人脂聯素elisa試劑盒的製作方法

2023-12-04 19:24:16 1

專利名稱：人脂聯素elisa試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明涉及醫學免疫學人脂聯素單克隆抗體工程，並涉及人脂聯素ELISA試劑盒的製備，以及試劑盒在檢測人脂聯素含量中的應用。
背景技術：
脂聯素(Adiponectin，APN)是由脂肪細胞合成和分泌的一種與細胞外基質相互作用的脂肪細胞因子，也稱Acrp30、apMl、AdipoQ、GBP28。人類脂聯素單體由244個胺基酸組成，包括有3個區域氨基末端信號序列、膠原結構域和羧基末端的球形結構域 (globular domain of APN，gAd)。脂聯素以三聚體(65kDa)、六聚體(150kDa)和高分子量 (HMW, 18-36個單體，> 280kDa)聚合體三種亞型存在於血液中。
血清中脂聯素的濃度範圍在2 30μ g/mL，佔血漿蛋白總量的0. 01%，無晝夜節律變化。交聯反應和蔗糖梯度離心實驗顯示，高分子量寡聚體由2 6個三聚體脂聯素聚合而成。電鏡顯示，三聚體呈球柄狀結構，三個單體中的兩個通過C端22位的胱氨酸(C22) 形成的二硫鍵相連；六聚體則由兩個相鄰的三聚的球形結構域和一個單一的膠原柄組成。 脂聯素的球形結構域本身也可形成同源三聚體，但不能形成高分子量的寡聚體。
製備脂聯素的方法包括提純、基因工程製備。其中基因工程是現在最常用的方法，基因工程製備脂聯素又可以分為大腸桿菌等原核細胞表達的重組脂聯素、真核細胞表達的重組脂聯素。真核表達的脂聯素的功能分析揭示了糖基化修飾的脂聯素作為胰島素增敏劑的效應明顯強於原核表達的非糖基化脂聯素。這提示了脂聯素的翻譯後修飾對其發揮最佳的生物學活性是必不可少的。
脂聯素的測定方法有多種，CN200480029098公開了 作為在各種多聚體混存的血液試樣中測定脂聯素總量的方法，有進行在十二烷基硫酸鈉(SDS)的存在下煮沸，使各種多聚體中立體結構上隱藏的抗體的識別部位暴露出的處理之後，進行免疫學測定的方法 (日本專利特開2000-304748公報)的報導。但是，該方法中存在需要用於煮沸(100°C ) 處理的裝置、從煮沸處理到免疫學測定的兩個工序實現自動化實際上是很困難的等問題。
血清中的存在HMW、六聚體及三聚體脂聯素。CN200980106328公開了 免疫學性測定殘留的脂聯素，從而直接檢測HMW脂聯素含量、並間接將三聚體、六聚體部分各自分別測定的方法(W02005/038457、Ebinuma H, et al. Clinica Chimica Acta. 372 :47-53,2006.)
CN 200980106328為解決上述課題進行銳意研究的結果，發現了通過使各種蛋白酶中的糜蛋白酶作用於含多聚體脂聯素的樣品，在小鼠、大鼠等中也能選擇性地消化HMW 部分以外的脂聯素，以及利用蛋白酶的消化處理之後，將殘留的HMW脂聯素進行免疫學性測定，就可以分級測定HMW脂聯素。但是，這樣的方法步驟複雜，操作不便，糜蛋白酶的成本尚ο
《排溢法ELISA，一種改進的二步法標記免疫實驗技術》(《中國免疫學雜誌》，2010 年，第26卷)指出
固相酶聯免疫吸附實驗(ELISA)的發展迄今已超過40年，其實驗類型繁多，反應方式亦曾歷多次重要改進。通常情況下，排溢法檢測所用標記抗體溶液的密度與粘度越高， 分層維持的時間越長，分層界限越清晰。然而過高的密度與粘度對標記抗體在溶液中的彌散及其免疫結合會帶來一定程度的負面影響。為達到理想的實驗結果，在標記抗體稀釋液的配製過程中，通過加入幾種經優化選擇的高、低分子溶質提升稀釋液的密度；通過改變此兩類化劑的比例調節稀釋液的粘度；在某些特殊(密度與粘度要求較高)的實驗場合，尚需適當延長反應時間，或加入適量免疫活性劑以促進標記抗體與固相化抗原的結合。鑑於在不同實驗體系中標記抗體稀釋液的製備須經歷一個較具個性化的，複雜而細緻的優化過程，其具體配製方法我們將在有關研究中作進一步的闡述。
而目前用於檢查脂聯素抗體的ELISA方法的缺點是血清中所含的高濃度的非特異性抗體可直接吸附到固相載體上，有時也可吸附到包被抗原的表面，從而導致本底較高或者可能出現假陽性的結果。克服ELISA的假陽性和較高本底，使得反應更加均勻，一直是科研的熱點。
目前，常用脂聯素單克隆抗體、脂聯素ELISA試劑盒均購自美國R&D Systems公司。脂聯素ELISA試劑盒價格昂貴、操作時間長、不利於大規模檢測人脂聯素含量。因此， 如何研製步驟簡單，操作方便的脂聯素測定方法是本發明所要解決的問題。發明內容
