人心肌型脂肪酸結合蛋白在大腸桿菌DH5α中的表達和純化的製作方法

2023-11-11 04:18:22

專利名稱：人心肌型脂肪酸結合蛋白在大腸桿菌DH5α中的表達和純化的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物技術領域。
背景技術：
1、心肌組織脂肪酸結合蛋白(heart-type fatty acid-binding protein; H-FABP)
(1). FABP的性質和特徵
脂肪酸結合蛋白(Fatty Acid Binding Protein; FABP)首先由Ockner等在 1972年研究大鼠的小腸脂肪酸吸收的調節時，在腸黏膜發現的一族同源性的小分 子細胞內蛋白質[1]。分子量為12-16KD，廣泛分布於哺乳動物的小腸、肝、脂肪、 心、腦、骨骼肌等多種細胞中[2]。已發現的FABPs包括心肌型(H-FABP)、小腸型 (I-FABP)、肝臟型(L-FABP)、脂肪細胞型(A-FABP)、腦細胞型(B-FABP)、腎臟型 (K-FABP)、骨骼肌型(S-FABP)、牛皮癬相關型(PA-FABP)及表皮型(E-FABP) 9種類 型[1-6]。 FABPs以其在組織中的分布而命名，在同一細胞中可分布多種FABPs，例 如在小腸內皮細胞上存在兩種不同FABPs，即L--FABP和I-FABP， 二者具有29%的 同源性。不同型FABP的序列有較大的同源性[3]。其中H-FABP是一種可溶性細胞質 蛋白，由132個胺基酸組成，分子量為14-15KD^，其中還有多個蘇氨酸和賴氨酸， 缺少半胱氨酸，在其N末端有一個乙醯化的纈氨酸殘基。H-FABP是一種酸性蛋白 質，其等電點(pl)為5.]。它特異地大量存在於心肌組織中，約佔心臟全部可 溶性蛋白的4-8%。它在心臟及某些骨骼肌中含量豐富，心臟和骨骼肌中含有相同 類型的H-FABP，但是在心肌中它的含量比骨骼肌中要高几倍。每克溼重心肌含H-FABP約0.Smg。而每克溼重骨骼肌含H-FABP僅O. 14 mg[7]。 H-FABP在心肌組織中含 量(0.5mg/g)比肌紅蛋白(2. 5mg/g)小5倍，但H-FABP在血漿中的參考濃度(2 ug/L)比肌紅蛋白(32tig/L)大約低15倍W。
從人心肌中純化的H-FABP，己製備出單克隆抗體，建立了非競爭夾心ELISA 法測定組織和血漿中的H-卜'ABP濃度。Glatz等[8]報告健康人血漿H-F/VBP水平為 (2. 1 ± 1. 1) u g/L，上限(鑑別值)為5 y g/L。
4H-FABP是新推薦的AMI的血漿生化標誌物，其血漿動力學同肌紅蛋白相似。 AMI後3小時內發現其血漿濃度升高，通常12 24小時內返回到正常，這就使 得H-FABP對早期評價或排除AMI成為一個有用的生化標誌物。Glatz等[9]報告 83例AMI患者，在住院期間作了一系列檢査，結果顯示對層I的診斷靈敏度， H-FABP為78%, MY0為53%， CK-MB為57%。此外，MY0和CK-MB活性增加的患者， 99%也表現有H-FABP濃度增加。H-FABP還可以用作判斷圍手術期心肌損傷的指 標。Suzuki等f剛發現H-FABP在心肌再灌注後60分鐘內立即出現高峰，遠在CK-MB 和cTnT之前。因此，作為AMI早期診斷的一種更好的生化指標，H-FABP具有 更大的潛能。H-FABP正成為心血管疾病診斷的有效標誌物^6' "-19]。FABPs能夠與疏水性配體分子如長鏈脂肪酸(FA)、維生素(視黃醇)、視黃 酸、某些有機陰離子等發生特異性結合，是關鍵的脂肪酸載體蛋白。它可將FA 從細胞質膜向發生酯化和氧化的部位運輸，從而進入線粒的能量代謝體系之中， 使FA在此氧化分解並最終生成三磷酸腺苷(ATP)，為肌肉收縮提供能量[瀏。由 於各型FABP具有各自特異的抗原決定簇，可以通過免疫學方法將H-FABP與其它型 的FABP相區別，所以，隨著FABP測定方法的研究和臨床應用，FABP正成為很多疾 病診斷的有效標誌物。H-FABP的生理效應是調控心肌細胞對FA攝取，酯化和氧化過程，維持細胞FA 的穩態，並且對心肌缺血和心肌缺血-再灌注(I/R)損傷具有保護作用。心肌缺 血時FA的P氧化和三羧酸循環被抑制，引發心肌能量代謝障礙，游離FA大量堆積。 再灌注時形成大量氧自由基，氧自由基和Ca離子可激活磷脂酶A，使細胞膜磷脂 分解形成溶血磷脂和花生四烯酸。