一種定量檢測植物病毒的螢光免疫斑點法

2023-11-04 17:58:42 1

一種定量檢測植物病毒的螢光免疫斑點法
【專利摘要】本發明公開了一種定量檢測植物病毒的螢光免疫斑點法，是將待測樣品研磨，製備檢測樣品上樣液，配製陽性、陰性及空白對照上樣液，測出陽性對照上樣液的病毒粒體平均數d。將2.0~2.5μl檢測樣品上樣液、陽性、陰性及空白對照上樣液分別點在硝酸纖維素膜上，將膜乾燥後封閉0.8~1.2h，依次加入稀釋後的一抗、二抗，分別反應0.8~1.2h，每次反應後洗膜3~4次，每次5~6min。將膜稍乾燥後置於螢光分光光度計中檢測螢光強度m，按照下述公式計算檢測樣品上樣液中待檢測病毒的粒體平均數d。陽性對照上樣液m值：陽性對照上樣液d值=檢測樣品上樣液m值：檢測樣品上樣液d值。所述方法能夠實現植物病毒的靈敏準確、快捷高效的定量分析，推廣應用價值較高。
【專利說明】一種定量檢測植物病毒的螢光免疫斑點法
【技術領域】
[0001]本發明屬於植物病毒定量檢測【技術領域】，具體涉及一種定量檢測植物病毒的螢光免疫斑點法。
【背景技術】
[0002]斑點免疫結合法(DIBA)是一種以硝基纖維素薄膜為固相載體進行抗原——抗體免疫學反應的檢測和鑑定植物病毒的基礎性方法。該方法具有靈敏度高，準確性好，操作簡便快捷等優點，但也存在著一些弊端:首先，判斷陰、陽性反應只能靠目測，所以在色差較小的樣品中，就可能造成錯判或漏判；其次，陽性反應的顏色差異雖然從一定程度上反映了陽性樣品中病毒的多少，但仍無法實現真正的定量檢測。螢光標記技術是利用能發螢光的物質通過共價結合或物理吸附在所要研究的分子的某個基團上，利用它的螢光特性來提供被研究對象的信息的一種手段。若將斑點免疫結合法與螢光標記技術聯合應用，利用螢光顯色技術減少斑點免疫結合法的定性誤差，提高其定量準確性，對於實現植物病毒靈敏準確、快捷高效的定量分析將具有十分重要的現實意義和推廣應用價值。

【發明內容】

[0003]本發明的目的在於提供一種定量檢測植物病毒的螢光免疫斑點法。
[0004]本發明的目的是這樣實現的，一種定量檢測植物病毒的螢光免疫斑點法，包括檢測樣品及試劑配製、檢測及
A、檢測樣品及試劑配製:按重量體積比1:2.5^3.5g/ml，將0.8^1.2g待檢測植物樣品加入磨樣緩衝液中，將植物樣品磨碎備用，作為檢測樣品上樣液；按體積比1:1000，將提純的待檢測植物病毒用磨樣緩衝液稀釋備用，作為陽性對照上樣液，並於電鏡下測算出陽性對照上樣液的病毒粒體平均數d ;按重量體積比1:2.5^3.5g/ml，將0.8^1.2g無待檢測病毒的植物樣品加入磨樣緩衝液中，將植物樣品磨碎備用，作為陰性對照上樣液；空白對照上樣液即為磨樣緩衝液；
B、檢測:將檢測樣品上樣液2.0-2.5μ1點在硝酸纖維素膜上，再將同樣體積的陽性對照上樣液、陰性對照上樣液及空白對照上樣液分別點在硝酸纖維素膜上，將硝酸纖維素膜乾燥後，置於容器內，加入封閉液浸沒0.Cl.2h，棄去封閉液，加入用稀釋緩衝液稀釋的一抗，反應0.8^1.2h，棄去一抗，用洗滌緩衝液洗滌硝酸纖維素膜3~4次，每次5飛min，再加入用稀釋緩衝液稀釋的二抗，反應0.8^1.2h，棄去二抗，用洗滌緩衝液洗滌硝酸纖維素膜3~4次，每次5~6min ；
