一種羊口瘡病毒蛋白orfv059單克隆抗體雜交瘤a3及單克隆抗體的製作方法

2023-09-12 10:55:15 1

專利名稱：一種羊口瘡病毒蛋白orfv059單克隆抗體雜交瘤a3及單克隆抗體的製作方法
技術領域：
本發明涉及細胞工程領域，具體涉及羊口瘡病毒結構蛋白0RFV059單克隆抗體雜交瘤細胞株A3及單克隆抗體。
背景技術：
羊傳染性膿皰病(Orf)又稱羊傳染性膿皰性炎，俗稱羊口瘡，是由羊口瘡病毒 (ORFV)引起的山羊和綿羊的一種急性、接觸性傳染病。其病變特徵是患羊口唇等處皮膚和黏膜形成紅斑、丘疹、膿瘡、潰瘍和疣狀結痂。羔羊極易感，多群發。本病在世界各地均有發生，我國主要養羊區也較常見，是危害羊群的主要疾病之一。該病毒抵抗力強，羊群一旦被感染則不易清除，可持續危害羊群多年，給畜牧業造成重大經濟損失。ORFV病毒屬痘病毒科，副痘病毒屬。病毒粒子呈磚形或橢圓形，其表面呈繩索樣縱橫交錯排列結構。該病毒可在牛、綿羊、山羊的腎細胞以及犢牛和羔羊的睪丸細胞上生長， 並產生細胞病變。ORFV引發病灶的病理組織學特徵包括角化細胞的空泡變化、腫脹，細胞間質玻璃樣變性，表皮增生顯著，表皮內微腫脹，皮下組織中性粒細胞、樹突狀細胞(DCs)、 T細胞和B細胞聚集。羊口瘡分布廣泛，傳染性強，一旦爆發會造成嚴重的經濟損失。病毒在病變部位持續存在，患病動物易重複感染，目前無有效疫苗，防控困難。因此，羊口瘡病毒的早期、準確檢出對於疾病的控制和預防具有重要的意義。獸醫臨床上羊口瘡病的診斷主要根據其典型症狀進行診斷，但無法與口蹄疫(foot-and-mouth disease, FMD)和羊痘(Capripox)區分。 目前所採用的實驗室診斷方法分為，(1)免疫學方法，如ELISA，Western blotting等； (2)病理組織學方法，如免疫組織化學(IHC)等；( 分子生物學方法，如PCR和限制性片段長度多態性(RFLP)分析等。其中以免疫學診斷方法最為重要，因其具有靈敏、快速、準確的特點，而特異性的抗體尤其是單克隆抗體是免疫學診斷中最重要的工具。近年，在我國吉林省和甘肅省的羊群中幾次爆發羊口瘡疫情，由於特異性抗體的缺乏，疾病控制和進一步研究工作無法有效開展。ORFV基因組全長約138kb，G+C含量豐富(63%-64%)，含132個基因。通過對羊口瘡病毒不同株(系)的基因組分析表明，0RFV059基因編碼的是一個免疫顯性蛋白。該蛋白定位於成熟病毒粒子胞膜，是C端錨定蛋白，與痘苗病毒H3L免疫顯性蛋白結構相似，它在病毒成熟、吸附、致病的分子機制以及疾病診斷和亞單位疫苗研發等過程中具有重要作用。 因此，0RFV059有作為潛在的臨床診斷靶標的可能，製備0RFV059的單克隆抗體具有十分重要的意義，可以為該蛋白功能的研究奠定基礎，同時為其作為疾病標誌物的可行性提供實驗數據支持。由於0RFV059定位於成熟病毒粒子胞膜，通常在組織標本中表達量較高，具有臨床檢測和驗證的價值。由此，製備能用於臨床標本免疫組化檢測的0RFV059單克隆抗體進行大批量組織標本的驗證，可為其作為羊口瘡臨床診斷靶標的驗證提供有力工具。本發明具有以下的特點和優勢
目前國內外尚未有商品化0RFV059的抗體，且其單抗亞型為IgG2b型，能用於ELISA、 western-blot、免疫螢光以及免疫組織化學檢測，從而為該蛋白作為臨床靶標驗證及其功能的研究奠定了堅實的基礎。

發明內容
本發明的目的是克服現有技術的不足，提供一種能用於ELISA、western-blot、免疫螢光以及免疫組織化學檢測的抗羊口瘡病毒蛋白0RFV059單克隆抗體。為了實現上述目的，本發明採用如下技術方案
