一種基於納米金和氧化石墨烯的雙信號放大elisa檢測方法
2023-12-03 13:31:51
一種基於納米金和氧化石墨烯的雙信號放大elisa檢測方法
【專利摘要】本發明公開了一種納米金和氧化石墨烯的新用途。該新用途具體為在放大ELISA檢測信號中的應用。本發明還公開了一種ELISA檢測方法，包括如下步驟：（1）向載有包被原的酶標板中加入與所述包被原特異結合的待測物；（2）向所述酶標板中加入納米金標記物；所述納米金標記物為將納米金與蛋白甲（與所述待測物質特異結合）和蛋白乙（與所述待測物質不結合）同時結合所得的物質；（3）向所述酶標板中加入氧化石墨烯標記物；所述氧化石墨烯標記物為將氧化石墨烯與蛋白丙（同時與所述蛋白甲和所述蛋白乙結合）結合所得的物質。本發明將納米金和氧化石墨烯同時引入傳統ELISA方法中，實現了雙信號放大，對蛋白檢測信號放大10倍以上，同時還大大降低了成本。
【專利說明】—種基於納米金和氧化石墨烯的雙信號放大ELISA檢測方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種納米金和氧化石墨烯的新用途，特別涉及一種納米金和氧化石墨烯在放大ELISA檢測信號中的應用。
【背景技術】
[0002]酶聯接免疫吸附劑測定(Enzyme-LinkedImmunosorbent Assay, ELISA)是各生物、化學實驗室以及臨床檢測中常用的分析檢測方法。ELISA的基礎是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標記。結合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學活性，酶標記的抗原或抗體既保留其免疫學活性，又保留酶的活性。在測定時，受檢標本(測定其中的抗體或抗原)與固相載體表面的抗原或抗體起反應。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體複合物與液體中的其他物質分開。再加入酶標記的抗原或抗體，也通過反應而結合在固相載體上。此時固相上的酶量與標本中受檢物質的量呈一定的比例。加入酶反應的底物後，底物被酶催化成為有色產物，產物的量與標本中受檢物質的量直接相關，故可根據呈色的深淺進行定性或定量分析。由於酶的催化效率很高，間接地放大了免疫反應的結果，使測定方法達到很高的敏感度。但是昂貴的抗體價格和非足夠低的檢測限已不能滿足當前實際應用的要求。
[0003]目前，納米材料在各領域的應用較為廣泛，尤其是納米金的應用多年來一直得到大家的認可。納米金即指金的微小顆粒，其直徑在I?lOOnm，具有高電子密度、介電特性和催化作用，能與多種生物大分子結合，且不影響其生物活性。
[0004]氧化石墨烯是近幾年才被大家關注的，在材料學領域得到了越來越廣泛的應用，但是其在生命科學領域的應用還鮮有報導。
[0005]目前尚未有將納米金和氧化石墨烯同時用於ELISA檢測中的相關報導。
【發明內容】
[0006]本發明的目的是提供一種納米金和氧化石墨烯的新用途。
[0007]本發明所提供的納米金和氧化石墨烯的新用途，具體為納米金和氧化石墨烯在放大ELISA檢測信號中的應用。所述ELISA檢測信號的放大可理解為在相同的檢測條件下，反應結束後反應液顏色更深，或OD值更大，可進一步理解為檢測靈敏度的提高。
[0008]在所述應用中，所述納米金的顆粒直徑可為10 - lOOnm，如10_20nm。在本發明的一個實施例中，所述納米金的顆粒直徑具體為16nm。所述氧化石墨烯為單原子層結構。
[0009]本發明的另一個目的是提供一種ELISA檢測方法。
[0010]本發明所提供的ELISA檢測方法，依次包括如下步驟:
[0011](I)向載有包被原的酶標板中加入能與所述包被原特異結合的待測物質；
[0012](2)向所述酶標板中加入納米金標記物；所述納米金標記物為將納米金與蛋白甲和蛋白乙結合所得的物質；所述蛋白甲是與所述待測物質特異結合的蛋白，所述蛋白乙是與所述待測物質不結合的蛋白；
[0013](3)向所述酶標板中加入氧化石墨烯標記物；所述氧化石墨烯標記物為將氧化石墨烯與蛋白丙結合所得的物質；所述蛋白丙為與所述蛋白甲和所述蛋白乙結合的另一種蛋白。
[0014]所述方法中，在步驟(I)、(2)和(3)之後均包括用洗滌液進行洗滌的步驟；所述洗滌液為ELISA檢測常用洗滌液。在步驟(3)後還包括加入顯色液進行顯色反應，以及加入終止液進行終止反應的步驟。在本發明的一個實施例中，所述顯色液具體為TMB，所述終止液為2M硫酸。
[0015]所述方法中，所述納米金的顆粒直徑可為10 -1OOnm0在本發明的一個實施例中，所述納米金的顆粒直徑具體為16nm。所述氧化石墨烯為單原子層結構。
[0016]所述方法中，各蛋白均為ELISA檢測中所涉及的抗原或抗體，當然所述抗原也包括半抗原與載體蛋白的偶聯物。
[0017]在本發明中，所述ELISA檢測方法具體為改良的雙抗夾心法，相應的，所述包被原為抗體；所述待測物質為與所述包被原特異結合的抗原；所述蛋白甲為與所述待測物質特異結合的一抗，所述蛋白乙為與所述待測物質不結合的一抗；所述蛋白丙為抗所述蛋白甲和所述蛋白乙的酶標二抗。
[0018]更加具體的，所述包被原為抗HSP70蛋白的一種抗體，如HSP70-Abl(mouse IgG)，為 santa cruz biotechnology, inc.產品，目錄號:HSP70 (F-3): sc sc-373867。所述待測物質為與所述包被原(抗體HSP70-Abl (mouse IgG))特異結合的抗原HSP70,如Abcam公司的HSP70蛋白標準品，其目錄號為ab78434。所述蛋白甲為與所述待測物質(抗原HSP70)特異結合的一抗，如 HSP70_Abl (rabbit IgG), santa cruz biotechnology, inc.產品，目錄號:HSP70(k-20): sc-1060，記作HSP70-Abl (rabbit IgG)。所述蛋白乙為與所述待測物質(抗原HSP70)不結合的一抗GST-Abl，為康為世紀公司產品，目錄號:cw0085A。所述蛋白丙為同時抗所述蛋白甲(特異性一抗HSP70-Abl (rabbit IgG))和所述蛋白乙(輔助一抗GST-Abl)的HRP酶標山羊抗兔IgG，為康為世紀公司產品，目錄號:CW0103。
[0019]所述方法中，所述納米金是通過自身的靜電吸附作用，將所述蛋白甲和所述蛋白乙結合在其表面。由於是依靠納米金自身的靜電吸附作用將所述蛋白甲和所述蛋白乙結合在其表面的，所以所述蛋白甲和所述蛋白乙與納米金的結合能力相同。
[0020]所述方法中，由於納米金和氧化石墨烯的比表面積較大，故而在單位面積上能結合更多的蛋白。一方面，通過引入所述納米金擴大一抗與抗原的比例；另一方面，通過引入所述氧化石墨烯擴大酶標二抗與一抗的比例，進而實現ELISA檢測信號的逐級放大。
[0021]實際應用中，通常首先通過單獨使用與所述待測物質(如抗原)特異結合的所述蛋白甲(不經納米金標記的抗原特異性抗體)，確定所需一抗的最小用量；然後再選擇比所述蛋白甲(特異性一抗)價格相比更加便宜的所述蛋白乙(輔助一抗)，在如上確定的一抗最小用量的範圍內，通過調節所述蛋白乙(輔助一抗)和所述蛋白甲(特異性一抗)的加入比例達到控制兩種一抗與納米金的結合比例，進而找到成本的降低幅度和檢測信號的放大倍數的最佳結合點。
[0022]本發明將納米金和氧化石墨烯同時引入到傳統ELISA檢測方法中，實現了雙信號放大，實現了對蛋白檢測信號放大10倍以上的高靈敏度檢測，同時還大大降低了成本。另夕卜，本發明還具有以下優點:
