一種鑑別尼羅羅非魚、奧利亞羅非魚及其雜交魚的分子標記方法
2023-11-05 13:03:27 1
專利名稱：一種鑑別尼羅羅非魚、奧利亞羅非魚及其雜交魚的分子標記方法
技術領域：
本發明屬於分子標記技術領域，涉及一種鑑別尼羅羅非魚、奧利亞羅非魚及其雜交魚的分子標記方法，是對不同種羅非魚的鑑別。
背景技術：
羅非魚(Tilapia)原產於非洲，是世界性養殖品種，該魚上世紀50年代引入我國，得到了較快發展，現中國已是世界上最大的羅非魚生產國和出口國。目前，我國主要養殖的羅非魚品種有尼羅羅非魚ipreochromis nilo ticus)，奧利亞羅非魚ifireochromis aureus)和奧尼雜交羅非魚，其中奧尼羅非魚是尼羅羅非魚(早)和奧利亞羅非魚(古) 的雜交1代，具有雄性率高、生長快、抗病力強等優點，但它的雄性率和養殖性能與親本的種質純度密切相關。由於羅非魚品種間很容易雜交，且雜種可育，雜交種形態又與親本很相似，傳統的形態辨別方法又很難準確辨別純種和雜交種。因此，很容易造成羅非魚種質混雜，導致優良經濟性狀退化，這也是目前制約我國羅非魚良種保護和養殖發展的突出問題。尼羅羅非魚，奧利亞羅非魚及其它們雜交魚鑑別方面，學者們曾利用同工酶技術、 RAPD技術、微衛星標記技術等建立了區別它們的生化和分子遺傳標記。然而，同工酶是基因表達產物，但檢測位點有限，對親緣關係較近或遺傳基礎複雜的品種不容易區分；RAPD方法雖然是從基因水平鑑別不同品種，但RAPD方法對反應條件的變化很敏感，許多反應因素稍微有差異就會導致擴增帶型發生改變，穩定性和重複性較差，從而限制了其應用。微衛星標記又稱簡單序列重複標記(SSR)與同工酶、RAPD、RFLP等技術相比，具有多態性頻率高、 檢測容易、重複性好、共顯性的孟德爾式遺傳等優點，被廣泛用於品種及親子鑑定等研究， 但應用微衛星標記進行多重PCR來快速、準確地鑑別不同羅非魚品種的研究還未見報導。 採用特異微衛星標記技術進行多重PCR分析尼羅羅非魚、奧利亞羅非魚以及它們的雜交魚的遺傳特性，可以建立快速、準確鑑別不同羅非魚品種的方法。
發明內容
發明目的
本發明的目的是提供一種鑑別尼羅羅非魚、奧利亞羅非魚及其雜交魚的分子標記方法，有助於快速、準確鑑別不同種羅非魚，在羅非魚保種、選育和養殖生產中有極大的應用價值。技術方案
一種鑑別尼羅羅非魚、奧利亞羅非魚及其雜交魚的分子標記方法，其特徵在於，採用以下提取步驟
(1)選用3對特異微衛星引物組合進行多重PCR反應，其中這3對特異微衛星引物如
下
CCCTCTGTTTCCATCTCA ； GATACCTGTCCATACCTCCTC ；
3GCTCGCTCCAGAAAAATCAC ； GTCAAAAAGGCATGGCAAAG ； CTGCACTTTTACTGAGGG ； TGGGAGATTAACAGAATAACA
(2)從待測羅非魚採樣血液或鰭條，採用DNA提取法提取基因組DNA；
(3)用步驟(2)的基因組DNA為模板，步驟(1)所選的3對微衛星引物組合進行多重 PCR擴增；
(4)對步驟(3)的PCR產物用8.0%的非變性聚丙烯醯胺凝膠進行電泳分離，銀染法染色後，拍照記錄電泳結果。(5)根據多重PCR的電泳檢測結果，鑑別尼羅羅非魚、奧利亞羅非魚及它們的雜交
佳.ο步驟(3)中，在進行PCR擴增時，PCR反應總體積為15 yL，其中含IOX反應緩衝液 1.5 μ L, Mg2+ 2 mmol/L, dNTP 200ymol/L, 3 對上下遊引物各 0· 2 μ mol/L，Taq 酶 0. 4U, DNA 50 ng 100 ng，用滅菌雙蒸餾水補足體積。步驟(3)中，PCR反應條件為94 "C 3 min ；94 "C 20 s，52 °C退火 20s，72 "C 20s, 25 30個循環；72°C延伸5 min。本發明具體如下步驟實現