本發明所述的檢測羊口瘡病毒蛋白0RFV059的抗體是用原核重組表達的0RFV059蛋白作為抗原免疫BALB/C小鼠獲得，並用細胞融合技術獲得產生這種抗體的雜交瘤細胞株A3， 雜交瘤細胞分泌的抗體為IgG2b陽性，輕鏈為κ型。所述抗羊口瘡病毒蛋白0RFV059單克隆抗體雜交瘤A3，於2011年11月4日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC No. MM。本發明中羊口瘡病毒蛋白0RFV059的胺基酸序列為AAR981M，如SEQ ID NO :1所示。本發明中羊口瘡病毒蛋白0RFV059的基因序列為AY386^3，如SEQ ID NO :2所示。本發明中0RFV059的全長基因是由羊口瘡病毒基因組為模板，由PCR擴增獲得。 擴增 0RFV059 基因的引物序列為上遊引物5，-CATTAAC CATGGATCCACCCGAAATCACGGC-3， (SEQ ID NO :3)，下遊引物5，- AATCATCTCGAGCACGATGGCCGTGACCAGCAGC-3，(SEQ ID NO: 4)。上遊引入NcoI內切酶位點，下遊引入BioI內切酶位點。原核表達載體選擇pET48a (+ )。所述的保藏號為CGMCC No. 5424的雜交瘤細胞株A3的製備方法是取血清效價大於1 IO5的BALB/c小鼠脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞按常規方法用50% PEG-4000進行融合；用含20%小牛血清的HAT RPMI-1640培養基篩選融合細胞，用重組表達的0RFV059蛋白包被ELISA板，進行ELISA篩選；經過多次有限稀釋，最後獲得穩定分泌抗0RFV059單克隆抗體的雜交瘤細胞株，標記為A3。應用此株雜交瘤細胞以IX IO6/只的量注入石蠟預處理的8-10周齡的BALB/c雌性小鼠腹腔，飼養觀察10-14天後小鼠腹部膨大時抽取腹水。採用親和色譜法ftOtein G Sepharose Fast Flow純化單克隆抗體，以SDS-PAGE鑑定單克隆抗體的純度，純度達到90%以上。與現有技術相比，本發明特色如下
本發明以重組0RFV059蛋白包被ELISA板，通過ELISA法檢測純化抗體的活性，並用此純化抗體對純化的羊口瘡病毒蛋白進行Wfestern-blot證明該抗體可以識別0RFV059蛋白。本發明將此純化抗體用於進行羊口瘡病毒的免疫螢光染色以及羊口瘡組織的免疫組化染色證明其能識別天然的0RFV059蛋白。此株雜交瘤細胞分泌的單克隆抗體為進一步研究的0RFV059功能和開發0RFV059的診斷試劑奠定了基礎，為其作為羊口瘡臨床診斷和治療靶標的驗證提供有力的工具。本發明的單克隆抗體其免疫原是原核重組表達0RFV059全長蛋白，其胺基酸序列為AAR981M，全長338個胺基酸。本發明的單克隆抗體除了能應用於ELISA和Wfestern檢測變性0RFV059蛋白以外還可以應用於細胞免疫螢光和臨床羊口瘡組織標本免疫組化研究檢測未變性的天然0RFV059蛋白，同時降低了應用成本。本發明的單克隆抗體能特異性識別多種羊口瘡病毒分離株的0RFV059蛋白，與痘病毒科的其它病毒，如羊痘病毒、雞痘病毒、痘苗病毒等無交叉反應。目前國內外尚無針對羊口瘡病毒特異性抗體，而本發明的抗體不僅能與變性蛋白結合，還能與具有高級結構的天然蛋白結合，從而能應用於免疫螢光和免疫組化實驗。本發明針對0RFV059全長蛋白製備出的單克隆抗體對檢測該蛋白具有較高的特異性和靈敏度，該抗體的應用將為0RFV059功能研究和其作為羊口瘡標誌物的臨床標本驗證工作提供支持。


圖1是本發明單抗A3對羊口瘡病毒免疫印跡的結果，其結合條帶的分子量約為 39kDa。1. 10 μ g OFTu細胞裂解蛋白；2. 2 μ g純化重組0RFV059蛋白；3. 2 μ g純化病毒蛋白。圖2是本發明單抗A3對羊口瘡病毒免疫螢光染色的結果，5 MOI羊口瘡病毒感染 OFTu細胞，分別於接種後12和M小時收集細胞，4%多聚甲醛固定，先後用單抗A3及綠色螢光標記的羊抗鼠二抗孵育，DAPI染色，螢光顯微鏡下觀察結果。圖3是本發明單抗A3對羊口瘡病變組織免疫組織化學染色的結果，A.抗 0RFV059單克隆抗體A3，B.正常鼠血清(陰性對照)，(顯微鏡放大倍數400倍)。
