一種IL-6/sIL-6R雙特異性環狀核酸適配體及試劑盒與應用

2023-06-20 13:09:52

一種il-6/sil-6r雙特異性環狀核酸適配體及試劑盒與應用
技術領域
1.本發明屬於生物醫藥領域，具體地，涉及一種il-6/sil-6r雙特異性環狀核酸適配體，包含該核酸適配體的試劑盒，以及所述核酸適配體和試劑盒在製備抗炎試劑和/或免疫疾病治療試劑中的應用。


背景技術：

2.白細胞介素6(il-6)是一種多功能細胞因子，在許多炎症和免疫疾病中發揮關鍵作用，如類風溼關節炎、哮喘或克羅恩病。il-6與一種可溶性形式的il-6受體(sil-6r)相互作用，被稱為反式信號通路，主要調控促炎反應。阻斷il-6/sil-6r相互作用已被證明是抑制各種炎症和免疫疾病的一種有前途的治療策略。值得一提的是，il-6/sil-6r相互作用也被報導參與非自身免疫性疾病的進展，包括冠狀病毒疾病2019(covid-19))的細胞因子風暴。tocilizumab是一種以sil-6r為靶點的免疫抑制單克隆抗體，可阻斷il-6/sil-6r相互作用，緩解細胞因子釋放症候群，已用於covid-19重症患者的治療。然而，基於單克隆抗體的治療往往存在生產成本高、免疫相關不良事件頻發等固有缺點。
3.核酸適配體是一種單鏈核酸探針，可以通過其獨特的二級或三級結構與特定的分子靶標特異性結合。它們通常是通過一種叫做配體系統進化的體外選擇策略(systematic evolution of ligands by exponential enrichment，selex)從隨機的核酸文庫中分離出來的。為了提高篩選效率，已經報導了幾種優良的篩選方法，如微流控、液滴放大、通過人工鹼基和分子擁擠selex來擴大文庫多樣性。與抗體相比，適配體具有體積小、重現性高、可逆變性、易控制修飾、熱穩定性高、構象靈活性好、無免疫原性以及對實驗條件的適應性等優點。因此，適配體作為抗體替代品在疾病診斷和疾病治療等領域具有很大的應用潛力。
4.儘管如此，天然線性適配體作為治療性寡核苷酸使用時，由於其構象的靈活性，在生物培養基中容易被核酸酶降解，並容易受到生物培養基中大量無關物質的影響，嚴重阻礙了適配體的實際治療應用。為了提高適配體在生物環境中的穩定性，人們開發了許多優化策略，包括化學修飾和納米顆粒修飾適配體。然而，選擇後的修飾會影響適配體的特異性和親和力，且納米材料的製備過程複雜且有副作用。這些問題都給核酸適配體在生物醫療領域的後續應用造成了相當大的阻礙。


技術實現要素：

5.本發明的目的是提供一種il-6/sil-6r雙特異性環狀核酸適配體。
6.為了實現上述目的，本發明的第一方面提供一種il-6/sil-6r雙特異性環狀核酸適配體(il-6/sil-6r bispecific circular aptamer，bca)，所述環狀核酸適配的核苷酸序列選自a)～c)中至少一種：
7.a)seq id no：1所示的核苷酸序列且5』端和3』端首尾連接成環，所述seq id no：1所示的核苷酸序列為5
』‑
atctcga ctagtca gtggtgg ataccgg atgggga ggctgtg gtgaggg tatggtt gtctcgg attggtt gtctcggat-3』；
8.b)取代序列，所述取代序列為seq id no：1所示的核苷酸序列經取代獲得的核苷酸序列，所述取代序列與所述seq id no：1所示的核苷酸序列具有90％以上同源性；
9.c)缺失序列，所述缺失序列為seq id no：1所示的核苷酸序列經缺失獲得的核苷酸序列，所述缺失序列與所述seq id no：1所示的核苷酸序列具有85％以上同源性。
10.根據本發明，優選地，所述取代序列相對於seq id no：1所示的核苷酸序列的取代均為t鹼基取代。
11.根據本發明一種優選實施方式，所述取代序列相對於seq id no：1所示的核苷酸序列具有1～2段取代，每段取代包括5-21個核苷酸。每段取代可以為連續的，也可以為不連續的，不連續發生在seq id no：1中的相關位點原本就是t的情況下。
12.進一步地，所述取代序列選自b1)～b2)中至少一種：
13.b1)seq id no：2所示的核苷酸序列，所述seq id no：2所示的核苷酸序列為5