(1)選用3對特異微衛星標記引物組合進行多重PCR反應。(2)從待測羅非魚採樣血液或鰭條，採用DNA提取法提取基因組DNA。(3)用步驟(2)的基因組DNA為模板，步驟(1)所選的3對微衛星引物組合進行多重PCR擴增。(4)對步驟(3)的PCR產物用8. 0%的非變性聚丙烯醯胺凝膠進行電泳分離，銀染法染色後，拍照記錄電泳結果。(5)根據多重PCR的電泳檢測結果，就能鑑別尼羅羅非魚、奧利亞羅非魚及它們的雜交魚在引物GM017擴增產物區，尼羅羅非魚條帶1條或2條，片段大小在144 148bp 左右；奧利亞羅非魚條帶1條，片段大小在160bp左右；雜交魚條帶都為2條，其中1條片段大小在144 148bp左右，另1條片段大小在160bp左右。在引物UNH948擴增產物區，尼羅羅非魚條帶1條或2條，片段大小在170 178bp左右；奧利亞羅非魚條帶1或2條，片段大小在196 202bp左右；雜交魚條帶都為2條，其中1條片段大小在170 178bp左右， 另1條片段大小在196 202bp左右。在引物GM440擴增產物區，尼羅羅非魚條帶1條或 2條，片段大小在262 266bp左右；奧利亞羅非魚條帶1條，片段大小在290bp左右；雜交魚條帶都為2條，其中1條片段大小在262 266bp左右，另1條片段大小在290bp左右。本發明中所選的3對微衛星引物在尼羅羅非魚、奧利亞羅非魚及其雜交魚中PCR 擴增反應穩定、擴增片段清楚、不同種羅非魚擴增片段差別明顯，且這3對微衛星引物退火溫度相近，每對引物擴增片段相差在20bp以上，在同一體系多重PCR反應中相互不影響各自的PCR擴增產物。這3對特異微衛星引物其中這3對特異微衛星引物如下
CCCTCTGTTTCCATCTCA ； GATACCTGTCCATACCTCCTC ； GCTCGCTCCAGAAAAATCAC ； GTCAAAAAGGCATGGCAAAG ； CTGCACTTTTACTGAGGG ； TGGGAGATTAACAGAATAACA
本發明中PCR反應總體積為15 μ L，其中含IOX反應緩衝液1. 5 μ L, Mg2+ 2 mmol/ L, dNTP 200 μ mol/L, 3 對上下遊引物各 0. 2 μ mol/L, Taq 酶 0. 4U, DNA 50 ng 100 ng,用滅菌雙蒸餾水補足體積。本發明中擴增PCR反應均在PCR儀上完成。PCR反應條件為94 V 3 min ；94 V 20 s, 52 °C退火 20s, 72 "C 20s，25 30 個循環；72°C延伸 5 min。有益效果
與現有技術相比，本申請採用特異微衛星標記技術進行多重PCR分析尼羅羅非魚、奧利亞羅非魚以及它們的雜交魚的遺傳特性，反應穩定，重複性好，可以準確地將純種尼羅羅非魚、奧利亞羅非魚和它們的雜交後代鑑別開。本申請一次可同時檢測多個微衛星位點，減少了檢測時間和降低了檢測成本。
圖1尼羅羅非魚、奧利亞羅非魚及其它們的雜交魚多重PCR電泳檢測結果，其中 M 分子量標準
1-13 尼羅羅非魚 14-20 奧尼羅非魚 21-28 尼奧羅非魚 29-40 奧利亞羅非魚
具體實施例方式
實施例1
本發明一種鑑別尼羅羅非魚、奧利亞羅非魚及其雜交魚的分子標記方法採用以下技術步驟