具體實施例方式下列實施例旨在舉例說明而不是限制本發明。實施例1 本發明單克隆抗體的製備和鑑定 1、單抗A3的製備
1)重組0RFV059抗原製備
以羊口瘡病毒基因組為模板，經PCR擴增獲得全長0RFV059基因，構建原核重組表達載體 pET28a(+)/0RFV059，在大腸桿菌fec力 ric力ia coli BL21 中表達，利用 Ni Sepharose 親和層析純化柱進行純化，獲得純度達90%以上的重組0RFV059蛋白。2)免疫小鼠
以純化的重組抗原免疫6-8周齡雌性BALB/c小鼠。第一次免疫取重組抗原與等體積的Bentonite佐劑混勻後，以每隻 50 μ g/500 μ L的量腹腔內注射BALB/c小鼠；
第二次免疫隔2周後，取重組抗原與等體積的Bentonite佐劑混勻後，以每隻 50 μ g/500 μ L的量腹腔內注射BALB/c小鼠；
第三次免疫再隔2周後，取重組抗原與等體積的Bentonite佐劑混勻後，以每隻 50 μ g/500 μ L的量腹腔注射BALB/c小鼠；第三次免疫10天後小鼠尾靜脈取血，以重組抗原包被，ELISA檢測血清效價，取效價大於1:105的小鼠脾細胞與骨髓瘤細胞進行融合； Bentonite佐劑使用商品化產品。3)免疫血清效價測定採用間接ELISA法測定免疫血清效價。取50yg重組0RFV059蛋白溶解於IOml 0. 05M PH9. 6碳酸鹽緩衝液，包被聚苯乙烯微96孔板，100 μ 1/孔，4°C過夜。使用PBS(含有0. 05% (V/V) Tween-20)洗板三次，用IOmM PBS含1 % BSA封閉液100 μ 1/孔，37°C封閉2h，使用 PBS (含有0.05% (V/V) Tween-20)洗板三次，第三次免疫後10天小鼠尾靜脈採血，鼠免疫血清用含1 % BSA IOmM PBS進行1(Γ2 1(Γ8倍稀釋，加入96孔板，100 μ 1/孔37°C Ih, PBS (含有0.05% (V/V) Tween-20)洗板三次後，加入1 :10000倍稀釋辣根過氧化物酶標記羊抗小鼠 IgG (Sigma，INC. )，100μ 1/孑 L 37 °C 30min，同上洗板後，TMB 顯色，100 μ 1/孔，室溫避光IOminJn 50 μ 1/孔2Μ H2SO2終止反應，測450nm吸收值，以免疫前小鼠血清作為陰性對照，以測定值與對照值得比> 2. 1為陽性來判斷免疫血清的效價。4)雜交瘤的製備
取血清效價大於1: IO5的小鼠，融合前3天，取重組抗原與等體積的PBS混勻後，以每隻50 μ g/500 μ L的量腹腔注射BALB/c待融合小鼠進行加強免疫。無菌取小鼠脾臟，製成脾細胞懸液與對數生長期的小鼠骨髓瘤細胞株SP2/0按1 :1的比例混合，IOOOXg室溫離心5min，棄上清，用手指輕彈離心管底部，使沉澱鬆散，離心管置於37°C水浴中，將在37°C 水浴保溫的50%聚乙二醇(PEG, MW4000，Sigma)用滴管一滴滴加入離心管中，邊滴邊搖動離心管，Imin內滴完，滴完後靜置2min，每隔1分鐘加入37°C預熱的無血清1640培養基1ml、 2ml,3ml,4ml,5ml和IOml來終止聚乙二醇的作用，細胞混合物IOOOXg室溫離心5min，棄上清，加入HAT培養液(次黃嘌呤(H)、氨基喋呤(A)和胸腺嘧啶核苷(T) (HAT, Sigma))輕輕重懸細胞，將細胞分至96孔板中，每孔200μ 1。培養三天後，觀察細胞融合情況，更換一半HAT培養液，連續數日，直至有克隆形成，融合後七天更換HT培養液(次黃嘌呤(H)和胸腺嘧啶核苷(T) (HT，Sigma))培養。5)篩選分泌抗0RFV059單克隆抗體的雜交瘤細胞
