粉末載體生物親和性的測定方法及應用與流程
2023-11-01 22:40:19
1.本發明涉及粉末載體技術領域，尤其涉及一種粉末載體生物親和性的測定方法及應用。
背景技術：
2.高濃度複合粉末載體生物流化床（hpb）技術可在不增加現有生化單元佔地面積的條件下，實現汙水處理廠同步提標與擴容。該技術通過向生化池中投加複合粉末載體，提高生化池混合液濃度的同時，構建懸浮生長和附著生長「雙泥」共生的微生物系統。複合粉末載體是由較大當量粒徑微生物基礎載體和微米級替代碳源功能材料複合而成。
3.填充在反應器中的粉末載體最大的作用就是為反應器內微生物的生長繁殖提供穩定的棲息場所。因此，考察粉末載體表面的生物量可直接反映載體的生物親和性的好壞。常規載體（填料）的粒徑較大（》1mm），能夠較好實現與活性汙泥進行分離，從而能夠測量出生物量從而表徵載體的生物親和性。然而，粉末載體粒徑較小（《200μm），與活性汙泥絮體顆粒從粒徑、密度等方面相近，粉末載體與活性汙泥絮體顆粒二者分離過程困難，從而導致了無法用常規的評價方法進行其生物親和性的評價。
技術實現要素：
4.本發明的主要目的是提供一種粉末載體生物親和性的測定方法及應用，以解決粉末載體生物親和性無法測量的技術問題。
5.為實現上述目的，本技術第一方面提供一種粉末載體生物親和性的測定方法，包括以下步驟：提供一載體混合物，並記錄載體混合物的掛膜天數，載體混合物包括粉末載體和附著在載體上的待測微生物。
6.將載體混合物中的待測微生物進行染色形成染色微生物，得到染色混合物。
7.獲取染色混合物在螢光下的顯示圖像，螢光為染色混合物中的染色微生物經激發產生。
8.根據顯示圖像得到顯示圖像中的粉末載體的載體面積，以及位於粉末載體範圍內的染色微生物的微生物面積，並獲得微生物面積和粉末載體面積的面積比。
9.根據面積比以及掛膜天數判斷粉末載體的生物親和性。
10.可選地，將載體混合物中的待測微生物進行染色形成染色微生物的步驟包括：將待測微生物採用細菌細胞活性測定試劑在黑暗的條件下進行染色。
11.可選地，染色微生物在激發波長為488 nm的條件下，產生發射波長最大值為500 nm的螢光。
12.可選地，根據顯示圖像得到顯示圖像中的載體面積的步驟包括：根據顯示圖像中的粉末載體的邊緣，得到粉末載體的邊緣構成的圖形的面積。
13.可選地，根據顯示圖像得到位於粉末載體範圍內的染色微生物的微生物面積的步
驟包括：根據顯示圖像中位於粉末載體的邊緣構成的圖形內染色微生物的染色區域，得到染色區域的面積。
14.可選地，載體混合物的數量為多個。
15.根據面積比以及掛膜天數判斷粉末載體的生物親和性的步驟包括：根據多個載體混合物的面積比得到面積比平均值，根據面積比平均值以及掛膜天數判斷粉末載體的生物親和性。
16.可選地，載體混合物包括第一粉末載體混合物和第二粉末載體混合物。其中，第一粉末載體混合物包括第一粉末載體和附著在第一粉末載體上的第一待測微生物。第二粉末載體混合物包括第二粉末載體和附著在第二粉末載體上的第二待測微生物。第一粉末載體和第二粉末載體之間、第一待測微生物和第二待測微生物之間中僅有一者相同。
17.根據面積比以及掛膜天數判斷粉末載體的生物親和性的步驟包括：根據第一面積比與第二面積比的大小、第一粉末載體混合物的掛膜天數與第二粉末載體混合物的掛膜天數判斷第一粉末載體與第二粉末載體的生物親和性。第一面積比為在第一粉末載體混合物染色獲得的顯示圖像中的微生物面積和第一粉末載體面積的面積比。第二面積比為在第二粉末載體混合物染色獲得的顯示圖像中的微生物面積和第二粉末載體面積的面積比。
18.可選地，在第一粉末載體混合物和第二粉末載體混合物的掛膜天數相同的情形下，第一面積比與第二面積比中的數值大的一者對應的載體的生物親和性大。
