來自遊動放線菌SE50/110的Acarboseacb基因簇的製作方法

2023-12-05 05:38:16 2

專利名稱：來自遊動放線菌SE50/110的Acarboseacb基因簇的製作方法
技術領域：
本發明涉及從放線菌，主要從遊動放線菌(Actinoplane sp.)SE50/110及其突變體中分離另外的acarbose生物合成及代謝基因，這些基因與先前已知的生物合成基因位於同一基因簇，本發明還涉及這些基因用於利用遊動放線菌和其他acarbose相關天然物質(假寡糖)的生產者製備acarbose及其同系物的用途，本發明還涉及這些基因用於藉助生物化學/分子生物學技術優化上述製備過程的用途，此外還涉及這些基因在其他微生物中的異源表達。
大量的放線菌，特別是遊動放線菌生成糖苷水解酶的類寡糖抑制劑，尤其生成具有消化活性片段的糖類裂解酶的抑制劑，這一發現構成了以前專利申請(例如，DE2064092和DE2209834)主題的一部分。被稱作acarbose的化合物O-4，6-雙脫氧-4-[[1S-(1S，4R，5S，6S)-4，5，6-三羥基-3-(羥甲基)-2-環己烯-1-基]-氨基]-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-O-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-D-吡喃葡萄糖是這組物質的最強的抑制劑[DE2347782]。
Acarbose是α-糖苷酶的強抑制劑，商品名為Glucobay的acarbose被用做治療糖尿病的口服抗糖尿病藥物。
次級代謝物acarbose是由遊動放線菌SE50[CBS No.79196]及其天然突變體SE50/110(CBS No.79396)[DE2209834]以及它們的篩選體和突變體生成的。上述專利申請描述了這種類型的α-糖苷酶抑制劑的分離，例如，所述德國專利申請P2209834中的實施例1～4。
在分子生物學方法中，使用基因探針能夠直接從一個未定性的基因組中分離出特定的基因，這些探針，例如32P標記過的DNA片段，能夠與那些廣受歡迎的DNA序列特異性地結合。
進一步還發現，在目前已經研究過的這種次級代謝物的生產者中，放線菌，特別是鏈黴菌的生物合成基因毗鄰分布在染色體上的同一基因簇中，而在質粒上這種現象卻極為罕見[Hershberger C.L.，etal.(1989)]。因此，用基因探針能夠分離相鄰的事先未知的生物合成基因，然後闡明這些基因對於所期望的生物合成的意義。同樣，用這些基因探針能夠檢測其他微生物體內的相應基因。
從acarbose的結構可以推斷出，acarbose分子的脫氧葡萄糖部分的形成與各種抗生素的6-脫氧糖殘基的生物合成過程(例如，鏈黴素和春日黴素等氨基糖苷，；紅黴素和泰樂菌素等大環內酯；兩性黴素A、兩性黴素B和制黴菌素等多烯；諾道紅菌素等蒽環類抗生素以及萬古黴素等糖肽)一致。因此，基因探針和可以異源使用的PCR引物對，均衍生於已知的dTDP-葡萄糖脫水酶酶蛋白的高度保守區。
就遊動放線菌SE50/110而言，最初用上述技術分離到一段2.2kb長的BamHI DNA片段並測定了其序列，該序列中含有acbB DNA全序列(編碼dTDP-葡萄糖脫水酶)和acbA(編碼Dtdp-葡萄糖合酶)和acbC(編碼環化酶)的部分DNA序列[EP A 0730029/DE19507214]。其他已知參與acarbose生物合成的酶是來自遊動放線菌SE50/110及其突變體的acrviosyl轉移酶(為acbD所編碼)[DE19626269.5]和acarbose7-磷酸轉移酶(為acbK所編碼)[Goeke，K.et al.(1996)；Drepper，A.，et al.(1996)]。已知在含有這種特定acrviosin殘基的假寡糖中，acrviosyl轉移酶能夠用其他糖代替acarviosyl結合的糖殘基。acarbose7-磷酸轉移酶(acarbose激酶)可能參與製備一種形式的acarbose，這種形式使它本身得以被轉運出細胞外。此外，acarbose7-磷酸轉移酶被認為是自身防禦機制的一部分。
Acarbose強烈地抑制生產菌株的胞質α葡糖苷酶，但經acarbose7-磷酸轉移酶作用磷酸化後的acarbose便不再具有抑制作用，因此，細胞特異性的底物代謝不被幹擾。目前已知氨基環多醇類抗生素的許多產物都具有這種特性的保護性機制。
本專利申請描述了生物合成基因簇和位於遊動放線菌SE50/110的18Kb片段上的其他參與acarbose代謝的基因(參看

圖1～3)。在分離參與acarbose代謝的另外的基因時，令人驚奇地發現，先前已知的生物合成基因acbABC和參與了以下反應的基因一起位於同一基因簇，這些反應包括acarbose的修飾(acarviosyl轉移和磷酸化，即基因acbD和acbK)，胞外和胞質內麥芽糖糊精和葡萄糖的代謝(分屬α-澱粉酶和4-α-葡聚糖轉移酶家族的酶)以及具有結合性能的蛋白質依賴性的糖轉運(麥芽糖糊精或二糖攝入胞質內的過程)。就以一種定向的方式優化上述製備方法這一點而言，這一發現對於利用生物技術生產acarbose是切實重要的。之所以這樣說是由於這一發現使得利用生物化學/分子生物學技術能夠完整地獲得acarbose代謝的重要部分，這樣得出的一個新觀點拓寬了先前專利中所強調的可能性。因此，目前可以通過以下方式影響對於acarbose的合成具有明顯重要性的α-1，4葡聚糖前體的供給澱粉/麥芽糖糊精的降解、攝入/釋放以及從寡糖一直到麥芽糖階段的胞質內變化過程，產物譜的多樣性和修飾(如acarbose磷酸化)對於acarbose的分泌和釋放出胞外的過程可能是重要的。
因此，本發明涉及從從遊動放線菌SE50/110分離另外的生物合成基因，以及這些基因用於為進一步闡釋acarbose基因簇而分離鄰接DNA區域的用途。
acarbose基因簇的闡釋包括acarbose生物合成基因的分離和定性，acarbose基因簇的闡釋對於以一種定向的方式來改進生產過程是必不可少的，例如通過●通過下列手段增強遊動放線菌合成acarbose的能力擴增瓶頸酶的編碼基因、使用更有效的啟動子以及去除或擴增調控因子。
●增加前體，尤其是來自糖代謝的前體的供給，同時優化下列轉運機制底物轉運入細胞和acarbose或經修飾的化合物的分泌。
●通過切斷生物合成次要成分的多餘途徑或者通過切斷酶降解反應的多餘途徑，嚴格控制遊動放線菌的產物譜從而得到所期望的主產物acarbose。
●在異源宿主菌中的表達為了增加產物而採用一種提高了的空間/時間產率，為了簡化檢測方法，以及為了以特定方式嚴格控制產物譜。
●使用單個或數個acarbose生物合成基因和人工合成的或微生物生產的前體，體外合成acarbose或其同類化合物。因此，本發明公開一個重組DNA分子，其中包括acarbose及其同系物的生物合成基因，這些基因位於圖2中所給出的基因簇中。
一個重組DNA分子，它的限制性酶切模式描繪在圖1中。
含有上述基因的18Kb片段的DNA全序列列於表1，由此推導出的氨基序列表示在圖3中。
表1acb基因的特性以及Acb基因的產物
