芋螺毒素類似物Glu-Con-G[1-13]、設計合成方法及用途的製作方法

2023-11-11 05:00:07 1

專利名稱：芋螺毒素類似物Glu-Con-G[1-13]、設計合成方法及用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種芋螺毒素類似物、其設計合成方法及用途。
背景技術：
芋螺屬於軟體動物門，腹足綱，芋螺科(Conidae)，多數棲息在熱帶海洋的淺海水域，因外形呈圓錐形或芋頭狀而得名，表面常有各色花紋，殼口窄長。芋螺是比較年輕的生物，化石記錄證明芋螺屬最早出現於始新世(Eocene)，中生代(mesozoic)時期海洋捕食性軟體動物菊石的消失客觀促進了芋螺的第一次大規模的物種形成。芋螺的第二次大規模的輻射始於中新世(Miocene)，基本上持續到現在(Terlau and Olivera，2004)。芋螺具有強大的自然進化能力，全球有約700種芋螺，芋螺是海洋無脊椎動物中進化最成功的生物之一。芋螺雖然種類很多，但它們都是食肉動物，靠毒液來捕食。芋螺毒液是芋螺捕食與防禦的主要武器，它是由許多單一毒肽組成的雞尾酒樣的混合毒素，稱為芋螺毒素(Conotoxin)。芋螺毒素通常是由7 41個胺基酸殘基組成的小分子多肽，大多富含半胱氨酸，具有高度保守的二硫鍵骨架。與蜘蛛、蠍、蛇、海葵等許多動物的毒素比較 (40 80個胺基酸左右)，芋螺毒素的肽鏈短的多，富含二硫鍵，分子結構更為緊密，生物活性更高。大多數芋螺毒素均有單一的mRNA編碼，原始的翻譯產物是一種特定的多肽前體， 約為70 100個胺基酸殘基，經蛋白酶水解後得到成熟肽。這些成熟肽分別選擇性地作用於鈣、鈉、鉀離子通道，或者乙醯膽鹼、NMDA、5-羥色胺等受體，許多已經成為神經生理學研究的工具藥。二十世紀八十年代初，美國猶他大學(University of Utah)的Olivera實驗室最早開展了芋螺毒素全面系統研究工作。芋螺毒素按照其結構特點(前體肽中N端高度保守的信號肽區和C端的二硫鍵骨架)可分為不同的超家族。至今已分離得到的芋螺毒素有近千種。數十種芋螺毒素已申請美國專利。他們在某些疾病診斷和受體研究中具有廣泛的應用價值，有的已用於臨床研究或被FDA正式批准為治療新藥，用作特異通道或受體鑑定診斷試劑和鎮痛藥。在神經藥理學領域得到了廣泛的應用。芋螺睡眠肽(Conantokin，Con)是一類較特殊的芋螺毒素，是芋螺毒素超家族中的一個成員家族。該家族迄今已經發現多個成員，但對芋螺睡眠肽-G(Con-G)、芋螺睡眠肽-T(Con-T)、芋螺睡眠肽-R(Con-R)、芋螺睡眠肽-L(Con-L)研究的較多。這四個毒素肽序列上顯示了高度同源性，除了 Con-R有一個二硫鍵外，其他三個肽均不含二硫鍵，而芋螺毒素超家族中其他成員一般均含有二硫鍵。這四個肽序列中都含有Y-羧基穀氨酸(Gla)， 能夠結合二價金屬離子。與金屬離子結合時，他們的空間構象均呈現高比例的-螺旋結構。 這四種毒素都是選擇性的NMDA受體非競爭性抑制劑，在實驗幼鼠身上可引起睡眠樣症狀。 研究發現人的NMDA受體參與一系列神經系統的病理過程，如阿爾茨海默症、癲癇、中風等， 動物試驗中發現芋螺睡眠肽對治療上述病症有較好的療效。芋螺睡眠肽-G(Con-G)是1984年美國猶他大學(University ofUtah)的 Olivera 小組從芋螺Conus geographus中分離得到的第一個Conantokins家族成員，它最初以前體
3肽(Con-G原始肽)的形式出現，其胺基酸序列為MHLYTYLYLLVPLVTFHLILGTGTLDDGGALTER RSADATALKAEPVLLQKSAARSTDDNGKDRLTQMKRILKQRGNKARGE γ Y LQ Y NQ γ LIR γ KSNGKR, N 端的信號肽和插入區域為80個胺基酸，序列保守，C端為成熟肽，前體肽通過翻譯後加工成為成熟肽(Con-G成熟肽)，其胺基酸序列為GEy YLQyNQyLIRyKSN = (I)在蛋白酶的作用下前體肽的Arg8°與Gly81之間發生裂解，Gly81成為成熟肽的Gly1殘基；(2)在維生素K的作用下前體肽的大部分Glu殘基羰基化為Gla。Con-G由17個胺基酸組成，其最保守的胺基酸殘基包括N末端的Gly-Gla序列、Glaici-Gla14以及最後一個Gla前的Arg殘基。