本發明所要解決的技術問題是針對上述現有技術的不足，提供一種基於雙抗體夾心原理研製的檢測人脂聯素含量的ELISA試劑盒。
本發明的技術方案是
用於製備抗人脂聯素單克隆抗體的一對雜交瘤細胞株
雜交瘤細胞株XA187 No. 1，中國典型培養物保藏中心，武漢，保藏編號CCTCCN0 C201160,
雜交瘤細胞株XA187 No. 19，中國典型培養物保藏中心，武漢，保藏編號CCTCCN0 C201161。
用於製備抗人脂聯素單克隆抗體的一對雜交瘤細胞株XA187 No. 1(簡稱為 XA187-1)及XA187 No. 19 (簡稱為XA187-19)在製備人脂聯素ELISA試劑盒上的應用。
本發明使用Wfestern Blot的方法證明，XA-187-1 (其製備檢測抗體)和 XA-187-19(其製備包被抗體)能夠特異性結合人血漿中天然構象的三種亞型脂聯素。由於人血漿中脂聯素存在三種亞型，本試劑盒能直接檢測人血漿中脂聯素總量，即三種亞型之和。
人脂聯素ELISA試劑盒的簡要製備過程是
複製人脂聯素基因編碼區；製備重組人脂聯素；抗人脂聯素單克隆抗體的製備； 製備辣根過氧化物酶(HRP)標記的檢測抗體；96孔酶標板的包被；配置樣品稀釋液、底物、 底物稀釋液、洗滌液、非離子活性劑等試劑、建立人脂聯素定量檢測試劑盒標準曲線。
一種人脂聯素ELISA試劑盒，所述試劑盒，其組成如下
(1)預包被抗人脂聯素單克隆抗體的96孔酶標板1塊；該單克隆抗體來自於雜交瘤細胞株XA187 No. 19 ；
(2)樣品稀釋液1瓶250ml，其為含10%小牛血清的磷酸鹽緩衝液；
(3)檢測抗體工作液1瓶12ml，其含有辣根過氧化物酶標記的抗人脂聯素單克隆抗體；該單克隆抗體來自於雜交瘤細胞株XA187 No. 1 ；
(4)底物稀釋液1瓶12ml，其含pH5. 0磷酸鹽-檸檬酸鹽緩衝液和3%過氧化氫；
(5)底物2，2』-連氮基-雙-(3-乙基苯並二氫噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽1瓶6mg;
(6)洗滌液1瓶50ml，其為含1. 0%吐溫-20的ρΗ7· 420 X磷酸鹽緩衝液；
(7)標準品2管，每管含人脂聯素凍乾粉IOOng ；
(8)非離子活性劑，聚氧乙烯辛基酚醚、聚氧乙烯烷基酚醚或聚氧乙烯脂肪醇醚 5ml，在稀釋液添加之後，按照10 μ L非離子活性劑/ImL稀釋液的比例添加；
抗人脂聯素單克隆抗體是由本發明的一對雜交瘤細胞株製備所得。
非離子活性劑用於增溶，使得反應更加均勻。
用於製備抗人脂聯素單克隆抗體抗原的引物
上遊引物5，-CGGGGTACCATGCTGTTGCTGGGAGCTGTTCTACTGCTATTAGCTC-3，
下遊引物5，-CCGGAATTCTCAGTGATGGTGGTGGTGATGGTTGGTGTCATGGTAG-3，


圖1反轉錄-聚合酶鏈反應產物1 %的瓊脂糖凝膠電泳
圖2Κρη I酶、EcoR I雙酶切質粒後1 %的瓊脂糖凝膠電泳
圖3篩選所得^3_ΑΡΝ細胞
圖4重組人脂聯素10%非變性聚丙烯醯胺凝膠電泳
圖 5Western Blot 檢測具體實施方式
為了實現本發明的技術方案，本發明採用了如下具體實施方式
。
實施例1人脂聯素基因的克隆構建及其序列分析
試驗材料
辣根過氧化物酶(HRP)為上海生工產品，質粒pMD 18_T，TaqDNA聚合酶，Kpn I酶、 EcoRI酶、T4DNA連接酶和DNAMarker為大連寶生物公司產品。質粒小提及中提試劑盒、DNA 凝膠回收試劑盒為omiga公司產品。載體pCDNA3. 1⑴、1Trizol為hvitrogen公司產品。 M-MLV逆轉錄酶為promega產品。鼠抗人脂聯素單克隆抗體購自CST公司；Ni-NTA純化柱 Qiagen公司；人胚胎腎細胞(human embryonic kidney cells,HEK293)購自美國菌種保藏中心(美國ATCC)；以及DMEM高塘培養基、胎牛血清為Hycolon公司產品；轉染試劑FuGENE HD為羅氏產品；二硫蘇糖醇(DTT)、DEPC水、G418、氨苄青黴素等試劑等均為進口或國產分析純試劑，DH5 α感受態細胞購自北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司，抗兔綠色螢光二抗購自北京康為世紀生物科技有限公司。
