一種利用適配子快速檢測水產品中孔雀石綠的方法
2023-11-10 11:54:22 1
專利名稱：一種利用適配子快速檢測水產品中孔雀石綠的方法
技術領域：
本發明涉及食品檢測領域，尤其涉及一種水產品中孔雀石綠的檢測方法。
背景技術：
孔雀石綠(Malachite green,簡稱MG),屬三苯曱烷類染料，其代謝 物為無色孔雀石綠(Leucomalachite green, LMG),長期以來，由於孔雀 石綠在水產養殖中具有良好的抗真菌病，水產品保鮮以及價格低廉等優 點，因此，成為許多養殖戶青睞的"漁藥"來使用，但這兩種物質所均具 有高毒素、高殘留和高致畸、致突變等副作用，不僅給我國水產品的出口 帶來了巨大障礙，而更為重要的是，給人們的健康構成了潛在威脅。
鑑於孔雀石綠及其代謝物的危害性，許多國家都將其列為水產養殖禁 用藥物，我國也於2002年5月將其列為《食品動物禁用的獸藥及其化合 物清單》中，然而，由於水產養殖戶健康養殖的意識淡薄，以及水產品安 全管理機制的不完善等原因，僅2005年，就在國內許多地方(尤其是福 建、江西和浙江)的多種水產品(如鰻魚、甲魚等)中檢測出孔雀石綠 的高殘留。
目前，關於孔雀石綠及其代謝物的檢測方法主要有三種，但這些方法 均存在著一定局限性(l)高效液相色譜法，當含量較低時，利用保留時 間很難定性；(2)氣質聯用法，只能用來對無色孔雀石綠的進行定性；(3) 液質聯用法(LC/MS ),效果較好，但價格昂貴；因此，孔雀石綠及其代 謝物在水產動物中快速、穩定可靠殘留檢測方法的建立成為國內外亟待解 決的技術難題。
但孔雀石綠具有很強的免疫毒性，製備孔雀石綠特異性抗體是一個非常困 難的工作，而且製備一種抗體周期也比較長， 一般需要6個月以上。因此
瓶頸問題。
寡核苷酸適配子技術是近年來發展的一種新型的分子印跡技術，是釆
用SELEX技術體外篩選獲得的。SELEX技術由Tuerk和Gold等在90年 代初建立的，通過多輪的選擇和擴增過程(PCR或RT-PCR)從隨機寡核 苷酸文庫中篩選特異識別靶物質的寡核苷酸適配子的組合化學技術，是一 種研究核酸結構與功能的有效方法。SELEX技術自創立以來得到迅猛發 展，目前因其具有庫容量大、篩選的適配子的靶分子範圍廣、親和力高與 特異性強等優點已在生命科學基礎研究、疾病治療、藥物篩選和臨床診斷 等領域得到了廣泛的探索和運用。
中國發明專利申請200510060995.1中公開了 一種水產品中無色孔雀 石綠間接竟爭ELISA檢測試劑盒。試劑盒的檢測板為包被無色孔雀石綠 與白蛋白偶聯物的可拆96孔酶標板，抗無色孔雀石綠抗體為利用無色孔 雀石綠與白蛋白的偶聯物免疫小鼠而製備的單克隆抗體，檢測樣品先經過 勻質後用乙酸乙酯和環己烷進行提取，調節pH值後稀釋用於檢測。樣本 檢測的判定標準為以標樣濃度的對數值為橫坐標，抑制率為縱坐標的回 歸曲線。才艮據每個樣品的抑制率就可從曲線上讀出相對應樣品的濃度。該 方法檢測的靈敏度為0.0023嗎/ml,檢測範圍是0.0016-1 (ig/ml。但該技術中高效的單克隆抗體的獲得十分困難，也增加了成本。
發明內容
本發明提供一種操作方便，準確度高的水產品中孔雀石綠的快速檢測 方法。
一種利用適配子快速檢測水產品中孔雀石綠的方法，將待測樣品與孔 雀石綠適配子和帶有檢測標記物的報告序列混合，報告序列與待測樣品中 的孔雀石綠可竟爭性地與孔雀石綠適配子結合後，檢測(用酶相對的顯色 底物檢測)4艮告序列上的標記物，計算待測樣品中孔雀石綠含量。