由於缺血時花生四烯酸和溶血磷脂再醯化發生 障礙，使細胞游離FA的含量進一歩增加。游離FA是一種具有"去汙劑"樣作用的 表面活性物質，高濃度時使心肌細胞膜嚴重受損。近來研究表明心肌缺血-再灌 注(工/R)時細胞H-FABP大量丟失，使心肌細胞對游離FA，長鏈酯醯CoA (輔酶A) 的調控能力降低，從而促使再灌注損傷的發生。 (2). FABP的結構特點FABPs是多基因家族，大約有20個相同的成員。不同種屬動物、不同組織FABPs 的結構有多種同型異構體[21]。 X衍射晶體分析它們的三級結構也很類似，有10個 反平行的P摺疊桶和兩個短的a螺旋[22]。儘管目前對哺乳動物FABPs結構有了很多了解，但對FABPs的生理功能尚缺乏足夠的認識，據認為胞質FABPs參與FA的吸 收、轉運和代謝[21。目前，採用X線或醒R技術己經知道了人、牛、兔、昆蟲等的FABPs的三維結 構，並得到了牛FABPs在溶液中的結構。對人FABPs而言，其蛋白的摺疊與其它型 的FABPs極其相似十條反平行的鏈排列形成一蛤殼形結構，其頂端有兩a螺旋 緊緊相鄰，從而使其內部形成一較大的空腔，用以容納和保護其內的FA^'^， 使之與外界環境相隔離。如圖1所示。在空腔內部，FA的羧基頭與蛋白質的帶電 基團或極性基團通過靜電或氫鍵間的相互作用而被固定，同時FA的非極性尾與蛋 白質的疏水基團發生相互作用而被固定。此空腔與外界環境通過一狹長的開口相 連，據研究，這個殼口是由蛋白質的側鏈殘基Va1-25、 Thr-29、 Phe-57、 Lys-58、 Ala-75形成的，且在口邊上存在一正電荷(Lys-58)。人們猜想這一正電荷可以 將腔外帶負電荷的FA吸引到腔內i13]。但是僅靠這一點要想使FA輕易地進入這個 小口是不可能的，必須還要有蛋白質分子的動態重排。此外,FABPs的D鏈和E鏈可 以形成第二個有效的小口。研究表明，這兩條鏈與形成桶狀結構的其它鏈一樣， 不通過氫鍵直接相連，而是通過側鏈與側鏈間的相互作用及水分子與主鏈原子間 形成鍵橋保持聯繫。由於兩鏈間充滿了溶劑分子，所以第二個區域不能成為一個 真正的口。由動力模擬實驗得來的結果表明，這一區域相當靈活[14]。由此人們 提出假說，即這一區域能夠進行拉鏈式的活動以拓寬現有的小殼口。並且這種活 動不能使桶狀結構的氫鍵網絡斷裂，而是能夠使配體與溶劑分子進入內腔[15]。FABPs結合FA分子甲基，並限制FA分子移動的重要功能單位是一個由a螺旋、|3 片層所組成的"開口"結構，當此結構域與FA結合後，由7個氫鏈所組成的靜電 網以及分子間範德華力的作用使得FA分子構象改變而被固定在FABPs分子內。 FABPs "開口"結構在與FA結合的同時也與一個由Aspll、 Asp34等組成的離子通 道相耦聯，在特定的條件下通過這一離子通道的調節作用而結合或釋放FA分子 [3]。這種結構決定了FABPs能夠結合各種類型FA，在FA的攝取、轉運及代謝調節 中具有重要作用。調節FA代謝是各型FABPs的共同作用，但在不同組織、不同條件下各型FABPs 的存在狀況及活性均有所不同。例如H-FABP特異地存在於心肌組織中，約佔心 髒全部可溶性蛋白質的4-8%， H-FABP與心肌細胞內的長鏈脂肪酸相結合，將其從細胞質膜向脂化和氫化部位運輸，從而進入能量代謝體系，氧化分解最終生成 三磷酸腺苷(ATP)，為心肌收縮提供能量。調節FA代謝是各型FABPs的共同作用，但在不同組織、不同條件下各型FABPs 的存在狀況及活性均有所不同。例如H-FABP特異地存在於心肌組織中，約佔心 髒全部可溶性蛋白質的4-8%， H-FABP與心肌細胞內的長鏈脂肪酸相結合，將其從細胞質膜向脂化和氫化部位運輸，從而進入能量代謝體系，氧化分解最終生成 三磷酸腺苷(ATP)，為心肌收縮提供能量[5]。 (3). H-FABP的臨床應用應用於急性心肌梗塞(AMI)的早期診斷^'14'23-26] 應用於急性心肌梗塞(AMI)的再灌注判斷。7'28]應用於推測急性心肌梗塞(AMI)的梗塞面積[29'30]監測急性心肌梗塞(AMI)的復發[8]應用於急性心肌梗塞(AMI)以外的心血管疾病[31'劃2、外源蛋白質表達系統隨著生物化學和分子生物學技術的發展，使人們得以更深入地了解蛋白質分 子的一級和二級結構，這樣就可以有目的的進行改造，創建新的有價值的蛋白質 分子。