[0023]1、納米金的製備為較成熟的實驗室操作技術，一般實驗室都能夠製備出高質量的納米金顆粒；
[0024]2、納米金與抗體的結合為靜電吸附，易於實現；
[0025]3、氧化石墨烯與抗體結合條件較為溫和，可以在實驗室條件下實現；
[0026]4、ELISA方法是較為經典的生物樣本檢測方法，具有較強的普遍適用性，只需在傳統方法的基礎上進行幾步抗體的修飾，既能達到優化改進的目的，較容易實現；
[0027]5、本發明重複性較好，所用試劑，價廉易得，能滿足不同目的的分析需求。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0028]圖1為納米金或氧化石墨烯與抗體的結合圖。其中，A為納米金顆粒和納米金與一抗結合物的透射電鏡圖:a為納米金顆粒的透射電鏡圖，b為納米金與一抗結合物的透射電鏡圖為氧化石墨烯和結合有二抗的氧化石墨烯的透射電鏡圖:a為氧化石墨烯的透射電鏡圖，b為結合有二抗的氧化石墨烯的透射電鏡圖；C為氧化石墨烯和結合有二抗的氧化石墨烯的X射線光電子譜圖:a為氧化石墨烯與二抗結合後的X射線光電子譜圖，b為氧化石墨烯的X射線光電子譜圖。
[0029]圖2為本發明ELISA檢測方法的操作流程示意圖。其中，a為傳統ELISA檢測方法的操作流程山為本發明優化改進後的ELISA檢測方法操作流程。其中的HSP70-aAbl即為 GST-AbI。
[0030]圖3為本發明優化改進後ELISA檢測方法對待測物質的檢測結果圖。其中，A為一抗最小用量的測定結果為輔助一抗和特異性一抗比例的優化測定結果；C為傳統ELISA檢測方法與本發明優化改進後ELISA檢測方法對同一樣本檢測結果對比圖。
【具體實施方式】
[0031 ] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
[0032]下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0033]抗原GST:Abcam 公司，目錄號 ab70456。
[0034]HSP70蛋白標準品:Abcam公司，目錄號ab78434。
[0035]作為包被原的抗HSP70蛋白的一抗:鼠源，santa cruz biotechnology, inc.產品，目錄號:HSP70 (F-3):sc sc-373867，記作 HSP70_Abl (mouse IgG)。
[0036]HSP70 蛋白的特異性一抗:兔源，santa cruz biotechnology, inc.產品，目錄號:HSP70 (k-20): sc-1060,記作 HSP70_Abl (rabbit IgG)。
[0037]HSP70蛋白的輔助一抗:GST蛋白的特異性一抗，兔源，記作GST-Abl，購自康為世紀公司，目錄號:cat:cw0085Ao
[0038]GST 蛋白的輔助一抗:cellular myelocytomatosis oncogene primaryantibody,兔源,記作C-MYC-Abl,來自康為世紀公司，目錄號:CW0089。
[0039]辣根過氧化酶標記的二抗:HRP標記的山羊抗兔IgG抗體，記作HRP-1gG，康為世紀公司產品，目錄號:CW0103。
[0040]下述實施例中所涉及的納米金標記抗體的製備均按照如下方法操作:[0041](I)納米金顆粒(AuNPs)的製備
[0042]首先將所用器皿用王水(質量分數31%的濃鹽酸與質量分數98%的濃硝酸以體積比3:1進行混合)浸泡，然後用雙蒸水衝洗，烘乾待用。