Con-G為親水肽，呈酸性，與Con-T、Con-R相比，Con-G酸性最高。在未結合金屬離子時，Con-G呈現一種無規則的結構，但當結合Ca2+、Mg2+等金屬離子後，Con-G的空間構想變成從N端到C端的-螺旋結構，其比例可高達85% (25°C )，這主要是由於Con-G的四個帶負電殘基Gla3-Gla7-Glaici-Gla14位於分子的同一面，相互之間的靜電斥力使之幾乎無法形成-螺旋結構，金屬離子與Gla的螫合正好起到電力中和作用，使原來排斥的負電殘基Gla空間上相互靠近，從而能轉變成穩定的-螺旋結構。用肽C端逐個截去胺基酸的方法發現Con-G最短有生物活性序列長度是 Con-G[l-13]，其胺基酸序列為GE y y LQ y NQ y LIR,表明對生物活性有影響的殘基位於這些序列內。N端的四個保守殘基即Gly1、Glu2, Gla3、Gla4被認為對芋螺睡眠肽的生物活性起非常重要的作用，第五位殘基對芋螺睡眠肽的抑制活性和亞基選擇性非常重要，Gln9對 Con-G的抑制活性是必不可少的，Gla7, Gla10, Gla14是金屬離子的結合位點，但和抑制活性無關，第12位殘基被認為參與了和NMDA受體的相互作用。研究已知，在腦動脈阻塞的小鼠梗塞模型中，Con-G能有效縮小梗塞範圍，有效抑制缺血性腦損傷引起的受損腦細胞中c-f0S、bax、bcl-2基因的大量表達，具有較強的神經保護作用。文獻報導，芋螺睡眠肽可用於癲癇的治療，以減輕癲癇的發作頻率和程度，且對神經受損引起的痛覺超敏有很強的抑制作用。芋螺睡眠肽還可用於藥物依賴的治療，本實驗室已初步證明Con-G可以抑制嗎啡誘導的精神依賴和軀體依賴。由於Gla為非天然胺基酸，難以通過常規的生物表達或化學合成獲得。除此之外， Con-G還存在肽鏈過長、分子量過大、難以通過血腦屏障的缺陷，動物實驗時只能通過鞘內注射的方法注射藥物，臨床應用時具有較大的局限性。

發明內容
本發明首先要解決的技術問題是提供一種較Con-G肽鏈短、分子量小的芋螺毒素類似物Glu-Con-G [1-13]，其胺基酸序列從N端到C端為GEEELQENQELIR，分子量為1588。所述GlU-Con-G[l-13]的C端可以是被醯胺化的C端，其胺基酸序列從N端到C 端為GEEELQENQELIRX，χ表示醯胺化。由於採用本發明的上述技術方案，本發明首先用天然胺基酸Glu將Con-G的Gla3、 Gla4、Gla7、Gla1Q、Gla14 替換，得到 Glu-Con-G 的胺基酸序列為GEEELQENQELIREKSN(如序列表SEQ NO :4所示)，其在一定程度上改善了 Gla殘基的難以獲得的缺陷，進一步地，將其序列C端4個胺基酸截掉，即得到Glu-Con-G[1-13]的胺基酸序列為GEEELQENQELIR(如序列表SEQ NO 5所示)，本發明所提供的GlU-Con-G[l-13]保持原有活性，即仍對嗎啡精神依賴和軀體依賴有一定的幹預作用，但更易於人工合成，且分子量更小，分子量僅為1588，而Con-G和Glu-Con-G的分子量分別為2洸5. 19、2044. 14。本發明另一個所要解決的技術問題是提供芋螺毒素類似物GlU-Con-G[l-13]的合成方法。為此，本發明採用以下技術方案它包括以下步驟(1)、利用同源模建的方法，以PDB資料庫中ID為2A5S的參考蛋白為模板，利用 Modeller 8v2進行NR2B亞基的同源模建；(2)、採用鑲嵌在 hsight II package version 2005 (AccelrysTM he.)中的 ZDOCK模塊，進行Con-G與NR2B亞基對接；(3)、選取與活性數據相符合的構象運用Charmml9力場進行能量優化；(4)、通過NACCESS軟體計算NR2B受體與Con-G作用前後蛋白質表面溶劑可及性 ASA 的變化AASAi = ASA^B-ASAiN—G ；(5)、計算受體NR2B亞基與配體Con-G之間重要胺基酸相互作用形成的氫鍵位點和長短，得到Con-G的重要胺基酸；(6)、保持Con-G重要胺基酸，剔除或替換非重要胺基酸以及非天然胺基酸，保持多肽原來三維結構、與受體結合方式，構建Con-G類似物Glu-Con-G[1-13]；(7)、採用固相合成和分離純化的化學方法合成GlU-Con-G[l-13]。