為此,各種不同的原核、真核外源蛋白表達體系應運而生,如大腸桿菌表達 系統、酵母表達系統、昆蟲細胞表達系統、哺乳動物細胞表達系統等。這些表達 系統為我們研究高純度重組蛋白質的應用發揮了重要作用，為生物醫藥市場提供 大量的重組蛋白質。各種原核、真核蛋白表達體系的特性比較見表l。Tabl: The comparison of characteristics of prokaryon and eucaryon表達體系優缺點師原核體系只有良好的口r操作性,成本低。但小能進行外源蛋lH 10-70%胞內表達，大腸桿菌糖埃化修飾，細胞內形成包涵體0.3-4%胞外表込。真核體系兼距原核體系良好的oj操作件和真核體外源蛋白佔菌體蛋白10%酵母系的後加工能力。但存在產量低和過度糖基化問題。甲醇營養第一:代酵母表達系統，部分克服過度糖外源蛋白佔菌體蛋白10-30%型酵母 化缺點，有較好的分泌性，產量較高，但產物結構'J天然分T仍有一些差異。昆蟲細胞具有高等真核生物表込系統的優點，產酵液中表達產物1-500mg/L物的抗原性、免疫原性4天然蛋白質相似，表達水平較高，但糖基化程度較低，形式單一。哺乳動物產物的抗原性、免疫原性'j天然蛋白質酵液中表達產物0. 2-200mg/L細胞接近糖基化等後加T準確，但表達水平較低。(1).原核表達體系將克隆化外源基因插入合適載體後導入大腸桿菌用於表達大量蛋白質的 方法一般稱為原核表達。在眾多外源蛋白質表達系統中，以大腸桿菌為宿主菌的 原核基因工程已成為最具吸引力的表達系統之一，這種方法廣泛應用在蛋白純 化、定位及功能分析等許多領域。外源基因置於大腸桿菌質粒特定的基因序列前 後可使外源基因得到正確的轉錄與翻譯而成功表達。通常使用可誘導的啟動子控 制蛋白的表達量，這在表達蛋白時尤其重要[34，34]。常用的細菌來源的啟動子有lac啟動子、trp啟動子及兩種啟動子的雜和體。另一類常用的啟動子為噬菌體 來源的啟動子，如R啟動子、T7RNA啟動子，前者受溫度控制，後者則用於嚴格控 制的兩級放大表達。同時還必須給外源基因加上大腸桿菌核糖體結合位點,包括 起始密碼子及其上遊3-llbp處Shine Dalgarno序列以啟動翻譯。該表達系統 的主要特點1生長迅速、增代時間短、蛋白產量高。2表達蛋白的純化、分離及分析快速，便於在短期內純化、分析和使用這些表達 蛋白。3外源基因的導入相對容易生產，成本較低。 4已建立了整套表達理論及技術。 5操作簡單，費用低廉。表達載體在基因工程中具有十分重要的作用，原核表達載體通常為質粒，典 型的表達載體應具有以下幾種元件(1) 選擇標誌的編碼序列；(2) 可控轉錄的啟動子；(3) 轉錄調控序列(轉錄終止子，核糖體結合位點)；(4) 一個多限制酶切位點接頭；(5) 宿主體內自主複製的序列。原核表達一般程序如下獲得目的基因一準備表達載體一將目的基因插入表達載體中(測序驗證)一轉化表達宿主菌一誘導靶蛋白的表達一表達蛋白的分析、 純化、進一步檢測。原核表達系統是生產蛋白抗原的一種最為經濟的手段，目前許多診斷試劑所用的抗原都是由大腸桿菌表達的。但是在高效表達的同時，目的蛋白往往會形成 包涵體，這對蛋白的天然結構和抗原活性造成很大的破壞，而使包涵體中的變性 蛋白溶解和復性往往是一個非常費時且效率很低的過程，經常會導致重組蛋白的 大量損失。包涵體是指細菌高水平表達的蛋白在細胞內凝集，形成顯微鏡下可見 的固體顆粒。 一般含有50%以上的重組蛋白，其餘為核糖體元件、RNA聚合酶、 內毒素、外膜蛋白、環狀或缺口的質粒DNA，以及脂體、脂多糖等，大小為0.5 lum，具有很高的密度，約1.3mg.ml/)，無定形，呈非水溶性，溶於高濃度變性 劑如尿素、鹽酸胍等。剛R等新技術的應用表明包涵體具有一定量的二級結構， 可能在復性的啟動階段中具有一定的作用。包涵體的產生主要是由於表達產物的不正確摺疊所致，細菌中高效合成的目 的蛋白不能及時摺疊，造成摺疊中間物的聚集，從而形成包涵體。影響包涵體形 成的因素主要有細胞內伴侶蛋白(chaperone)和摺疊酶(foldase)的活性、細菌 培養溫度、目的蛋白的表達量、細胞內環境的pH值，此外還有一個重要因素， 那就是蛋白質的一級結構即胺基酸序列。蛋白質中某些胺基酸(尤其是半胱氨酸) 的改變可能會顯著改變蛋白質的整體構象，從而使其容易受細胞內摺疊機制的影 響而不能順利進行摺疊。Strandberg。"