1.人脂聯素基因編碼區克隆
液氮中取出人腹部皮下脂肪組織lg，放入研缽中，加入少量液氮，迅速研磨，待組織變軟，再加少量液氮，再研磨，反覆三次，加入15mL Trizol試劑，總RNA的提取按說明常規操作。紫外分光光度計測定RNA的純度及含量，利用瓊脂糖凝膠電泳快速鑑定所提取的總RNA的質量。人脂肪組織總RNA的提取得到了總RNA，經紫外分光光度計測定其純度為A260nm/A280nm = 1.90。
引物設計、反轉錄、聚合酶鏈反應及其產物的純化根據已報導的人脂聯素基因編碼區序列(GENBANK基因登陸號為D45371)設計引物，由上海生工合成。
上遊引物5，-CGGGGTACCATGCTGTTGCTGGGAGCTGTTCTACTGCTATTAGCTC-3，
下遊引物5，-CCGGAATTCTCAGTGATGGTGGTGGTGATGGTTGGTGTCATGGTAG-3，
cDNA 第 1 鏈的合成按照 Promega 公司 M-MLVReverse Transcriptase 說明書進行，主要操作步驟如下
在聚合酶鏈反應管中加入總RNA1. 5 μ g，隨機引物oligo (dT) 2 μ L (濃度為10 μ mol/L)，DEPC水補足至12 μ L，混合均勻，70°C孵育5min後迅速冰浴，加入 M-MLV5XBuffer4y L, 10mmol/L dNTPmix 2 μ L, M-MLVReverse Transcriptase (200U/ μ L) 1 μ L，力Π ddH20至總體系20μ L，42°C反應60min，70°C孵育IOmin終止反應。
人脂聯素基因編碼區克隆(cDNA的聚合酶鏈反應)=Template cDNA 4yL，上遊引物 2μ L，下遊引物 2μ L，Taq DNA Polymerase 12. 5 μ L，加 H2O 至 25 μ L。反應條件94 °C 預變性5min ；94°C變性30s, 55°C退火30s, 72°C延伸lmin, 30個循環；72C延伸IOmin0聚合酶鏈反應產物經瓊脂糖凝膠電泳分析後，快速取771bp左右處的條帶進行割膠純化。
2. DNA序列分析
根據已知序列設計的引物，以人腹部皮下脂肪組織RNA為摸板，特異性地擴增出約771bp的目的條帶，與理論值相符，此條帶電泳位置與實驗設計一致，提示擴增產物為脂聯素片段。反轉錄-聚合酶鏈反應產物的瓊脂糖凝膠電泳(見圖1)。
擴增的人脂聯素基因片段與pcDNA3. 1⑴載體的連結及其DNA序列分析
(1)酶切用Kpn I酶、EcoR I酶雙酶切擴增的人脂聯素基因片段及pcDNA3. 1⑴ 載體，酶切產物經瓊脂糖凝膠電泳分析後，分別取 750bp處的條帶(目的片段)和 5.41Λ處的條帶(線性化載體)進行割膠，利用DNA凝膠回收試劑盒，按照操作說明回收純化。
(2)連結按照線性化載體與目的片段的量為1 3比例，取2yL線性化載體 pcDNA3. 1 (+)、6 μ L回收的人脂聯素基因片段、1 μ LT4DNA連接酶及1 μ L連接緩衝液混勻， 16 °C連接過夜。
(3)轉化及鑑定將連接反應液10 μ L加入IOOyL的感受態細菌DH5 α中，冰浴 30min，42°C熱休克90s，冰浴5min，加入900 μ L無氨苄青黴素抗性的LB液體培養基，37°C 溫和振搖lh，3500r/min離心lmin，棄去900 μ L上清，留100 μ L均勻塗在含氨卞青黴素的選擇性LB培養基上，37 °C恆溫培養16h。
挑取單克隆於含100μ g/mL氨苄青黴素的5mL LB中37°C過夜培養，離心收集菌體，利用質粒小提試劑盒小量提取質粒(pcDNA3. 1-APN)。用Kpn I酶、EcoR I雙酶切此質粒，經的瓊脂糖凝膠電泳鑑定(見圖2)，在 750bp處有特異性條帶。DNA序列分析由上海生工生物科技有限公司完成。重組質粒的人脂聯素DNA序列分析，與GenBank的人脂聯素基因序列(D45371) —致，見序列表。將測序成功的含質粒菌液製作甘油菌於_80°C保存。
實施例2重組人脂聯素的製備
1.質粒(pcDNA3. 1-APN)的提取取_80°C保存的含質粒甘油菌液少量，劃LB平板(100yg/ml氨苄青黴素)，37°C活化過夜，挑取單個克隆，接種於:3ml LB培養基(100 μ g/ ml氨苄青黴素)，37°C過夜培養，取ImL培養液按1 50的比例接種新鮮LB培養基 (100μ g/ml氨苄青黴素)，37°C培養12hr。離心收集菌體，利用質粒中提試劑盒提取質粒 (pcDNA3. 1-APN)。紫外分光光度計測定其濃度。