[0043]將I mL濃度為1% (質量百分數)的氯金酸水溶液加入到IOOml雙蒸水中，有力攪拌並加熱至沸騰，迅速加入4.5mL濃度為1% (質量百分數)的檸檬酸鈉水溶液，充分攪拌，保持沸騰lOmin。這期間溶液顏色由灰變藍再變紫，最後為酒紅色。移去熱源，再攪拌15min，自然冷卻至室溫，即製得平均粒徑為16nm的金膠(用透射電鏡表徵)，4°C下保存備用。納米金顆粒的透射電鏡圖如圖1中A中a所示。
[0044](2)納米金-抗體結合物的製備
[0045]ρΗ7.4 的 PBS溶液:8g NaCl.0.2g KCl、1.44g Na2HPO4和 0.24g KH2PO4,溶於 800ml蒸懼水中，用HCl調節溶液的pH值至7.4,最後加蒸懼水定容至1L。
[0046]一抗:GST_Abl 與 HSP70_Abl (rabbit IgG)的混合物，質量比為 3:2。
[0047]在緩慢攪拌下，將30 μ g上述一抗加入到ImL pH9.0 (用0.1M的NaOH調pH)的膠體金溶液中，混合液在室溫下靜置lh。然後加入0.2mL濃度為5% (5g/100ml)的牛血清白蛋白(BSA)溶液(溶劑為ρΗ7.4的PBS溶液)，再放置30min後，於16000r/min離心IOmin,溶液分為兩層:上層是無色或淡紅色的上清液，下層是鬆散的暗紅色沉澱。移去上清液，將沉澱用PBS-BSA溶液(用pH7.4的PBS作溶劑，配置而成的含有5g/100mL的BSA溶液)洗滌一次，最後將沉澱懸浮在ImL的PBS-BSA溶液中，於4°C下保存。納米金與一抗結合物的透射電鏡圖如圖1中A中b所示。
[0048]下述實施例中所涉及的氧化石墨烯(GO)標記抗體的製備均是將氧化石墨烯上的鍵氧化為羧基，進而通過該羧基與抗體上的氨基反應，生成醯胺鍵，具體按照如下方法操作:
[0049](I)將50mg的NaOH和50mg的ClCH2COONa加到ImL濃度為lmg/mL的氧化石墨烯(GO)懸浮液(水溶液)中；氧化石墨烯的透射電鏡圖如圖1中B中a所示；
[0050](2)聲裂水浴(在水浴中超聲處理，40KHz，250W) 2h，所得溶液為母液；
[0051](3)用稀HCl中和母液至pH為7，得到G0-C00H，反覆用水清洗和離心，直到產物在去離子水中均勻分散；
[0052](4)用去離子水透析GO-COOH懸浮液48h以上以除去所有離子，得到濃度為
1.12mg/mL 的 G0-C00H，待用；
[0053](5)將 ImL 濃度為 1.12mg/mL 的 GO-COOHUOmL 濃度為 400mM 的 1-乙基 _(3_ 二甲基氨基丙基)碳醯二亞胺(EDC)、IOmL濃度為IOOmM的N-羥基硫代琥珀醯亞胺(NHS)和ImL pH5.2的MES緩衝液混合，反應30min ;因為後面還要將多餘的EDC，MES等通過離心除去，所以對於其體積要求不是很嚴格，只要過量就行。
[0054](6)以13000rpm離心5min，除去懸浮液，然後用MES緩衝液反覆衝洗除去EDC和NHS ；
[0055](7)得到的產物分散於pH7.4的1.0mL的PBS中，超聲處理5min，得到均勻分散的分散液；
[0056](8)保存於4°C備用，放置3周仍能保持酶活性；
[0057](9)加入50 μ L辣根過氧化酶標記的二抗(HRP-1gG)，攪拌過夜(4°C )，用PBS洗漆、離心5min (3次)；
[0058](10)將沉澱重溶於1.0mL的PBS-BSA溶液中，即得氧化石墨烯功能化修飾過的HRP酶標二抗，將其放在4°C備用。結合有二抗的氧化石墨烯的透射電鏡圖如圖1中B中b所示；氧化石墨烯和結合有二抗的氧化石墨烯的X射線光電子譜圖如圖1中C所示。
[0059]實施例1、利用納米金和氧化石墨烯進行ELISA檢測的方法
[0060]本發明基於納米金和氧化石墨烯的雙信號放大ELISA檢測中所用材料和試劑如下:
[0061](I)酶標板。