a 對應於圖3中的BglII-SstI片段上的鹼基對的位置序數，括號內的序列信息是還不完整或與不確定的閱讀框架有關；b 括號內給出的是編入資料庫中時的登記號；AA＝胺基酸；在上下文(context)中，基因acbA和acbB極有可能編碼參與acarbose生物合成的酶，因為它們各自編碼的蛋白質AcbA和AcbB分別與已知的細菌dTDP-葡萄糖合成酶和dTDP-葡萄糖4，6-脫水酶具有高度的序列同一性。這些蛋白序列與這兩個酶家族的代表之間的相似性，比與來自這兩組的其他任意對功能相同的蛋白質之間的相似性要大得多，上述代表在所有情況下都是最接近的。在上下文中，令人奇怪的是，雖然在鏈黴菌蛋白質中發現了AcbA的最接近的親緣蛋白，但是AcbB卻與革蘭氏陰性菌中的各種RfbB蛋白更緊密相關。然而，在其他相應的鏈黴菌蛋白中也出現了這種現象，例如，來自產泰樂菌素的弗氏鏈黴菌的TylA1和TylA2[Merson-Daviesh和Cundiffe(1994)]，它們同樣是被同一基因簇中的相鄰基因編碼的。
基因acbC編碼一種酶，該酶可能參與了acarbose的生物合成，因為酶AcbC與蛋白AroB，即與脫氫奎寧酸合成酶相關，而且隨著在淺青鏈黴菌中的過量表達，與預想的一樣，酶AcbC表達出一種酶活性，能把庚酮糖磷酸鹽(例如景天庚酮糖-7-磷酸鹽)轉化成具有類似於Valienone和Valiolone(acarbose生物合成的可能前體)特性的產物，但這些產物與這些化合物並不相同。
基因acbK(acarbose7-激酶)，acbL(酮糖或醇糖氧化還原酶)和acbM(功能未知)以及acbN-基因(起始/終止密碼子重疊表明直接連接到acbL和acbC閱讀框架上)可能編碼參與acarbose生物合成的酶，因為它們與acbC和可能也包括acbQ一起形成一個可能的操縱子(翻譯單元)，並且可能以一種翻譯中連接的方式閱讀。一種特定的位於胞質中的acarbose激酶(acbK)的功能和一種可能的脫氫酶(acbL)的功能，也為直接參與細胞內acarbose代謝提供了支持；在上下文中，糖脫氫酶AcbL可能參與了C-7環多醇或6-脫氧己糖前體的合成或它們的縮合。
在遊動放線菌SE50/110的基因簇中，acbD(acrviosyl轉移酶)[DE19625269.5；Gokeke，K.，et al.(1996)；Drepper，A.，etal.(1996)]和acbE(α-澱粉酶)，這兩個基因方向相反共用同一個啟動子區域，這兩種基因所編碼的酶都屬於澱粉酶家族，這種現象說明，澱粉降解的調節和acarbose的生成二者之間緊密相關。以下發現進一步證實了這一點，當遊動放線菌的生長依靠澱粉作為碳源時，這兩種酶是培養物上清中表達量最大的胞外蛋白。甚至淺青紫鏈黴菌中的acbE在自身啟動子控制下的表達也發生上述情況(見實施例)。
基因acbH、acbF和acbG所編碼物質可能是胞外糖結合蛋白AcbH以及屬於ABC輸入類型的一種細菌糖轉運蛋白的兩種典型的膜成分AcbF和AcbG。它們可能通過以下方式來參與acarbose代謝攝入寡聚麥芽糖糊精，重複利用acarbose或者是作為把短鏈寡聚-α-1，4-葡聚糖(acarbose的較高同系物)吸收入細胞的運輸工具。acbQ基因編碼的類似於澱粉麥芽糖的基因產物(AcbQ)也能夠參與這種性能的過程。
本發明進一步公開一種從放線菌，特別是從遊動放線菌中分離acarbose生物合成基因的方法，其特徵在於使用了來源於2.2kb長的BamHI片段的基因探針。這個2.2kb長的BamHI片段是藉助於用PCR分離的基因探針，從已知的dTDP-葡萄糖脫水酶酶蛋白的高度保守區獲得的，有關該片段的描述見專利申請[EP A 0730029/DE19507214]。
一種分離參與放線菌中acarbose-相關天然底物生物合成過程的基因的方法(例如，編碼有效黴素、寡糖制菌素(trestatin)和肥胖菌素)。
一種通過下列手段增強放線菌合成acarbose能力的方法●增加編碼具有限速特性的生物合成酶基因的量，●採用高效啟動子增強具有限速特性的生物合成酶的合成，以及●消除不合需要的調節步驟。
一種通過與限制acarbose合成的生物合成步驟相關的蛋白質技術增強放線菌合成acarbose能力的方法，或者一種避免由於生物合成酶的不合需要的逆反應而導致的產物降解的方法。
一種通過切斷生物合成次要成分的多餘途徑或消除多餘的酶降解反應，例如，失活acbD基因，嚴格控制遊動放線菌的產物譜從而得到所期望的主產物acarbose的方法。
一種通過加快底物轉運入胞或提高acarbose分泌出胞效率來改變轉運機制的方法。
一種在異源宿主菌中實施表達的方法(例如，生成假寡糖的鏈黴菌以及在淺青紫鏈黴菌等其他鏈黴菌中，在大腸桿菌等快速生長的細菌或在酵母和真菌中)。
●為了增加產物而提高空間/時間產率，●為了簡化檢測方法，以及●為了以一種定向的方式嚴格控制產物譜。
使用acarbose生物合成基因體外合成acarbose或其同類化合物的方法，合成過程從人工合成的或微生物生產的前體開始。
下面是本發明的詳細描述。此外，本發明也通過權利要求的內容來說明。
除其他另有說明外，所有遺傳工程的操作方法均按照Sambrook等人(1989)所描述的方法進行。
使用三種不同的基因探針進行篩選。它們是從質粒pAS2、pAS5/7.3和pAS6/3中得到的。質粒pAS2是通過「煮沸裂解法」或通過鹼裂解結合限制性內切酶BamHI消化的方法從E.coli DH5α中製備得到的。分離所製得的2.2kb長的BamHI片段，並通過所謂切口平移的方法用32P標記的脫氧核苷酸標記上述片段。用這個放射性標記的片段作為探針分離acarbose生物合成基因，以下稱該標記片段為acb探針II。第二個基因探針是從質粒pAS5/7.3中分離的。分離SphI-SstI片段並按照上述方法進行放射性標記。以下稱該基因探針為探針III。第三個基因探針是從質粒pAS6/3中分離的。分離BamHI片段並按照上述方法進行放射性標記。稱該探針為acb探針IV。
用兩種不同的方法分離acarbose生物合成基因，具體如下1)用限制性內切酶SsfI、BglII和PstI消化來自遊動放線菌的染色體DNA，並用凝膠層析的方法分離限制性片段，然後採用acb探針II(SstI和BglII消化)或acb探針III(PstI消化)通過Southern雜交篩選同源DNA序列。用基因探針雜交得到的SstI片段的長度大約為10.7kb，BglII片段的長約10.2kb。從凝膠中洗脫出上述10.7kb長的SstI片段和12kb長的BglII片段，並將它們分別連接到載體pUC18和pBluescript II KS中，然後克隆到E.coli DH5α中。所得質粒定名為pAS5(SstI片段)和pAS6(BglII片段)。用acb探針III雜交所得的一段2.8kb長的PstI片段與SstI片段重疊，將PstI片段克隆入pUC18載體中，得到名為pMJ1重組質粒。
2)用acb探針III和acb探針IV通過嗜斑雜交對遊動放線菌基因組DNA的GEM12噬菌體文庫進行篩選。總計，用acb探針III篩選到15個嗜斑，而用acb探針IV篩選到2個嗜斑，這些嗜斑中包括內含acarbose生物合成基因的總(a total of)長約38.5 kb的共線性遊動放線菌DNA。這些嗜斑的特徵在於更詳細地命名為10/3和5/4。通過用PstI酶消化和將一個2.8kb長的PstI片段克隆入質粒pUC18中從嗜斑10/3中得到質粒pMJ1。通過用SstI酶消化和接著克隆入質粒pUC18中(SstI消化的)從嗜斑5/4中得到質粒pMJ9(6.3kb片段)。