2.重組pcDNA3. 1-APN穩定轉染人胚胎腎細胞(human embryonic kidney cells, HEK293)將HEK293細胞在35mm細胞培養皿中培養到80%匯合(3_6 X IO5細胞/35mm培養皿)。按照 FuGENE HD Transfection Reagent 操作說明使重組 pcDNA3. I-APN 轉染 293 細胞，即將ρ⑶NA3. 1⑴-APN 2 μ g禾Π 97 μ L的細胞培養基(無血清、無抗生素的DMEM高糖) 混合均勻，並向其中加入3μ L的轉染試劑，混合均勻。室溫下混合物反應15-25分鐘，然後將其混合液滴加入上述培養細胞的培養液中。Mhr後，用含有G418的培養基(DMED高糖， 10%的胎牛血清)以400 μ g/mL的量更新培養基。然後用含有400yg/mlL G418培養基更新培養基7-10天，在此期間，無G418抗性基因的細胞以及陰性對照細胞被完全殺死。挑選 G418抗性細胞克隆，建立^3-APN細胞株(見圖3)。將篩選的得到的^3_APN細胞系保存於液氮中。
3.重組人脂聯素的表達與純化
目的蛋白C端融合有組氨酸標籤(6Xhis)，用金屬親和柱純化。將對數生長期的 293-APN細胞傳代至用75cm2培養瓶中培養，5瓶，用含10%小牛血清DMEM高糖培養基培養2天，待細胞鋪滿瓶底(細胞密度達到90%)後，換成無血清DMEM繼續培養4天，收集培養上清。2500g離心10分鐘，以出去細胞碎片。再用50mmol/L磷酸鈉、300mmol/L氯化鈉緩衝液(PH7. 0)透析2次，以除去培養基中Ca2+和狗2+等2價離子。透析後的培養上清上 Ni-NTA親和層析柱。
吸除培養基，用磷酸鹽緩衝液清洗細胞3次，加入含0. 25%胰酶的磷酸鹽緩衝液消化細胞，離心收集細胞，按照細胞和液體1 20的比例加入預冷的磷酸鹽緩衝液，反覆吹打重懸細胞。超聲(VCX 105)破碎細胞後，12000g，4°C離心30min，吸取上清。
將細胞裂解上清加入用磷酸鹽緩衝液預先平衡的Ni-NTA柱，流速(lml/min)。以大於4倍柱床體積的平衡緩衝液(磷酸鹽緩衝液，20mM Imidazole)洗柱後，用洗脫緩衝液 (磷酸鹽緩衝液，IOOmM Imidazole)洗脫人脂聯素。洗脫後的蛋白以Millipore centricon Plus-20濃縮並除去hidazole並將緩衝液跟換為磷酸鹽緩衝液。
4.純化產物鑑定取純化得到的人脂聯素20uL加入5XSDS凝膠加樣緩衝液 5 μ L，混勻，100°C煮沸5分鐘，再以12000轉/分鐘離心10分鐘。在10%非變性聚丙烯醯胺凝膠中電泳(見圖4)，經考馬斯亮藍染色脫色，UVP凝膠成像系統掃描，所得重組人脂聯素蛋白條帶在> IOOKDa處，純度> 90%。
送上海生工測定可溶脂聯素蛋白的序列是見序列表中。該序列與人脂聯素的胺基酸序列相同。
高效液相色譜法檢測分離純化的重組人脂聯素純度，達到標準品脂聯素純度的 95%，因此，可以按照標準品使用。
5.脂聯素蛋白的凍幹分裝將純化的脂聯素蛋白用Lowry法定量，用無菌濾器 (0. 22 μ m)過濾除菌，分裝於數個1. 5ml離心管中，使每管脂聯素蛋白含量為100 μ g，然後用凍幹機凍幹至成為凍乾粉，置-20°C保存。
實施例3小鼠抗人脂聯素單克隆抗體的製備
以XA-187-1為例，小鼠抗人脂聯素單克隆抗體聚體製備步驟如下
第1步，動物免疫
取純化的人重組脂聯素蛋白150 μ g溶於1. 5ml生理鹽水並與等量弗氏完全佐劑 (購自Sigma公司)混和後充分乳化，背部皮下多點注射BALB/c小鼠，免疫3隻8周齡雌性BALB/c小鼠，依次間隔4周和3周行第2次及第3次免疫，其中第二次免疫應用弗氏不完全佐劑，第3免疫不加佐劑，免疫途徑為腹腔注射。第3次免疫後10天間接ELISA方法檢測血清效價(包被抗原為酶切並純化的蛋白)，效價達到1 5萬以上後準備融合。
第2步，飼養細胞的製備
細胞融合前3天，腹腔注射加強免疫，抗原劑量50 μ g。融合前1天，無菌衝洗雌性BALB/c小鼠的腹腔巨噬細胞，以不完全RPMI 1640洗滌1次，用40ml含20%小牛血清的RPMI 1640重懸，100 μ 1/孔鋪入96孔細胞培養板，置37°C ,5% CO2，相對飽和溼度培養箱中備用。