[0062](2)包被原:HSP70-Abl(mouse IgG)。
[0063](3)待測物質:HSP70蛋白標準品。
[0064](4)納米金標記的一抗:被納米金標記的一抗為與待測物質(HSP70蛋白)特異結合的一抗(肥?7041310^1*^ IgG))和不與待測物質(HSP70蛋白)特異結合的輔助一抗(GST-Abl)的混合物(質量比2:3)。
[0065](5)氧化石墨烯標記的酶標二抗:被氧化石墨烯標記的二抗為HRP_GSTAb2。
[0066](6)顯色液:TMB (碧雲天公司，產品目錄號:P0209)。
[0067](7)終止液:2mol/L 硫酸。
[0068](8)洗滌液:PBS 和 PBST。其中，PBS 的配方為:8g NaCU0.2g KC1、1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4，溶於800ml蒸餾水中，用HCl調節溶液的pH值至7.4，最後加蒸餾水定容至IL ;PBST為向PBS中加入體積分數為0.05%的吐溫-20後所得的溶液。
[0069](9)樣品稀釋液:PBS (配方同上)；
[0070](10)封閉液:向PBS (配方同上)中加入終濃度為0.5g/100mL的牛血清白蛋白(BSA)後所得的溶液。
[0071]本發明的ELISA檢測是在傳統ELISA檢測的基礎上引入了納米金和氧化石墨烯，從而實現檢測信號的雙重放大，操作步驟具體如下(其操作流程如圖2中b所示):
[0072]I)包被:在 96 孔酶標板中加入 100 μ I 濃度為 0.1 μ g/mL HSP70_Abl (mouse IgG)溶液(用包被稀釋液進行稀釋)，同時設置無包被原的對照，4°C包被過夜，用洗滌液洗滌3次。
[0073]2)封閉:加入150 μ L/孔的封閉液，在37°C孵育2h，棄封閉液，洗滌3次，拍幹。置
於4°C冰箱保存備用。
[0074]3)加待測物質:吸取100 μ I 一定濃度的待測物質(抗原HSP70)，加入對應的酶標板中，37°C孵育30min，用洗滌液洗板4次，拍幹。
[0075]同時設置以PBS代替待測物質的對照(陰性對照孔)。
[0076]4)加納米金標記的抗體:吸取100μ I的納米金標記的抗體溶液(用樣品稀釋液進行稀釋)，其中HSP70-Abl (rabbit IgG)的含量為1.668X 10_5mg，GST-Abl的含量為
2.502X 10_5mg，37°C孵育120min，用洗滌液洗板4次，拍幹。
[0077]5)加氧化石墨烯標記的酶標二抗:吸取100 μ I濃度為lmg/mL的氧化石墨烯標記的酶標二抗HRP-GST Ab2 (用樣品稀釋液進行稀釋)，37°C孵育45min，用洗滌液洗板4次，拍幹。
[0078]6)顯色:將 20 X TMB 稀釋至 1XTMB，按 100 μ I/孔加入，37°C顯色 15_30min。[0079]7)終止:加入終止液(2M H2SO4) 50 μ I/孔。
[0080]8)讀數:以450nm單波長測定各孔OD值。
[0081]一、條件優化
[0082]為了降低成本，需要採用價格更低的輔助一抗(GST-Abl)代替部分與待測物質(抗原肥?70)特異結合的一抗(肥?7041310^1*^ IgG))。具體思路如下:首先，測得相對於固定量的待測物質(抗原HSP70)，所需一抗的最小用量；然後，固定兩種一抗的總量不變，不斷調整兩種一抗的比例，由於輔助一抗(GST-Abl)不能直接與待測物質(抗原HSP70)結合，所以隨著輔助一抗(GST-Abl)的量不斷增加，檢測信號會逐漸降低，同時考慮到檢測信號和成本，選擇檢測信號沒有明顯減弱，而成本得到最大程度降低的比例作為平衡點。具體如下:
[0083]A.一抗最小用量的測定[0084]I)包被:在96孔酶標板中加入100 μ I濃度為128ng/m L的抗原GST溶液(用包被稀釋液進行稀釋)，同時設置無包被原的對照，4°C包被過夜，用洗滌液洗滌3次。
[0085]2)封閉:加入150 μ L/孔的封閉液(配方同上)，在37°C孵育此，棄封閉液，洗滌3
次，拍幹。置於4°C冰箱保存備用。
[0086]3)加一抗:將原濃度lmg/mL的一抗GST-Abl稀釋300倍(用樣品稀釋液進行稀釋，樣品稀釋液配方同上)後待用，再依次進行2倍稀釋，得到由8個具體濃度組成的系列濃度梯度。分別吸取100μ I的8個濃度的一抗GST-Abl，加入對應的酶標板中，37°C孵育30min，用洗滌液洗板4次，拍幹。計算8個濃度的一抗GST-Abl的對應用量依次為3.33X 10_4mg、
1.67X 10 4mg、8.33X 10 5mg、4.17X10 5mg、2.08 X 10 5mg、1.04 X 10 5mg> 5.21X10 6mg、
2.60X 10_6mg。同時設置以PBS代替一抗的對照(陰性對照孔)。
[0087]4)加酶標二抗:吸取100 μ I濃度為lmg/mL的酶標二抗HRP-GST Ab2 (用樣品稀釋液進行稀釋，樣品稀釋液配方同上)，37°C孵育45min，用洗滌液洗板4次，拍幹。
[0088]5)顯色:將 20 X TMB 稀釋至 1XTMB，按 100 μ I/孔加入，37°C顯色 15_30min。
[0089]6)終止:加入終止液(2M H2SO4) 50 μ I/孔。
[0090]7)讀數:以450nm單波長測定各孔OD值。
[0091 ] 結果如圖3中A所示，每個孔中的GST抗原的用量均相同，從左至右逐步降低一抗的用量，從OD值可以看出，在左數第四個孔所對應的OD值與左面的OD值相差不大，而與右面的值相差較大，所以認為第四個孔所需的一抗的量(4.17X10_5mg)為所需一抗的最小用量。實驗共設置了 3次重複，3次重複實驗的結果均相同。
[0092]B.兩種一抗比例的優化
[0093]ELISA檢測的具體操作步驟參照如步驟A所述，其中一抗為GST-Abl和C-MYC-Abl的混合物，兩種一抗的總量為步驟A中所得到的最小用量(4.17X10_5mg)，兩種一抗的比例設置如表1所示。實驗重複3次。
[0094]表1兩種一抗各自用量的質量百分比設置情況(單位:％)
[0095]
【權利要求】
1.納米金和氧化石墨烯在放大ELISA檢測信號中的應用。
2.ELISA檢測方法，依次包括如下步驟: (O向載有包被原的酶標板中加入待測物質，所述待測物質能與所述包被原特異結合； (2)向所述酶標板中加入納米金標記物；所述納米金標記物為納米金與蛋白甲和蛋白乙的結合物；所述蛋白甲能與所述待測物質特異結合，所述蛋白乙不能與所述待測物質結合； (3)向所述酶標板中加入氧化石墨烯標記物；所述氧化石墨烯標記物為氧化石墨烯與蛋白丙的結合物；所述蛋白丙能與所述蛋白甲和所述蛋白乙結合。
3.根據權利要求1所述的應用，或權利要求2所述的方法，其特徵在於:所述納米金的顆粒直徑為10 - lOOnm。
4.根據權利要求2或3所述的方法，其特徵在於:所述包被原為抗體；所述待測物質為與所述包被原特異結合的抗原；所述蛋白甲為與所述待測物質特異結合的一抗，所述蛋白乙為與所述待測物質不結合的一抗；所述蛋白丙為抗所述蛋白甲和所述蛋白乙的酶標二抗。
【文檔編號】G01N33/543GK103913573SQ201310003676
【公開日】2014年7月9日 申請日期:2013年1月5日 優先權日:2013年1月5日
【發明者】錢小紅, 張養軍, 林虹君 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院放射與輻射醫學研究所