為了測定遊動放線菌10.7kb長的SstI片段(pAS5)的序列，從pUC18開始構建下述重組質粒，分析所插入的DNA片段的序列PAS5來自放線菌染色體DNA的10.7kb的SstI片段PAS2來自放線菌染色體DNA的2.2kb的BamHI片段(見專利申請DE19507214)PAS5/15 來自pAS5的3.8kb的HindIII/SstI片段(見專利申請DE19625269.5)pAS5/15.1 ＝來自pAS5的2.6kb的HindIII/PstI片段pAS5/15.2 ＝來自pAS5/15.1的0.75kb的salI片段pAS5/15.3 ＝來自pAS5/15.1的0.5kb的salI片段pAS5/15.4 ＝來自pAS5/15.1的0.4kb的salI片段pAS5/15.5 ＝來自pAS5/15.1的0.35kb的salI片段pAS5/15.6 ＝來自pAS5/15.1的1.25kb的PvuII片段pAS5/15.7 ＝來自pAS5/15.1的0.7kb的PvuII/HindIII片段pAS5/15.9 ＝來自pAS5/15.1的0.1kb的PvuII片段pAS5/15.11 ＝來自pAS5/15的1.1kb的KnpI/NcoI片段pAS5/15.12 ＝來自pAS5/15的0.9kb的KnpI/NcoI片段用PCR方法擴增三個DNA區域，克隆得到的相應片段並測序pAS5/17＝0.46kb的PCR片段pAS5/18＝0.26kb的PCR片段pAS5/19＝0.27kb的PCR片段pAS5/6 來自質粒pAS5的5.4kb的PstI片段從pAS5/6開始用外切核酸酶III和S1核酸酶製備克隆，然後用XhoI和SstI消化pAS5/6.3-15＝5.1 kb的DNA插入片段pAS5/6.12-4＝4.7 kb的DNA插入片段pAS5/6.3-18＝4.3 kb的DNA插入片段pAS5/6.6-3 ＝4.2kb的DNA插入片段
pAS5/6.9-2＝3.8kb的DNA插入片段pAS5/6.9-6＝3.8kb的DNA插入片段pAS5/6.12-6 ＝3.2kb的DNA插入片段pAS5/6.3-6＝3.0kb的DNA插入片段pAS5/6.15-1 ＝2.8kb的DNA插入片段pAS5/6.3-16 ＝2.3kb的DNA插入片段pAS5/6.9-1＝1.8kb的DNA插入片段pAS5/6.9-3＝1.2kb的DNA插入片段pAS5/6.6-1＝0.9kb的DNA插入片段pAS5/6.12-3 ＝0.47kb的DNA插入片段pAS5/6.12-2 ＝0.17kb的DNA插入片段pAS5/3來自質粒pAS5的1.4kb的BamHI片段pAS5/3.1 ＝來自質粒pAS5/3的0.35kb的SphI/FspI片段pAS5/3.2 ＝來自質粒pAS5/3的0.85kb的SphI/BamHI片段pAS5/3.3 ＝來自質粒pAS5/3的0.55kb的SphI/BamHI片段pAS5/4來自質粒pAS5的1.2kb的BamHI片段pAS5/5來自質粒pAS5的0.48kb的SstI/BamHI片段pAS5/7來自質粒pAS5的1.2kb的PstI/SstI片段pAS5/7.1 來自質粒pAS5/7的0.64kb的PvuII/AccI片段pAS5/7.2 來自質粒pAS5/7的0.54kb的PstI/SphI片段pAS5/7.3 來自質粒pAS5/7的0.67kb的SphI/SstI片段pAS5/11 來自質粒pAS5的0.68kb的BglII/HindIII片段pAS5/12 來自質粒pAS5的0.63kb的BglII/PstI片段pAS5/13 來自質粒pAS5的4.8kb的BamHI/SstI片段pAS5/16 來自質粒pAS5的0.5kb的BamHI片段為了確定DNA序列而構建的質粒包括來自質粒pAS6(參看實施例6)的內含遊動放線菌的acarbose生物合成基因的片段。克隆到質粒pAS6中的DNA包括一個內含acarbose生物合成基因的6.2kb的BglII/SstI片段，pAS5中也包括這個片段。為了測定連接到pAS5中的5.9kb的BglII/SstI片段(圖1)的序列，在pUC18載體的基礎上構建下列重組質粒。pMJ6/6 來自質粒pAS6的5.9kb的BglII/SstI片段PMJ6/4.2 來自質粒pAS6/6的0.5kb的BamHI/PstI片段PMJ6/4.1 來自質粒pAS6/6的0.36kb的BamHI/PstI片段PMJ6/6.2.2 0.5kb的SalI重連片段PMJ6/6.2.3 3.3kb的SalI片段pMJ6/6.2.4 1.2kb的SalI片段pMJ6/6.2.5 1.0kb的SalI片段pMJ6/6.2.6 0.7kb的SalI片段pMJ6/6.2.7 0.14kb的SalI片段pMJ6/6.2.8 0.13kb的SalI片段pMJ6/8.1 1.1kb的ClaI/BamHI片段pMJ6/10 1.5kb的PstI/SalI片段PAS6/3來自質粒PAS6的2.8kb的BamHI片段PAS6/3.1 來自質粒PAS6/3的1.1kb的HincII片段PAS6/3.2 來自質粒PAS6/3的1.2kb的SalI片段PAS6/3.3 來自質粒PAS6/3的1.45kb的PstI片段為了確定遊動放線菌2.8kb長的PstI片段(pMJ1)的序列，構建下列質粒並分析插入片段的序列。
pMJ1/1 來自質粒pMJ1的0.6kb的SphI/PstI片段，SphI消化後的重連片段。
pMJ1/2 來自質粒pMJ1的1.2kb的SalI/PstI片段，SalI消化後的重連片段。
pMJ1/3 來自質粒pMJ1的1.4kb的SstI/PstI片段，SstI消化後的重連片段。
pMJ1/4.1來自質粒pMJ1的0.9kb的SalI片段。
用Sanger等人(1977)的方法或其衍生出的方法進行DNA測序。採用自動閱讀測序試劑盒(Pharmacia，Freiburg，Germany)結合自動雷射螢光標記DNA測序儀(ALF)(Pharmacia，Freiburg，Germany)完成測序。合適的螢光標記的pUC反向測序引物和正向測序引物均可以購買獲得(Pharmacia，Freiburg，Germany)。長約18.0kb的BglII/PstI片段的序列列於圖3。表1總結了acb基因及其所編碼的產物的特性。
表2用於PCR及測序反應的引物的序列。
用於PCR擴增的引物質粒pAs5/17質粒名稱序列acbD/E1 5′GGCGGCGATTCGGCCTGCGCGG3′acbD/E2 5′GCGGCGATGGCATGCCTGGCG3′質粒pAs5/18質粒名稱序列acbD3 5′ACCAGGCCGAGGACGGCGCCC3′acbD4 5′AGCGGCATGTGCTTGACGGCG3′質粒pAs5/19質粒名稱序列acbD5 5′ACCGGCTCGAACGGGCTGGCACC 3′acbD6 5′CCCTCGACGGTGACGGTGGCG 3′擴增acb基因的引物帶有下劃線的序列區段被用來構建限制性內切酶NdeI和EcoRI的識別位點。
引物名稱序列AS7 5′GGAAGCTCATATGAGTGGTGTCG3AS8 5′CGAGACGGTACATATGCACGCGGATG3』AS9』 5′CCGTCTCGCCCACCCGCATCACC3』AS-C1』 5′AGGGAAGCTCATATGAGTGGTGTCGAG3』AS-C2 5′GGTATCGCGCCAAGAATTCCTGGTGGACTG3
用於測序的引物引物名稱序列通用引物 5′GTAAAACGACGGCCAGT3′反向引物 5′GAAACAGCTATGACCATG3′用一種購自Applied Biosystems的473A氣相蛋白測序儀(Forster City，CA，USA)和標準的快速印跡蛋白測序程序(standardfastblott protein sequencing programme)分析Acb蛋白的N端序列。上述蛋白測序儀、不同的程序、斷裂循環以及PTH鑑定系統在測序儀的使用手冊中都有詳細描述(使用手冊；蛋白測序系統模型473A(1989)；Applied Biosystems，Forster City，CA 94404，USA)。
