氯化二亞苯基碘鎓在製備治療細菌感染藥物中的用途的製作方法

2023-11-03 12:15:00 1

本發明屬於醫藥技術領域，特別涉及氯化二亞苯基碘鎓用於製備細菌感染治療藥物的用途。

背景技術：

感染性疾病是指病原微生物入侵機體並在局部或全身大量繁殖所引發的器質性或功能性損害，是導致臨床患者死亡的主要因素之一。細菌是最為常見的病原微生物，細菌進入機體中，一方面通過侵襲定植或釋放毒素等形式直接造成組織臟器損傷，另一方面細菌的菌體成分還可刺激機體炎症細胞活化，誘導tnf-α、il-1、il-6和hmgb-1等炎症介質的大量釋放，進而引發失控性炎症反應並導致機體多器官、多系統的損傷和功能紊亂。最終導致患者死亡。

抵禦細菌感染主要依賴於外源性的抗菌藥物和機體自身的免疫防禦功能。抗生素的應用和更新發展曾一度使得細菌性疾病得到有效的控制，但由於細菌耐藥性的增加以及多重耐藥細菌的不斷出現，以抗生素為代表的抗菌藥物的研發和應用已陷入困境。在此情況下，從提高機體自身免疫防禦的角度出發，積極尋找新型抗菌藥物，對於拓寬細菌感染、特別是耐藥菌感染的解決措施就具有重要的意義。

機體的天然免疫系統是應對病原體入侵的第一道免疫防線。天然免疫細胞的吞噬效應對其發揮抗菌防禦功能至關重要。巨噬細胞因廣泛分布於皮膚以及各組織臟器中，因而在天然免疫細胞中最先感知和抵禦病原體入侵。研究表明，巨噬細胞通過直接吞噬作用，經內體-溶酶體途徑介導對病原體的降解清除。吞噬作用也可與細胞自噬作用結合，加快巨噬細胞內體的酸化成熟及其與溶酶體的結合，提高對酵母真菌等的處理能力。另一方面，巨噬細胞吞噬病原體後，也可經抗原提呈作用活化特異性免疫反應，進一步加強對病原體的清除作用。基於上述認識，巨噬細胞的吞噬能力對於機體抗菌免疫防禦非常重要，基於調節細胞吞噬能力的策略有望為尋找感染性疾病的新型藥物靶點提供新思路。

氯化二亞苯基碘鎓（diphenyleneiodoniumchloride,dpi）屬於聯苯碘類化合物，最早發現其具有抑制糖異生的效應，可導致血糖降低。後續研究發現，該化合物的藥理作用主要與其抑制nadph氧化酶的活性，進而抑制呼吸鏈有關。研究表明，氯化二亞苯基碘鎓可能通過與nadph氧化酶的黃素基團發生相互作用而抑制相應電子轉運體，從而抑制電子傳遞和ros產生，上述作用機制也是目前該化合物的公認藥理機制。

技術實現要素：

本發明的目的是提供一種氯化二亞苯基碘鎓在製備治療細菌感染藥物中的用途，該藥物可上調天然免疫細胞對細菌的吞噬活性，抑制細菌感染所致的炎症反應，增強機體對細菌的抵抗能力。其特點是通過增加機體天然免疫細胞的吞噬能力實現對細菌的吞噬和殺傷，是一種在預防及治療細菌感染性疾病的新型的抗菌藥物。

本發明的技術方案是：

氯化二亞苯基碘鎓在製備治療細菌感染藥物中的用途。

所述的細菌為革蘭陽性細菌或革蘭陰性細菌。

所述藥物用於增加機體天然免疫細胞的吞噬能力。

所述天然免疫細胞為單核巨噬細胞或中性粒細胞。

所述氯化二亞苯基碘鎓為碘鎓鹽類化合物，其分子量為314.55，化學結構式為c12h8cli。分子結構如下：

所述藥物按照每公斤體重0.1-1mg給藥，每天1次，給藥方式為靜脈注射。

申請人對氯化二亞苯基碘鎓的促吞噬和抗菌、抗炎活性進行了研究，發現氯化二亞苯基碘鎓可增強巨噬細胞對革蘭氏陰性和陽性細菌的吞噬作用，抑制細菌感染所致的炎症反應損傷，提高細菌感染小鼠模型的存活率。因此，該化合物可通過增強機體自身細胞的吞噬能力從而實現抗感染作用，並為其可能作為抗感染藥物應用到臨床奠定基礎。