第3步，免疫脾細胞的製備
取免疫小鼠脾臟，放入5ml盛有不完全培養液的平皿中，置於200目的不鏽鋼網上，用注射器內芯研磨脾臟，並用不完全培養液衝洗鋼網，使脾細胞完全通過鋼網擠壓到溶液中。將脾細胞懸液轉入到50ml離心管中，加不完全培養液至30ml。IOOOrpm離心5分鐘， 棄去上清；加不完全培養液將沉澱細胞再洗滌一次(重複以上步驟)，將細胞懸垂至10ml， 混勻，用細胞計數板計數。
第4步，骨髓瘤細胞懸液的製備
離心收集處於對數生長期的SP2/0細胞，總數為5 6X 107，棄上清，以不完全 RPMI 1640洗滌1次。取對數生長的骨髓瘤細胞SP2/0，IOOOrpm離心5min，棄上清，用不完全培養液混懸細胞後計數，取所需的細胞數，用不完全培養液洗滌2次。
第5步，細胞融合及雜交瘤篩選
將骨髓瘤細胞與脾細胞按1 10或1 5的比例混合在一起，在50ml塑料離心管內用不完全培養液洗滌2次，1200rpm 8min,棄上清，用滴管吸淨殘留液體，輕輕彈擊離心管底，使細胞沉澱略為鬆動。在室溫下融合，30s內加入37°C預熱的lml45% PEG，邊加邊攪拌，之後作用90s，加37°C預熱的不完全培養液，以終止PEG的促融作用，連續每aiiin內分別加入 lml、2ml、3ml、4ml、5ml 和 10ml。離心 800rpm，6min，棄上清，用 40ml 20%小牛血清RPMI 1640輕輕混懸，將融合後的細胞懸液加入含有飼養細胞的96孔板，100 μ 1/孔，置 37°C,5% CO2,相對飽和溼度培養箱中培養。
在融合M小時後，每孔加入5 X HAT選擇培養液50 μ 1，3天後換液1次，改為 1ΧΗΑΤ/ΗΤ選擇培養液，3天後再次換液，改用1 XHT培養液，約2 3天後，取孔內上清，間接ELISA方法陽性克隆(包被抗原為酶切並純化的蛋白)並進行克隆化。無菌取BALB/c小鼠脾臟，製備脾細胞懸液，用80ml含20%小牛血清和2 X HT的RPMI1640重懸，100 μ 1/孔鋪入96孔細胞培養板，置37°C，5% CO2，相對飽和溼度培養箱中備用。將雜交瘤細胞調整密度至10個/ml，100 μ 1/孔鋪入已加入脾細胞懸液的96孔細胞培養板，置37°C，5% CO2, 相對飽和溼度培養箱中培養6 7天後待克隆長出後再次檢測，連續克隆化直至連續2次 100%陽性。挑取陽性比較強的克隆擴大培養，留取培養上清並製備腹水。最終篩選獲得能穩定分泌抗人脂聯素的雜交瘤細胞株，命名為XA187-1，交由武漢大學中國典型培養物保藏中心予以保藏。
第6步，單克隆抗體的製備及純化
以1 X IO6個/只的量腹腔注射預先致敏8-10周齡的BABL/C雌性小鼠，7_10天後，採集小鼠腹水，用間接ELISA方法檢測單抗的效價。腹水4°C、12000rpm離心15min，取 1份(體積)腹水與2份(體積)0. 06MpH4. 8的醋酸緩衝液混合，每毫升腹水逐滴加入正辛酸33 μ L，室溫攪拌30min。4°C靜置2小時以上使其充分沉澱，然後4°C、12000rpm離心 30min，棄去沉澱，上清經砂芯漏鬥過濾後加入1/10體積的0. 1ΜρΗ7. 4的磷酸鹽緩衝液，用 2M NaOH調節pH至7. 4。冰浴下於30min內加入0. 277g/mL的硫酸銨使飽和度達到45%， 4°C靜置1小時以上，然後4°C、10000rpm離心30min，棄去上清。沉澱用含有137mM NaCl, 2. 6mM KC1、0. 2mM EDTA的pH7. 4磷酸鹽緩衝液溶解，並於50-100倍體積的上述磷酸鹽緩衝液中4°C透析過夜。然後用Q Sepharose Fast Flow交換柱層析技術進一步純化。平衡緩衝液為20mM pH7. 5的Tris-HCl緩衝液、洗脫緩衝液為含1. OM NaCl的20mM pH7. 5的 Tris-HCl緩衝液，層析柱XK 16/20 JharmaciaAKTAFPLC層析系統。按照廠商提供的說明書裝柱，平衡緩衝液平衡層析柱、流速5mL/min。上樣完畢後用3倍柱體積的平衡緩衝液洗去未結合蛋白，以NaCl遞增的線性梯度洗脫結合的抗體蛋白，線性梯度為0-1. OMNaCl/lO倍柱體。檢測A280，收集洗脫的抗體蛋白。SDS-PAGE檢測純度，用本領域常用的紫外分光光度法測定抗體含量，用間接ELISA法檢測抗體效價。
XA-187-19小鼠抗人脂聯素單克隆抗體的製備方法同XA-187-1。篩選所得能穩定分泌抗人脂聯素(XA-187-19)的雜交瘤細胞株，交由武漢大學中國典型培養物保藏中心予以保藏。