和Wetzel等[恥研究表明，重組蛋白中少 數胺基酸的改變可以大大改變表達產物的可溶性，而Rinas等人[37]的研究顯示， 蛋白序列中某個半胱氨酸的改變即可改變整個蛋白分子的可溶性。大腸桿菌表達系統屬於原核生物表達系統，缺乏真核生物蛋白質的加工與修 飾系統，無法對重組蛋白進行糖基化、正確摺疊等蛋白翻譯後的修飾、加工步驟， 在高水平表達時，疏水作用和離子作用、蛋白質的錯誤摺疊及宿主細胞的還原性 環境、降解作用等都會導致重組蛋白形成無活性包涵體。同時，許多真核基因也 無法利用該系統進行生產。而且，利用大腸桿菌表達系統生產的重組醫用、食用 蛋白，其熱源性物質難以去除，人服用後易引起發燒等毒副反應[38]。pBV220是我國科學工作者自己構建的表達載體，使用了很強的PRPL雙啟動 子，含有編碼溫度敏感性阻遏蛋白的cI857基因，在30-32t:時產生的阻遏蛋白 能阻止PRPL的轉錄起始，細菌可以正常生長繁殖，42攝氏度時該阻遏蛋白發生 構像變化而失活，基因開始轉錄而表達[39]。(2).真核表達系統真核表達系統包括酵母，昆蟲細胞，哺乳動物細胞表達系統"1-42]。產生的 重組蛋白有水溶性高，可被翻譯後加工，可被分泌等優點。但它們也具有價格高， 產量低等缺點(表1)。與大腸桿菌相比，酵母是低等真核生物，除了具有細胞生長快，易於培養， 遺傳操作簡單等原核生物的特點外，又具有真核生物時表達的蛋白質進行正確加 工，修飾，合理的空間摺疊等功能，非常有利於真核基因的表達，能有效克服大 腸桿菌系統缺乏蛋白翻譯後加工、修飾的不足。因此酵母表達系統受到越來越多 的重視和利用[43]。甲基營養型酵母包括Pichia、 Candida等。以Pichia. pastoris (畢赤巴 斯德酵母)為宿主的外源基因表達系統近年來發展最為迅速，應用也最為廣泛。 畢赤酵母系統的廣泛應用，原因在於該系統除了具有一般酵母所具有的特點外，還有以下幾個優點[43—45];(1) 具有醇氧化酶A0X1基因啟動子，這是目前最強，調控機理最嚴格的啟動子之一。(2) 表達質粒能在基因組的特定位點以單拷貝或多拷貝的形式穩定整合。(3) 菌株易於進行高密度發酵，外源蛋白表達量高。(4) 畢赤酵母中存在過氧化物酶體，表達的蛋白貯存其中，可免受蛋白酶的降解， 而且減少對細胞的毒害作用。Pichia. pastoris基因表達系統經過近十年發展，己基本成為較完善的外源 基因表達系統，具有易於高密度發酵，表達基因穩定整合在宿主基因組中，能使 產物有效分泌並適當糖基化，培養方便經濟等特點。利用強效可調控啟動子 A0X1，已高效表達了HBsAg、 TNF、 EGF、破傷風毒素C片段、基因工程抗體等多 種外源基因[45-47]，證實該系統為高效、實用、簡便，以提高表達量並保持產物 生物學活性為突出特徵的外源基因表達系統，而且非常適宜擴大為工業規模[別。 目前美國FDA已能評價來自該系統的基因工程產品，最近來自該系統的C印helon 製劑己獲得FDA批准，所以該系統被認為是安全的。Pichia. pastoris表達系統 在生物工程領域將發揮越來越重要的作用，促進更多外源基因在該系統的高效表 達，提供更為廣泛的基因工程產品[43'44]。畢赤酵母表達系統有多種分泌型表達質粒，有許多蛋白在畢赤酵母得到了高效分泌表達。胞外表達需要在外源蛋白的N末端加上一段信號肽序列，引導重組 蛋白進入分泌途徑，可使蛋白質在分泌到胞外之後獲得準確的構型。畢赤酵母對 外源蛋白自身的信號序列識別能力差，在本試驗中所使用pP:[CZ a A質粒，其信 號肽來自釀酒酵母的a-交配因子(a-factor),能很好的達到以上的要求。並 且作為新一代的畢赤酵母分泌表達質粒，它還擁有一個特點是其具有Zeocin抗 性標記基因，給我們篩選轉化子的工作帶來很大的便利[43' 44]。pPICZ a A質粒是作為新一代的畢赤酵母分泌表達質粒，它的主要特點簡介 如下(1) 具有強效可調控啟動子A0X1 (alcohol oxidase,醇氧化酶)；(2) 具有Zeocin抗性篩選標記基因，重組轉化子可直接用Zeocin進行篩選，即 在YPDZ平板上生長的轉化子中，100%都有外源基因的整合，大大簡化了重組轉 化酵母的篩選過程[68]。