由於採用上述技術方案，本發明可以計算機模擬、計算和預算配體分子與受體生物大分子之間的關係，設計和優化配體分子的方法，使設計出的新分子具有合理性，大大減少了所篩選的化合物的數目加快了藥物研究與開發的周期，明顯的優於傳統的廣泛藥理篩選和先導化合物優化的方法。本發明另一個所要解決的技術問題是提供芋螺毒素類似物GlU-Con-G[l-13]在製備對嗎啡精神依賴和軀體依賴有幹預作用的藥物中的用途，以及在製備對鎮痛有一定療效的藥物中的用途。本發明所提供的芋螺毒素類似物GlU-Con-G[l-13]具有抑制嗎啡誘導小鼠條件性位置偏愛(Conditioned Place Preference,CPP)的作用，其最佳鎮痛率為嗎啡的702倍。因此，本發明所述的此種類似物GlU-Con-G[l-13]可作為抗嗎啡成癮藥以及高效鎮痛藥物。


圖 1NR2B 與同源蛋白 1Y20 (NRl 的 PDB ID)、2A5S (NR2A 的 PDB ID)和 (NR3A 的PDB ID)進行序列比對圖。圖2Con-G和NR2B亞基作用模型圖。虛線表示氫鍵，紫色字母代表Con-G胺基酸， 桔黃色字母代表NR2B的胺基酸。圖3NR2B亞基和Con-G的Connolly表面圖。NR2B亞基和Con-G相互作用的胺基酸用不同顏色標出。箭頭表示作用位置。圖4Con G、Glu_Con G、Glu_Con G[l_13]抑制嗎啡誘導小鼠CPP表達的結果圖。* P <0.01表示與生理鹽水組相比存在差異，其數據表示為均數士標準差。M-C表示Con-G 組，M-G 表示 Glu-Con-G 組，M-13 表示 Glu-Con-G[1-13]組。圖5為Glu-Con-G[1-13]與生理鹽水組、嗎啡組、ConG組軀體依賴試驗結果比較圖。與生理鹽水組比較，<0.05，<0.01，*〃p <0.001 ；與嗎啡組相比較， #p <0.05，##p < 0. 01 ；與 ConG 組相比較，腳ρ <0.001，；Δ ρ < 0. 05，ΔΔ ρ < 0. 01，ΔΔΔρ< 0. 001。圖6為Glu-Con-G[1-13]與生理鹽水組、嗎啡組、ConG組福馬林實驗結果比較圖。與生理鹽水組比較，<0.05，<0.01，*〃p <0.001 ；與嗎啡組相比較， flP < 0. 05，##p < 0.01,腳ρ < 0. 001 ；與 ConG 組相比較，Δρ < 0. 05，ΔΔρ < 0·01，ΔΔΔρ < 0. 001。圖7 為 0. 5h、lh、l. 5h、2h、2. 5h 時刻 Glu-Con-G[l_13]與生理鹽水組、嗎啡組、 ConG組熱板實驗結果的比較圖。
具體實施例方式以下實施例將有助於本領域的普通技術人員進一步理解本發明，但不以任何形式限制本發明。實施例一序列比對、同源模建和分子對接序列比對、同源模建NMDA受體NR2B亞基共有1484個胺基酸，穀氨酸受體結合區為404-802 (Si D404-N543, S2 :Κ670_Η802)。同源模建使用軟體 Modeller 8v2,並用 Charmml9 立場對模建的結構進行優化。NR2B亞基004-802)的序列從NCBI上得到，根據序列通過 BLAST(PSI-BLAST)搜尋NR2B的同源蛋白，選擇同源性較高的參考蛋白2A5S、1Y20、1S50 和2F34，然後進行序列比對。確定參考蛋白2A5S，將比對序列和參數輸入計算機，利用 Modeller 8v2進行NR2B亞基的同源模建。Modeller 8v2程序可以模建多個目的結構，根據空間結構和能量最小原則選出較優蛋白進行下一步優化。模建目的蛋白後，採用Charmmig 立場對模建結果進行優化處理。結構優化時，先加5nm水層，然後進行300步的共軛梯度法能量極小化計算，再進行分子動力學模擬，動力學模擬溫度為300K。對每個構象進行300步的最陡下降法和300步共軛梯度法優化後，選擇能量最低的構象作為模建的最終結構。利用 UCLA-DOE 伺服器上的 Verify 3D、Errat plots 程序和 Cambridge RAMPAGE 伺服器上的 Ramachandran plots程序對模建結果進行合理性檢測。