PF‑127‑miRNA‑615agomir複合物及其製備方法和應用與流程
2023-11-30 00:05:41
本發明涉及生物醫藥技術領域，具體涉及一種PF-127-miRNA-615agomir複合物及其製備方法和應用。
背景技術：
臂叢神經撕脫(Brachial Plexus Avulsion,BPA)是一種常見的致殘性外科創傷，尤其是全臂叢神經根性撕脫，致殘率高、療效不佳、預後差。隨著家庭機動車輛和現代交通物流的不斷發展，臂叢損傷的發病率逐年增加，其最常見的病因為交通意外和新生兒難產所造成的牽拉性損傷。神經根由中樞部分和外周部分組成，二者的交界部分稱為「過渡區」(transitional zone,TZ)。臂叢撕脫是神經根與脊髓在TZ區發生的物理性斷離，不僅引起外周神經斷裂，還導致相應脊髓節段神經元嚴重損傷和大量死亡，神經軸突斷裂、突觸結構破壞、神經網絡中斷等，造成受損神經對應皮節的感覺喪失及所支配上肢肌肉癱瘓。為了恢復神經通路和運動功能，受損神經元必須存活和再生軸突，並外向延伸穿過TZ瘢痕，重新進入外周神經幹並與所支配肌肉重建突觸聯繫。雖然通過神經外科再植術能使部分運動神經元存活並獲得一定的軸突再生，但由於局部病理微環境的抑制作用，膠質瘢痕形成，以及軸突再生能力極其有限等原因，神經再生和運動功能恢復的效果並不令人滿意。因此，臂叢神經根性撕脫治療的關鍵問題在於如何改善損傷局部的抑制性病理微環境，有效促進神經軸突的再生修復與外向延伸，以恢復過渡區神經聯繫的延續性，重建突觸聯繫，改善肢體的運動功能。
相關研究發現，髓磷脂相關抑制因子是脊髓損傷後局部微環境中的重要抑制因素。該類抑制因子由髓鞘和膠質瘢痕合成釋放，主要包括軸突生長抑制因子(neurite outgrowth inhibitory A，NogoA)、髓磷脂相關糖蛋白(myelin-associated glycoprotein,MAG)和少突膠質細胞髓磷脂糖蛋白(oligodendrocyte myelin glycoprotein,OMgp)。這些髓磷脂相關抑制因子可與神經細胞上的共受體成分LINGO-1(LRR and Ig domain-containing Nogo receptor interacting protein)結合而介導抑制效應，抑制中樞神經軸突生長和髓鞘形成。LINGO-1在腦和脊髓的神經元及少突膠質細胞上選擇性表達，參與細胞膜上NgR1/p75/LLNGO-1或NgR1/Troy/LINGO-1信號轉導複合物的構成。LINGO-1與抑制因子結合使信號複合物活化，通過RhoA激酶的作用將下遊抑制信號轉導入神經元和少突膠質細胞，從而阻礙神經軸突的再生修復與髓鞘的形成。研究表明，拮抗LINGO-1對脊髓損傷後的神經再生和功能恢復有明顯促進作用。同時，我們的前期研究發現，用慢病毒Lingo-1 RNAi幹擾LINGO-1的表達，可影響移植性神經幹細胞的發育分化，並能促進脊髓全橫斷大鼠的神經再生和運動功能恢復。但關於其發揮作用的胞內機制，目前尚未可知。
近年來，miRNA因其功能多樣化而在組織工程學領域中的備受關注。miRNA是通過調控靶基因而影響表觀遺傳的重要分子，主要通過種子序列(seed sequence)與靶mRNA 3』-端非翻譯區(3』-untranslated region,3』-UTR)部分或完全互補結合而抑制基因表達或介導靶基因降解，實現轉錄後水平的廣泛基因調控。miRNA介導的基因沉默效應涉及真核生物細胞增殖、細胞分化、細胞凋亡、免疫調節等各種發育和代謝過程。因此，我們推測，miRNA是否也參與LINGO-1基因表達的生物調控過程。通過生物信息學在線軟體預測和功能分析，我們初步篩選出可能對LINGO-1基因具有潛在調控作用的miRNA，再經細胞轉染後雙螢光素酶報告系統和western blotting驗證，證實miRNA-615對LINGO-1的表達有負調控作用。