C、定量分析:將洗滌後的硝酸纖維素膜稍乾燥，置於螢光分光光度計中檢測螢光強度m，按照下述公式即可算出檢測樣品上樣液中待檢測病毒的粒體平均數d:
陽性對照上樣液m值:陽性對照上樣液d值=檢測樣品上樣液m值:檢測樣品上樣液d
值 其中，陽性對照上樣液d= WN3+……Ny"；y:電鏡下觀察視野的個數；
N:第y個觀察視野中的病毒粒體數。
[0005]本發明所述方法將斑點免疫結合法與螢光標記技術聯合應用，利用螢光顯色技術避免了斑點免疫結合法可能出現的假陽性幹擾，通過對固相支持物及底物的選擇，進一步減少了定性誤差，有效提高了定量準確性，對於實現植物病毒靈敏準確、快捷高效的定量分析具有十分重要的現實意義和較高的推廣應用價值。
【具體實施方式】
[0006]下面對本發明作進一步的說明，但不以任何方式對本發明加以限制，基於本發明教導所作的任何變換或替換，均屬於本發明的保護範圍。
[0007]本發明所述的定量檢測植物病毒的螢光免疫斑點法，包括檢測樣品及試劑配製、檢測及定量分析工序，具體包括:
A、檢測樣品及試劑配製:按重量體積比1:2.5^3.5g/ml，將0.8^1.2g待檢測植物樣品加入磨樣緩衝液中，將植物樣品磨碎備用，作為檢測樣品上樣液；按體積比1:1000，將提純的待檢測植物病毒用磨樣緩衝液稀釋備用，作為陽性對照上樣液，並於電鏡下測算出陽性對照上樣液的病毒粒體平均數d ;按重量體積比1:2.5^3.5g/ml，將0.8^1.2g無待檢測病毒的植物樣品加入磨樣緩衝液中，將植物樣品磨碎備用，作為陰性對照上樣液；空白對照上樣液即為磨樣緩衝液；
B、檢測:將檢測樣品上樣液2.0-2.5μ1點在硝酸纖維素膜上，再將同樣體積的陽性對照上樣液、陰性對照上樣液及空白對照上樣液分別點在硝酸纖維素膜上，將硝酸纖維素膜乾燥後，置於容器內，加入封閉液浸沒0.Cl.2h，棄去封閉液，加入用稀釋緩衝液稀釋的一抗，反應0.8^1.2h，棄去一抗，用洗滌緩衝液洗滌硝酸纖維素膜3~4次，每次5飛min，再加入用稀釋緩衝液稀釋的二抗，`反應0.8^1.2h，棄去二抗，用洗滌緩衝液洗滌硝酸纖維素膜3~4次，每次5~6min ；
C、定量分析:將洗滌後的硝酸纖維素膜稍乾燥，置於螢光分光光度計中檢測螢光強度m，按照下述公式即可算出檢測樣品上樣液中待檢測病毒的粒體平均數d:
陽性對照上樣液m值:陽性對照上樣液d值=檢測樣品上樣液m值:檢測樣品上樣液d
值
其中，陽性對照上樣液d= WN3+……Ny"； y:電鏡下觀察視野的個數；
N:第y個觀察視野中的病毒粒體數。
[0008]所述的磨樣緩衝液為加入0.01%吐溫20的pH為7.0的PBST，稀釋緩衝液為pH為
7.0的PBST，洗滌緩衝液為加入0.01%吐溫20的pH為7.0的PBST。
[0009]步驟A所述的植物樣品可以為植物的葉、花、果或莖中的任一種。
[0010]步驟A所述的將植物樣品磨碎備用，指的是將植物樣品置於加厚的自封袋中，用研缽棒磨出汁液即可，但保證所有組織都研磨到。