』‑
atctcga ctatttt ttttttt ttttttt ttgggga ggctgtg gtgaggg ttttttt ttttttt ttttttt gtctcggat-3』；
14.b2)seq id no：3所示的核苷酸序列，所述seq id no：3所示的核苷酸序列為5
』‑
atctcga ctagtca gtggtgg ataccgg atttttt ttttttt ttttttt tatggtt gtctcgg attggtt gtctcggat-3』。
15.根據本發明另一種優選實施方式，所述取代序列相對於seq id no：1所示的核苷酸序列的首個取代位點與末個取代位點之間的間隔小於等於3個核苷酸。所述間隔不包括首個取代位點和末個取代位點。
16.進一步地，所述取代序列選自b3)～b18)中至少一種：
17.b3)seq id no：4所示的核苷酸序列，所述seq id no：4所示的核苷酸序列為5
』‑
tttttga ctagtca gtggtgg ataccgg atgggga ggctgtg gtgaggg tatggtt gtctcgg attggtt gtctcggat-3』；
18.b4)seq id no：5所示的核苷酸序列，所述seq id no：5所示的核苷酸序列為5
』‑
atctctt tttgtca gtggtgg ataccgg atgggga ggctgtg gtgaggg tatggtt gtctcgg attggtt gtctcggat-3』；
19.b5)seq id no：6所示的核苷酸序列，所述seq id no：6所示的核苷酸序列為5
』‑
atctcga ctatttt gtggtgg ataccgg atgggga ggctgtg gtgaggg tatggtt gtctcgg attggtt gtctcggat-3』；
20.b6)seq id no：7所示的核苷酸序列，所述seq id no：7所示的核苷酸序列為5
』‑
atctcga ctagtca tttttgg ataccgg atgggga ggctgtg gtgaggg tatggtt gtctcgg attggtt gtctcggat-3』；
21.b7)seq id no：8所示的核苷酸序列，所述seq id no：8所示的核苷酸序列為5
』‑
atctcga ctagtca gtggttt tttccgg atgggga ggctgtg gtgaggg tatggtt gtctcgg attggtt gtctcggat-3』；
22.b8)seq id no：9所示的核苷酸序列，所述seq id no：9所示的核苷酸序列為5
』‑
atctcga ctagtca gtggtgg atatttt ttgggga ggctgtg gtgaggg tatggtt gtctcgg attggtt gtctcggat-3』；
23.b9)seq id no：10所示的核苷酸序列，所述seq id no：10所示的核苷酸序列為5
』‑
atctcga ctagtca gtggtgg ataccgg attttta ggctgtg gtgaggg tatggtt gtctcgg attggtt gtctcggat-3』；
24.b10)seq id no：11所示的核苷酸序列，所述seq id no：11所示的核苷酸序列為5
』‑
atctcga ctagtca gtggtgg ataccgg atggggt ttttgtg gtgaggg tatggtt gtctcgg attggtt gtctcggat-3』；
25.b11)seq id no：12所示的核苷酸序列，所述seq id no：12所示的核苷酸序列為5
』‑
atctcga ctagtca gtggtgg ataccgg atgggga ggctttt ttgaggg tatggtt gtctcgg attggtt gtctcggat-3』；
26.b12)seq id no：13所示的核苷酸序列，所述seq id no：13所示的核苷酸序列為5
』‑
