所述的方法，其中，所述癌症選自由三陰性乳腺癌、HER-2陽性乳腺癌和成膠質細胞瘤所組成的組中。
30.根據權利要求28所述的方法，其中，所述癌症包括原發性癌症或轉移癌中的至少一種。
31.根據權利要求18所述的方法，其中，所述至少一個靶向模塊的每一個均獨立的選自由抗體、肽、多肽、寡核苷酸和化學治療劑所組成的組中。
32.根據權利要求18所述的方法，其中，所述至少一個靶向模塊中的一個或多個特異性針對β澱粉樣斑塊。
33.根據權利要求32所述的方法，其中，所述至少一個靶向模塊包括薑黃素。
34.根據權利要求18所述的方法，其中，所述至少一個靶向模塊靶向病變細胞或病變組織，並且，給藥的步驟導致疾病或狀況的至少一種症狀減輕或消除。
35.根據權利要求34所述的方法，其中，該方法還包括，對受試者的疾病或其它狀況的治療效率進行監測，所述監測的方法包括:獲得受試者在第一次給藥步驟後的細胞或組織的第一圖像；獲得第一次給藥一段時間後的所述細胞或所述組織的第二圖像；並將所述第一圖像和第二圖像進行對比。
36.根據權利要求18所述的方法，其中，該方法還包括使所述納米綴合物在病變細胞或病變組織中積累一段時間。
37.一種合成納米綴合物的方法，該方法包括: 提供含有多個羧基側基的聚蘋果酸； 使含有巰基和胺基酸基團的化合物起反應，通過羧基側基使巰基添加到所述聚蘋果酸上，以形成活化的聚蘋果酸； 使含有巰基結合基團的至少一個成像部分與所述活化的聚蘋果酸反應，以形成綴合物前體； 使含有巰基結合基團的至少一個靶向模塊與所述綴合物前體反應。
38.根據權利要求37所述的方法，其中，所述至少一個成像部分包括活化的造影劑分子。
39.根據權利要求38所述的方法，其中，所述活化的造影劑分子包括釓-1，4，7，10-四氮環十二烷-1，4，7，10-四乙酸-胺。
40.根據權利要求37所述的方法，其中，所述至少一個靶向模塊包括活化的抗體。
41.根據權利要求40所述的方法，其中，所述活化的抗體包括抗體-聚乙二醇-馬來醯亞胺。
42.根據權利要求37所述的方法，其中，所述至少一個靶向模塊包括活化的薑黃素-聚乙二醇_胺。
43.根據權利要求 37所述的方法，其中，所述至少一個靶向模塊特異性結合受試者病變細胞或組織的組分，所述組分選自由表皮生長因子受體、人受體生長因子、粘連層蛋白.411、胰島素樣生長因子、轉鐵蛋白受體蛋白、薑黃素和腫瘤壞死因子-α所組成的組中。
【文檔編號】A61K49/00GK103582497SQ201280026653
【公開日】2014年2月12日 申請日期:2012年4月6日 優先權日:2011年4月6日
【發明者】K·L·布萊克, J·Y·柳比莫娃, A·V·柳比莫夫, E·哈勒爾 申請人:西奈醫療中心