鼠麴草中多酚類化合物單體製備方法

2023-12-05 16:42:06 1

鼠麴草中多酚類化合物單體製備方法
【專利摘要】本發明涉及植物中有效成分提取【技術領域】，具體來說是一種鼠麴草中多酚類化合物單體製備方法，步驟包括(1)鼠麴草過柱產物；(2)上樣洗脫；(3)結構測定；本發明利用HSCCC與製備HPLC聯用技術從鼠麴草中製備分離得到6個化合物，該方法簡便、高效無毒，適宜化合物的大量製備，並鑑定了其中5個化合物；同時，對化合物對α-葡萄糖苷酶的抑制作用進行了研究，為鼠麴草進一步藥理研究及質量控制奠定基礎；本發明方法可快速才鼠麴草中提取多酚類化合物單體，方法操作簡單，製備的多酚類單體化合物純度高。
【專利說明】鼠麴草中多齡類化合物單體製備方法

【技術領域】
[0001] 本發明涉及植物中有效成分提取【技術領域】，具體來說是一種鼠麴草中多酷類化合 物單體製備方法。

【背景技術】
[000引 鼠麴草（Gnaphalium affine D. Don)為菊科鼠麴草屬植物鼠麴草的全草，1977年版 《中華人民共和國藥典》一部中就有收載。傳統醫學認為它具有止咳化姨，巧風除溼，解毒之 功效，主治咳嗽姨多，風溼瘍痛，水腫，赤白帶下，痛腫療瘡等症。在墨西哥，鼠麴草屬植物常 被用作抗炎藥物。現代藥理研究進一步表明鼠麴草不僅具有顯著的抗炎、抗氧化、抑菌、鎮 咳巧姨、保肝等作用，還有殺蟲作用，因此具有廣泛的開發利用前景。
[0003] 目前，文獻報導的鼠麴草的化學成分主要是黃麗及黃麗巧類成分，而對其他化合 物研究較少，深入研究鼠麴草中化合物種類、分離其單體成分並進行化學結構鑑定及結 構一活性關係是極其必要的。


【發明內容】

[0004] 本發明的目的是針對上述技術存在的問題，提供一種鼠麴草中多酷類化合物單體 製備方法。
[0005] 為實現上述目的，本發明採用的技術方案是；一種鼠麴草中多酷類化合物單體制 備方法，步驟為：
[000引 （1)新鮮的鼠麴草置於6(TC的烘箱中烘乾後粉碎至10?20目，然後粉碎的原料 加入鼠麴草粉末量20?30倍、質量濃度為50?70 %的己醇，在70?8(TC條件下回流提 取0. 5?比，過濾，濾渣重複提取1次，合併提取液並減壓濃縮至1?1. 5ml/g，同時用鹽酸 調節抑=3,過濾除去沉澱，將濾液W 4BVA流速通過裝有DlOl樹脂的層析柱，上柱體積為 吸附後靜置0.化，用水洗至無色，然後用4?她V質量濃度為60%己醇W 2?4BV/h的流 速洗脫，收集己醇洗脫液，減壓濃縮後冷凍乾燥，得鼠麴草過柱純化產物；
[0007] (2)將正己焼、己酸己醋、無水甲醇、體積濃度為0. 5%的冰己酸水溶液按體積比 為0. 7:3. 5:1:4的比例充分混合，靜置分層過夜，將上相與下相分離，超聲脫氣，將製得的 鼠麴草過柱純化產物100?120mg用10?20mL下相超聲溶解，作為進樣溶液；上相溶劑 W 20mL/min的流速注入高速逆流色譜儀，待上相溶劑充滿後，在850?9(K)巧m/min的轉 速下將下相W 1. 5mL/min的流速粟入高速逆流色譜儀，設溫箱溫度20?3(TC，待下相流出 時即系統已經平衡，此時將準備好的進樣溶液從進樣口注入，同時進行圖譜採集，檢測波長 為280nm，根據峰形手動分段收集流出液，將收集的流出液減壓濃縮後冷凍乾燥；該溶劑體 系一次分離得到純度分別為95. 3%、98. 7%、99. 6%、99. 7%的化合物1、化合物2、化合物 3、化合物6，及化合物4、5的混合物，該混合物用少量甲醇溶解後用製備液相色譜進一步分 離，A粟為質量濃度為0. 5%冰醋酸，B粟為色譜甲醇，洗脫梯度為：在60min有機相W 32% 的體積，水相W 68%的體積等度洗脫，流速15ml/min，柱溫3(TC，進樣量1ml，檢測輸出波長 328nm，根據峰形收集化合物4、5 ;