atctcga ctagtca gtggtgg ataccgg atgggga ggctgtg gtttttt tatggtt gtctcgg attggtt gtctcggat-3』；
27.b13)seq id no：14所示的核苷酸序列，所述seq id no：14所示的核苷酸序列為5
』‑
atctcga ctagtca gtggtgg ataccgg atgggga ggctgtg gtgaggg ttttttt gtctcgg attggtt gtctcggat-3』；
28.b14)seq id no：15所示的核苷酸序列，所述seq id no：15所示的核苷酸序列為5
』‑
atctcga ctagtca gtggtgg ataccgg atgggga ggctgtg gtgaggg tatggtt ttttcgg attggtt gtctcggat-3』；
29.b15)seq id no：16所示的核苷酸序列，所述seq id no：16所示的核苷酸序列為5
』‑
atctcga ctagtca gtggtgg ataccgg atgggga ggctgtg gtgaggg tatggtt gtctttt tttggtt gtctcggat-3』；
30.b16)seq id no：17所示的核苷酸序列，所述seq id no：17所示的核苷酸序列為5
』‑
atctcga ctagtca gtggtgg ataccgg atgggga ggctgtg gtgaggg tatggtt gtctcgg atttttt gtctcggat-3』；
31.b17)seq id no：18所示的核苷酸序列，所述seq id no：18所示的核苷酸序列為5
』‑
atctcga ctagtca gtggtgg ataccgg atgggga ggctgtg gtgaggg tatggtt gtctcgg attggtt ttttcggat-3』；
32.b18)seq id no：19所示的核苷酸序列，所述seq id no：19所示的核苷酸序列為5
』‑
atctcga ctagtca gtggtgg ataccgg atgggga ggctgtg gtgaggg tatggtt gtctcgg attggtt gtctttttt-3』。
33.根據本發明一種優選實施方式，所述缺失序列相比seq id no：1所示的核苷酸序列缺失1-10個核苷酸，缺失的1-10個核苷酸為連續的一段序列或各自連續的兩段序列。
34.進一步地，所述缺失序列選自c1)～c3)中至少一種：
35.c1)seq id no：20所示的核苷酸序列，所述seq id no：20所示的核苷酸序列為5
』‑
atctcga ctagtca gggatac cggatgg ggaggct gtggtga gggtatg gttgtct cggattg gttgtct cggat-3』；
36.c2)seq id no：21所示的核苷酸序列，所述seq id no：21所示的核苷酸序列為5
』‑
atctcga ctagtca gtggtgg atatggg gaggctg tggtgag ggtatgg ttgtctc ggattgg ttgtctc ggat-3』；
37.c3)seq id no：22所示的核苷酸序列，所述seq id no：22所示的核苷酸序列為5
』‑
20℃保存直到所有樣品收集。將上述樣品與20μl 2
×
上樣緩衝液混合，進行10％變性page分析。使用tomos分子成像凝膠doc ex系統對凝膠進行可視化，並使用imagej軟體對條帶進行量化。
80.結果如圖1所示，同樣是針對il-6/sil-6r的核酸適配體，環狀核酸適配體bca21在50％的血清中直到48小時以後還沒有被降解，而線性核酸適配體在4.5小時達到半衰期，12小時以後全部被降解。
81.可見，環狀核酸適配體bca21在複雜生物體系中的穩定性大大優於現有的線性核酸適配體。
82.對lps誘導的細胞炎症抑制
83.i、測定雙特異性環狀適配體bca21對於lps誘導的細胞炎症的促炎因子(il-6，il-1β，cox-2)以及sil-6r的mrna表達水平。