19.可選地，在第一面積比與第二面積比的大小相同的情形下，第一粉末載體混合物與第二粉末載體混合物的掛膜天數中的數值小的一者對應的粉末載體的生物親和性大。
20.本技術第二方面提供上述的測定方法在製備粉末載體生物流化床中的應用。
21.上述的粉末載體生物親和性的測定方法，對待測微生物進行染色，因而在顯示圖像中可以較好識別染色微生物，從而獲得微生物面積與粉末載體的載體面積的比值，進而結合掛膜天數判斷粉末載體的生物親和性。上述的粉末載體生物親和性的測定方法，不需要將載體和待測微生物進行分離稱重，克服了由此帶來的生物親和性無法測定的問題。
附圖說明
22.為了更清楚地說明本發明實施例或現有技術中的技術方案，下面將對實施例或現有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發明的一些實施例，對於本領域普通技術人員來講，在不付出創造性勞動的前提下，還可以根據這些附圖示出的結構獲得其他的附圖。
23.圖1是本技術一實施方式的掛膜1天的微生物死活染色及成像圖；其中，a為de載體混合液的微生物死活染色及成像圖；b為無機砂混合液的微生物死活染色及成像圖；圖2是本技術一實施方式的掛膜2天的微生物死活染色及成像圖；其中，a為de載體混合液的微生物死活染色及成像圖；b為無機砂混合液的微生物死活染色及成像圖；圖3是本技術一實施方式的掛膜3天的微生物死活染色及成像圖；其中，a為de載體混合液的微生物死活染色及成像圖；b為無機砂混合液的微生物死活染色及成像圖；圖4是本技術一實施方式的掛膜5天的微生物死活染色及成像圖；其中，a為de載體
混合液的微生物死活染色及成像圖；b為無機砂混合液的微生物死活染色及成像圖；圖5是本技術一實施方式的掛膜10天的微生物死活染色及成像圖；其中，a為de載體混合液的微生物死活染色及成像圖；b為無機砂混合液的微生物死活染色及成像圖；圖6是本技術一實施方式的掛膜15天的微生物死活染色及成像圖；其中，a為de載體混合液的微生物死活染色及成像圖；b為無機砂混合液的微生物死活染色及成像圖；圖7是本技術一實施方式的掛膜20天的微生物死活染色及成像圖;其中，a為de載體混合液的微生物死活染色及成像圖；b為無機砂混合液的微生物死活染色及成像圖。
24.本發明目的的實現、功能特點及優點將結合實施方式，參照附圖做進一步說明。
具體實施方式
25.下面將結合本發明實施方式中的附圖，對本發明實施方式中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施方式僅僅是本發明的一部分實施方式，而不是全部的實施方式。基於本發明中的實施方式，本領域普通技術人員在沒有做出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施方式，都屬於本發明保護的範圍。
26.需要說明，本發明實施方式中所有方向性指示（諸如上、下
……
）僅用於解釋在某一特定姿態（如附圖所示）下各部件之間的相對位置關係、運動情況等，如果該特定姿態發生改變時，則該方向性指示也相應地隨之改變。
27.另外，在本發明中如涉及「第一」、「第二」等的描述僅用於描述目的，而不能理解為指示或暗示其相對重要性或者隱含指明所指示的技術特徵的數量。由此，限定有「第一」、「第二」的特徵可以明示或者隱含地包括至少一個該特徵。
28.並且，本發明各個實施方式之間的技術方案可以相互結合，但是必須是以本領域普通技術人員能夠實現為基礎，當技術方案的結合出現相互矛盾或無法實現時應當認為這種技術方案的結合不存在，也不在本發明要求的保護範圍之內。