用一個Applied Biosystems RP 18柱(220mm×2mm，5μ原料)聯機檢測PTH胺基酸。用50pmol標準液對PTH胺基酸進行鑑定和定性。用Applied Biosystems 610A測序儀資料系統處理所得資料。
蛋白測序儀所用的所有化學物質都由Applied Biosystems提供。
實施例1.培養大腸桿菌菌株、製備質粒DNA以及DNA片段的分離在37℃下用LB培養基培養E.coliDH5α。在選擇壓力(氨苄青黴素，100μg/ml)的作用下篩選得到帶有質粒的菌株。在轉速為270rpm的搖床上振蕩培養細菌。過夜培養(OC)標明(designate)已經培養了至少16h的菌樣。
從經選擇培養後的過夜培養物1.5ml中提取細胞。用SDS鹼裂解法[Birnboim，H.C.，J.Doly(1979)]提取質粒。
按照產品說明(Gibco BRL，Eggenstein，Germany)，使用專門的限制性內切酶特定地消化載體DNA。取相關的限制性內切酶5U消化10μg質粒DNA，37℃保溫消化2h。為了確保消化完全，再加入等量的限制性內切酶，並將上述混合物再繼續保溫消化至少1h。
用水平瓊脂糖凝膠電泳分離切割後的DNA，瓊脂糖凝膠的濃度因DNA片段的大小而變化，其範圍為0.5～1.2％。洗脫前，用無菌的手術刀片切出含有DNA片段的凝膠塊並稱重。然後用JET吸附試劑盒(Genomed，Bad Oeynhausen，Germany)按照說明書上的方法洗脫出上述DNA片段。2.培養遊動放線菌SE50/110、製備和切割染色體DNA以及凝膠電泳分離片段遊動放線菌SE50/110在TSB培養基中30℃振蕩培養3d。種培養物(5ml)在培養管中240rpm振蕩培養，而培養物的主要部分在500ml的擋板燒瓶(baffled flask)中100rpm振蕩培養。培養後，離心取細胞沉澱，並用TE buffer洗滌兩次。
取1.5～2mg(鮮重)細胞，用酚/氯仿抽提法(Hopwood，D.A.，et al.(1985))製備總DNA。
取20μg染色體DNA，用相應的限制性內切酶(Gibco BRL，Eggenstein，Germany)10U在適當的緩衝液中37℃消化2h。為了確保消化完全，再加入等量的限制性內切酶，並將上述混合物再繼續保溫消化至少1h。
用水平瓊脂糖凝膠電泳分離切割後的DNA。用JET吸附試劑盒(見實施例1)再一次洗脫出上述DNA片段。3.acb基因探針II、acb基因探針III和acb基因探針IV的製備按照實施例1中的方法，從質粒pAS2(見DE19507214)、pAS5/7.3和pAS6/3中製備片段，並用Gibco BRL，Eggenstein，Germany提供的切口平移系統按照前者提供的說明書對片段進行放射性標記。按照這種方法用[α-32P]dCTP(3000 Ci/mM；Amersham Buchler，Braumschweig)標記0.5～1.0μg的DNA片段。然後將混合物煮沸10分鐘(變性)，立即加入雜交溶液(見實施例4)。4.把DNA轉移到膜上以及DNA的雜交(Southern雜交和放射自顯影)用Southern雜交方法[Southern，E.M.(1975)]把DNA片段從瓊脂糖凝膠中轉移到雜交膜上。將按照實施例2的方法獲得的瓊脂糖凝膠在0.25M HCl中搖動20分鐘。把凝膠置於3層疊放的Whatman 3 MM吸水性濾紙(Whatman，Maidstone，GB)上，然後再在上面放置一張HybondTM-N-雜交膜(Amersham Buchler，Braumschweig)同時排盡氣泡。然後再在膜的上面放幾層吸水紙，最後在這個洗濾垛上放置約1kg的一重物。利用0.4 M NaOH的吸取(sucking)轉移DNA。在經過至少12h轉移後，將尼龍濾膜放入2×SSC漂洗兩次，空氣中晾乾。
然後，把尼龍濾膜放入50～100ml的預雜交溶液，68℃水浴振蕩至少12h。在此期間更換溶液。在雜交盒中進行至少12h的雜交。使用15ml含有acb探針II(見實施例3)的雜交溶液。
然後，用6×後洗液(postwash)和1×後洗液各漂洗尼龍濾膜15分鐘。在尼龍濾膜未乾前，上面覆蓋一層抗滑膜(clingfilm)。在配有增感屏的防光暗盒中用Hyperfilm-MP(Amersham Buchler，Braumschweig)-80℃條件下放射自顯影至少16h。5.從遊動放線菌總DNA中分離和克隆BglII、PstI和SstI片段用BglII、PstI和SstI徹底消化遊動放線菌染色體DNA，用瓊脂糖凝膠電泳分離消化產物；從凝膠中洗脫出長約9.0～12kb的SstI片段、長約11～13kb的BglII片段和長約2.5～3.5kb的PstI片段。(見實施例1)。把洗脫出的SstI片段和PstI片段分別連接到從E.coli DH5α中製備得到的並用SstI和PstI消化後的質粒載體pUC18中。該載體已經被按照產品說明書用鹼性磷酸鹽(Boehringer，Mannheim)預先處理過。連接反應在20μl體積的溶液中進行。混合物中目的片段與載體之間的比例為3∶1，其中含有的DNA的量為0.01～0.1μg。使用T4 DNA連接酶及其配套緩衝液(Gibco BRL，Eggenstein，Germany)。把洗脫出的BglII片段連接到用BamHI消化過的質粒載體pBluescript II KS中，連接反應與SstI片段和PstI片段相同。
用完全連接後的混合物[見Hanahan，D.的方法(1983)]轉化E.coli DH5α的感受態細胞。把具有氨苄青黴素抗性的轉化菌轉移到LB-Amp選擇培養平板(100μg/ml)上。6.對含有來自acarbose生物合成基因簇中的以下片段的克隆進行鑑定10.7kb的SstI片段、12kb的BglII片段、2.8kb PstI片段和6.3kb的SstI片段檢測具有氨苄青黴素抗性的轉化菌中是否含有10.7kb的SstI片段和12kb的BglII片段，其中後者採用acb探針II雜交。
上述兩個克隆每個各劃線10個選擇性培養基平板，過夜培養，然後用3ml LB培養基把這些細菌從平板上的洗脫下來，然後從由上述兩個克隆的各10塊平板得到的20個pools中，提取質粒DNA[採用Birnboim，H.C.和J.Doly(1979)的方法]。為了從多接頭中切除SstI片段，用限制性內切酶EcoRI和HindIII以及SstI和HindIII兩兩配對分別消化這20個不同的質粒提取物。然後在0.6％的瓊脂糖凝膠上電泳分離限制性片段混合物，接著通過Southern轉移的方法把DNA片段從瓊脂糖凝膠中轉移到尼龍濾膜上(見實施例4)。用acb探針II再進行一次雜交(見實施例4)。所有情況下都有一個pools與acb探針II反應成陽性，然後把它分成10個單個克隆。同樣從它們中提取質粒，並按上述方法對這些質粒進行操作。發生雜交的質粒稱為pAS5和pAS6。它們分別帶有一個10.7 kb的SstI片段(pAS5)和一個12kb的BglII片段(pAS6)。
用PstI消化重組噬菌體10/3，然後用水平瓊脂糖凝膠分離切割後的DNA；從凝膠塊中洗脫出上述10.7kb的PstI片段，並將其連接到pUC18載體上。定名重組質粒為pMJ1，並將其轉化到E.coli DH5α中。