[0008] (3)通過質譜、核磁共振技術對獲得的5個化合物進行了結構鑑定，化合物1為 綠原酸，化合物3為3, 5-雙咖啡醜基奎寧酸、化合物4為4, 5-雙咖啡醜基奎寧酸、化 合物5為3, 4-雙咖啡醜基奎寧酸，化合物6為2' ,4,4' -H輕基-6'-甲氧基查爾 麗-4' -0-目-D-葡萄糖巧。
[0009] 本發明中，參照文獻方法（GaoH, Kaw油ata J. A-glucosidase inhibition of6-hydroxyflavones. PartS:Synthesis and evaluation of2, 3, 4-trihydroxybenzoyl-containing flavonoid analogs and6-aminoflavones as a -glucosidase inhibitors. Bioorganic&Medicinal Qiemishy. 2005 ;13:1661_1671 ;YE X_P, SONG C-Q, YUAN P,et al. a -glucosidase and a -amylase inhibitory activity of common constituents from traditional Chinese medicine used for diabetes mellitus. Chinese Journal of化化ral Medicines. 2010;8:349-352) W對硝基苯基-a-D-化喃葡萄糖巧為底物測定 化合物對a-葡萄糖巧酶的抑制作用。6個化合物對a-葡萄糖巧酶均有抑制作用，其抑制 活性均與濃度呈正相關，化合物對a -葡萄糖巧酶抑制作用由強到弱為；化合物2〉化合物 6 >化合物1〉化合物3〉化合物5〉化合物4,抑制作用遠遠大於同等濃度的拜糖平。
[0010] 本發明的有益技術效果是：本發明利用服CCC與製備HPLC聯用技術從鼠麴草中制 備分離得到6個化合物，該方法簡便、高效無毒，適宜化合物的大量製備，並鑑定了其中5個 化合物；同時，對化合物對a -葡萄糖巧酶的抑制作用進行了研究，為鼠麴草進一步藥理研 究及質量控制奠定基礎；
[0011] 本發明方法可快速才鼠麴草中提取多酷類化合物單體，方法操作簡單，製備的多 酷類單體化合物純度高。
[001引說明書附圖
[0013] 圖1鼠麴草提取物HPLC檢測圖譜；
[0014] 圖2鼠麴草提取物服CCC分離色譜圖；
[00巧]圖3鼠麴草中分離組分的HPLC圖譜。

【具體實施方式】
[0016] 下面將結合本發明實施例，對本發明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述， 顯然，所描述的實施例僅僅是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例。基於本發明中的 實施例，本領域普通技術人員在沒有作出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都 屬於本發明保護的範圍。
[0017] 實施例1
[0018] 一種鼠麴草中多酷類化合物單體製備方法，步驟為：