尼羅羅非魚13尾從中國水產科學研究院淡水漁業研究中心宜興漁場採得。從每尾魚的尾靜脈採血0. 5!1^，取3(^1^血細胞抽提基因組0嫩。以尼羅羅非魚的基因組DNA為模板， 用引物GM017, UNH948和GM440 3對引物對進行多重PCR擴增，PCR反應總體積為15 μ L， 其中含IOX反應緩衝液1. 5 μ L, MgCl2 2 mmol/L, dNTP 200ymol/L, 3對上下遊引物各0. 2μπιο1/1，7^《酶0. 4U，DNA 80 ng，用滅菌雙蒸餾水補足體積。PCR反應條件為94 °C 3 min ；94 "C 30 s，52 °C退火 30s, 72 "C 30s，25 個循環；72°C延伸 8 min。PCR 反應結束後，產物用8. 0%的非變性聚丙烯醯胺凝膠進行電泳分離，銀染法染色後，拍照記錄電泳結果。電泳檢測發現，在引物GM017擴增產物區，尼羅羅非魚條帶1條或2條，片段大小在 144 148bp ；在引物UNH948擴增產物區，尼羅羅非魚條帶1條或2條，片段大小在170 184bp ；在引物GM440擴增產物區，尼羅羅非魚條帶1條或2條，片段大小在262 ^6bp。其中這3對特異微衛星引物如下 CCCTCTGTTTCCATCTCA ； GATACCTGTCCATACCTCCTC； GCTCGCTCCAGAAAAATCAC ； GTCAAAAAGGCATGGCAAAG ； CTGCACTTTTACTGAGGG ； TGGGAGATTAACAGAATAACA。實施例2
本發明一種鑑別尼羅羅非魚、奧利亞羅非魚及其雜交魚的分子標記方法採用以下技術步驟
奧尼雜交羅非魚(尼羅羅非魚早X奧利亞羅非魚￠)8尾從中國水產科學研究院淡水漁業研究中心宜興漁場採得。每尾魚取0. Ig尾鰭鰭條，抽提基因組DNA。以奧尼雜交羅非魚的基因組DNA為模板，用引物GMO17，UNH948和GM440 3對引物對進行多重PCR擴增，PCR反應總體積為15 μ L，其中含IOX反應緩衝液1. 5 μ L5MgCl2 2 mmol/L,dNTP 200ymol/ L, 3對上下遊引物各0. 2μπιο1/1，7^《酶0. 4U，DNA 50 ng，用滅菌雙蒸餾水補足體積。PCR 反應條件為94 "C 3 min ；94 "C 30 s，52 °C退火 30s，72 "C 30s，30 個循環；72°C延伸 8 min。PCR反應結束後，產物用8.0%的非變性聚丙烯醯胺凝膠進行電泳分離，銀染法染色後，拍照記錄電泳結果。電泳檢測發現，在引物GM017擴增產物區，奧尼雜交魚條帶都為2 條，其中1條片段大小在144 148bp左右，另1條片段大小在160bp左右。在引物UNH948 擴增產物區，奧尼雜交魚條帶都為2條，其中1條片段大小在170 178bp左右，另1條片段大小在196 202bp左右。在引物GM440擴增產物區，奧尼雜交魚條帶都為2條，其中1 條片段大小在262 266bp左右，另1條片段大小在290bp左右。其中這3對特異微衛星引物如下 CCCTCTGTTTCCATCTCA ； GATACCTGTCCATACCTCCTC； GCTCGCTCCAGAAAAATCAC ； GTCAAAAAGGCATGGCAAAG ； CTGCACTTTTACTGAGGG ； TGGGAGATTAACAGAATAACA。實施例3
本發明一種鑑別尼羅羅非魚、奧利亞羅非魚及其雜交魚的分子標記方法採用以下技術步驟
奧利亞羅非魚12尾，尼奧雜交羅非魚(尼羅羅非魚$ X奧利亞羅非魚早)7尾從中國水產科學研究院淡水漁業研究中心宜興漁場採得。每尾魚取30 μ L血細胞抽提基因組 DNA。以這些基因組DNA為模板，用引物GMO17，UNH948和GM440 3對引物對進行多重PCR 擴增，PCR反應總體積為15 μ L，其中含IOX反應緩衝液1. 5 μ L，MgCl2 2 mmol/L, dNTP 200 μ mol/L, 3對上下遊引物各0. 2 μ mol/L，Taq酶0. 4U，DNA 70 ng，用滅菌雙蒸餾水補足體積。