用SstI消化重組噬菌體5/4，然後用水平瓊脂糖凝膠分離切割後的DNA；從凝膠塊中洗脫出上述6.3kb的SstI片段，並將其連接到pUC18載體上。定名重組質粒為pMJ9，並將其轉化到E.coli DH5α中。7.GEM12文庫的構建、帶有acarbose生物合成基因的重組噬菌體的分離以及噬菌體DNA的製備。
用Sau3AI部分消化遊動放線菌染色體DNA。為了達到上述目的，在50μg遊動放線菌染色體DNA中加入Sau3AI 0.015 U，37℃下消化30min。通過酚抽提以及氯仿和乙醇沉澱終止酶切反應，(Sambrooket al.(1989))。進一步處理DNA片段，並按照產品的說明書(PromegaHeidelberg)的方法將其連接到噬菌體載體GEM12中。用Boehringer(Mannheim)提供的DNA-包裝試劑盒體外包裝連接混合物。用Sambrook等人(1989)所公開的方法進行用E.coli LE392增殖噬菌體。用acb探針III和acb探針IV通過嗜斑雜交(Sambrook等人所公開的方法，1989)鑑定含有acarbose生物合成基因的噬菌體。用Sambrook等人(1989)所公開的方法從用E.coli LE392增殖後的噬菌體中製備含有acarbose生物合成基因的噬菌體DNA。8.多聚酶鏈反應體外用PCR的方法擴增DNA目的區域[Mullis，K.B.，F.A.Fallona(1987)]。所有擴增反應中，均按照產品(Gibco BRL，Eggenstein)說明書使用的方法，使用Taq DNA多聚酶進行25個反應循環。在DNA富含GC時，為了抑制可能出現的次生結構，向混合物中加入5％的甲醯胺。100μl的反應體積中每種引物各加入50pmol，dNTP的反應濃度為200μM。首先，95℃DNA變性5分鐘，然後在熱啟動的情況下向反應混合物中加入2.5 U的耐熱的DNA多聚酶。在72℃下進行引物延伸，在每個循環的開始首先95℃DNA變性1分鐘。反應在Biometra熱循環儀中進行(Gttingen)。
表3從acarbose基因簇中PCR擴增DNA片段的方法。
表中列出了含有相應片段的重組質粒的名稱。<
9.質粒pAS5的亞克隆為了闡明雙股DNA的序列，從質粒pAS5中製備數個亞克隆。
pAS5/6用限制性內切酶PstI消化質粒pAS5，用凝膠電泳(0.7的瓊脂糖凝膠)分離消化產物；從凝膠中洗脫出5.4kb的PstI片段，並將其克隆到pUC18(用PstI消化過的)中，然後把重組質粒轉化到E.coli DH5α中。
pAS5/3；pAS5/4；pAS5/13和pAS5/16 用限制性內切酶BamHI消化質粒pAS5，用凝膠電泳分離消化產物。片段大小如下1.4kb的BamHI片段1.2kb的BamHI片段2.3kb的BamHI片段0.5kb的BamHI片段0.45kb的BamHI片段7.5kb的BamHI片段(＝被連接到pUC18中的4.8kb的BamHI片段)預期用於亞克隆的片段的大小為1.4kb和0.5kb，把它們從凝膠中洗脫出來(見實施例1)。按照實施例1的方法用限制性內切酶BamHI製備用於亞克隆的pUC18載體。按照實施例5的方法進行連接反應。把0.5kb的片段連接到預先製備好的pUC18中得到亞克隆pAS5/16。亞克隆pAS 5/3是把1.4kb的片段連接到預先製備好的pUC18中得到的。亞克隆pAS 5/4是把1.2kb的片段連接到預先製備好的pUC18中得到的。亞克隆pAS 5/13是把7.5kb的片段連接到預先製備好的pUC18中得到的。
pAS5/5；pAS5/7；pAS5/11和pAS5/12用限制性內切酶BamHI和SstI、PstI和SstI、BglII和PstI以及BglII/HindIII消化質粒pAS5，用1.2％的瓊脂糖凝膠分離消化產物。從瓊脂糖凝膠中洗脫出目的片段(用BamHI和SstI、PstI和SstI、BamHI和PstI或BamHI/HindIII消化得到的)，並將其連接到pUC18中，然後把重組質粒轉化到E.coliDH5α中。亞克隆pAS5/5包括0.48kb的SstI/BamHI片段，亞克隆pAS5/12包括0.63 kb的BglII和PstI片段，亞克隆pAS5/11包括0.68kb的BglII/HindIII片段。
pAS5/15.11；pAS5/15.12用限制性內切酶NcoI和KnpI消化質粒pAS5。從1.2％的瓊脂糖凝膠中洗脫出0.9kb的NcoI/KpnI和1.1kb的NcoI/KpnI目的片段(見實施例1)，並將這兩個片段克隆到載體pUCBM21中，然後把重組質粒轉化到E.coli DH5α中得到亞克隆pAS5/15.12(0.9kb的片段)和pAS5/15.11(1.1kb的片段)。
10.質粒pAS6和pMJ6/6以及噬菌體5/4的亞克隆pMJ6/6用用限制性內切酶SstI消化質粒pAS6(利用載體上的限制性切割位點)，從瓊脂糖凝膠中洗脫出5.9kb的SstI片段，並將其連接到pUC18中。然後把重組質粒轉化到E.coli DH5α中。
pMJ6/4.1和pMJ6/4.2用限制性內切酶BamHI和PstI消化質粒pAS6/6，得到一個0.36 kb的BamHI/PstI片段和一個0.5 kb的BamHI/PstI片段，把這兩個片段從凝膠中洗脫出來，並將其連接到pUC18中。然後把重組質粒轉化到E.coli DH5α中。
pMJ6/6.2.2、pMJ6/6.2.3、pMJ6/6.2.4、pMJ6/6.2.5、pMJ6/6.2.6、pMJ6/6.2.7和pMJ6/6.2.8用限制性內切酶salI消化質粒pMJ6/6，從凝膠中洗脫出所得到的大小為3.3 kb、1.2 kb、1.0 kb、0.7 kb、0.14 kb和0.13 kb片段各一個，把這些片段連接到pUC18中。然後把重組質粒轉化到E.coli DH5α中。通過消化和亞克隆得到pMJ6/6.2.2。
pMJ6/8.1用限制性內切酶ClaI和BamHI消化質粒pMJ6/6，從凝膠中洗脫出1.1 kb的片段，並將其連接到pUC18中。然後把重組質粒轉化到E.coli DH5α中。
pMJ6/10用限制性內切酶PstI和SalI消化質粒pMJ6/6，從凝膠中洗脫出1.5 kb片段，並將其連接到pUC18中。然後把重組質粒轉化到E.coli DH5α中。
pMJ6/3用限制性內切酶BamHI消化質粒pAS6，從凝膠中洗脫出2.8 kb片段，並將其連接到pUC18中；然後把重組質粒轉化到E.coliDH5α中。
pMJ6/3.1用限制性內切酶HincII消化質粒pAS6/3，把得到的1.1 kb的片段連接到預先用HincII消化過的pUC18中，然後把重組質粒轉化到E.coli DH5α中。
pMJ6/3.2用限制性內切酶salI消化質粒pAS6/3，把得到的1.2kb的片段連接到預先用salI消化過的pUC18中，然後把重組質粒轉化到E.coli DH5α中。
pMJ6/3.3用限制性內切酶PstI消化質粒pAS6，從凝膠中洗脫出1.45 kb片段，並將其連接到pUC18中。然後把重組質粒轉化到E.coliDH5α中。
11.質粒pMJ1的亞克隆pMJ1/1用限制性內切酶SphI消化質粒pMJ1，從凝膠中洗脫出3.3 kb的SphI片段(把0.6 kb的SphI/PstI片段連接到pUC18中)。把這個片段再連接，然後把重組質粒轉化到E.coli DH5α中。