29.為實現上述目的，本技術第一方面提供一種粉末載體生物親和性的測定方法，包括以下步驟：s101:提供一載體混合物，並記錄載體混合物的掛膜天數，載體混合物包括粉末載體和附著在載體上的待測微生物。
30.粉末載體可以填充在反應器中。微生物具有兩種狀態，一種為附著生長在載體上，另一種為懸浮狀態，懸浮在水中。部分微生物會附著在載體上掛膜生長，通常隨著掛膜天數的增加，微生物的量也會增加。附著在載體上的微生物為待測微生物。單個載體混合物為單個粉末載體和附著在載體上的待測微生物。載體混合液包括水和載體混合物。
31.s102:將載體混合物中的待測微生物進行染色形成染色微生物，得到染色混合物。
32.在該步驟中，為了染色方便以及後續觀察方便，可以將載體混合物放置在載玻片上進行染色。染色所用的染料可進入微生物內，這樣染料激發產生顏色，使得待測微生物呈現相應的顏色，而便於觀測和獲取顯示圖像。染色混合物包括粉末載體和附著在載體上的染色後的待測微生物。由於取樣時，樣品中除了載體混合物外，還可能包括懸浮狀態的微生物，因此，在染色時，除了對待測微生物進行染色之外，還可能對懸浮狀態的微生物也進行了染色。
33.在一些實施例中，將載體混合物中的待測微生物進行染色形成染色微生物的步驟
包括：將待測微生物採用細菌細胞活性測定試劑在黑暗的條件下進行染色。
34.在該步驟中，細菌細胞活性測定試劑進入活的微生物激發後顯示顏色不同於，細菌細胞活性測定試劑進入受損或死亡微生物激發後顯示顏色，如此可以區分活的微生物以及受損或死亡微生物。細菌細胞活性測定試劑對待測微生物染色，粉末載體不會染色，提高了檢測結果的準確性。
35.細菌細胞活性測定試劑（例如可以使用細菌細胞活性測定試劑盒（live / dead bac light tm bacterialviability kit，l-7012））在黑暗條件下對待測微生物進行染色15 min。以下以細菌細胞活性測定試劑為細菌細胞活性測定試劑盒為例進行說明。
36.上述的粉末載體生物親和性的測定方法，對待測微生物進行染色，因而在顯示圖像中可以較好識別染色微生物，從而獲得微生物面積與粉末載體的載體面積的比值，進而結合掛膜天數判斷粉末載體的生物親和性。上述的粉末載體生物親和性的測定方法，不需要將粉末載體和待測微生物進行分離稱重，克服了由此帶來的生物親和性無法測定的問題。可以理解的是，上述的粉末載體生物親和性的測定方法適用於粉末載體上的微生物未完全覆蓋粉末載體時，測量粉末載體的親和性。
37.s103:獲取染色混合物在螢光下的顯示圖像，螢光為染色混合物中的染色微生物經激發產生。
38.染色後的染色混合物可以置於雷射共聚焦掃描電子顯微鏡下觀察。染色後的待測微生物經雷射激發產生螢光。可以將染色後的染色混合物激發顯示的圖像保存，得到顯示圖像。
39.在一些實施例中，染色微生物在激發波長為488 nm的條件下，產生發射波長最大值為500nm的螢光。
40.在該條件下，試劑盒中syto 9染料可直接進入活微生物，使膜內微生物顯示為綠色螢光；受損或死亡微生物則顯示為紅色螢光。綠色螢光和紅色螢光的顏色區分度較大，便於分辨和識別活微生物和受損或死亡微生物。
41.s104:根據顯示圖像得到顯示圖像中的粉末載體的載體面積，以及位於粉末載體範圍內的染色微生物的微生物面積，並獲得微生物面積和載體面積的面積比。
42.在該步驟中，可以將顯示圖像導入圖像處理軟體（例如， imagej ）中處理。在一些實施例中，根據顯示圖像得到顯示圖像中的載體面積的步驟包括：根據顯示圖像中的粉末載體的邊緣，得到粉末載體的邊緣構成的圖形的面積。