由於miRNA動物實驗的體內環境複雜，實驗周期長，對miRNA的穩定性要求更高，而人工合成的miRNA-615的擬似物(miRNA-615 mimics)具有較好的分子穩定性和miRNA活性，所以，需要選擇合適的miRNA-615擬似物；另一方面，如何準確地將miRNA-615擬似物運輸到損傷局部以有效地發揮其基因調控作用成為難題。
因此，亟待有可負載miRNA-615擬似物並能填充損傷裂隙的運載體，該運載體應具備高效、無毒、較好的生物相容性、生物降解性等特點，同時還應為神經軸突外向延伸生長提供必要的條件支持。
技術實現要素：
本發明的目的在於針對現有技術的不足，提供一種所述能負載miRNA-615 agomir、並能促進臂叢撕脫神經再生修復的水凝膠包裹miRNA-615 agomir複合物及其製備方法以及該複合物在製備治療臂叢神經根性撕脫的藥物中的應用。
為了實現上述目的，本發明採用如下技術方案：
提供PF-127-miRNA-615 agomir複合物，所述複合物由以下組份製成：
Pluronic F-127水凝膠、去離子水和miRNA-615 agomir，所述miRNA-615 agomir包括SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。
優選的，Pluronic F-127水凝膠與去離子水的用量比為每100ml去離子水中加入20g～25g的Pluronic F-127水凝膠。
優選的，miRNA-615 agomir在Pluronic F-127水凝膠與去離子水充分混合後得到的混合液中的濃度為18～23nmol/ml。
優選的，miRNA-615 agomir是經特殊化學修飾合成的miRNA-615擬似物，是由廣州銳博生物科技有限公司合成的。
本發明還提供上述PF-127-miRNA-615 agomir複合物的製備方法，包括以下步驟：
(1)miRNA-615 agomir的合成；
(2)水凝膠原液的製備：
稱取一定量的水凝膠，將其與去離子水在無菌條件下配製成混懸液，將混懸液置於一定溫度條件下，使水凝膠充分溶解，然後過濾除菌，得水凝膠原液；
(3)水凝膠與miRNA-615 agomir混合液的製備：
在一定溫度條件下，將步驟(1)的miRNA-615 agomir與步驟(2)製備的水凝膠原液攪拌使其充分混合，得水凝膠與miRNA-615 agomir的混合液，備用；
(4)水凝膠包裹miRNA-615 agomir：
取步驟(3)製備的混合液加入至24孔板，使混合液平鋪孔底，然後放入培養箱在一定溫度下溫一段時間後，使孔底形成不透明薄膠狀物，即得PF-127-miRNA-615 agomir複合物。
優選的，所述步驟(1)，miRNA-615 agomir是由廣州銳博生物科技有限公司合成的。
優選的，所述步驟(2)，水凝膠和去離子水在無菌條件下配製成質量體積比濃度為0.20～0.25g/ml的混懸液，將混懸液置於0～4℃，使水凝膠充分溶解，然後採用0.20μm孔徑的濾膜除菌，得水凝膠原液。
優選的，所述步驟(3)，在0～4℃條件下，以每毫升水凝膠原液中含20nmol miRNA-615 agomir的濃度攪拌使其充分混合，得水凝膠與miRNA-615 agomir的混合液。