申請人對氯化二亞苯基碘鎓的體外促吞噬作用進行了藥理學研究，實驗表明，其可促進小鼠巨噬細胞吞噬革蘭陽性菌和革蘭陰性菌，且該作用與其促進鈣離子內流、上調肌動蛋白的活性有關；同時，氯化二亞苯基碘鎓可在體內外抑制細菌感染導致的炎症反應，降低小鼠組織細菌計數，提高存活率。申請人經研究發現，氯化二亞苯基碘鎓介導巨噬細胞的吞噬和殺菌活性與其對nadph氧化酶和ros的抑制效應無關，因此是一種新穎的藥理作用。

本發明所述藥物並非直接針對細菌，而是通過誘導或增強機體的自噬效應而實現，故對細菌的殺傷效應具有廣譜性的特點，特別是對耐藥細菌也具有良好的殺菌活性，可用於預防、治療細菌感染性疾病相關藥物的開發。

附圖說明

圖1為氯化二亞苯基碘鎓對小鼠巨噬細胞吞噬大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌效應的影響，圖中，ec：大腸埃希菌；sa：金黃色葡萄球菌；dpi：氯化二亞苯基碘鎓，**：p<0.01；

圖2為氯化二亞苯基碘鎓促進小鼠巨噬細胞吞噬大腸埃希菌作用的時效和量效關係測定,圖中，ec：大腸埃希菌；dpi：氯化二亞苯基碘鎓；其中圖2a表示不同濃度的氯化二亞苯基碘鎓對小鼠巨噬細胞吞噬大腸埃希菌的影響。圖2b表示氯化二亞苯基碘鎓作用不同時間後對小鼠巨噬細胞吞噬大腸埃希菌的影響；

圖3為氯化二亞苯基碘鎓促進小鼠巨噬細胞吞噬大腸埃希菌作用的特異性檢測，圖中，ec：大腸埃希菌；dpi：氯化二亞苯基碘鎓，**：p<0.01。其中圖3a表示細胞色素d對氯化二亞苯基碘鎓促進小鼠巨噬細胞吞噬大腸埃希菌的影響，3b表示溫度對氯化二亞苯基碘鎓促進小鼠巨噬細胞吞噬大腸埃希菌的影響；

圖4為三種nadph氧化酶抑制劑對大腸埃希菌誘導巨噬細胞胞內活性氧產生以及對小鼠巨噬細胞吞噬大腸埃希菌的影響，圖中，nc：陰性對照；ec：大腸埃希菌；dpi：氯化二亞苯基碘鎓；va：vas2870；eb：ebselen，**：p<0.01。其中圖4a表示三種nadph氧化酶抑制劑氯化二亞苯基碘鎓，vas2870和ebselen對大腸埃希菌誘導巨噬細胞胞內活性氧產生的影響，4b表示氯化二亞苯基碘鎓，vas2870和ebselen對巨噬細胞吞噬大腸埃希菌的影響。

圖5為氯化二亞苯基碘鎓對大腸埃希菌刺激小鼠巨噬細胞釋放炎症介質的抑制活性檢測，圖中，nc：陰性對照，ec：大腸埃希菌；dpi：氯化二亞苯基碘鎓，**：p<0.01。其中圖5a表示氯化二亞苯基碘鎓對大腸埃希菌誘導的小鼠巨噬細胞tnf-a，il-6mrna表達的影響，5b表示氯化二亞苯基碘鎓對大腸埃希菌誘導的小鼠巨噬細胞隨時間變化釋放tnf-a，il-6的影響；

圖6為氯化二亞苯基碘鎓介導鈣離子內流和肌動蛋白聚集，進而上調巨噬細胞吞噬活性的作用檢測。圖中，m：未處理對照組，ec：大腸埃希菌，dpi：氯化二亞苯基碘鎓，egta和bapta：鈣離子螯合劑，**：p<0.01。其中圖6a表示氯化二亞苯基碘鎓對巨噬細胞胞漿鈣離子水平的影響，圖6b表示鈣離子螯合劑對氯化二亞苯基碘鎓介導的巨噬細胞吞噬能力的影響，圖6c表示氯化二亞苯基碘鎓對肌動蛋白聚合能力的影響。