pMJ1/2用限制性內切酶SalI消化質粒pMJ1，從凝膠中洗脫出3.9 kb的salI片段(把1.2 kb的SalI/PstI片段連接到pUC18中)。把這個片段再連接，然後把重組質粒轉化到E.coli DH5α中。
pMJ1/3用限制性內切酶SalI消化質粒pMJ1，從凝膠中洗脫出4.1kb的SstI/PstI片段(把1.4 kb的SstI/PstI片段連接到pUC18中)。把這個片段再連接，然後把重組質粒轉化到E.coli DH5α中。
pMJ1/4.1用限制性內切酶SalI消化質粒pMJ1，從凝膠中洗脫出0.9 kb的SalI/SmaI片段，並將其連接到pUC18中。然後把重組質粒轉化到E.coli DH5α中。
12.製備pAS5/6的亞克隆用雙股巢式缺失(deletion)試劑盒(Pharmacia，Freiburg，Germany)製備pAS5/6亞克隆。按照實施例1的方法製備10μg pAS5/6DNA，並用XhoI和SstI各10 U消化該DNA。接下來按照產品說明書用外切核酸酶III溫育20min。每隔5min從混合物中取出等份試樣，其中DNA的含量約2.5μg。為了製備非突出DNA末端，上述等份試樣按照產品說明書的方法均在20℃下用S1核酸酶處理30min。然後用T4 DNA連接酶再連接(religated)這些DNA分子，並克隆入E.coliDH5α中。
13.遊動放線菌acarbose生物合成基因DNA序列的測定對實施例8～11中的質粒進行序列測定。從製備的溶液(實施例1)中取出6～8μl質粒DNA進行測序反應。測序使用自動讀取測序試劑盒(Pharmacia，Freiburg，Germany)。採用用於dsDNA測序的標準方法。為了在序列分析中能夠使用A.L.F.(自動雷射螢光標記(DNA)測序儀)，測序反應的起始分子選用螢光標記的通用引物和反向測序引物(見表2)。製備凝膠的方法如下，取Hydro Link LongRanger(Serva，Heidelberg)8ml、尿素33.6g和10×TBE buffer8ml，加水補足至80ml並混合，過濾除菌並除氣1分鐘。加入10％(W/V)的過硫酸銨350μl和N，N，N』，N』-四甲基乙二胺40μl啟動聚合。在凝膠加樣孔(50×50×0.05cm)中加入上述溶液。在38W下45℃恆溫電泳。用1×TBE buffer做電泳緩衝液。連接到測序儀上的電腦(Compaq 386/20e)把測得的螢光轉化成DNA序列，該電腦還能夠控制該電泳單元(A.L.F.Manager 2.5 program；Pharmacia，Freiburg)。
14.淺青紫鏈黴菌的轉化用Babcock和Kendrick的方法(1988)製備淺青紫鏈黴菌TK23和1326的原生質體並轉化，用TSB-PEG 8000培養這些細胞。
15.AcbC的過量表達15. 1.AcbC在大腸桿菌中的過量表達基因acbC的DNA序列顯示，AcbC的翻譯有兩個可能的起始位點(start point)。由於具有一個更重要的核糖體結合位點的原因，AcbC的翻譯很可能是從起始位點1開始的，儘管這樣，這兩種可能的蛋白都被過量表達。因此，大腸桿菌中的表達使用質粒pET11a和pET16b(Novagen，Heidelberg)。為了確保過量表達從優選的翻譯起始位點開始，應該用pET載體的ATG起始密碼子，該密碼子與類大腸桿菌RBS的距離合適。為了實現這一點，就需要在acbC的起始密碼子上構建NdeI識別位點。用上述寡核苷酸AS7(序列位置6617)和AS8(序列位置6638)在兩個可能的起始密碼子上合成NdeI識別位點。寡核苷酸AS9結合到序列位置6887處的BamHI識別序列的下遊的66bp的DNA片段上。用PCR方法(實施例8)擴增用來表達兩個可能的AcbC蛋白的兩個DNA片段。引物在45℃復性40sec，延伸30 sec。用限制性內切酶NdeI和BamHI消化上述兩擴增產物，並將它們對應連接到載體pET11a和pET16b中。從重組質粒pAS2中分離出2.2kb的BamHI片段[EP A 0730029/DE19507214]，並通過BamHI識別位點將其融合到克隆後的PCR片段中。檢查了2.2kb的BamHI片段的方向後，完整的acbC基因出現在表達載體中。這些表達載體定名為pAS8/1～pAS8/4(圖4)。此外，表達載體中的克隆DNA上出現完整的acbB基因閱讀框(相反方向)和acbA基因的起始部分。這些載體中的每一個都能鑑定一個表達在IPTG誘導的E.coli BL21pLys培養物中的外源蛋白。表4中列出了過量表達的AcbC蛋白的大小。然而，這些蛋白都以不溶性的包涵體的形式合成的。
表4.用於大腸桿菌表達的AcbC表達載體的結構
15. 2在淺青紫鏈黴菌1326中過量表達AcbC蛋白在淺青紫鏈黴菌1326中，用質粒載體pIJ6021表達AcbC蛋白[Takano，E.，et al.(1995)]。用PCR方法[Mullis和Fallona(1987)]從染色體DNA中擴增只含有編碼區的片段。寡核苷酸ASC-1和ASC-2用於PCR擴增，在acbC基因的起始密碼子2上用ASC-1引物(序列位置6089)構建一個NdeI識別序列。寡核苷酸ASC-2結合到序列位置7882上，用ASC-2構建一個EcoRI識別序列。引物在50℃復性20sec，延伸40sec。把首先得到的acbC DNA片段平端克隆到pUC18載體中，並檢查PCR擴增的忠實性。把含有克隆後的acbC基因的重組質粒命名為pAS8/5.1。用限制性內切酶NdeI和EcoRI消化質粒pAS8/5.1。瓊脂糖凝膠分離DNA，然後從凝膠塊中洗脫出上述DNA，把用這種方法製備的片段連接到載體pIJ6021中。把重組後的表達質粒轉命名為pAS8/7.2(圖5)。用質粒pAS8/7.2轉化淺青紫鏈黴菌的原生質體。得到的克隆在硫鏈嗜菌肽誘導的培養物中以可溶性形式過量表達AcbC蛋白(圖6)。
16在淺青紫鏈黴菌TK23中過量表達AcbE蛋白通過用限制性內切酶EcoRI和HindIII消化質粒，從質粒pAS5/6.9-6中分離AcbE基因。瓊脂糖凝膠分離DNA，然後從凝膠塊中洗脫出3.8kb的EcoRI/HindIII片段，把AcbE片段正確地連接到載體pUWL219中[J.Wehmeier，U.F.(1995)]。本發明用這些載體上遊區域200bp處可能的啟動子序列在淺青紫鏈黴菌中表達AcbE(見表5)。該重組質粒定名為pAS11(圖7)。
表5基因acbE和acbD之間的順反子間區。下劃線部分是能夠參與調節的反向重複序列(IR)和同向重複序列(DR)。