優選的，所述步驟(4)，取步驟(3)製備的混合液，以每孔200μL加至24孔板，使其平鋪孔底，然後放置於25℃～37℃培養箱溫育3～5min，取出後，孔底形成不透明薄膠狀物，即得PF-127-miRNA-615 agomir複合物。
本發明還提供PF-127-miRNA-615 agomir複合物在製備治療臂叢神經根性撕脫的藥物中的應用。
本發明的有益效果是：
與現有的技術相比，本發明的有益效果在於：
(1)本發明提供的PF-127-miRNA-615 agomir複合物，由於含有溫敏型水凝膠Pluronic F-127，不僅能夠負載miRNA-615 agomir，實現miRNA-615 agomir的精確遞送和局部緩釋，起到藥物遞送緩釋的作用，還兼具生物支架的性能，通過體內膠化形成具有生物支架功能的三維孔隙結構，為神經軸突的生長提供三維空間和力學支撐，同時還可有效填補脊髓損傷裂隙，促進軸突的生長和外向延伸，起到在形態和功能上雙重修復的作用；
(2)本發明提供的PF-127-miRNA-615 agomir複合物，由於含有miRNA-615擬似物miRNA-615 agomir，與一般的miRNA-615擬似物相比，miRNA-615 agomir有更高的穩定性和miRNA活性，在生物體內不易被降解，且更易穿透細胞膜和組織間隙而富集於靶細胞，並能通過全身或局部注射的方式等進行給藥，有效作用時間長，可操作性更強，特別適用於動物實驗觀察和分析。因此，含有miRNA-615 agomir的PF-127-miRNA-615 agomir複合物能夠特異性抑制神經細胞中LINGO-1基因和蛋白的表達，減少其與髓磷脂抑制因子的結合，促進神經軸突的生長；
(3)本發明提供的PF-127-miRNA-615 agomir複合物的製備方法，具有生產成本低、操作簡便、耗時短、實驗設備要求低，且能用於大規模生產的特點；
(4)本發明提供的PF-127-miRNA-615 agomir複合物，既能利用Pluronic F-127水凝膠的分子運載系統實現miRNA-615 agomir的精確遞送和局部緩釋，通過抑制LINGO-1基因和蛋白的表達，減少其與髓磷脂抑制因子的結合，改善損傷局部的抑制性病理微環境，促進神經軸突的再生修復；又能藉助Pluronic F-127的智能溫敏性能，通過體內膠化形成具有生物支架功能的三維孔隙結構，為神經軸突的生長提供三維空間和力學支撐，同時還可有效填補脊髓損傷裂隙，起到在形態和功能上雙重修復的作用。因此，該PF-127-miRNA-615 agomir複合物可用於製備治療臂叢神經根性撕脫的藥物，能夠有力促進臂叢神經根性撕脫的神經再生修復，為中樞和外周神經損傷患者的治療和康復提供新的治療途徑。
具體實施方式
結合以下實施例對本發明作進一步說明。
實施例1：PF-127-miRNA-615 agomir複合物的製備
PF-127-miRNA-615 agomir複合物由Pluronic F-127水凝膠、去離子水和miRNA-615 agomir採用以下步驟製備而成：
(1)miRNA-615 agomir的合成：
本實施例中，miRNA-615 agomir是經特殊化學修飾合成的miRNA-615擬似物，是由廣州銳博生物科技有限公司合成的；
miRNA-615的基本信息如表1所示：
表1 miRNA-615的基本信息