所述的檢測標記物為辣根過氧化物酶、化學發光基團、化學螢光基團 或膠體金等。
所述的報告序列的製備根據獲得的孔雀石綠適配子序列，設計合成 與適配子序列部分(5 ，端回文互補序列)互補的報告序列，將檢測標記物 標記在淨艮告序列上。
所述的孔雀石綠適配子通過如下步驟製得
(1)構建一個序列長度約為80個鹼基的隨機ssDNA文庫，ssDNA 序列兩端帶有限制性內切酶位點的固定序列、中間為35個序列隨機的鹼 基，根據ssDNA序列兩端的固定序列設計PCR引物；
(2 )採用不對稱PCR法或生物素-鏈親和素磁珠法對步驟(1 )得到 的ssDNA文庫進行擴增；
(3 )利用孔雀石綠-OVA偶聯物包被微孔板介質法或高效毛細管電泳 方法從擴增後的ssDNA文庫中進行SELEX篩選，得到與孔雀石綠特異結 合的ssDNA即孔雀石綠適配子。
步驟(2)中所述的不對稱PCR法即在PCR擴增循環中引入不同濃 度的引物(一般釆用50: 1-100: l比例的引物濃度)，在最初10-15個循 環中主要產物為雙鏈DNA (dsDNA),但低濃度引物被耗盡後，高濃度引 物介導的PCR反應可產生大量的ssDNA。
步驟(2)中所述的生物素-鏈親和素磁珠法即在PCR體系中，設計並 合成下遊引物的5，端標記有生物素，以ssDNA文庫為模板，進行PCR 擴增可得到3，端帶有生物素的dsDNA產物，經分離純化後與鏈親和素 磁珠結合(dsDNA通過3，端的生物素與磁珠上的鏈親和素結合)，然後 用 一定濃度(O.15mol/L )的NaOH使dsDNA變性解鏈，帶有生物素的一條 鏈與鏈親和素結合留在磁珠上，而不帶生物素的一條鏈被解離出來，經分 離純化後用於下一輪篩選，重複上述操作循環富集(一般10次左右)直 至孔雀石綠和適配子的結合率達到90%。
偶聯物(MG-OVA ) 96孔酶標板，同時設白蛋白(OVA)包被孔和空白對 照孔，均用3。/。的BSA封閉，PCR擴增與純化的ssDNA文庫先與空白對 照孔反篩去除與BSA結合的ssDNA，再與OVA包被孔初篩去除與OVA 結合的ssDNA,然後轉移至孔雀石綠-OVA偶聯物包被孔結合，經洗脫、 分離與純化得到與孔雀石綠特異結合的ssDNA。
步驟(3)中所述的高效毛細管電泳方法即將一定量的PCR擴增、純 化的ssDNA文庫與孔雀石綠孵育後，通過高效毛細管電泳將未結合序列 與孔雀石綠結合複合物分離，收集結合序列，重複上述操作循環富集-分 離最後得到與孔雀石綠特異結合的ssDNA (即孔雀石綠適配子)。
根據本發明所述的快速檢測方法，可以將相關試劑封裝或固定後製成 試劑盒或快速糹全測試紙。
本發明還提供了用於檢測水產品中孔雀石綠的試劑盒，至少包括包被
有孔雀石綠適配子的測試片基(如96孔酶標板或硝酸纖維膜等)，還包括 結合緩衝液，包被緩衝液。
將孔雀石綠適配子包被於測試片基上時，可將連接序列(如3， -ACTCATCTGTGA-5' ) 5，端與孔雀石綠適配子序列3，端連接合成孔雀 石綠適配子-連接序列；設計合成與連接序列互補的固定序列(如 3'-ATGAGTAGACACT-5，)，將固定化基團(如將親和素固定在NC膜的 表面，再通過親和素將帶有生物素的單連Biotin—ssDNA固定)標記在固 定序列的3，端，通過固定化基團與連接序列將孔雀石綠適配子包被於測試 片基上。