84.將raw264.7細胞以每孔105個細胞接種於24孔培養板中，在37℃5％co2下培養一夜。用1μg/ml lps激活細胞，同時用不同濃度的bca1、bca20、bca21、bca22環狀適配體，或其他陽性對照組(sil-6r特異性rna適配體air-3、il-6特異性適配體il62、crandom和tocilizumab)處理12h。為了提取總rna，用trizol試劑裂解貼壁細胞。使用takara primescript rt試劑盒根據製造商說明將每個樣本中的rna轉化為cdna。qpcr反應採用bio-rad cfx96實時pcr檢測系統(bio-rad，hercules，ca)進行，反應條件採用如下參數：95℃變性2min，55℃退火30s，72℃延伸45s，30個循環反應。本發明對il-6、sil-6、il-1β、cox-2等靶基因的表達進行評價。
85.結果如圖2所示，在濃度為200ng/ml時，bca1、bca20、bca21和bca22對於il-6、sil-6、il-1β、cox-2等基因的表達均具有較好的抑制效果，相比於bca1，bca20、bca21和bca22的抑制效果更好，特別是bca21，對於il-6、sil-6、il-1β、cox-2等基因具有最好的抑制效果。
86.結果如圖3所示，在濃度為20ng/ml、200ng/ml、2μg/ml時，bca21對於il-6的抑制效果分別為80％、60％、49％，對sil-6r的抑制效果分別為98％、77％、52％，對il-1β的抑制效果分別為59％、45％、38％，對cox-2的抑制效果分別為75％、70％、57％。
87.可見，il-6/sil-6r雙特異性環狀核酸適配體bca21對lps誘導的細胞炎症具有最為良好的抑制作用，且具有濃度依賴性。
88.ii、以il-6/sil-6r雙特異性環狀核酸適配體(bca21)、隨機的環狀序列(crandom)，il-6特異性核酸適配體(il-62)，sil-6r特異性核酸適配體(air-3)以及sil-6r免疫抑制單克隆抗體(tocilizumab)為例，測定這些物質對lps誘導的mrna抑制效果。
89.如圖4的a-d所示，在濃度為2μg/ml時，bca21對於il-6，il-1β，cox-2以及sil-6r的抑制率分別為49％、39％、57％、52％，il-62對於il-6，il-1β，cox-2以及sil-6r的抑制率分別為96％、80％、73％、110％，air-3對於il-6，il-1β，cox-2以及sil-6r的抑制率分別為82％、113％、89％、98％，tocilizumab對於il-6，il-1β，cox-2以及sil-6r的抑制率分別為88％、63％、81％、82％，crandom對於il-6，il-1β，cox-2以及sil-6r的抑制率分別為126％、128％、115％、130％，bca21對於促炎因子mrna表達水平抑制作用最顯著。
90.此外，如圖4的e所示，2μg/ml的bca21等抑制劑處理m1態巨噬細胞後，其中，control組m1巨噬細胞(cd80
+
)比例為71.8％，bca21處理組m1巨噬細胞(cd80
+
)比例為55.5％，il-62處理組m1巨噬細胞(cd80
+
)比例為67.4％，air-3處理組m1巨噬細胞(cd80
+
)比
例為65.4％，tocilizumab處理組m1巨噬細胞(cd80
+
)比例為70.9％，crandom處理組m1巨噬細胞(cd80
+
)比例為71.6％，bca對於m1巨噬細胞(cd80
+
)的抑制作用最顯著。即bca21對lps誘導的細胞炎症的抑制效果比現有的特異性靶向il-6，sil-6r的核酸適配體以及tocilizumab效果更好。
91.以上結果說明，雙特異性環狀核酸適配體bca21對il-6，sil-6r，il-1β以及cox-2的mrna抑制作用遠遠高於隨機的環狀序列(crandom)、已有的線性il-6特異性核酸適配體(il-62)、sil-6r特異性核酸適配體(air-3)以及sil-6r免疫抑制單克隆抗體(tocilizumab)。
92.以上已經描述了本發明的各實施例，上述說明是示例性的，並非窮盡性的，並且也不限於所披露的各實施例。在不偏離所說明的各實施例的範圍和精神的情況下，對於本技術領域的普通技術人員來說許多修改和變更都是顯而易見的。