miRNA-615與LINGO-1的反應機制：成熟miRNA主要通過與特定靶基因的3』-UTR結合而影響基因的轉錄後翻譯效率和穩定性。成熟miRNA-615通過其種子序列(seed sequence)─GGGGGUCCCC(表1單下劃線部分)與LINGO-1 mRNA的3』-UTR的部分序列(表1雙下劃線部分)特異性結合，介導基因沉默效應阻遏LINGO-1 mRNA的翻譯過程，進而引起LINGO-1蛋白含量下降。LINGO-1表達減少，其與髓磷脂相關抑制因子的結合就減少，信號複合物的活化及神經元和少突膠質細胞中抑制信號的轉入則相應減弱，在一定程度上起到促進神經軸突再生、髓鞘形成並進而改善運動功能恢復的效應。
(2)水凝膠原液的製備：
超淨臺酒精擦拭消毒，將電子天平、稱量紙、稱量藥勺、50ml離心管等稱量物品放入並紫外照射消毒約30分鐘；於超淨臺內稱取適量水凝膠，並在無菌條件下，將水凝膠與去離子水配置成質量體積比濃度為0.20～0.25g/ml的混懸液，然後將混懸液置於0～4℃的水平搖床以60-70轉/分鐘的速度振搖過夜10-24小時，至水凝膠充分溶解後，取0.20μm孔徑的瓶蓋式過濾器覆蓋於50ml離心管管口，連接上50ml注射器，將上述混合液倒入注射器後，緩慢推出通過濾膜以過濾除菌，得水凝膠原液；
(3)水凝膠與miRNA-615 agomir混合液的製備：
將步驟(1)合成的miRNA-615 agomir與步驟(2)製備的水凝膠原液在0～4℃以每毫升水凝膠原液中含20nmol的miRNA-615 agomir的濃度混合，攪拌使其充分混合，得混合液；
(4)水凝膠包裹miRNA-615 agomir：
取步驟(3)製備的混合液，以每孔200μL加至24孔板，使其平鋪孔底，然後放置於25℃～37℃培養箱溫育3～5min，取出後，孔底形成不透明薄膠狀物，即得PF-127-miRNA-615 agomir複合物。
以上步驟的所有操作均在無菌條件下進行。
本實施例中，水凝膠原液一般在2～8℃的醫用冰箱或冷藏櫃中儲存，miRNA-615 agomir儲存於-80℃的液氮或者其他環境保存。
實施例2：PF-127包裹miRNA-615 agomir複合物修復臂叢神經根性撕脫的應用
1.臂叢神經根性撕脫大鼠模型製備
成年雌性SD大鼠用10％水合氯醛(3.5ml/kg)腹腔注射麻醉，在體視顯微鏡下，暴露右側C4-T2脊髓節段，行C4-C7椎板切除，分離出右側臂叢神經的C5～C7脊神經根，用精細玻璃掛鈎輕輕撕脫C5～C7神經根，並切除與C5和C7神經根相連的一段脊神經，使神經與脊髓間留下大概5mm的間隙，隨後將C6前根重置回原位，充分止血，逐層間斷縫合肌肉和皮膚。術後保暖，待動物甦醒後送至清潔級動物飼養房進行常規護理。術後每隻大鼠給予青黴素16萬單位(1ml/d)和硫酸慶大黴素25萬單位(0.5ml/d)肌內注射預防感染，每日2次，連續注射3天。
2.水凝膠包裹miRNA-615 agomir複合物局部注射
採用本發明實施例1製備所得水凝膠包裹miRNA-615 agomir複合物，用微量注射泵吸取10ul所述水凝膠包裹miRNA-615 agomir複合物，在臂叢神經撕脫大鼠模型C6神經根撕脫原位空隙緩慢注射。注射時注意謹防微泵針尖傷及周圍脊髓組織。注射完畢後，靜置大鼠約5分鐘，依次逐層縫合肌肉和皮膚，標準條件下常規飼養。
3.水凝膠包裹miRNA-615 agomir複合物修復大鼠臂叢撕脫試驗
實驗組：採用本發明實施例1製備所得水凝膠包裹miRNA-615 agomir複合物，37℃水浴溫育3-5min至形成不透明膠凍物，用微量注射泵吸取10ul所述水凝膠包裹miRNA-615 agomir複合物，在臂叢神經撕脫大鼠模型C6神經根撕脫原位空隙緩慢注射。注射完畢後，靜置大鼠約5分鐘，依次逐層縫合肌肉和皮膚，標準條件下常規飼養。