分子對接利用計算機模擬技術研究Con-G與NR2B亞基的相互作用情況，Con-G的三維結構來自於PDB蛋白質結構庫。研究分子之間相互作用採用ZDOCK程序。蛋白對接採用鑲嵌在 Insight II package version 2005 (AccelrysTM Inc.)中的 ZDOCK 牛莫雙。ZDOCK 運算前，輸入同源模建的受體分子結構，再輸入配體多肽Con-G的PDB結構(Broolchaven Protein Data Bank)，然後進行ZDOCK運算。選取打分最高的50個構象進行RDOCK運算。 再從中選取與活性數據相對符合的構象運用Charmml9力場進行能量優化。通過NACCESS 軟體計算NR2B受體與Con-G作用前後蛋白質表面溶劑可及性(ASA)變化AASAi = ASAiNE2B-ASAiNR2B-Con-G。分子設計根據分子對接結果得到複合物結合模型，通過觀察受體NR2B亞基與配體Con-G 相互作用的幾何模型與結構特徵，計算它們之間重要胺基酸相互作用形成的氫鍵位點和長短，構效關係研究結果得到，E2、Gla4、L5、Q9和112為Con-G必須胺基酸，根據上述信息對 Con-G進行結構修飾或改造，儘量保持Con-G重要胺基酸，有條件地剔除或替換非重要胺基酸以及非天然胺基酸，儘量保持多肽原來三維結構、與受體結合方式，構建Con-G類似物， 得到 Glu-Con-G [1-13]。通過序列比對(見圖1)、同源模建和分子對接(圖2、圖3)，形成Con-G和NR2B亞基的複合物。複合物接觸面對接結果顯示Con-G與NR2B亞基相互作用的殘基，一共形成了七對氫鍵，氫鍵長度都在3A之內(見表1)(氫鍵作用主要存在於蛋白質分子中相距較近的極性原子O、N、S等原子之間，一般在3.2A以內)。表1NR2B亞基與Con-G的氫鍵作用。
權利要求
1.芋螺毒素類似物GlU-Con-G[l-13]，其胺基酸序列從N端到C端為序列表SEQNO 5 所示序列，分子量為1588。
2.如權利要求1所述的芋螺毒素類似物Glu-Con-G[1-13]，其特徵為其C端被醯胺化， 胺基酸序列從N端到C端為GEEELQENQEURX，x表示醯胺化。
3.如權利要求1所述的芋螺毒素類似物GlU-Con-G[l-13]的設計合成方法，其特徵它包括以下步驟(1)、利用同源模建的方法，以參考蛋白2A5S為模板，利用Modeller8v2軟體進行NR2B 亞基的同源模建；(2)、將Con-G與NR2B亞基對接；(3)、選取與活性數據相符合的構象運用Charmmig力場進行能量優化；(4)、通過NACCESS軟體計算NR2B受體與Con-G作用前後蛋白質表面溶劑可及性ASA 的變化AASAi = ASA^B-ASA^lg，i表示胺基酸殘基序號；(5)、計算受體NR2B亞基與配體Con-G之間重要胺基酸相互作用形成的氫鍵位點和長短，得到Con-G的重要胺基酸；(6)、保持Con-G重要胺基酸，剔除或替換非重要胺基酸以及非天然胺基酸，保持多肽原來三維結構、與受體結合方式，構建Con-G類似物Glu-Con-G[1-13]；(7)、採用固相合成和分離純化的化學方法合成GlU-Con-G[l-13]。
4.權利要求1或2所述的芋螺毒素類似物GlU-Con-G[l-13]在製備對嗎啡精神依賴和軀體依賴有幹預作用的藥物中的用途。
5.權利要求1或2所述的芋螺毒素類似物GlU-Con-G[l-13]在製備對鎮痛有一定療效的藥物中的用途。
全文摘要
本發明用天然胺基酸Glu將Con-G的Gla3、Gla4、Gla7、Gla10、Gla14替換，得到一種較Con-G肽鏈短、分子量小的芋螺毒素類似物Glu-Con-G[1-13]。本發明在一定程度上改善了Gla殘基的難以獲得的缺陷，本發明所提供的Glu-Con-G[1-13]保持原有活性，即仍對嗎啡精神依賴和軀體依賴有一定的幹預作用，但更易於人工合成，且分子量更小，分子量僅為1588，而Con-G和Glu-Con-G的分子量分別為2265.19、2044.14。
文檔編號A61K38/10GK102167730SQ20111003339
公開日2011年8月31日 申請日期2011年1月29日 優先權日2011年1月29日
發明者任展宏, 周晚玲, 徐豔蘭, 朱永平, 王 華, 許潔瓊, 諶程, 錢玲玲, 陳翔 申請人:浙江大學