圖7為氯化二亞苯基碘鎓對大腸埃希菌感染小鼠組織菌計數、炎症介質水平和生存率的影響，圖中，ns：生理鹽水；ec：大腸埃希菌；dpi：氯化二亞苯基碘鎓，*：p<0.05，**：p<0.01。其中圖7a表示氯化二亞苯基碘鎓對大腸埃希菌感染小鼠存活率的影響，7b表示氯化二亞苯基碘鎓對大腸埃希菌感染小鼠後肺組織（左）以及腹腔液和腹腔巨噬細胞胞內細菌加載量（右）的影響，圖7c和7d表示氯化二亞苯基碘鎓對大腸埃希菌感染小鼠後肺、脾、肝組織以及血清中tnf-α和il-6產生的影響。

具體實施方式

本發明所述試劑和儀器如下：

試劑：氯化二亞苯基碘鎓、vas2870、ebselen、皂苷、egta、bapta、dcfh-da購於sigm-aldrich公司；

細胞色素d購於selleck公司；

f-actin染色試劑盒購於abcam公司；

大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌購於美國標準生物製品收藏中心（atcc）；

細胞培養基dmem購於lifetechnologies公司；

用於配製lb液體培養基的酵母提取物和胰蛋白腖購於oxoid公司；

氯化鈉購於成都科隆化學品有限公司；

dmso購於biosharp公司；

抗生素頭孢美唑鈉購於重慶藥友製藥有限公司；

tnf-α和il-6檢測試劑盒購於ebioscience公司；

rna提取試劑盒購於天根生化科技有限公司；

反轉錄試劑盒和rt-pcr試劑盒購於toyobo公司；

tnf-α和il-6引物由上海生工生物工程有限公司合成。

儀器：多功能讀數儀器（thermovarioskanflash），酶標儀（伯樂smartspecplus），細菌菌落計數儀（迅數菌落計數儀），實時螢光定量pcr儀（伯樂cfx96real-timesystem），二氧化碳培養箱（thermo3111型），恆溫孵箱（上海精宏實驗設備有限公司dnp-9162型），超淨工作檯（蘇淨vs-1300l-u型）。

實施例1：氯化二亞苯基碘鎓對小鼠巨噬細胞吞噬大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌效應的影響

1.1實驗方法：將體外培養的小鼠巨噬細胞接種至24孔無菌細胞培養板中，細胞密度為5×105/ml，1ml/孔。挑取種植於營養瓊脂平板上的大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌菌株的單個菌落，轉入lb培養基中增菌至對數生長期（od600約為0.5-0.8），調整菌液濃度為5×107cfu/ml，取10μl加入預先接種小鼠巨噬細胞的24孔板中，同時加入氯化二亞苯基碘鎓10μm，以加入同等體積dmso作為對照組，37℃，5%co2培養1h，加入抗生素殺滅胞外細菌後移除培養上清，細胞用200μl0.3%皂苷裂解，裂解液稀釋10倍後取100μl塗布營養瓊脂板上，37℃孵育12h，菌落計數儀計數細菌菌落數。吞噬指數=胞內細菌數/加樣總細菌數。

1.2實驗結果：由圖1結果可知，氯化二亞苯基碘鎓處理細胞後其吞噬指數顯著增加，表明氯化二亞苯基碘鎓可有效促進小鼠巨噬細胞對大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌的吞噬作用。

實施例2：氯化二亞苯基碘鎓促進小鼠巨噬細胞吞噬大腸埃希菌作用的時效和量效關係測定

2.1實驗方法：採用不同濃度（0.625，1.25，2.5，5，10μm）的氯化二亞苯基碘鎓處理小鼠巨噬細胞，或採用同一濃度（10μm）氯化二亞苯基碘鎓分別作用不同時間（0.5，1，1.5，2，2.5h）後，檢測氯化二亞苯基碘鎓對細胞吞噬大腸埃希菌的吞噬指數，具體操作方法同1.1。

2.2實驗結果：由圖2a結果可知，隨著氯化二亞苯基碘鎓濃度的增加，其吞噬指數不斷升高。同時由圖2b結果可知，隨著氯化二亞苯基碘鎓作用時間的延長，其吞噬指數也不斷升高。以上結果表明氯化二亞苯基碘鎓成劑量依賴性和時間依賴性方式促進細胞對細菌的吞噬。