間接ELISA法篩選細胞培養上清，選擇效價較高的陽性克隆雜交瘤細胞進行亞克隆化，並用有限稀釋法連續克隆化2-3次，直至到100%細胞陽性率，最後獲得穩定分泌抗 0RFV059單克隆抗體細胞株，標記為A3。將克隆化後陽性率達100%的細胞擴增培養後液氮凍存。6)腹水的製備和純化
將A3雜交瘤細胞株以IX IO6/只的量注入液體石蠟預處理的8-10周齡的BALB/c雌性小鼠腹腔，飼養觀察10-14天後小鼠腹部膨大時抽取腹水。採用親和色譜法ftOtein G Sepharose Fast Flow純化單克隆抗體，以SDS-PAGE測定單克隆抗體的純度，純度達到90% 以上。2、本發明單克隆抗體的特性鑑定
1)抗體濃度的測定經雜交瘤細胞CGMCC No. 5424製備的腹水經純化後獲得0RFV059 單克隆抗體A3，使用BIO-RAD公司生產的Smart Spec plus核酸蛋白測定儀測定，其濃度為 0. 51mg/ml。2)抗體亞型鑑定採用Roche公司的鼠單抗亞型鑑定試劑盒鑑定雜交瘤細胞株的亞型，A3分泌抗體的亞型為IgG2b型，輕鏈為κ鏈。3)純化抗體的效價鑑定50 μ g重組0RFV059抗原溶於IOml pH9. 6的0. 05M碳酸鹽包被緩衝液中，加入96孔板，每孔100yL，4°C過夜。PBS (含有0. 05% (V/V) Tween-20)洗板三次，用IOmM PBS含1 % BSA封閉液150 μ 1/孔，37°C封閉2h，使用PBS (含有0. 05% (V/V) Tween-20)洗板三次，每孔加入100 μ 1純化抗體，37°C孵育lh, PBS (含有0. 05% (V/ V) Tween-20)洗板三次，加入辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG多克隆抗體為二抗，37°C孵育 30min, PBS (含有 0. 05% (V/V) Tween-20)洗板三次，每孔加入 100 μ 1，TMB 顯色，37°C 孵育15min後，加入2M H2SO4溶液終止反應，酶標儀在吸光度值450 nm處檢測。4)抗體的Wfestern blot鑑定0FTu細胞裂解蛋白、純化的羊口瘡病毒蛋白及重組 0RFV059蛋白用2 X SDS裂解緩衝液裂解後上樣，經12%SDS_PAGE後用Bio-Rad電轉移裝置將蛋白轉移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉lh，pH7. 4的Tris-HCl緩衝液(含有0. 1% (V/ V) Tween-20)洗膜3次，每次5min，1 1000加入經純化的雜交瘤細胞CGMCC No. 5424製備的抗0RFV059單克隆抗體A3，4°C孵育過夜，pH7. 4的1Tris-HCl緩衝液(含有0. 1% (V/ V) Tween-20)洗膜3次，每次5min，加入1:10000稀釋的羊抗鼠IgG多克隆抗體(Sigma) 為二抗，室溫孵育2h，TBST洗膜3次，用濾紙吸去多餘的溶液，平鋪於乾淨的保鮮紙上，力口入 L4ml Pierce-Thermo Scientific ECL 系列 Western 化學發光底物反應液(A:B=1 1 )， 使膜完全浸潤於反應液中，迅速取出，用濾紙吸去多餘液體，鋪於另一張保鮮紙上，用保鮮紙把膜包好，放入X射線攝影暗盒，在暗房中顯影。雜交瘤細胞CGMCC No.54M製備的抗 0RFV059單克隆抗體A3出現單一的特異性條帶，結果如圖1所示。5)抗體的免疫螢光鑑定收集原代綿羊胎兒鼻甲骨(OFTu)細胞鋪於玻璃片上生長過夜，羊口瘡病毒(ORFV)感染(M0I=5)，分別於12、24h後收集細胞，PBS洗滌細胞，使用預冷的多聚甲醛固定細胞，加入雜交瘤細胞CGMCC No. 5424製備的抗0RFV059單克隆抗體 A3 (1:1000稀釋)，室溫孵育lh，以PBS為陰性對照。