[0011]步驟A所述的測算出陽性對照上樣液的病毒粒體平均數d，指的是在電子顯微鏡下觀察陽性對照上樣液的I個視野，數取每個視野的病毒粒體數N，用下述公式計算出y個視野的病毒粒體平均數d。[0012]d= WN3+......Ny/y
y:電鏡下觀察視野的個數；
N:第y個觀察視野中的病毒粒體數。
[0013]y值取25~35即可，優選取30。
[0014]步驟B所述的將檢測樣品上樣液、陽性對照上樣液、陰性對照上樣液及空白對照上樣液分別點在硝酸纖維素膜上，指的是用移液器吸取2.0-2.5μ1檢測樣品上樣液點在硝酸纖維素膜上，然後用移液器吸取同樣體積的陽性對照上樣液點在檢測樣品上樣液的旁邊，再依次將同樣體積的陰性對照上樣液點在陽性對照上樣液的旁邊，將空白對照上樣液點在陰性對照上樣液的旁邊。
[0015]步驟B所述的封閉液為用稀釋緩衝液配製的質量百分比為4~6%的脫脂奶粉。
[0016]步驟B所述的將硝酸纖維素膜乾燥，指的是將硝酸纖維素膜置於室溫下自然乾燥，或是將硝酸纖維素膜置於37°C培養箱中乾燥。
[0017]所述的室溫為20~25°C。
[0018]步驟B所述的將硝酸纖維素膜乾燥後，置於容器內，加入封閉液浸沒，指的是將硝酸纖維素膜置於容器中，加入5^20ml封閉液，淹沒硝酸纖維素膜，再將容器置於37°C培養箱中封閉0.8~1.2h。
[0019]所述的容器為培養皿。
[0020]所述的加入5~20ml封閉液，淹沒硝酸纖維素膜，指的是直徑為6cm的培養皿加入5ml ;直徑為9 cm的培養皿加入15ml ;直徑為12 cm的培養皿加入20ml，即按需加入，要求能淹沒硝酸纖維素膜即可。
[0021]步驟B所述的用稀釋緩衝液稀釋的一抗，指的是用稀釋緩衝液按體積比1:100-1000000倍稀釋的一抗(不同病毒，它的一抗的稀釋稀釋效價不同，稀釋倍數根據實際病毒確定)，所述的用稀釋緩衝液稀釋的二抗，指的是用稀釋緩衝液按體積比1:100-1000000倍稀釋的二抗(二抗，不同公司生產的，它的稀釋效價不同，稀釋倍數根據實際情況確定)。
[0022]步驟B所述的加入用稀釋緩衝液稀釋的一抗，反應0.8^1.2h，指的是加入5~20ml用稀釋緩衝液稀釋的一抗，淹沒硝酸纖維素膜，置於37°C培養箱中反應0.8^1.2h ;所述的加入用稀釋緩衝液稀釋的二抗，反應0.8^1.2h，指的是加入5~20ml用稀釋緩衝液稀釋的二抗，淹沒硝酸纖維素膜，置於37°C培養箱中反應0.8^1.2h。
[0023]所述的加入5~20ml用稀釋緩衝液稀釋的一抗或二抗，淹沒硝酸纖維素膜，指的是直徑為6cm的培養皿加入5ml ;直徑為9 cm的培養皿加入15ml ;直徑為12 cm的培養皿加入20ml,即按需加入，要求能淹沒硝酸纖維素膜即可。
[0024]步驟B所述的用洗滌緩衝液洗滌硝酸纖維素膜，指的是用洗滌緩衝液洗滌硝酸纖維素膜3~4次，每次均置於水平搖床上振蕩洗滌5飛min。
[0025]步驟C所述的將洗滌後的硝酸纖維素膜稍乾燥，指的是將洗滌後的硝酸纖維素膜用吸溼性材料吸乾。
[0026]所述的吸溼性材料為濾紙。
[0027]步驟C所述的突光分光光度計為美國Thermo Scientif ic公司製造的Lumina型號螢光分光光度計。[0028]步驟C所述的螢光分光光度計的檢測條件為:波長範圍:190-900nm ;光源:150W