實施例3：氯化二亞苯基碘鎓促進小鼠巨噬細胞吞噬大腸埃希菌作用的特異性檢測

3.1實驗方法：巨噬細胞的接種和細菌培養方法同1.1，加入氯化二亞苯基碘鎓（10μm）或同時加入細胞色素d（2.5μm）處理，按照1.1方法檢測細胞對細菌的吞噬指數。同時將細胞分別置於4℃或37℃環境下，加入氯化二亞苯基碘鎓處理後，檢測細胞對細菌的吞噬指數。

3.2實驗結果：由圖3a結果可知，細胞色素d是公認的細胞吞噬抑制劑，氯化二亞苯基碘鎓處理細胞後可顯著增加細胞對細菌的攝取能力，同時加入細胞色素d處理後相對於單獨氯化二亞苯基碘鎓組其細胞對細菌的攝取能力顯著降低，表明氯化二亞苯基碘鎓促進細胞對細菌的攝取能力是通過促進其吞噬能力實現的。由圖3b結果可知，低溫可降低細胞的吞噬能力，正常未處理細胞置於4℃時比37℃時的吞噬能力顯著降低，加入氯化二亞苯基碘鎓處理後置於4℃時同樣比37℃時的細胞攝取細菌的能力顯著降低。以上結果表明氯化二亞苯基碘鎓可通過促進巨噬細胞吞噬能力增強對細菌的攝取和清除。

實施例4：三種nadph氧化酶抑制劑對大腸埃希菌誘導巨噬細胞胞內活性氧產生以及對小鼠巨噬細胞吞噬大腸埃希菌的影響

4.1實驗方法：將體外培養的小鼠巨噬細胞接種至24孔無菌細胞培養板中，細胞密度為5×105/ml，1ml/孔。按照1.1方法加入大腸埃希菌，同時分別加入二亞苯基碘鎓、vas2870和ebselen三種nadph氧化酶抑制劑各10μm作用小鼠巨噬細胞，以加入同等體積dmso作為對照組，37℃，5%co2培養1h，加入活性氧螢光探針dcfh-da，37℃，5%co2繼續孵育20min，更換培養基，雷射共聚焦顯微鏡檢測胞內活性氧探針螢光強度。同時檢測二亞苯基碘鎓，vas2870和ebselen對細胞吞噬大腸埃希菌的吞噬指數，具體操作方法同1.1。

4.2實驗結果：由圖4a結果可知，大腸埃希菌可誘導小鼠巨噬細胞胞內活性氧水平升高，加入三種nadph氧化酶抑制劑後其活性氧水平均顯著降低，表明二亞苯基碘鎓，vas2870和ebselen可有效抑制大腸埃希菌誘導小鼠巨噬細胞活性氧的產生。由圖4b結果可知，二亞苯基碘鎓可顯著增強小鼠巨噬細胞對大腸埃希菌的吞噬作用，另兩種nadph氧化酶抑制劑vas2870和ebselen對小鼠巨噬細胞吞噬細菌無促進作用。以上結果表明，二亞苯基碘鎓促進小鼠巨噬細胞的吞噬作用與其對nadph氧化酶的抑制無關。

實施例5：氯化二亞苯基碘鎓對大腸埃希菌刺激小鼠巨噬細胞釋放炎症介質的抑制活性檢測

5.1實驗方法：將體外培養的小鼠巨噬細胞接種至96孔無菌細胞培養板中，細胞密度為5×105/ml，200μl/孔。大腸埃希菌按照1.1方法培養後，調整菌液濃度為5×107cfu/ml加樣。取氯化二亞苯基碘鎓（10μm）和細菌（5×105cfu/ml）加入預先接種的細胞，37℃，5%co2孵育2-10h，分別取上清稀釋後檢測tnf-α和il-6。取培養4h細胞提取rna，反轉錄後進行rt-pcr，檢測tnf-α和il-6mrna水平的表達情況。

5.2實驗結果：由圖5a結果可知，大腸埃希菌感染後，小鼠巨噬細胞tnf-α和il-6mrna表達顯著上調，而加入氯化二亞苯基碘鎓處理可顯著降低tnf-α和il-6mrna水平。同時由圖5b結果可知，對上清tnf-α和il-6的檢測發現，大腸埃希菌加入後2-10h可觀察到tnf-α和il-6持續釋放，而氯化二亞苯基碘鎓處理組以時間依賴的方式明顯抑制tnf-α和il-6的釋放。