[0019] (1)新鮮的鼠麴草置於6(TC的烘箱中烘乾後粉碎至10目，然後粉碎的原料加入鼠 曲草粉末量20倍、質量濃度為50%的己醇，在7(TC條件下回流提取0.化，過濾，濾渣重複 提取1次，合併提取液並減壓濃縮至無己醇味，同時用鹽酸調節抑=3,過濾除去沉澱，將 濾液W 4BVA流速通過裝有DlOl樹脂的層析柱，上柱體積為吸附後靜置0.化，用水洗至無 色，然後用4BV質量濃度為60%己醇W 2BV/h的流速洗脫，收集己醇洗脫液，減壓濃縮後冷 凍乾燥，得鼠麴草過柱純化產物；
[0020] (2)將正己焼、己酸己醋、甲醇、體積濃度為0.5%的冰己酸水溶液按體積比為 0.7:3. 5:1:4的比例充分混合，靜置分層過夜，將上相與下相分離，超聲脫氣；將製得的鼠 曲草過柱純化產物IOOmg用IOmL下相超聲溶解，作為進樣溶液；上相溶劑W 20mL/min的流 速注入高速逆流色譜儀，待上相溶劑充滿後，在85化pm/min的轉速下將下相W 1. 5mL/min 的流速粟入高速逆流色譜儀，設溫箱溫度2(TC，待下相流出時即系統已經平衡，此時將準 備好的進樣溶液從進樣口注入，同時進行圖譜採集，檢測波長為280nm，根據峰形手動分段 收集流出液，將收集的流出液減壓濃縮後冷凍乾燥；該溶劑體系一次分離得到純度分別為 95. 3%、98. 7%、99. 6%、99. 7%的化合物1、化合物2、化合物3、化合物6,及化合物4、5的 混合物，該混合物用少量甲醇溶解後用製備液相色譜進一步分離，A粟為質量濃度為0. 5% 冰醋酸，B粟為色譜甲醇，洗脫梯度為：在60min有機相W 32%的體積，水相W 68 %的體積 等度洗脫，流速15ml/min，柱溫3(TC，進樣量1ml，檢測輸出波長328nm，根據峰形收集化合 物 4、5 ;
[0021] (3)通過質譜、核磁共振技術對獲得的5個化合物進行了結構鑑定，化合物1為 綠原酸，化合物3為3, 5-雙咖啡醜基奎寧酸、化合物4為4, 5-雙咖啡醜基奎寧酸、化 合物5為3, 4-雙咖啡醜基奎寧酸，化合物6為2' ,4,4' -H輕基-6'-甲氧基查爾 麗-4' -0-目-D-葡萄糖巧。
[00過 實施例2
[0023] (1)新鮮的鼠麴草置於6(TC的烘箱中烘乾後粉碎至10目，然後粉碎的原料加入鼠 曲草粉末量25倍、質量濃度為60%的己醇，在75C條件下回流提取比，過濾，濾渣重複提取 1次，合併提取液並減壓濃縮至無己醇味，同時用鹽酸調節抑=3,過濾除去沉澱，將濾液W 4BVA流速通過裝有DlOl樹脂的層析柱，上柱體積為吸附後靜置0.化，用水洗至無色，然後 用地V質量濃度為60%己醇W 3BVA的流速洗脫，收集己醇洗脫液，減壓濃縮後冷凍乾燥， 得鼠麴草過柱純化產物；
[0024] (2)將正己焼、己酸己醋、甲醇、體積濃度為0.5%的冰己酸水溶液按體積比為 0.7:3. 5:1:4的比例充分混合，靜置分層過夜，將上相與下相分離，超聲脫氣；將製得的鼠 曲草過柱純化產物IlOmg用15mL下相超聲溶解，作為進樣溶液；上相溶劑W 20mL/min的流 速注入高速逆流色譜儀，待上相溶劑充滿後，在875巧m/min的轉速下將下相W 1. 5mL/min 的流速粟入高速逆流色譜儀，設溫箱溫度25C，待下相流出時即系統已經平衡，此時將準 備好的進樣溶液從進樣口注入，同時進行圖譜採集，檢測波長為280nm，根據峰形手動分段 收集流出液，將收集的流出液減壓濃縮後冷凍乾燥；該溶劑體系一次分離得到純度分別為 95. 3%、98. 7 %、99. 6 %、99. 7%的化合物1、化合物2、化合物3、化合物6,及化合物4、5的 混合物，該混合物用少量甲醇溶解後用製備液相色譜進一步分離，A粟為質量濃度為0. 5% 冰醋酸，B粟為色譜甲醇，洗脫梯度為：在60min有機相W 32%的體積，水相W 68%的體積 等度洗脫，流速15ml/min，柱溫3(TC，進樣量1ml，檢測輸出波長328nm，根據峰形收集化合 物 4、5 ;