←CGT GGA CCC TCT CTC GCG ATC GCT GGG ACG CTA GCC CGG CGG GAG ACG TGC CCG CAA GAAAcbE GCA CCT GGG AGA GAG CGC TAG CGA CCC TGC GAT CGG GCC GCC CTC TGC ACG GGC GTT CTTIR ICTT GCT GTT TTA GCA AGA AGT TTC AGA ACC GGG ACG GCA CGC TGT AGC CCA GAT CAT AGAGAA CGA CAA AAT GCT TCT TCA AAG TCT TGG CCC TGC CGT GCG ACA TCG GGT CTA GTA TCTHind III IR2TAC TTA AAG CTC TGC GCA AGC TTA GGG TTG AAG TGG CGG TGA TGC ATC CAT CAC TGT ATGATG AAT TTC GAG ACG CGT TCG AAT CCC AAC TTC ACC GCC ACT ACG TAG GTA GTG ACA TACIR 3DRICGC ATC TGA ATG ACG TCT TCT GCA AGT TCT TGC AGC GGT CTC CGG GCC CTG CCC TTC CTCGCG TAG ACT TAC TGC AGA AGA CGT TCA AGA ACG TCG CCA GAG GCC CGG GAG GGG AAG GAGGTC ATC CCT TCA CAA GGA GAA GCT C AcbDCAG TAG GGA AGT GTT CCT CTT CGA G →用質粒pAS11轉化淺青紫鏈黴菌TK23的原生質體。在使用淺青紫鏈黴菌TK23/pAS11樣品和遊動放線菌樣品兩種情況下，在MD 50培養基上清中都能檢測到大小為110 kDa的胞外蛋白(圖8)。這種蛋白的大小對應於源於acbE的蛋白的分子量。通過合適的酶實驗(見實施例19，2)以及通過N端胺基酸序列的測定(見實施例18)說明了這些蛋白的同一性。MD50培養基培養的對照用淺青紫鏈黴菌TK23/pUWL219培養物的上清中檢測不到相應的蛋白。這說明acbE基因上遊的可能的啟動子序列(表5)啟動了AcbE在用MD50培養基培養的淺青紫鏈黴菌TK23/pAS11中的表達。
17.凝膠電泳製備蛋白質按照Lugtenberg方法(1975)，用變性SDS聚丙烯醯胺凝膠分離蛋白，考馬斯染液染色。根據樣品的不同選用8％或者11％的凝膠。
凝膠組成(11％凝膠)
*見緩衝液和溶液用SERVA藍垂直100/C裝置(凝膠體積，80×100×0.75mm)或Renner雙垂直裝置(凝膠體積，180×170×1mm)電泳。
用Biorad，Munich，蛋白分析確定被分析的樣品的蛋白質濃度，用BSA建立校準曲線。用Sigma(Deisenhofen)提供的VIIL道爾頓標準參照物(14.2kDa～66kDa)和高分子量標準參照物作為標準，確定被分離蛋白的大小。
18.N端胺基酸序列的測定確定源於遊動放線菌的AcbE蛋白和淺青紫鏈黴菌TK23/pAS11克隆的N端胺基酸序列，並加以比較。為此目的，50ml培養物在MD50培養基中溫育3天。離心除去細胞，上清在透析(against)緩衝液(5mM tris/HCl，pH7.5，1mM CaCl2)中透析12h。接著把上清凍幹48h，然後把凍幹基溶解在1.5ml的載樣緩衝液中。把這樣製備好的培養物上清用Renner雙垂直裝置(凝膠體積，180×170×3mm)通過SDS-PAGE分離。為了確保AcbE蛋白從胞外蛋白中最大限度的分離開來，實驗採用了梯度凝膠電泳(5％→10％)。按照產品說明書的方法，用快速轉印B33裝置(Fast Blot B33 apparatus)(Biometra Go--ttingen)通過半乾法把蛋白質從SDS聚丙烯醯胺凝膠轉移到聚氟乙烯(PVDF)膜上。在250mA下轉移45min。電泳緩衝液1∶2稀釋後(見緩衝液和溶液)用做轉移緩衝液。把轉移後的膜染色30min，然後用脫色液(見緩衝液和溶液)脫色。為了確定N端胺基酸的序列，測序前用50％的甲醇100μl漂洗轉印樣品2次，以除去多餘的鹽。變幹後，用預先用聚凝胺處理過的轉印夾片(cartridge)和濾膜進行測序。測序反應採用快速轉印循環。結果見表6。
表6來自遊動放線菌和淺青紫鏈黴菌TK23/pAS11的AcbE蛋白蛋白N端胺基酸序列的測定結果
19.酶活力的測定19. 1.valienone合成酶活力的測定為了過量表達AcbC，用遊動放線菌1326/pAS8.7.2孢子懸液溫育10ml的YEME培養基。培養1～2天後，培養物處於對數生長早期。這時，用7.5μg/ml硫鏈嗜菌肽誘導培養物。誘導20h後收穫培養物。把細胞沉澱溶解在1.5ml的冷的裂解液中(見緩衝液和溶液)，超聲波小心裂解。4℃下15,000離心30分鐘除去細胞碎片。AcbC的抽提物用2.5升的裂解液4℃下透析(12h)後，用於酶切實驗。這種抽提物可以在-20℃的條件下保存2個月而沒有明顯的活力喪失。用Biorad，Munich，蛋白分析確定蛋白抽提物的蛋白成分，用SDS-PAGE實驗分析15μg上述樣品(圖6)。酶切實驗在含有40μM CoCl的20mM P緩衝液(pH7.5)中室溫下進行2h。酶切實驗中加入了來自AcbC抽提物的蛋白質20μg和景天庚酮糖-7-磷酸鹽8mM。此外，為了抑制抽提物中非特異性磷酸酶，在反應混合物中加入2mM的NaF。反應總體積為100μ1。取反應混合物25μl，在矽酸凝膠膜上通過薄層層析(TLC)確定實驗結果，實驗中的流動相是丁醇/乙醇/水(9∶7∶4)。用鈰試劑(見緩衝液和溶液)塗布TLC薄膜以顯示上述有機化合物，然後把薄膜置於乾燥箱中95℃乾燥15分鐘。valienone和valiolone的混合物被用作實驗的標準參照物。
遊動放線菌表達的AcbC蛋白特異性地轉化為景天庚酮糖-7-磷酸鹽(圖9)。然而，上述反應產物在TLC的遷移行為不同於valienone/valiolone標準參照物所表現出的小範圍遷移行為。因此，反應緩衝液減小了矽酸凝膠膜上反應產物的遷移距離的可能性可以被排除(圖9，泳道5)。
19. 2.α-澱粉酶活力的確定在含有25μg/ml硫鏈嗜菌肽的TSB培養基和MD50培養基中，培養遊動放線菌TK23/pAS11。培養3～4天後，收穫培養物。4℃離心(3500g)10min除去細胞，上清在透析緩衝液(25mM tris/HCl，pH7.5，1mM CaCl2)中4℃透析12h。取上述方法製備的上清500μl真空乾燥，用1.5ml的載樣緩衝液(見緩衝液和溶液)溶解得到的幹基；SDS-PAGE實驗分離上清中的蛋白質(圖8)。在同樣的條件下培養遊動放線菌，取其上清作為對照。通過測量1％澱粉懸液的渾濁度來確定α-澱粉酶的活力。測量實驗如下，取透析過的培養物上清100μl與澱粉懸液900μl混合，把300nm處的消光度隨時間而減小的值記錄下來[Virolle，M.J.，et al.(1990)]。對桿菌屬(bacillus sp)的澱粉酶進行同樣的研究作為對比實驗。結果見圖10。在該實驗中，1mM的acarbose不能抑制遊動放線菌MD50培養物和淺青紫鏈黴菌TK23/pUWL219 MD50培養物中AcbE的活力。另一方面，0.1mM的acarbose就可以抑制淺青紫鏈黴菌TK23/pUWL219 MD50培養物的本底活力。用0.1mM的acarbose也可以抑制上述桿菌屬的α-澱粉酶。緩衝液和溶液細菌培養基LB培養基胰化蛋白腖 10gNaCl 10g酵母提取物 5g
H2O 補足至1000ml用4 M NaOH把pH調到7.5MD50培養基溶液IMD50澱粉水解物 70g(NH4)2SO45g酵母提取物 2g補H2O至400ml溶液IIK2HPO41gKH2PO41g檸檬酸三鈉 5g補H2O至400ml用1 M NaOH把pH調到7.0溶液IIIMgCl2·6H2O 1gFeCl3·6H2O 0.25gCaCl2·2H2O 2g補H2O至200ml混合後，過濾除菌。TSB培養基大豆蛋白腖肉湯(broth)(Oxoid) 30gH2O至1000mlTSB PEG8000[見Babcock et al.(1988)]大豆蛋白腖肉湯(Oxoid) 30g/lPEG 8000 50g/l高壓滅菌後甘氨酸(20％) 25mlMgCl2(2.5M) 2mlYEME[Hoop，D.A.，et al.(1985)]酵母提取物 30g/l