在操作過程中，Zeocin也可用來篩選含表達載體pPICZ a A的大腸桿菌轉化子，不必另外使用Amp，經濟而又簡便；(3) 在表達載體A0X1 5'端啟動子序列下遊，有供外源基因插入的多克隆位點， 多克隆位點下遊有A0X1 3'端終止序列；(4) 分泌效率強的信號肽a-factor. Invitrogen公司開發的畢赤酵母表達系統的系列產品作為目前被應用為最為廣泛的酵母表達系統，其主要的優點有醇氧化酶可調控的強啟動子，能高密度發酵，重組蛋白表達量高。外源基因整合在酵母基因組上，可以穩定存在。同時，高效分泌表達質粒能將外源蛋白表達後，進行翻譯後加工處理，將外源蛋白分泌到細胞外，不但提高表達蛋白的活性，而且有利於產物的純化。 發明內容本發明的目的是提供一種人心肌型脂肪酸結合蛋白在大腸桿菌DH5a中的表達和純化，該發 明可獲得大量重組人心肌型脂肪酸結合蛋白，為進一歩研究和開發應用人心肌型 脂肪酸結合蛋白奠定基礎。 本發明的技術方案是 1、寡核苷酸引物根據GenBank(NM004012)的人H-FABP cDNA序列，設計編碼H-FABP基因片 段的5'和3'端寡核苷酸引物，並在各自5'末端分別引入了EcoRI和Sall限制性酶切位點。引物序列如下正向弓l物5' - gcg aat tea tgg tgg acg ctt tc -3'; 反向弓l物5' -att. gtc gac tea tgc etc ttt etc-3'，2、 RT-PCR擴增及序列測定使用Invitrgen的Trizol總RNA提取試劑盒從人心肌組織中提出取總RNA， 提取方法按試劑盒說明操作。將RNA溶於50ul DEPC處理水，取10ul人心臟 總RNA(約10ug)加2ul Oligo-dT,置70°C 5rain,冰水中冷卻5min，然後加 4dNTP(10mmol/L) 、 5ul AMV逆轉錄酶緩衝液、lul RNAase inhibitor(40u/u 1) 、 2yl AMV逆轉錄酶U0u/ul),最後加DEPC處理水至 終體積25ul，混合均勻，置42t:水浴90min， 95。C滅活5min。以上述逆轉錄的 cDNA 15ul為模板，加入上、下遊引物，用ABI 2400熱循環儀進行PCR擴增， 循環參數先變性94。C 5min，然後94°C 45s、 57°C 45s、 72°C lmin，循環30 次，最後在72"C延伸7min。 1%瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠回收試劑盒回收目的片 段。採用Promega的TA克隆試劑盒將PCR純化產物克隆至pGEM-T easy載體， 構建克隆質粒pGEM-T-H-FABP，進行序列測定(大連寶生物工程公司)。3、 重組表達質粒的構建以EcoR I和Sal I雙酶切pGEM-T-H-FABP質粒，切取脂肪酸結合蛋白片段， 與同樣以EcoR I和Sal I雙酶切的PBV220質粒連接，獲得重組質粒PBV-H-FABP， 轉化DH5ci感受態細胞，接種於LB固體培養基平板上(含50mg/L氨節青黴素)， 挑取數個菌落，接種於LB液體培養基中，用質粒提取試劑盒提取質粒DNA，酶 切鑑定，篩先出陽性克隆。4、 脂肪酸結合蛋白誘導表達挑取重組菌(PBV-H-FABP)接種於LB液體培養基中(含50mg/L氨苄青黴素)， 30°C ， 200rpm振搖過夜，次閂以1: 50接種至LB液體培養基中，繼續在3(TC條 件下振蕩培養，至OD卿值0. 4~0. 5，將溫度調到42。C繼續培養5小時。4。C ， 12000g 離心lmin，分別收集菌體和上清，菌體中加入緩衝液(50隱ol/L NaH2P04， 10mmol/L Tris-HCL， 250mmol/L NaCl)超聲破碎，12000g離心，再分別取上清 和沉澱加入等量的2XSDS變性緩衝液，進行SDS-PAGE電泳。鑑定出高表達質粒 並確定誘導表達條件。5、 人心肌脂肪酸結合蛋白的提取純化將誘導表達的重組菌經-7(TC冰箱中反覆凍融，離心收集上清。裝入透析袋 中用PEG6000濃縮，上樣Sephacryl S-100 HR和S印harose G-75柱，用pH7. 4 、 150mM NaCl 、 15mM磷酸鉀緩衝液進行洗脫，速度仍為30ml/h。紫外檢測儀靈 敏度為0. 2,記錄儀走紙速度為3cm/h，量程為20mV。收集洗脫液，行SDS-PAGE 電泳。6、 Western blot將提取純化的重組蛋白進行15% SDS-PAGE電泳，用半乾式轉移電泳儀轉印 到硝酸纖維素膜，然後用BSA 4'C封閉過夜，洗膜，加入鼠抗人脂肪酸結合蛋 白單抗(Clone 6B6 ， 1: 1000)， 37。