第7步，Western Blot檢測小鼠抗人脂聯素單克隆抗體XA-187-19和XA-187-1與天然構象人血漿脂聯素特異性結合
1.樣品處理
取1.5ml EP管一隻，加入去離子水75 μ 1，再加入人血漿25 μ Γ混勻，即按照1 4 稀釋後，加入上樣緩衝液25 μ 1 (未加β -巰基乙醇)，吹打混勻備用。
2.電泳
(1)配製電泳緩衝液取預先配製好IOX電泳緩衝液100ml，加去離子水稀釋至 1000ml，燒杯中充分混勻。
(2)組裝電泳裝置從4°C冰箱取出預製梯度膠2塊(BI0-RAD，161-1104)，拆封並撕去膠條，裝入電泳槽中，將電泳液加滿內槽並觀察是否滲漏，如無滲漏將電泳液加滿內外槽(外液略低於內液)。
(3)上樣按照15 μ 1/孔，加入製備好的非變性蛋白樣品，最後孔加蛋白標準 5 μ 1。
(4)電泳連接電泳儀，打開電泳儀(BIO-RAD Powerpac HC高流電源，型號 164-5052)，程序設置為=Sl :80伏，20分種；S2 :100伏，1小時。再次檢查連結無誤，開始電泳。
3.轉膜
(1)配製轉膜緩衝液取預先配製好的IOX轉膜緩衝液80ml，加去離子水稀釋至800ml，再加入甲醇200ml，混勻後4°C冰箱預冷。
(2)準備轉膜裝置採用溼轉方法。取出溼轉儀(上海天能TanonEPS-300)，將軟膜海綿浸泡於轉膜緩衝液中。準備好冰盒。
(3)轉膜電泳完成後，從槽中取出膠板，清水衝洗乾淨，撬開兩層膠板，根據需要切取蛋白標準在43kDa以上膠塊，浸泡於預冷後的轉膜緩衝液中。按照膠塊大小，分別剪出相應大小的醋酸纖維膜和濾紙，並浸泡於轉膜緩衝液中。按照從負極到正極依次為黑色板、軟膜海綿、2層濾紙、膠、醋酸纖維膜、2層濾紙、軟膜海綿、紅色板的順序組裝轉膜裝置 (此過程在轉膜緩衝液中進行，不能有氣泡)。將轉膜槽放入冰盒中，連結到電源。設置轉膜條件為100伏、2小時。檢查連接無誤，開始轉膜。
4.立春紅染色
轉膜結束後，在膜的右上角進行標記。用5%的立春紅染色5min，可見明顯蛋白條帶，IXTBST 清洗，IOminX 3 次。
5.封閉
用IX TBST配製濃度為5%的脫脂奶粉40ml。將醋酸纖維膜浸泡其中，搖床低速搖動2小時。封閉結束後，IXTBST清洗，IOminX 3次。
6. 一抗雜交
(1) 一抗配製①包被抗體按照1 100稀釋於aiil IXTBST中；②檢測抗體 按照1 200稀釋於anl IXTBST中；③對照抗體(R&D，MABl 1192)按照1 1500稀釋於 1.5ml IX TBST中。以上抗體提前10分鐘配製備用。
(2)將膜封閉於充滿相應抗體的塑料小袋中，4°C搖床過夜。
(3) 14 16小時後，取出醋酸纖維膜，IXTBST清洗，IOminX 3次。
7. 二抗雜交
(1) 二抗配製①包被抗體和檢測抗體均選用抗小鼠二抗(公司北京康為世紀生物科技有限公司，貨號CW0102)，按照1 2000稀釋於細1 1 X TBST中；②對照抗體選用抗大鼠二抗(公司北京康為世紀生物科技有限公司，貨號CW0104)，按照1 2000稀釋於 2ml IX TBST中。以上抗體提前10分鐘配製備用。
(2)將膜封閉於充滿相應二抗的塑料小袋中，室溫搖床1小時。
(3)取出醋酸纖維膜，IXTBST清洗，10minX3次。
8.顯影
取顯影液Iml充分淋灑醋酸纖維膜，照相(顯影液MILLIP0RE，WKBLS0100 ；顯影儀=BioSpectrum AC chemi HR 410)(見圖 5)。
實施例4辣根過氧化物標記抗體XA-187-1
稱取5mg辣根過氧化物酶(HRP)溶解於ImL蒸餾水中，加入0. 2mL新鮮配製的0. IM 過碘酸鈉溶液，室溫下避光攪拌20min。將上述溶液裝入透析袋中對ImM pH4. 4的醋酸鈉緩衝液於4°C透析過夜。加入20 μ L0. 2Μ、ρΗ9· 5的碳酸鹽緩衝液，使ρΗ升高到9. 0-9. 5，立即加入IOmg抗體ΧΑ187-1，室溫避光輕輕攪拌池。加0. ImL新鮮配製的硼氫化鈉溶液(^ig/ mL)，混勻放置4°C 2小時，然後對0. 15M、pH7. 4磷酸鹽緩衝液於4°C透析過夜。攪拌條件下逐滴加入等體積飽和硫酸銨溶液、4°C靜置1小時，然後3000rpm、4°C離心30min，棄去上清。 沉澱物用半飽和硫酸銨洗2次，最後沉澱物溶於少量0. 15M、pH7. 4的磷酸鹽緩衝液中。透析除去銨離子，IOOOOrpm離心30min，上清即為酶標抗體XA187-1-HRP，分裝後冰凍保存。酶標抗體的濃度測定採用紫外吸光光度法，按公式