43.示例性地，粉末載體形狀相對較為規則，例如粉末載體為硅藻土，硅藻土為圓盤狀，故而其邊緣規則，在後續的顯示圖像中易於識別硅藻土邊緣。圖像處理軟體容易識別粉末載體的邊緣，粉末載體的邊緣構成的圖形較為清晰，可以計算得到粉末載體的面積。當粉末載體的部分邊緣被遮擋時，可根據粉末載體的未被遮擋的邊緣及粉末載體的整體形狀確定被遮蓋的部分邊緣，如，硅藻土的部分邊緣被遮擋時，可根據硅藻土的圓盤狀輪廓以及未被遮擋的邊緣位置，確定被遮蓋的部分邊緣的位置。
44.示例性地，粉末載體顏色與其他物質的顏色有較大差異，如無機砂、沸石、活性炭，以石英砂為例，在顯示圖像中無機砂的顏色與其他物質（如待測微生物，淤泥）的顏色有較大差異，從而識別無機砂的邊緣。圖像處理軟體容易識別粉末載體的邊緣，粉末載體的邊緣
構成的圖形較為清晰，可以計算得到粉末載體的面積。
45.在一些實施例中，根據顯示圖像得到位於粉末載體範圍內的染色微生物的微生物面積的步驟包括：根據顯示圖像中位於粉末載體的邊緣構成的圖形內染色微生物的染色區域，得到染色區域的面積。
46.染色微生物因而顯示特定的顏色，容易與周邊環境區分，如粉末載體的邊緣以及粉末載體上未附著染色微生物的區域。粉末載體範圍內的染色微生物的微生物面積，即位於粉末載體的邊緣構成的圖形內的染色微生物的染色區域面積。
47.因此，也可以通過圖像處理軟體計算得到染色微生物的微生物面積。然後計算微生物面積和粉末載體的面積二者的面積比。
48.s105:根據面積比以及掛膜天數判斷粉末載體的生物親和性。
49.面積比以及掛膜天數可以評價該待測微生物對該載體的親和性，記錄該數據。可以理解的是，可以以該方法獲得各待測微生物對各載體的面積比以及掛膜天數，從而建立一個親和性的資料庫。
50.面積比大的說明該載體上附著的微生物的數量較多，因而，該微生物對該載體的親和性較好。而達到一定面積比所需的掛膜天數小，也說明微生物對該載體的親和性較好。
51.由於單個粉末載體的體積小，因而在反應中取樣時，樣品中可能包括單個或多個載體混合物。在一些實施中，載體混合物的數量為多個。即顯示圖像中包括多個粉末載體的圖像、多個粉末載體上的染色微生物圖像以及懸浮狀態的染色微生物圖像。
52.根據面積比以及掛膜天數判斷粉末載體的生物親和性的步驟包括：根據多個載體混合物的面積比得到面積比平均值，根據面積比平均值以及掛膜天數判斷粉末載體的生物親和性。這樣一來，可以更為準確的判斷粉末載體的生物親和性。
53.在一些實施例中，載體混合液包括第一粉末載體混合物和第二粉末載體混合物。其中，第一粉末載體混合物包括第一粉末載體和附著在第一粉末載體上的第一待測微生物。第二粉末載體混合物包括第二粉末載體和附著在第二粉末載體上的第二待測微生物。第一粉末載體和第二粉末載體、第一待測微生物和第二待測微生物中僅有一者相同。
54.根據面積比以及掛膜天數判斷粉末載體的生物親和性的步驟包括：根據第一面積比與第二面積比的大小、第一粉末載體混合物的掛膜天數與第二粉末載體混合物的掛膜天數判斷第一粉末載體與第二粉末載體的生物親和性。第一面積比為在第一粉末載體混合物染色獲得的顯示圖像中的微生物面積和第一粉末載體面積的面積比。第二面積比為在第二粉末載體混合物染色獲得的顯示圖像中的微生物面積和第二粉末載體面積的面積比。
55.也就是說在比較第一粉末載體混合物和第二粉末載體混合物時，或者兩個待測微生物相同而對應的載體不同，或者兩個載體相同而對應的待測微生物不同。這樣在可以評價不同的待測微生物在同一載體上的親和性，或者同一待測微生物在不同的載體上的親和性。
56.在一些實施例中，在第一粉末載體混合物和第二粉末載體混合物的掛膜天數相同的情形下，第一面積比與第二面積比中的數值大的一者對應的載體的生物親和性大。在相同掛膜天數的條件下，面積比大的說明該載體上附著的微生物的數量較多，因而，該微生物