PCR反應條件為94 "C 3 min ；94 "C 30 s，52 °C退火30s，72 "C 30s，沘個循環；72°C延伸8 min。PCR反應結束後，產物用8. 0 %的非變性聚丙烯醯胺凝膠進行電泳分離，銀染法染色後，拍照記錄電泳結果。電泳檢測發現，在引物GM017擴增產物區，奧利亞羅非魚條帶1條，片段大小在160bp左右；尼奧雜交魚條帶都為2條，其中1條片段大小在 144 148bp左右，另1條片段大小在160bp。在引物UNH948擴增產物區，奧利亞羅非魚條帶1或2條，片段大小在196 202bp左右；尼奧雜交魚條帶都為2條，其中1條片段大小在170 178bp左右，另1條片段大小在196 202bp左右。在引物GM440擴增產物區，奧利亞羅非魚條帶1條，片段大小在290bp左右；尼奧雜交魚條帶都為2條，其中1條片段大小在262 266bp左右，另1條片段大小在290bp左右。其中這3對特異微衛星引物如下 CCCTCTGTTTCCATCTCA ； GATACCTGTCCATACCTCCTC； GCTCGCTCCAGAAAAATCAC ； GTCAAAAAGGCATGGCAAAG ； CTGCACTTTTACTGAGGG ； TGGGAGATTAACAGAATAACA。
權利要求
1.一種鑑別尼羅羅非魚、奧利亞羅非魚及其雜交魚的分子標記方法，其特徵在於，採用以下提取步驟(1)選用3對特異微衛星引物組合進行多重PCR反應，其中這3對特異微衛星引物如下CCCTCTGTTTCCATCTCA ； GATACCTGTCCATACCTCCTC； GCTCGCTCCAGAAAAATCAC ； GTCAAAAAGGCATGGCAAAG ； CTGCACTTTTACTGAGGG ； TGGGAGATTAACAGAATAACA(2)從待測羅非魚採樣血液或鰭條，採用DNA提取法提取基因組DNA；(3)用步驟(2)的基因組DNA為模板，步驟(1)所選的3對微衛星引物組合進行多重 PCR擴增；(4)對步驟(3)的PCR產物用8.0%的非變性聚丙烯醯胺凝膠進行電泳分離，銀染法染色後，拍照記錄電泳結果；(5)根據多重PCR的電泳檢測結果，鑑別尼羅羅非魚、奧利亞羅非魚及它們的雜交魚。
2.根據權利要求1所述的鑑別尼羅羅非魚、奧利亞羅非魚及其雜交魚的分子標記方法，其特徵在於，步驟(3)中，在進行PCR擴增時，PCR反應總體積為15 yL，其中含IOX反應緩衝液 1.5 μ L, Mg2+ 2 mmol/L, dNTP 200ymol/L, 3 對上下遊引物各 0. 2 μ mol/L， Taq酶0. 4U，DNA 50 ng 100 ng，用滅菌雙蒸餾水補足體積。
3.根據權利要求1所述的鑑別尼羅羅非魚、奧利亞羅非魚及其雜交魚的分子標記方法，其特徵在於，步驟(3)中，PCR反應條件為94 V 3 min ；94 V 20 s，52 °C退火20s， 72 "C 20s，25 30 個循環；72°C延伸 5 min。
全文摘要
本發明涉及一種鑑別尼羅羅非魚、奧利亞羅非魚及其雜交魚的分子標記方法，其特徵是選用3對特異微衛星標記引物組合，從待測羅非魚採樣血液或鰭條，提取基因組DNA，對待測羅非魚基因組DNA進行多重PCR擴增，PCR產物用8.0％的非變性聚丙烯醯胺凝膠進行電泳分離，銀染法染色後，拍照記錄電泳結果。根據多重PCR的電泳檢測結果，可鑑別尼羅羅非魚、奧利亞羅非魚及它們的雜交魚。本發明可快速、有效地鑑別尼羅羅非魚、奧利亞羅非魚及其雜交魚。
文檔編號C12Q1/68GK102226220SQ20111016311
公開日2011年10月26日 申請日期2011年6月17日 優先權日2011年6月17日
發明者俞菊華, 唐永凱, 徐跑, 李建林, 李紅霞 申請人:中國水產科學研究院淡水漁業研究中心