[00巧](3)通過質譜、核磁共振技術對獲得的5個化合物進行了結構鑑定，化合物1為 綠原酸，化合物3為3, 5-雙咖啡醜基奎寧酸、化合物4為4, 5-雙咖啡醜基奎寧酸、化 合物5為3, 4-雙咖啡醜基奎寧酸，化合物6為2' ,4,4' -H輕基-6'-甲氧基查爾 麗-4' -0-目-D-葡萄糖巧。
[002引 實施例3
[0027] (1)新鮮的鼠麴草置於6(TC的烘箱中烘乾後粉碎至20目，然後粉碎的原料加入鼠 曲草粉末量30倍、質量濃度為70%的己醇，在8(TC條件下回流提取比，過濾，濾渣重複提取 1次，合併提取液並減壓濃縮至無己醇味，同時用鹽酸調節抑=3,過濾除去沉澱，將濾液W 4BVA流速通過裝有DlOl樹脂的層析柱，上柱體積為吸附後靜置0.化，用水洗至無色，然後 用她V質量濃度為60%己醇W 4BVA的流速洗脫，收集己醇洗脫液，減壓濃縮後冷凍乾燥， 得鼠麴草過柱純化產物；
[0028] (2)將正己焼、己酸己醋、甲醇、體積濃度為0.5%的冰己酸水溶液按體積比為 0.7:3. 5:1:4的比例充分混合，靜置分層過夜，將上相與下相分離，超聲脫氣；將製得的鼠 曲草過柱純化產物120mg用20血下相超聲溶解，作為進樣溶液；上相溶劑W 20mL/min的流 速注入高速逆流色譜儀，待上相溶劑充滿後，在90化pm/min的轉速下將下相W 1. 5mL/min 的流速粟入高速逆流色譜儀，設溫箱溫度3(TC，待下相流出時即系統已經平衡，此時將準 備好的進樣溶液從進樣口注入，同時進行圖譜採集，檢測波長為280nm，根據峰形手動分段 收集流出液，將收集的流出液減壓濃縮後冷凍乾燥；該溶劑體系一次分離得到純度分別為 95. 3%、98. 7%、99. 6%、99. 7%的化合物1、化合物2、化合物3、化合物6,及化合物4、5的 混合物，該混合物用少量甲醇溶解後用製備液相色譜進一步分離，A粟為質量濃度為0. 5% 冰醋酸，B粟為色譜甲醇，洗脫梯度為：在60min有機相W 32%的體積，水相W 68%的體積 等度洗脫，流速15ml/min，柱溫3(TC，進樣量Iml，檢測輸出波長328nm，根據峰形收集化合 物 4、5 ;
[0029] (3)通過質譜、核磁共振技術對獲得的5個化合物進行了結構鑑定，化合物1為 綠原酸，化合物3為3, 5-雙咖啡醜基奎寧酸、化合物4為4, 5-雙咖啡醜基奎寧酸、化 合物5為3, 4-雙咖啡醜基奎寧酸，化合物6為2' ,4,4' -H輕基-6'-甲氧基查爾 麗-4' -0-目-D-葡萄糖巧。
[0030] 實施例4
[0031] 1 方法
[0032] (1)高效液相色譜（冊LC)分析條件
[0033] 流動相為A粟：水（0.5%冰醋酸），B粟：甲醇，採用高壓二元梯度洗脫，洗 脫方法如下；〇min(:A70 %，B:30 % ) - 15min(A:55 %，B:45 % ) - 25min(A:55 %， B:45% ) - 40min(A:30%，B:70% )，流速 I血/min,柱溫 30°C，進樣量 20yL，檢測輸出波 長 328nm。
[0034] (2)鼠麴草提取液的製備
[0035] 新鮮的鼠麴草於室內自然陰乾，置6(TC烘箱中乾燥，粉碎，取200g鼠麴草粉碎原 料，用70 %己醇，料液比為1:30,在8(TC回流提取比，提取2次，合併提取液並用鹽酸調節 抑3,抽濾去除沉澱，濾液經旋轉減壓濃縮儀濃縮至無醇味（200ml)，得到鼠麴草提取液。