PBS洗片後1:1000加入Alex 594 (紅色螢光)標記的羊抗鼠二抗(Sigma)，室溫孵育lh，DAPI (藍色)染色lOmin，PBS洗片後， 螢光顯微鏡下觀察，經抗0RFV059單克隆抗體A3染色的細胞均觀察到綠色螢光，如圖2所示。結果證明雜交瘤細胞CGMCC No. 5424製備的抗0RFV059單克隆抗體A3可識別天然的 0RFV059 蛋白。6)抗體的免疫組化(IHC)鑑定收集患羊病變組織，利用純化後的雜交瘤細胞 CGMCC No. 5似4製備的抗0RFV059單克隆抗體A3 (1 1000稀釋)進行免疫組化染色，使用福建邁新公司的免疫組化試劑盒，染色方法參照邁新試劑盒說明書，DAB顯色，陰性對照組以正常鼠血清代替一抗，結果發現經抗0RFV059單克隆抗體A3染色的組織標本上細胞被染成棕黃色，如圖3所示。病變組織的免疫組化染色結果證明雜交瘤細胞CGMCC No. 5424製備的抗0RFV059單克隆抗體A3可識別天然的0RFV059蛋白。7)抗體對不同羊口瘡病毒分離株和其它痘病毒的反應性檢測採用ELISA和 IHC方法檢測抗0RFV059單克隆抗體A3對不同羊口瘡病毒分離株和其它種屬痘病毒的反應性。結果如表1所示，抗0RFV059單克隆抗體A3能識別從中國分離的各不同地區的ORFV 分離株以及美國標準ORFV分離株0V-IA82，而與其它種屬的痘病毒，如痘苗病毒、羊痘病毒和雞痘病毒無交叉反應。
表1.本發明單抗A3對不同羊口瘡病毒分離株和其它痘病毒的反應性
權利要求
1.一種抗羊口瘡病毒0RFV059單克隆抗體雜交瘤細胞株A3，於2011年11月4日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC No. MM。
2.一種抗羊口瘡病毒0RFV059單克隆抗體A3，其特徵是由權利要求1所述雜交瘤細胞株A3分泌所得。
3.權利要求1所述抗羊口瘡病毒0RFV059單克隆抗體雜交瘤細胞株A3的製備方法， 其特徵是取血清效價大於1 :105的BALB/c小鼠脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞按常規方法用 50%PEG-4000進行融合；用含20%小牛血清的HAT RPMI-1640培養基篩選融合細胞，用重組表達的羊口瘡病毒0RFV059蛋白包被ELISA板，進行ELISA篩選；經過多次有限稀釋，最後獲得穩定分泌抗羊口瘡病毒0RFV059單克隆抗體的雜交瘤細胞株，標記為A3。
4.一種檢測羊口瘡病毒0RFV059表達情況的免疫檢測試劑，其特徵是含有權利要求2 所述抗羊口瘡病毒0RFV059單克隆抗體A3。
全文摘要
本發明公開了一種羊口瘡病毒蛋白ORFV059單克隆抗體雜交瘤A3及單克隆抗體。一種抗羊口瘡病毒ORFV059單克隆抗體雜交瘤細胞株A3，於2011年11月4日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC No.5424。本發明以重組ORFV059蛋白包被ELISA板，通過ELISA法檢測純化抗體的活性，並用此純化抗體對純化的羊口瘡病毒蛋白進行Western-blot證明該抗體可以識別ORFV059蛋白。本發明將此純化抗體用於進行羊口瘡病毒的免疫螢光染色以及羊口瘡組織的免疫組化染色證明其能識別天然的ORFV059蛋白。此株雜交瘤細胞分泌的單克隆抗體為進一步研究的ORFV059功能和開發ORFV059的診斷試劑奠定了基礎，為其作為羊口瘡臨床診斷和治療靶標的驗證提供有力的工具。
文檔編號C07K16/08GK102559605SQ20121001737
公開日2012年7月11日 申請日期2012年1月19日 優先權日2012年1月19日
發明者廖小青, 李宏, 李明, 羅樹紅, 郝文波 申請人:南方醫科大學