對照組：給予同等劑量的PBS。
(1)免疫螢光染色檢測神經絲蛋白NF-200的表達
各組動物模型10％水合氯醛(3.5mg/kg)腹腔注射麻醉，用生理鹽水和4℃多聚甲醛進行左心室灌注，取C5-C7脊髓節段，4℃多聚甲醛後固定6-8小時，30％蔗糖溶液脫水，OCT包埋並切成20um厚的冰凍縱切片，Hoechst33342染核，於螢光顯微鏡下觀察。
(2)甲苯胺藍染色觀察髓鞘形成
10％水合氯醛(3.5mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，剪開胸腔行心臟灌流固定，取脊髓標本用4％戊二醛溶液和1％鋨酸溶液進行再固定,逐級酒精丙酮梯度脫水，環氧樹脂包埋，切成0.5μm厚的半薄切片，甲苯胺藍染色,封片後鏡下觀察並比較有髓神經軸突的數量及直徑大小。
(3)行為學測試
參照Bertelli JA等人提出的Terzis grooming test對臂叢撕脫模型大鼠進行右前肢的運動功能評估。在安靜環境中，用10ml注射器往大鼠頭頸部噴射約10ml左右的水以引出其前肢的理毛行為，觀察並依據該評定標準對其右前肢的運動功能進行等級評分。該評定標準分為0-5級：右前肢無反應為0分，右前肢可彎曲並能到達耳部及耳後為5分。術前對動物檢查為5級，術後第二天對動物右上肢功能評定為功能喪失，評分0級，納入評分標準。術後第二周開始對不同處理組動物進行運動功能等級評分，每周一次，連續4周。測試結果(見表2)顯示，實驗組動物右前肢的運動功能評分明顯高於對照組，有統計學差異(P＜0.05)。
表2 臂叢神經根撕脫運動功能評分(x±s)
實驗組與對照組(單純脊髓損傷)相比，P＜0.05。
如表2所示，實驗組大鼠在2、3、4、5W的運動功能評分均明顯優於對照組(P＜0.05)，提示水凝膠包裹miRNA-615 agomir複合物能明顯促進脊髓損傷大鼠運動功能的恢復。
(4)螢光金逆行標記
取材前3-4天，麻醉動物後暴露右側肌皮神經，於肌皮神經入肱二頭肌肌點近端5mm處進針，緩慢注射1.0ul螢光金。標記後4天7％水合氯醛麻醉，4％多聚甲醛(加PBS磷酸鹽緩衝液稀釋)心臟灌注固定，取出C5-C7脊髓節段，放入30％蔗糖脫水48h後切成20um薄片。於螢光顯微鏡下觀察C5-C7脊髓內螢光金標記的神經細胞數(見表3)，以觀察C6回植後神經軸突的修復再生情況。
表3 螢光金標記的神經細胞計數(x±s)
實驗組與對照組(單純脊髓損傷)相比，P＜0.05。
如表3所示，實驗組螢光金標記的神經元細胞數明顯多於對照組，有明顯差異(P<0.01)。由此可見，水凝膠包裹miRNA-615 agomir複合物對神經軸突的再生有明顯改善作用。
(5)運動終板檢測
取材固定後肱二頭肌切成14um厚的縱切片，0.2mg/L的α-環蛇毒素(α-Bungarotoxin,α-BTX)染色30min。於螢光顯微鏡下計數運動終板的數目，並利用Image J圖像軟體計算其面積大小(見表4)。
表4 運動終板檢測
實驗組與對照組(單純脊髓損傷)相比，P＜0.05。
如表4所示，實驗組大鼠肱二頭肌運動終板的數量明顯多於對照組(P＜0.05)，由此說明水凝膠包裹miRNA-615 agomir複合物對受損神經的再生及與其所支配肌肉重建突觸聯繫有保護作用。
最後應當說明的是，以上實施例僅用於說明本發明的技術方案而非對本發明保護範圍的限制，儘管參照較佳實施例對本發明作了詳細說明，本領域的普通技術人員應當理解，可以對本發明的技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發明技術方案的實質和範圍。