無臭氧氙燈。
[0029]步驟C所述的將洗滌後的硝酸纖維素膜稍乾燥，置於螢光分光光度計中檢測螢光強度m，對檢測結果的評判標準如下:
(O當陽性對照上樣液有螢光讀數，陰性對照上樣液和空白對照上樣液沒有螢光讀數時，檢測即為成功。
[0030](2)當檢測樣品上樣液有螢光讀數時，可判斷為陽性樣品，沒有螢光讀數時，可判斷為陰性樣品。即在螢光分光光度計的讀數中，陰性反應的讀數應為0，而陽性反應的讀數應大於O。
[0031](3)若檢測樣品上樣液為陽性樣品，則按照下述公式算出檢測樣品上樣液中待檢測病毒的粒體數d:
陽性對照上樣液m值:陽性對照上樣液d值=檢測樣品上樣液m值:檢測樣品上樣液d
值
其中，陽性對照上樣液d= WN3+……Ny"； y:電鏡下觀察視野的個數；
N:第y個觀察視野中的病毒粒體數。
[0032]實施例1
-菸草葉片樣品中菸草花葉病毒(TbAacco mosaic virus, TMV)的檢測
所用試劑如下:
磨樣緩衝液:加入0.01%吐溫20的pH為7.0的PBST。
[0033]稀釋緩衝液:pH為7.0的PBST。
[0034]洗滌緩衝液:加入0.01%吐溫20的pH為7.0的PBST。
[0035]封閉液:用稀釋緩衝液配製的質量百分比為5%的脫脂奶粉。
[0036]一抗:TMV兔源抗體 二抗:螢光素標記的羊抗兔
A、檢測樣品及試劑配製:按重量體積比1:3.0g/ml，將1.0g待檢測菸葉加入磨樣緩衝液中，將菸葉樣品置於加厚的自封袋中，用研缽棒磨出汁液(保證所有菸葉組織都研磨到)作為檢測樣品上樣液。按體積比1:1000，將提純的TMV用磨樣緩衝液稀釋備用，作為陽性對照上樣液，在電子顯微鏡下觀察陽性對照上樣液的30個視野，數取每個視野的病毒粒體數N，如表1所示。用下述公式計算出30個視野的病毒粒體平均數d。
[0037]d= Ni+N2+N3+......N30/30=524/30 ^ 17
表1 30個視野中的病毒粒體數
【權利要求】
1.一種定量檢測植物病毒的螢光免疫斑點法，其特徵在於包括檢測樣品及試劑配製、檢測及定量分析工序，具體包括: A、檢測樣品及試劑配製:按重量體積比1:2.5^3.5g/ml，將0.8^1.2g待檢測植物樣品加入磨樣緩衝液中，將植物樣品磨碎備用，作為檢測樣品上樣液；按體積比1:1000，將提純的待檢測植物病毒用磨樣緩衝液稀釋備用，作為陽性對照上樣液，並於電鏡下測算出陽性對照上樣液的病毒粒體平均數d ;按重量體積比1:2.5^3.5g/ml，將0.8^1.2g無待檢測病毒的植物樣品加入磨樣緩衝液中，將植物樣品磨碎備用，作為陰性對照上樣液；空白對照上樣液即為磨樣緩衝液； B、檢測:將檢測樣品上樣液2.0-2.5μ1點在硝酸纖維素膜上，再將同樣體積的陽性對照上樣液、陰性對照上樣液及空白對照上樣液分別點在硝酸纖維素膜上，將硝酸纖維素膜乾燥後，置於容器內，加入封閉液浸沒0.Cl.2h，棄去封閉液，加入用稀釋緩衝液稀釋的一抗，反應0.8^1.2h，棄去一抗，用洗滌緩衝液洗滌硝酸纖維素膜3~4次，每次5飛min，再加入用稀釋緩衝液稀釋的二抗，反應0.8^1.2h，棄去二抗，用洗滌緩衝液洗滌硝酸纖維素膜3~4次，每次5~6min ； C、定量分析:將洗滌後的硝酸纖維素膜稍乾燥，置於螢光分光光度計中檢測螢光強度m，按照下述公式即可算出檢測樣品上樣液中待檢測病毒的粒體平均數d: 陽性對照上樣液m值:陽性對照上樣液d值=檢測樣品上樣液m值:檢測樣品上樣液d值 其中，陽性對照上樣液d= WN3+……Ny"； y:電鏡下觀察視野的個數； N:第y個觀察視野中的病毒粒體數。
2.根據權利要求1所述的螢光免疫斑點法，其特徵在於所述的磨樣緩衝液為加入0.01%吐溫20的pH為7.0的PBST，稀釋緩衝液為pH為7.0的PBST，洗滌緩衝液為加入0.01% 吐溫 20 的 pH 為 7.0 的 PBST。
3.根據權利要求1所述的螢光免疫斑點法，其特徵在於步驟B所述的封閉液為用稀釋緩衝液配製的質量百分比為4~6%的脫脂奶粉。
4.根據權利要求1所述的螢光免疫斑點法，其特徵在於步驟B所述的將硝酸纖維素膜乾燥，指的是將硝酸纖維素膜置於室溫下自然乾燥，或是將硝酸纖維素膜置於37°C培養箱中乾燥。
5.根據權利要求1所述的螢光免疫斑點法，其特徵在於步驟B所述的將硝酸纖維素膜乾燥後，置於容器內，加入封閉液浸沒，指的是將硝酸纖維素膜置於容器中，加入5^20ml封閉液，淹沒硝酸纖維素膜，再將容器置於37°C培養箱中封閉0.8^1.2h。
6.根據權利要求1所述的螢光免疫斑點法，其特徵在於步驟B所述的用稀釋緩衝液稀釋的一抗，指的是用稀釋緩衝液按體積比1:100-1000000倍稀釋的一抗，所述的用稀釋緩衝液稀釋的二抗，指的是用稀 釋緩衝液按體積比1:100-10000倍稀釋的二抗。
7.根據權利要求1所述的螢光免疫斑點法，其特徵在於步驟B所述的加入用稀釋緩衝液稀釋的一抗，反應0.8^1.2h，指的是加入5~20ml用稀釋緩衝液稀釋的一抗，淹沒硝酸纖維素膜，置於37°C培養箱中反應0.8^1.2h ;所述的加入用稀釋緩衝液稀釋的二抗，反應0.8^1.2h，指的是加入5~20ml用稀釋緩衝液稀釋的二抗，淹沒硝酸纖維素膜，置於37°C培養箱中反應0.8~1.2h。
8.根據權利要求1所述的螢光免疫斑點法，其特徵在於步驟B所述的用洗滌緩衝液洗滌硝酸纖維素膜，指的是用洗滌緩衝液洗滌硝酸纖維素膜3~4次，每次均置於水平搖床上振蕩洗滌5~6min。
9.根據權利要求1所述的螢光免疫斑點法，其特徵在於步驟C所述的將洗滌後的硝酸纖維素膜稍乾燥，指的是將洗滌後的硝酸纖維素膜用吸溼性材料吸乾。
10.根據權利要求1所述的螢光免疫斑點法，其特徵在於步驟C所述的螢光分光光度計為美國Thermo Scie ntific公司製造的Lumina型號突光分光光度計。
【文檔編號】G01N33/569GK103760346SQ201410034665
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2014年1月25日 優先權日:2014年1月25日
【發明者】丁銘, 盧訓, 張仲凱 申請人:雲南省農業科學院生物技術與種質資源研究所