本發明採用 一種不依賴實驗動物的適配子(aptamer)技術，通過指數 級冨集酉己體的系統進4匕4支術(systematic evolution of ligands by exponential enrichment, SELEX )體外篩選到高親和性特異識別孔雀石綠的適配子， 替代傳統免疫學方法中的抗體來建立一種快速^^測孔雀石綠方法。
本發明4企測方法優點為
1. 篩選周期短3周；
2. 與孔雀石綠結合的特異性強，靈敏度高；
3. 適配子的合成周期短，利於大規模生產；
4. 檢測試劑穩定性強，變性後容易復性，利於運輸、儲存。 根據本發明方法研製的試劑盒與快速檢測試紙，能較好滿足目前對水
產品孔雀石綠殘留檢測的迫切需要，用於海關檢測，食品衛生部門檢測， 易於大範圍推廣應用。
圖1為孔雀石綠適配子製備及孔雀石綠檢測方法流程示意圖； 圖2為孔雀石綠適配子固定示意圖； 圖3為孔雀石綠適配子竟爭檢測適宜具體實施方式
孔雀石綠適配子的製備
(1 )構建一個序列長度約為80 (範圍75 ~90)個鹼基的隨機ssDNA 文庫，ssDNA序列兩端帶有限制性內切酶位點的固定序列，所述的ssDNA 序歹'J為(5，ATAGAGCTCATGGAGTCTCCCTCGG-(N35)-TTTGGAT CCGGCAGTGGTGGGCGGGC3，)、中間為35個序列隨機的鹼基(N35)， 根據ssDNA序列兩端的固定序列設計PCR引物； 上遊引物5，-ATAGAGCTCATGGAGTCTCC陽3,, 下遊引物5 ， -GCCCGCCCACCACTGCCGG-3' (2 )釆用不對稱PCR法對步驟(1 )得到的ssDNA文庫進行擴增。 不對稱PCR法#:作過程為
在PCR擴增循環中引入不同濃度的引物(一般採用50: 1-100: l比 例的引物濃度)，在最初10-15個循環中主要產物為雙鏈DNA (dsDNA), 但低濃度引物被耗盡後，高濃度引物介導的PCR反應可產生大量的 ssDNA。 PCR反應體系dsDNA模板2W, IOXPCR緩衝液l(M， MgCl26W, dNTPslOOPmol/L, Tag酶2W，上遊引物60pmo1,下遊引物lpmol，加去 離子水至100W 。 PCR反應條件94 °C變性5min ，然後40循環94 °C變性 30 s， 65。C退火lmin， 72 。C延伸2min,最後72°C 10 min。
也可以採用生物素-鏈親和素磁珠法對步驟(1)得到的ssDNA文庫 進行擴增。
生物素-鏈親和素;茲珠法操作過程為
在PCR體系中，設計併合成下遊引物的5，端標記有生物素，以ssDNA 文庫為模板，進行PCR擴增可得到3，端帶有生物素的dsDNA產物，經 分離純化後與鏈親和素磁珠結合(dsDNA通過3，端的生物素與磁珠上的 鏈親和素結合)，然後用一定濃度(0.15mol/L)的NaOH使dsDNA變性 解鏈,帶有生物素的一條鏈與鏈親和素結合留在磁珠上，而不帶生物素的一 條鏈被解離出來，將ssDNA溶解於20ulTE緩沖液中，測定吸光度(A)值， 經分離純化可用於下一輪篩選，重複上述操作循環富集( 一般10次左右) 直至孔雀石綠和適配子的結合率達到90% 。
(3 )利用孔雀石綠-OVA偶聯物包被微孔板介質法從擴增後的ssDNA 文庫中進行SELEX篩選，得到與孔雀石綠特異結合的ssDNA即孔雀石綠