[0036] (3)鼠麴草提取液的純化
[0037] 將上述所得提取液通過裝有DlOl樹脂（3cmX60cm，450ml)的層析柱，流速4BV/h， 吸附後靜置0.化，用IBV水洗去水溶性雜質，再用4BV的60%己醇W 3BVA的流速洗脫，收 集60%己醇洗脫部位，減壓濃縮後冷凍乾燥，得鼠麴草純化產物6. 44g，4C冰箱中保存，作 為高速逆流進樣原料。
[0038] (4)服CCC兩相溶劑體系的選擇
[0039] 實驗通過HPLC測定目標化合物的分配係數化值）來選擇高速逆流的溶劑體系， 一般來說各分離組分K值在0. 2-5之間時可W接受。選擇方法操作步驟：按照不同比例配 置溶劑體系，充分混勻，30s靜置分層，待溶劑體系兩相分層徹底後，取適量鼠麴草純化提取 物粉末用2mL下相溶解，過0. 45um膜，取20 y L過膜溶液經HPLC分離，記錄各峰面積為Al ; 取已過膜下相溶液ImL加入等體積已過膜的上相充分混合搖勻萃取，靜置分層徹底後，再 取下相20 y L經HPLC分離，記錄各峰面積為A2,按下列公式計算K值。
[0040] 對於逆流色譜，選擇K值合適的溶劑體系作為HSCCC的固定相與流動相。
[00川 妨高速逆流色譜腿CCC)製備分離鼠麴草中化合物
[004引按正己焼-己酸己醋-甲醇-水（體積濃度為0.5%的冰己酸）=0.7:3. 5:1:4 (V/ V)配製溶劑體系。將所有溶劑按體積比加入到2000mL的分液漏鬥中充分震蕩得溶劑混合 物，靜置一晚，等到兩相平衡後，將上相與下相分離，分別裝入試劑瓶裡，超聲脫氣40min。然 後將上相溶劑W 20mL/min的流速粟入高速逆流色譜主機管路中，待上相溶劑充滿管路後， 開啟儀器W 900巧m/min轉速正向旋轉，同時將下相W 1. 5mL/min的流速粟入主機管路，計 算固定相的保留率Sf。稱取鼠麴草服CCC進樣原料lOOmg，用IOmL下相溶解，從進樣口注 入。設置色譜採集波長340nm，分離溫度2(TC，進樣比後進行圖譜採集。根據流出峰形手 動收集每個峰的尖部流出液，經HPLC鑑定其純度。
[004引 （6)製備HPLC分離化合物4、5
[0044] 將服CCC分離物中含有組分4、5的流出液部分濃縮至幹，用少量甲醇溶解後用制 備型HPLC分離。分離條件為：流動相為A粟：水（0. 5%冰醋酸），B粟；甲醇，洗脫方法如 下；Omin (A:68%，B: 32% ) - 60min (A:68%，B: 32% )，流速 1 SmT,/min.柱溫 30°C，進樣體 積ImU檢測輸出波長328nm。
[0045] (7)結構鑑定
[0046] 質譜採用電噴霧電離源巧SI)，負離子模式，核磁共振譜用IN0VA-300核磁共振儀 完成，用CD30D為溶劑，由湖南大學分析測試中也完成。
[0047] (8)化合物對a -葡萄糖巧酶的抑制作用
[0048] W PNPG為底物測定樣品對a-葡萄糖巧酶的抑制作用。在試管中加入PBS(PH =6. 8、0. 2mol/L)0. 7血、樣品溶液0. 1血（化合物濃度0. 05-0. 7mg/mL，純化產物、拜糖平 2. 0-10. mg/血）、PNPG(20mmol/L)0. 1血、a -葡萄糖巧酶（0. 57U/ml)0. 1血在 37°C水浴加 熱15min，加入5ml0. Imol/L化2〇)3終止反應，在400nm波長下測定吸收值，同時作樣品對 照。按下式計算抑制率：
[0049] 酶活性抑制率=
[0050] Ag自；不加待測樣品反應後的吸收值；A樣。。。：加入待測樣品反應後的吸收值；A背景： 只加待測樣品的吸收值。