實施例6：氯化二亞苯基碘鎓對小鼠巨噬細胞胞漿鈣離子水平和肌動蛋白聚合的影響

6.1實驗方法：將體外培養的小鼠巨噬細胞接種至共聚焦培養皿或24孔孔無菌細胞培養板中，細胞密度為5×105/ml。大腸埃希菌按照1.1方法培養後，調整菌液濃度為5×cfu/ml，取氯化二亞苯基碘鎓（10μm）和大腸埃希菌（5×105cfu/ml）加入預先接種在共聚焦培養皿中的細胞，37℃，5%co2孵育30min，共聚焦培養皿中加入鈣離子探針fluo4-am，37℃，5%co2孵育20min，pbs洗滌後雷射共聚焦顯微鏡檢測胞內鈣離子情況。同時將共聚焦培養皿的細胞用多聚甲醛固定後，使用鬼筆環肽對肌動蛋白f-actin染色，用dapi對細胞核染色後進行雷射共聚焦檢測，觀察f-actin聚合情況。24孔板加入大腸埃希菌（5×105cfu/ml）和氯化二亞苯基碘鎓（10μm）或同時加入鈣離子螯合劑egta(5mm)或bapta(10μm)，按照1.1方法進行吞噬指數檢測。

6.2實驗結果：由圖6a結果可知，大腸埃希菌可誘導胞內鈣離子較少的增加，加入二亞苯基碘鎓處理後，其胞內鈣離子進一步增加。由圖6b對吞噬指數檢測結果顯示，氯化二亞苯基碘鎓可顯著增強細胞的吞噬作用，然而同時加入鈣離子螯合劑egta或bapta其吞噬作用受到顯著抑制。由圖6c中f-actin的螢光染色結果顯示，不加試劑對照組沒有觀察到f-actin的明顯聚集，然而二亞苯基碘鎓處理組可顯著促進f-actin在膜上的聚集。以上結果顯示，二亞苯基碘鎓可通過促進胞內鈣離子增加誘導f-actin聚合，從而促進巨噬細胞對細菌的吞噬作用。

實施例7：氯化二亞苯基碘鎓對大腸埃希菌感染小鼠組織菌計數、炎症介質水平和生存率的影響

7.1實驗方法：6-8周的野生型balb/c小鼠腹腔注射生理鹽水或大腸埃希菌（1×108cfu/kg)，同時注射氯化二亞苯基碘鎓(1mm/kg)或等體積生理鹽水，觀察72h的存活率（n=10）。注射6h後將小鼠麻醉，用生理鹽水對腹腔進行灌洗，收集灌洗液，1000rpm離心，取上清塗布營養瓊脂板上進行細菌培養，上清加入抗生素殺滅胞外細菌後，去除上清，細胞沉澱用0.3%saponin裂解，取裂解液塗布瓊脂板上進行細菌培養。同時解剖獲取肝，脾，肺和血液，臟器加入500μl生理鹽水勻漿後離心，檢測上清細胞因子和將上清塗板進行細菌培養檢測。血液離心後取血清檢測細胞因子。

7.2實驗結果：由圖7a結果可知，腹腔注射大腸埃希菌後，模型組小鼠72h存活率為40%，氯化二亞苯基碘鎓處理組72h存活率為80%，表明氯化二亞苯基碘鎓可提高大腸埃希菌感染小鼠的存活率。由圖7b結果可知，對組織細菌加載量的檢測發現，大腸埃希菌感染6h後肺組織細菌顯著增加，而氯化二亞苯基碘鎓處理組肺組織勻漿中細菌加載量顯著減少。同時對腹腔灌洗液上清及腹腔巨噬細胞胞內的細菌量檢測發現，氯化二亞苯基碘鎓處理的小鼠其上清中的細菌量顯著減少，而胞內的細菌量顯著增加，表明氯化二亞苯基碘鎓可通過促進腹腔巨噬細胞對細菌的吞噬作用而增強對細菌的清除能力。由圖7c和7d所示，注射大腸埃希菌顯著增加了肺，脾，肝勻漿和血液上清中的tnf-α和il-6水平，然而氯化二亞苯基碘鎓可顯著抑制各臟器tnf-α和il-6水平。以上實驗結果表明，氯化二亞苯基碘鎓可在體內誘導細胞對細菌的吞噬，從而增強了對細菌的清除，改善炎症反應進而提高大腸埃希菌感染小鼠的存活率。