適配子。
孔雀石綠-OVA偶聯物包被微孔板介質法操作過程為 將MG-OVA蛋白包被於酶聯板上，4T過夜，包被液為0.05mol/L NaHC03， pH9.6的緩衝液，同時設空白對照。C蛋白包被孔和空白對照孔 均以3。/。BSA37。C封閉2h。隨機ssDNA文庫和一定量的tRNA先在結合緩 衝液SHCMK液(20mmol/L Hepes pH 7.3 5 ， 120mmol/L NaCl ， 5mmol/L KC1 ， 1 mmol/L CaCl2, 1 mmol/L MgCl2)中與經3%BSA封閉的空白對 照孔37°C結合40min。用緩沖洗液洗(SHAMK液+0.05Q/。吐溫20 ) 6次)， 洗去未結合的ssDNA，再加洗脫緩衝液(20mmol/L Tris-HCl, 4mol/L異 硫氰酸胍，lmmol/LDDT, pH8.3)於8(TC作用10min,洗脫下與C蛋白 結合的ssDNA,經酚-氯仿抽提、乙醇沉澱，將ssDNA溶解於20^1 TE 緩衝液中。將ssDNA用標記生物素的引物經PCR擴增成一端帶生物素 的dsDNA，經生物素-鏈親和素磁珠分離ssDNA,用作下一輪篩選的ssDNA 文庫。重複上述操作循環富集-分離最後得到與孔雀石綠特異結合的 ssDNA。
也可以利用高效毛細管電泳方法乂人擴增後的ssDNA文庫中進行 SELEX篩選，得到與孔雀石綠特異結合的ssDNA即孔雀石綠適配子。 高效毛細管電泳方法才喿作過程為
將一定量的PCR擴增、純化的ssDNA文庫與孔雀石綠孵育後，通過 高效毛細管電泳將未結合序列與孔雀石綠結合複合物分離，收集結合序列 可用於下一輪篩選。
進行SELEX篩選得到時孔雀石綠適配子使用的相關試劑在詹林盛的 文章"隨機單鏈DNA文庫SELEX篩選寡核苷酸適配子方法的建立"(《生 物化學與生物物理進展》2003 30巻(1 ) 151 ~ 155 )中均有公開。
經過以上步驟的篩選和測序，得到了以下幾個高特異結合序列(即孔 雀石綠適配子)
5 ，-GTACAAAAAAGTTGGCCTTTAAGACAATCGTTGTGAA匿3' 5 ，-CTGAAAGAAACTAAAATCTCATGGCGACGACGTCGAC-3' 5 ，-ATTAGAAAATGGCAGAACAGAAACAAATGGAAGTGGT-3'
檢測水產品中孔雀石綠的試劑盒
將孔雀石綠適配子包被於測試片基上時，可將連接序列5，端(3， -ACTCATCTGTGA-5')與孔雀石綠適配子序列3，端連接合成孔雀石綠 適配子-連接序列；設計合成與連接序列互補的固定序列 (3，-ATGAGTAGACACT-5，)，將固定化基團(如生物素)標記在固定序
被於測試片基上。
水產品中孔雀石綠的檢測
50pmol 5'端標記[Y-32P]ATP的孔雀石綠適配子與l|imol/L孔雀石綠 (標樣)在結合緩沖液中37。C作用40min後，抽濾於硝酸纖維膜上，用 5ml結合緩衝液沖洗後，將膜烤乾，取下至於閃爍杯中，加PPO-POPOP-二甲苯液3ml，用BeckmanLS液體閃爍儀測定其放射性，經計算孔雀石 綠適配子與孔雀石綠結合百分率為90% 。解離常數在50pmol/L。