蛋白腖 5g/l麥芽提取物 3g/l葡萄糖 10g/l蔗糖 340g/l高壓滅菌後MgCl2(2.5M) 2ml質粒DNA的提取液[由Birnboim和Doly(1979)改進而來]混合液I 50mM葡萄糖50mM tris/HCl(pH8.0)10mM EDTA(pH8.0)5mg/ml的溶菌酶混合液II 200mM NaOH1％(W/V)SDS(十二烷基硫酸鈉)混合液III 3M乙酸鉀1.8M甲酸TE buffer(pH8.0)Tris/HCl 10mMNa2EDTA 1mMDNA-DNA雜交液20×SSC3M NaCl0.3M檸檬酸鈉預雜交液；6×SSC0.01M磷酸鈉緩衝液，pH6.81mM EDTA0.5％SDS0.1％脫脂奶粉雜交液標記後，把acb探針加入到預雜交液中。
6×後洗液6×SSC
0.5％SDSDNA測序TBE buffer(pH8.0)1MTris鹼0.83M 硼酸10mM EDTA蛋白質的聚丙烯醯胺凝膠電泳5×載樣緩衝液甘油25mlSDS 5gBPB 2.5mg2-巰基乙醇 12.5ml0.625 M Tris/HCl(pH6.8)補足至50ml電泳緩衝液Tris/HCl(pH8.3) 25mM甘氨酸 190mMSDS(W/V)0.1％加SDS以前調pH溶液A丙烯醯胺44gN，N-亞甲雙丙烯醯胺 0.8g補H2O至100ml溶液B丙烯醯胺30gN，N-亞甲雙丙烯醯胺 0.8g補H2O至100ml染色液SERVA蘭 0.15％R-250(W/V)甲醇(V/V) 50％乙酸(V/V) 10％脫色液甲醇(V/V) 25％乙酸(V/V) 10％AcbC變性液K2HPO4/KH2PO4(pH6.8) 50mMDTT 0.5mm2-澱粉酶測試磷酸鹽緩衝液K2PO4/KH2PO4(PH6.8) 50mMKCl50mM鈰試劑磷鉬酸 1.25g硫酸鈰試劑(IV) 0.5gH2SO43ml補H2O至 50ml文獻Babcock，M.J.，Kendrick，K.E.(1988)利用灰色鏈黴菌孢子進行DNA克隆，J.Bacterol.170，2802～2808Birnboim，H.C.，Doly，J(1979)快速鹼抽提方法篩選重組質粒DNANucleic Acids Res.7，1513～1523Drepper，A.，Pape，H.(1996)遊動放線菌的景天庚酮糖-7-磷酸鹽純化，特性及可能的生理功能J.Antibiot.，49，664～669Goeke，K.，Drepper，A.，Pape，H.(1996)用來自產acarbose遊動放線菌的無細胞抽提物製備acarbose磷酸鹽J.Antibiot.，49，661～663Hanahan，D.(1983)質粒轉化大腸桿菌的研究J.Mol.Biol.166，557～580Hershberger C.L.，et al.，(1989)
工業用微生物的分子生物學上遺傳特徵Amer.Soc.Microbiol.，p.58，p.61～67，p.147～155Hopwood，D.A.，et al.(1985)鏈黴菌的遺傳學操作實驗手冊The John Innes Foundation，Norwich，EnglandLugtenberg，B.，et al.，(1975)把大腸桿菌「主要」外膜蛋白分成4個條帶的電泳緩衝液FEBS Lett.58，254～258Merson-Davies，L.A.，Cundiffe，E.(1994)對來自弗氏鏈黴菌基因組TyIIBA區的5個泰樂菌素生物合成基因進行分析Mol.Microbiol.，13，349～355Mullis，K.B.，Fallona，F.A.(1987)用多聚酶結晶鏈反應體外特異性地合成DNAMethod Enzymol.，155，335～350Sambrook，J.，et al(1989)分子克隆；實驗指南，第2版Cold Spring Harbor Laboratory Press，N.Y.，USASanger F.；Nicklan S.；Coulson A.R.(1977)鏈終止劑進行DNA序列的測定Proc，Natl.Acad.Sci.USA，74，5463～5467Southern，E.M.(1975)對凝膠電泳分離得到的DNA片段中的特異性序列的進行測J.Mol.Biol.，98，503～521Takano E.，et al.(1995)構建硫鏈嗜菌肽誘導的高拷貝數的表達載體並將其應用到鏈黴菌種(spp.)Gene，166，133～137Virolle，M.J.，Morris，V.J.，Bibb，M.J.(1990)對在培養上清和細胞抽提物便於使用的α-澱粉酶進行一種簡單可靠的比濁和動力學分析J.Industrial Microbiol.，5，295～302Wehmeier，U.F.(1995)可以在培養基平板上實現藍白斑篩選的新型多功能大腸桿菌-鏈黴菌穿梭載體Gene，165，149～150圖例圖1來自遊動放線菌SE50/110基因組的約18kb的測序片段的限制性酶切圖譜(參見圖2)。粗的黑線代表原始專利所請求保護的區域，該區域與acbBA基因部分重合(以從左到右為序)。圖2 acarbose生物合成基因簇的基因圖譜。圖3 acarbose生物合成基因簇的DNA序列。圖4由質粒pET11a和pET16b構建的用於大腸桿菌表達AcbC的重組質粒。圖5由質粒pIJ6021構建的用於淺青紫鏈黴菌1326表達AcbC的重組質粒pAS8/7.2。圖6細胞裂解物的凝膠-電泳分離(見實施例15.2)。泳道3顯示的是硫鏈嗜菌肽誘導的淺青紫鏈黴菌1326/pAS8/7培養物表達的AcbC(42kDa)。圖7由質粒pUWL219構建的用於淺青紫鏈黴菌TK23中表達AcbE的重組質粒。圖8培養物上清中蛋白的凝膠-電泳分離(見實施例16)。泳道2、5和6顯示的是AcbE(110kDa)的表達。圖9在矽酸凝膠膜上通過薄層層析(TLC)檢測AcbC的酶活性。
1)遊動放線菌的抽提物2)淺青紫鏈黴菌1326/pIJ6021的抽提物3)淺青紫鏈黴菌1326/pAS8/7.2的抽提物(在-20℃下儲存了2個月的抽提物)4)淺青紫鏈黴菌1326/pAS8/7.2的抽提物(煮沸變性)5)淺青紫鏈黴菌1326/pAS8/7.2的抽提物(valienone代替景天庚酮糖-7-磷酸鹽作為底物)6)valiolone/valienone標準參照物7)景天庚酮糖8)景天庚酮糖-7-磷酸鹽
9)淺青紫鏈黴菌1326/pAS8/7.2的抽提物(製備的新鮮抽提物)10)圖10培養物上清中α-澱粉酶活性的測定。用MD50培養基培養細菌。煮沸變性的培養物上清中沒有能檢測到任何活性。實驗持續的時間為6min。作為對照，樣品9～11中都各加有商品化的α-澱粉酶2.8mU。
權利要求
1.包括圖3中的DNA在內的acarbose生物合成基因簇。
2.包括圖3中的DNA在內的acarbose基因。
全文摘要
本發明涉及來自遊動放線菌SE50/110的acarbose基因簇的生物合成基因,本發明還涉及從遊動放線菌中或從假寡糖的生產者中分離該基因,本發明還涉及分離這些生物合成基因的方法,本發明還涉及所述基因編碼的蛋白質,本發明還涉及上述蛋白質在異源宿主菌中的表達以及acarbose生物合成基因用於優化製備過程的用途。
文檔編號C12N15/52GK1249001SQ98802927
公開日2000年3月29日 申請日期1998年2月16日 優先權日1997年2月28日
發明者A·克呂格爾, H·阿佩勒, W·施勒德伯, H·帕佩, K·戈克, W·皮佩斯格, J·迪斯特勒, P·M·迪爾茲－古爾達米諾烏裡貝, M·亞林, A·斯特拉曼 申請人:拜爾公司