對該載體的親和性較好。
57.在另一些實施例中，在第一面積比與第二面積比的大小相同的情形下，第一粉末載體混合物與第二粉末載體混合物的掛膜天數中的數值小的一者對應的載體的生物親和性大。同樣地，在相同面積比的條件下，面積比大的說明該載體上附著的微生物的數量較多。
58.本技術第二方面提供上述的測定方法在製備粉末載體生物流化床中的應用。
59.實施例1：sbr反應器運行過程分為進水、厭氧、好氧、沉澱、排水和靜置階段，時間分別為10、120、90、30和28min，充水比為1:3，進水cod/tn=4，溶解氧控制在2.0mg/l。
60.按照上述運行條件進行sbr反應器運行，運行30 d，汙泥採自於花橋汙水處理廠，並過100目網篩，去除較大顆粒和雜質；反應器進水採用實驗室配水，採用乙酸鈉、氯化銨、硝酸鉀和磷酸二氫鉀配製進水cod、氨氮、硝酸鹽氮和總磷分別為100mg/l、25 mg/l、25 mg/l和3 mg/l。載體選擇硅藻土載體粉末，平均粒徑為48.6微米。
61.（1）取硅藻土載體（也可以稱為de載體）de載體混合液樣品（運行至完全掛膜完成），將載體置於載玻片上，使用細菌細胞活性測定試劑盒（live / dead bac light tm bacterial viability kit，l-7012）於黑暗條件下對樣品進行染色15 min。
62.（2）染色後的de載體置於雷射共聚焦掃描電子顯微鏡下觀察。激發波長為488nm，發射波長最大值為500 nm。試劑盒中syto 9染料可直接進入活微生物，使膜內微生物顯示為綠色螢光強度；受損或死亡微生物則顯示為紅色螢光。表明載體表面富集的菌體是有較高活性的。
63.（3）通過軟體 imagej 測出單個載體面積s1，另外統計出單個載體面積活微生物（綠色）面積s2，通過s2/s1的比值反應載體的生物親和性，可以設定：在s2/s1為50%的相同掛膜天數下，天數越小表示載體生物親和性越好，說明其掛膜速度快；或者在相同的掛膜天數條件下，s2/s1的值越大，表示載體生物親和性越好，說明其生長的生物量大。
64.實驗結果載體微生物活性實驗參見圖1至圖7，圖1至圖7分別為運行1天、2天、3天、5天、10天、15天以及20天的微生物死活染色及成像圖。在圖1至圖7中，右側圖（即採用b標識的圖）為無機砂混合液樣品的微生物死活染色及成像圖，左側圖（即採用a標識的圖）為de載體混合液的微生物死活染色及成像圖。為便於理解，在圖1至圖7中，用較為稀疏的虛線框標識de載體，較為緻密的虛線框標識石英砂。
65.通過對不同運行時間de載體、無機砂混合液樣品進行微生物活死細胞染色及成像實驗，對拍攝結果進行分析可知：隨著掛膜實驗的進行，活細胞的數量不斷增加，並且附著在生物載體上的微生物活細胞不斷增加。
66.為便於理解，在圖4中，a處所示的虛線框中，de載體的面積為16287px（pixel，像素），載體所在範圍內的微生物面積為3050px，微生物面積和de載體面積的面積比為18.7%。b處所示的虛線框中，載體的面積為1947px，載體所在範圍內的微生物面積為147px，微生物面積和de載體面積的面積比為7.5%。
67.其他天數的圖片中，載體的面積、載體所在範圍內的微生物面積可以參照上述方
法進行測量。
68.結論從載體微生物活性實驗結果說明de載體相較於無機砂具有更好的生物親和性。
69.本發明的上述技術方案中，以上僅為本發明的優選實施例，並非因此限制本發明的專利範圍，凡是在本發明的技術構思下，利用本發明說明書及附圖內容所作的等效結構變換，或直接/間接運用在其他相關的技術領域均包括在本發明的專利保護範圍。