[005。 2結果
[0052] (1) HPLC分析條件的優化
[0053] 實驗分別考察了不同溶劑組成W及不同濃度梯度的己膳-水（0. 5%冰醋酸）、甲 醇-水、甲醇-水（0.5%冰醋酸）作為流動相體系對鼠麴草多酷類化合物HPLC分離效果。 結果表明（圖1)，W甲醇-水（0.5%冰醋酸）作為流動相時，鼠麴草提取液中化合物的檢 測基線比較平穩，分離效果好，色譜峰分布均勻，能實現多個色譜峰之間的分離，因此選擇 甲醇-水（0. 5%冰醋酸）作為流動相。
[0054] (2)服CCC的兩相溶劑體系選擇
[0055] 在高速逆流色譜分離中，最關鍵的是要選出合適的溶劑體系，實驗對多個不同極 性的溶劑體系進行考察，結果發現，由正己焼-己酸己醋-甲醇-水（0.5 %己酸）組成的體 系中各組分的K值較好，再進一步調整溶劑的不同比例，K值結果見表1。
[0056] 表1不同溶劑體系的K值
[0057]

【權利要求】
1.鼠麴草中多酚類化合物單體製備方法，其特徵在於，步驟為： (1) 新鮮的鼠麴草置於60°c的烘箱中烘乾後粉碎至10?20目，然後粉碎的原料加 入鼠麴草粉末量20?30倍、質量濃度為50?70%的乙醇，在70?80°C條件下回流提取 0. 5?lh，過濾，濾漁重複提取1次，合併提取液並減壓濃縮至1?1. 5ml/g，同時用鹽酸調 節pH = 3,過濾除去沉澱，將濾液以4BV/h流速通過裝有D101樹脂的層析柱，上柱體積為吸 附後靜置〇. 5h，用水洗至無色，然後用4?6BV質量濃度為60%乙醇以2?4BV/h的流速 洗脫，收集乙醇洗脫液，減壓濃縮後冷凍乾燥，得鼠麴草過柱純化產物； (2) 將正己烷、乙酸乙酯、無水甲醇、體積濃度為0.5 %的冰乙酸水溶液按體積比為 0.7:3. 5:1:4的比例充分混合，靜置分層過夜，將上相與下相分離，超聲脫氣，將製得的鼠 曲草過柱純化產物100?120mg用10?20mL下相超聲溶解，作為進樣溶液；上相溶劑以 20mL/min的流速注入高速逆流色譜儀，待上相溶劑充滿後，在850?900rpm/min的轉速 下將下相以1. 5mL/min的流速泵入高速逆流色譜儀，設溫箱溫度20?30°C，待下相流出 時即系統已經平衡，此時將準備好的進樣溶液從進樣口注入，同時進行圖譜採集，檢測波長 為280nm，根據峰形手動分段收集流出液，將收集的流出液減壓濃縮後冷凍乾燥；該溶劑體 系一次分離得到純度分別為95. 3%、98. 7%、99. 6%、99. 7%的化合物1、化合物2、化合物 3、化合物6,及化合物4、5的混合物，該混合物用少量甲醇溶解後用製備液相色譜進一步分 離，A泵為質量濃度為0.5%冰醋酸，B泵為色譜甲醇，洗脫梯度為：在60min有機相以32% 的體積，水相以68%的體積等度洗脫，流速15ml/min，柱溫30°C，進樣量lml，檢測輸出波長 328nm，根據峰形收集化合物4、5 ; (3) 通過質譜、核磁共振技術對獲得的5個化合物進行了結構鑑定，化合物1為綠 原酸，化合物3為3, 5-雙咖啡醯基奎寧酸、化合物4為4, 5-雙咖啡醯基奎寧酸、化合 物5為3, 4-雙咖啡醯基奎寧酸，化合物6為2'，4,4'-三羥基-6'-甲氧基查爾 酮-4' -Ο-β-D-葡萄糖苷。
【文檔編號】C07C69/732GK104262154SQ201410349777
【公開日】2015年1月7日 申請日期:2014年7月22日 優先權日:2014年7月22日
【發明者】陸英, 劉仲華, 李覓路, 譚斌, 林海燕, 李佳銀 申請人:湖南農業大學