脂聯素(g/L) = (OD280mi-OD405nmXO. 3) X0. 62計算。65%的脂聯素和抗體結合、超過99%的脂聯素與HRP結合，酶HRP和抗體的活性無損失。
實施例596孔酶標板的包被
將所獲得的抗體分裝於1. 5mL離心管中，每管100 μ L，_20°C保存。
製備預先固定包被抗體的固相載體
1.包被用單克隆抗體XA-187-19作包被用抗體，用50mM、pH9. 6碳酸鹽緩衝液稀釋至2. 5 μ g/mL加至96孔板，100 μ L/孔，4°C包被過夜；
2.洗滌用含0. 吐溫的磷酸鹽緩衝液洗板3次，甩幹；
3.乾燥保存存於加乾燥劑的密封袋中，4°C保存備用。
實施例6人脂聯素定量檢測試劑盒標準曲線的建立
建立檢測人脂聯素含量的標準曲線，具體操作步驟如下
(一)相關試劑的配製
1.洗滌液將前面所述的洗滌液用雙蒸水作20倍稀釋。
2.底物溶液取前面所述的底物稀釋液10ml，加入2，2』 -連氮基-雙_(3_乙基苯並二氫噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽5mg，臨用前新鮮配製，配後立即使用。
(二)標準曲線的建立
1.標準品脂聯素的配置和加樣
將預包被的酶標板用洗滌液洗4次，每次1分鐘，甩幹。用樣品稀釋液溶解脂聯素凍乾粉，濃度為100. 000ng/ml,並對比稀釋6個濃度50. 000ng/ml、25. 000ng/ml、 12. 500ng/ml、6. 250ng/ml、3. 125ng/ml、l. 563ng/ml。每種濃度的脂聯素吸取 100 μ 1 加入到上述脂聯素抗體包被孔中(每種濃度做8個復孔)，0. 000ng/ml為陰性對照。在稀釋液添加之後，按照10μ L/ml添加聚氧乙烯辛基酚醚，
也可以按照按照10 μ L/ml添加聚氧乙烯壬基酚醚等聚氧乙烯烷基酚醚或聚氧乙烯脂肪醇醚，
聚氧乙烯基脂肪醇醚，結構式為R-C(CH2CH2O)nH1式中R為10至18碳原子的烷基， η = 7 至 15 ；
聚氧乙烯烷基酚醚，結構式為R -OCCH2CH2 0)n H式中R為8至15碳原子的烷基，η = 8至202，滴加酶標抗體。
將酶標板用洗滌液洗4次，每次1分鐘，甩幹。酶標板每孔加酶標單克隆抗體父八-187-1(辣根過氧化物酶標記的抗脂聯素單克隆抗體)10(^1，371溼盒溫育1小時。
2.顯色反應及光密度值的檢測
將酶標板用洗滌液洗4次，每次1分鐘，甩幹。酶標板每孔加入2，2』 -連氮基-雙-(3-乙基苯並二氫噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽溶液100 μ 1，在震蕩器上低頻震蕩15 秒，室溫避光反應15分鐘後，10分鐘內用酶聯檢測儀測定OD 405值。
3.建立標準曲線
以標準品脂聯素濃度 100. 000,50. 000,25. 000、12. 500,6. 250,3. 125、1. 563、 0. 000ng/ml為橫坐標，以相應濃度的0D405減去空白值後為縱坐標，在坐標紙上作圖，畫出標準曲線，該曲線線性範圍較理想。該試劑盒除有8個孔用於建立標準曲線外，共可檢測88 份體液標本。
實施例7用本發明試劑盒檢測糖尿病患者及正常對照組血清脂聯素含量的方法
1.準備試劑
(1)洗滌液將20X洗滌液用雙蒸水做1 20稀釋。
(2)標準品的配製使用前在標準品管內加入2000 μ 1樣品稀釋液溶解脂聯素凍乾粉濃度為 100ng/ml,並對比稀釋 6 個濃度:50. 000ng/ml、25. 000ng/ml、12. 500ng/ml、 6. 250ng/ml、3. 125ng/ml、l. 563ng/ml。
C3)待測標本的處理取待測標本10 μ 1，使用樣品稀釋液1 200稀釋待測標本。
(4)底物工作液的配製使用前將2，2』 -連氮基-雙-(3-乙基苯並二氫噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽5mg加入底物稀釋液IOml中溶解。
2.標準品及待測標本加樣
酶標板上設標準孔8孔及待測樣品孔若干，第8孔為空白對照。上樣量均為 100 μ 1/孔，加樣後置37°C溼盒溫育1小時。
3.滴加酶標抗體