C反應1小時，洗膜，加入HRP標記的羊抗 鼠IgG (1: 1000)， 37。C反應l小時，DAB顯色鑑定表達產物。7、 人H-FABP基因的擴增、克隆及測序以人心肌組織RNA為模板，用所設計的引物進行擴增，產物經1%瓊脂糖凝 膠電泳分析，在約419bp處出現特異性條帶，其大小與預期結果相符，見圖3。 PCR產物純化後，克隆入克隆載體，經PCR鑑定克隆成功。陽性克隆經LB擴大 培養後進行序列測定。測序結果表明我們採用的引物很好地擴增出人H-FABP 基因，H-FABP基因成熟肽編碼區含有402bp ，編碼134個胺基酸，與GenBank 中報導的人H-FABP分離物的核苷酸序列有99.9。/。同源性，。8、 重組表達質粒的構建及酶切鑑定pGEM-T-H-FABP質粒經EcoR I和Sal I雙酶切後，獲得脂肪酸結合蛋白片 段，插入同樣經雙酶切PBV220載體中，獲得重組質粒PBV-H-FABP。經EcoR I和 Sal I雙酶切及DNA序列測定對重組質粒進行鑑定，篩選出具有H-FABP基因cDNA 正向插入的重組質粒，酶切鑑定結果，見圖4。9、 重組人H-FABP的誘導表達將表達菌株的單菌落接種在LB (50mg/L氨苄青黴素)液體培養基中，30 。C培養過夜，次日以l: 50接種量擴種，當菌液OD6oo達0.4 0.5時，將溫度調 節到42匸，經5小時取樣進行SDS-PAGE電泳。結果表明，經溫度誘導後在相對 分子質量約14kD處出現明顯的誘導蛋白條帶，分子質量大小與預期一致，見 Fig.3。凝膠掃描分析顯示，最佳表達狀態時目的蛋白佔菌體蛋白的20%。表達產物以可溶蛋白和包涵體形式存在。10、 重組人H-FABP的純化 溫度誘導下的菌液經-7(TC反覆凍溶，離心收集上清，經PEG6000濃縮後，分別上SephacrylS-100HR和SepharoseG-75柱，用pH7.4 、 150mMNaCl 、 15mM磷酸鉀緩衝液洗脫。純化H-FABP的SDS-PAGE電泳分析。11、 Western blot印跡分析 為了確定表達的脂肪酸結合蛋白生物學特性，以鼠抗人脂肪酸結合蛋白單克隆抗體為一抗，HRP標記的羊抗鼠IgG為二抗進行免疫印跡分析，結果可見誘導表達的菌體蛋白在！5kD處均呈現--條強的特異性反應帶。 本發明的有益效果是1、 1996年Schaap F G等人在大腸桿菌中表達H-FABP以來，國內外先後有不同的表達報導[49-52本實驗採用目前較常用的PBV220蛋白表達系統。PBV220表達 系統，它使用的是PJPK啟動子，是噬菌體的阻遏物操縱系統。這個啟動子受噬 菌體的阻遏基因cl編碼的阻遏蛋白質的正控制。cl基因存在著一個溫度敏感突 變等位基因，即Ci857基因。這個基因或是存在於大腸桿菌染色體上，或是存在 於相容性的質粒分子上，它所產生的一種阻遏蛋白在42t:時會被失活。當大腸 桿菌寄主細胞在42t:下生長時，它編碼產生的阻遏蛋白質被破壞而失去活性， PL啟子便啟動轉錄合成出大量的mRNA;而在28-3(TC下培養時，cl基因則表 達出有活性的阻遏蛋白質，使PL啟動子進入完全抑制狀態。利用這一特性使 H-FABP蛋白在PBV220系統中得到表達。2、 在表達過程中我們進行了溫度和時間的優化，在3CTC增菌，42'C條件下誘導 5小時得到高效表達。同時蛋白質以可溶性和包涵體兩種形式存在。經過試驗， 在-7CTC下反覆凍融導致細菌的脹融，在菌體上清中有大量的可溶性脂肪酸結合 蛋白表達，這是其他大腸桿菌表達所沒有的。此方法免去了分離包涵體的麻煩， 同時也避免了包涵體變性復性過程中蛋白質復性的不正確和不完全。3、 菌體上清中含細菌雜蛋白量較少且分子量大約在30KD以上，我們先採用 S印hacryl S-100 HR對菌體上清進行純化，得到含有一 30KD的雜蛋白。又採 用S鄰harose G-75柱除去此雜蛋白，這樣得到了高純的可溶性人H-FABP蛋白。 Western blot檢測證明抗體特異性良好。重組人心肌型脂肪酸結合蛋白的成功 克隆與表達，為進一歩研究心肌型脂肪酸結合蛋白在疾病的診斷和療效判定中的意義奠定了基礎。


圖1是本發明中H-FABP的立體結構圖-圖2是本發明中pBV220的物理圖譜； 圖3是本發明中H-FABP RT-PCR結果圖； 圖4是本發明重組表達質粒酶切鑑定圖；具體實施方式