將水產品(檢測樣品)先經過勻質後用乙酸乙酯和環己烷進行提取， 調節pH值後稀釋後與50pmo1 5，端標記[Y-32P]ATP的孔雀石綠適配子在結 合緩衝液中37。C作用40min後，抽濾於硝酸纖維膜上，用5ml結合緩沖 液衝洗後，將膜烤乾，取下至於閃爍杯中，力。PPO-POPOP-二曱苯液3ml， 用BeckmanLS液體閃爍儀測定其放射性，乘以係數卯％ (通過上步孔雀 石綠適配子與孔雀石綠標樣的結合測得)即得到該樣品種的孔雀石綠含 量。圖2，和圖3示意了孔雀石綠適配子竟爭檢測的原理。圖2中總共有
特異性結合能力的適配子序列，其兩端據有回文互補結構；上部5，端是設 計合成的連接序列；下部3，端是跟連接序列互補的固定化序列，這部分序 列的鹼基已經被生物素化，可固定在96孔板或硝酸纖維膜上；下部5，端 的序列是報告序列，該序列是酶聯修飾的，負責l艮告顯色。在沒有孔雀石 綠的狀態下，這部分序列的5'端是跟適配子的5'端回文互補序列互補結合 的。在圖3所示的狀態下，環境中有了孔雀石綠，適配子因結合了孔雀石 綠，構象為之改變，3，與5'端回文互補序列自結合，同報告序列形成竟爭， 報告序列隨之脫落。經過洗脫，顯色的步驟，通過與對照的對比就可以看 出，待測物中孔雀石綠的含量。
權利要求
1、一種利用適配子快速檢測水產品中孔雀石綠的方法，將待測樣品與孔雀石綠適配子和帶有檢測標記物的報告序列混合，報告序列與待測樣品中的孔雀石綠可競爭性地與孔雀石綠適配子結合後，檢測報告序列上的標記物，計算待測樣品中孔雀石綠含量；所述的檢測標記物為辣根過氧化物酶、化學發光基團、化學螢光基團或膠體金等；所述的報告序列與孔雀石綠適配子序列部分互補。
2、 如權利要求1所述的方法，其特徵在於所述的孔雀石綠適配子 通過如下步驟製得(1)構建一個序列長度約為80個鹼基的隨機ssDNA文庫，ssDNA 序列兩端帶有限制性內切酶位點的固定序列、中間為35個序列隨機的鹼 基，根據ssDNA序列兩端的固定序列設計PCR引物；(2 )採用不對稱PCR法或生物素-鏈親和素磁珠法對步驟(1 )得到 的ssDNA文庫進4亍擴增；(3 )利用孔雀石綠-OVA偶聯物包被微孔板介質法或高效毛細管電泳 方法從擴增後的ssDNA文庫中進行SELEX篩選，得到與孔雀石綠特異結 合的ssDNA即孔雀石綠適配子。
3、 一種^^測水產品中孔雀石綠的試劑盒，包括測試片基，其特徵在 於所述的測試片基上包被有孔雀石綠適配子。
4、 如權利要求3所述的試劑盒其特徵在於將孔雀石綠適配子包被 於測試片基上時，將連接序列5，端與孔雀石綠適配子序列3，端連接合 成孔雀石綠適配子-連接序列；設計合成與連接序列互補的固定序列，將 固定化基團標記在固定序列的3，端，通過固定序列與連接序列的結合將孔 雀石綠適配子包被於測試片基上。
全文摘要
本發明公開了一種利用適配子快速檢測水產品中孔雀石綠的方法，將待測樣品與孔雀石綠適配子和帶有檢測標記物的報告序列混合，報告序列與待測樣品中的孔雀石綠可競爭性地與孔雀石綠適配子結合後，檢測報告序列上的標記物，計算待測樣品中孔雀石綠含量。根據本發明方法研製的試劑盒與快速檢測試紙，能較好滿足目前對水產品孔雀石綠殘留檢測的迫切需要，用於海關檢測，食品衛生部門檢測，易於大範圍推廣應用。
文檔編號G01N33/52GK101358963SQ20071007038
公開日2009年2月4日 申請日期2007年8月1日 優先權日2007年8月1日
發明者軍 劉, 張明洲, 靈 方, 王墨染, 胡華軍, 軍 黃 申請人:中國計量學院;杭州寶派生物科技有限公司