將上述酶標板用洗滌液洗4次，每次1分鐘，甩幹。再加酶標單克隆抗體 XA-187-1(辣根過氧化物酶標記的抗脂聯素單克隆抗體)工作液ΙΟΟμ 1/孔，37°C溼盒溫育 1小時。
4.顯色反應及光密度值的檢測
將上述酶標板用洗滌液洗4次，每次1分鐘，甩幹。酶標板每孔加底物工作液 100μ 1，在震蕩器上低頻震蕩15秒，37°C避光反應15分鐘。10分鐘內用酶聯檢測儀測定標準品和待測樣品OD 405值。
5.結果計算與判斷
(1)建立標準曲線以標準品脂聯素的濃度(0. 000,1. 563,3. 125,6. 250,12. 500、 25. 00,50. 000、100. 000ng/ml)為橫坐標，酶標儀測得的0D405值減去空白值後為縱坐標，建立標準曲線。在標準曲線上，隨著標準品濃度的升高，測得的0D405值也隨之升高。
(2)體液標本樣品檢測值的計算根據檢測樣品OD 405值減除空白值後在上述標準曲線上查出相應脂聯素含量。如空白孔OD 405平均值為0.198，檢測樣品脂聯素409值為0. 538，減去空白值後為0. 34，該值在標準曲線上對應的脂聯素含量為82. 42ng/ml。
本發明試劑盒質檢相關指標的檢測
1.線性範圍該試劑盒檢測脂聯素含量的線性範圍為370pg/ml lOOng/ml。
2.回收率將50ng/ml的脂聯素加入檢測樣品中，回收率為98. 94% (n = 8)。
3.批內差異平均為5%。
4.批間差異平均為13. 15%。
5.敏感性檢測糖尿病血清標本敏感性為91. 67%。
6.特異性檢測糖尿病血清特異性為88. 7%。
經臨床試用，該試劑盒檢測100例正常人和178例糖尿病患者血清脂聯素的結果如表1所示。
表1血清中脂聯素的檢測結果(χ士s，μ g/ml)
權利要求
1.用於製備抗人脂聯素單克隆抗體的一對雜交瘤細胞株雜交瘤細胞株XA187 No. 1，中國典型培養物保藏中心，武漢，保藏編號CCTCCN0: C201160,雜交瘤細胞株XA187 No. 19，中國典型培養物保藏中心，武漢，保藏編號CCTCCN0 C201161。
2.如權利要求1所述的一對雜交瘤細胞株在製備人脂聯素ELISA試劑盒中的應用。
3.如權利要求1所述的一對雜交瘤細胞株在製備人脂聯素ELISA試劑盒中的應用，其特徵在於雜交瘤細胞株XA187 No. 1製備檢測抗體； 雜交瘤細胞株XA187 No. 19製備包被抗體。
4.一種人脂聯素ELISA試劑盒，其特徵在於其組成如下(1)預包被抗人脂聯素單克隆抗體的96孔酶標板1塊；該單克隆抗體來自於權利要求 1所述的雜交瘤細胞株XA187 No. 19 ；(2)樣品稀釋液1瓶250ml，其為含10%小牛血清的磷酸鹽緩衝液；(3)檢測抗體工作液1瓶12ml，其含有辣根過氧化物酶標記的抗人脂聯素單克隆抗體； 該單克隆抗體來自於權利要求1所述的雜交瘤細胞株XA187 No. 1 ；(4)底物稀釋液1瓶12ml，其含pH5.0磷酸鹽-檸檬酸鹽緩衝液和3%過氧化氫；(5)底物2，2』-連氮基-雙-(3-乙基苯並二氫噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽1瓶6mg(6)洗滌液1瓶50ml，其為含1.0%吐溫-20的pH7. 420 X磷酸鹽緩衝液；(7)標準品2管，每管含人脂聯素凍乾粉IOOng；(8)非離子活性劑，聚氧乙烯辛基酚醚、聚氧乙烯烷基酚醚或聚氧乙烯脂肪醇醚5ml， 在稀釋液添加之後，按照10 μ L非離子活性劑/ImL稀釋液的比例添加。
5.如權利要求1所述的人脂聯素ELISA劑盒在製備檢測人脂聯素含量的試劑中的應用。
6.如權利要求1所述的用於製備抗人脂聯素單克隆抗體抗原的引物 上遊引物5，-CGGGGTACCATGCTGTTGCTGGGAGCTGTTCTACTGCTATTAGCTC-3， 下遊引物5，-CCGGAATTCTCAGTGATGGTGGTGGTGATGGTTGGTGTCATGGTAG-3，。
全文摘要
本發明涉及醫學免疫學人脂聯素單克隆抗體工程，並涉及採用雜交瘤細胞株XA187 No.1和雜交瘤細胞株XA187 No.19用於人脂聯素ELISA試劑盒的製備，以及試劑盒在檢測人脂聯素含量中的應用。
文檔編號G01N33/577GK102517256SQ20111030741
公開日2012年6月27日 申請日期2011年10月12日 優先權日2011年10月12日
發明者屈延, 廉坤, 楊璐, 金伯泉, 陶凌 申請人:陶凌