如圖3所示，1: DNA標準DL2000+15000, 1: H-FABP PCR擴增結果；如圖4所示，M. DNA標準DL2000+15000， 1. EcoR I和Sal I酶切pBV-H-FABP2. EcoR I禾卩Sal I酶切pBV-220 ， 3. pBV-H-FABP。實施例1:1、 質粒、菌株大腸桿菌(coJ/) DH5a菌株，pGEM-T easy, PBV220蛋白表達質粒。2、 工具酶及生化試劑限制性內切酶、T4 DNA連接酶、T叫DNA聚合酶，質粒DNA提出取試劑盒、 DNA凝膠回收試劑盒，人H-FABP單抗(Clone 6B6)，辣根過氧化物酶標記的二抗， RNAase inhibitor、 AMV逆轉錄酶，S印hacryl S-100 HR、 S印harose G-75。3、 寡核苷酸引物遵循PCR引物設計的原則，根據GenBank(NM004012)的人H-FABP cDNA序列， 設計編碼H-FABP基因片段的5'和3'端寡核苷酸引物，並在各自5'末端分別 引入了 EcoR I和Sal I限制性酶切位點。引物序列如下正向弓i物5， - gcg aat tea tgg tgg acg ctt tc -3，； 反向弓i物5' -att gtc gac tea tgc etc ttt etc-3，，4、 RT-PCR擴增及序列測定使用Invitrgen的Trizol總RNA提取試劑盒從人心肌組織中提出取總RNA, 提取方法按試劑盒說明操作。將RNA溶於50wl DEPC處理水，取10ul人心臟 總RNA(約10ug)加2ul Oligo-dT，置70°C 5min,冰水中冷卻5min，然後加 4"1 dNTP(10瞧ol/L) 、 5ul AMV逆轉錄酶緩衝液、lul RNAase inhibitor (40u/u 1) 、 2 y 1 AMV逆轉錄酶(10u/ul)，最後加DEPC處理水至 終體積25ul，混合均勻，置42。C水浴90min， 95。C滅活5min。以上述逆轉錄的 cDNA 15ul為模板，加入上、下遊引物，用ABI 2400熱循環儀進行PCR擴增， 循環參數先變性94。C 5min,然後94°C 45s、 57°C 45s、 72°C lmin，循環30 次，最後在72'C延伸7min。 1%瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠回收試劑盒回收目的片段。採用Promega的TA克隆試劑盒將PCR純化產物克隆至pGEM-T easy載體， 構建克隆質粒pGEM-T-H-FABP，進行序列測定(大連寶生物工程公司)。5、 重組表達質粒的構建以EcoR I和Sal I雙酶切pGEM-T-H-FABP質粒，切取脂肪酸結合蛋白片段， 與同樣以EcoR I和Sal I雙酶切的PBV220質粒連接，獲得重組質粒PBV-H-FABP， 轉化DH5a感受態細胞，接種於LB固體培養基平板上(含50mg/L氨節青黴素)， 挑取數個菌落，接種於LB液體培養基中，用質粒提取試劑盒提取質粒DNA，酶 切鑑定，篩先出陽性克隆。6、 脂肪酸結合蛋白誘導表達挑取重組菌(PBV-H-FABP)接種於LB液體培養基中(含50mg/L氨節青黴素)， 30°C， 200rpm振搖過夜，次R以l: 50接種至LB液體培養基中，繼續在3(TC條 件下振蕩培養，至OD,值0. 4 0. 5，將溫度調到42。C繼續培養5小時。4。C ， 12000g 離心lmin，分別收集菌體和上清，菌體中加入緩衝液(50聽ol/L NaH2P04， 10,ol/L Tris-HCL, 250咖ol/L NaCl)超聲破碎，12000g離心，再分別取上清 和沉澱加入等量的2XSDS變性緩衝液，進行SDS-PAGE電泳。鑑定出高表達質粒 並確定誘導表達條件。7、 人心肌脂肪酸結合蛋白的提取純化將誘導表達的重組菌經-70'C冰箱中反覆凍融，離心收集上清。裝入透析袋 中用PEG6000濃縮，上樣Sephacryl S-100 HR和S印harose G-75柱，用pH7. 4 、 150mM NaCl 、 15mM磷酸鉀緩衝液進行洗脫，速度仍為30ml/h。紫外檢測儀靈 敏度為0. 2,記錄儀走紙速度為3cm/h,量程為20mV。收集洗脫液，行SDS-PAGE 電泳。8、 Western blot將提取純化的重組蛋白進行15% SDS-PAGE電泳，用半乾式轉移電泳儀轉印 到硝酸纖維素膜，然後用BSA 4'C封閉過夜，洗膜，加入鼠抗人脂肪酸結合蛋 白單抗(Clone 6B6 ， 1: 1000)， 37。C反應1小時，洗膜，加入服P標記的羊抗 鼠IgG(l: 1000)， 37。C反應l小時，DAB顯色鑑定表達產物。
權利要求
1、一種人心肌型脂肪酸結合蛋白在大腸桿菌DH5α中的表達和純化，其表達和純化是a、寡核苷酸引物根據GenBank的人H-FABP cDNA序列，設計編碼H-FABP基因片段的5』和3』端寡核苷酸引物，並在各自5』末端分別引入了EcoR I和SalI限制性酶切位點，引物序列如下正向引物5』-gcg aat tca tgg tgg acg ctt tc-3』；反向引物5』-att gtc gac tca tgc ctc ttt ctc-3』；b、RT-PCR擴增及序列測定使用Invitrgen的Trizol總RNA提取試劑盒從人心肌組織中提出取總RNA，提取方法按試劑盒說明操作，將RNA溶於50μl DEPC處理水，取10μl人心臟總RNA加2μl Oligo-dT，置70℃ 5min，冰水中冷卻5min，然後加4μl dNTP、5μl AMV逆轉錄酶緩衝液、1μl RNAase inhibitor、2μl AMV逆轉錄酶，最後加DEPC處理水至終體積25μl，混合均勻，置42℃水浴900min，95℃滅活5min。以上述逆轉錄的cDNA 15μl為模板，加入上、下遊引物，用ABI 2400熱循環儀進行PCR擴增，循環參數先變性94℃ 5min，然後94℃ 45s、57℃ 45s、72℃ 1min，循環30次，最後在72℃延伸7min。1％瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠回收試劑盒回收目的片段；採用Promega的TA克隆試劑盒將PCR純化產物克隆至pGEM-T easy載體，構建克隆質粒pGEM-T-H-FABP，進行序列測定；c、重組表達質粒的構建以EcoR I和Sal I雙酶切pGEM-T-H-FABP質粒，切取脂肪酸結合蛋白片段，與同樣以EcoR I和Sal I雙酶切的PBV220質粒連接，獲得重組質粒PBV-H-FABP，轉化DH5α感受態細胞，接種於LB固體培養基平板上，挑取數個菌落，接種於LB液體培養基中，用質粒提取試劑盒提取質粒DNA，酶切鑑定，篩先出陽性克隆；d、脂肪酸結合蛋白誘導表達挑取重組菌接種於LB液體培養基中，30℃，200rpm振搖過夜，次日以1∶50接種至LB液體培養基中，繼續在30℃條件下振蕩培養，至OD600值0.4~0.5，將溫度調到42℃繼續培養5小時，4℃，12000g離心1min，分別收集菌體和上清，菌體中加入緩衝液，超聲破碎，12000g離心，再分別取上清和沉澱加入等量的2×SDS變性緩衝液，進行SDS-PAGE電泳；鑑定出高表達質粒並確定誘導表達條件；e、人心肌脂肪酸結合蛋白的提取純化將誘導表達的重組菌經-70℃冰箱中反覆凍融，離心收集上清。裝入透析袋中用PEG6000濃縮，上樣Sephacryl S-100HR和Sepharose G-75柱，用pH.4、150mM NaCl、15mM磷酸鉀緩衝液進行洗脫，速度仍為3ml/H。紫外檢測儀靈敏度為0.2，記錄儀走紙速度為3cm/h，量程為20mV，收集洗脫液，行SDS-PAGE電泳。
全文摘要
一種人心肌型脂肪酸結合蛋白在大腸桿菌DH5α中的表達和純化，屬於生物技術領域，其表達和純化是a.寡核苷酸引物；b.RT-PCR擴增及序列測定；c.重組表達質粒的構建；d.脂肪酸結合蛋白誘導表達；e.人心肌脂肪酸結合蛋白的提取純化。本發明的有益效果是使PL啟動子進入完全抑制狀態。利用這一特性使H-FABP蛋白在PBV220系統中得到表達。在表達過程中我們進行了溫度和時間的優化，在30℃增菌，42℃條件下誘導5小時得到高效表達。重組人心肌型脂肪酸結合蛋白的成功克隆與表達，為進一步研究心肌型脂肪酸結合蛋白在疾病的診斷和療效判定中的意義奠定了基礎。
文檔編號C12N15/09GK101250517SQ200710056208
公開日2008年8月27日 申請日期2007年10月24日 優先權日2007年10月24日
發明者於源華, 巍 侯, 玥 侯, 張淑華, 許淑芬 申請人:侯 玥;許淑芬;侯 巍;於源華;張淑華