吡咯並喹啉醌依賴性葡糖脫氫酶的熱穩定突變體的製作方法

2023-06-29 16:56:11

專利名稱：吡咯並喹啉醌依賴性葡糖脫氫酶的熱穩定突變體的製作方法
技術領域：
血糖濃度測定在糖尿病的臨床診斷和管理中極為重要。全世界約1.5億人患慢性病糖尿病，據WHO推測至2025年數字會加倍。儘管糖尿病易於診斷和治療，但連續的長期管理需要快速且精確地報告血糖濃度的低成本診斷工具。PQQ依賴性葡糖脫氫酶(EC 1.1.5.2)催化其中葡萄糖被氧化為葡糖酸內酯的反應。因此，該類型酶用於檢測血糖。這些工具中的一種是基於可溶性葡糖脫氫酶(s-GlucDOR，EC 1.1.5.2)的診斷條，所述可溶性葡糖脫氫酶是一種最初來源於乙酸鈣不動桿菌(Acinetobacter calcoaceticus)的含吡咯並喹啉醌的酶。
醌蛋白利用醌作為輔因子以將醇、胺和醛糖氧化成它們相應的內酯、醛和醛糖酸(aldolic acid)(Duine，J .A.，Energy generation and theglucose dehydrogenase pathway in Acinetobacter，載於「The Biology ofAcinetobacter」(1991)295-312，New York，Plenum Press；Duine，J.A.，EurJ Biochem 200(1991)271-84，Davidson，VL.，「Principles andapplications of quinoprotems」(1993)，全書，New York，Marcel Dekker；Anthony，C.，Biochem.J.320(1996)697-711；Anthony，C.和Ghosh，M.，Current Science 72(1997)716-727；Anthony，C.，Biochem.Soc.Trans.26(1998)413-417；Anthony，C.和Ghosh，M.，Prog.Biophys.Mol.Biol.69(1998)1-21)。在醌蛋白中，含有非共價結合輔因子2，7，9-三羧基-1H-吡咯並[2，3-f]喹啉-4，5-二酮(PQQ)的醌蛋白構成最大的亞組(Duine1991，參見上文)。迄今為止已知的所有細菌醌葡糖脫氫酶都屬於該亞組，其中PQQ為輔因子(Anthony和Ghosh 1997，參見上文；Goodwin，P.M.和Anthony，C.，Adv.Microbiol.Physiol.40(1998)1-80；Anthony，C.，Adv.in Phot.and Resp.15(2004)203-225)。
兩種類型的PQQ依賴性葡糖脫氫酶(EC 1.1.5.2)已在細菌中被表徵一種是膜結合的(m-GDH)；另一種是可溶性的(s-GDH)。兩種類型均不共有任何顯著的序列同源性(Cleton-Jansen，A.M.等，Mol GenGenet 217(1989)430-6；Cleton-Jansen，A.M.等，Antonie VanLeeuwenhoek 56(1989)73-9；Oubrie，A.等，Proc Natl Acad Sci USA 96(1999)11787-91)。它們在其動力學以及其免疫學特性方面也是不同的(Matsushita，K.等，Bioscience Biotechnol.Biochem.59(1995)1548-1555)。m-GDH廣布於革蘭氏陰性細菌中，然而，僅僅在不動桿菌屬(Acinetobacter)菌株如乙酸鈣不動桿菌(A.calcoaceticus)(Duine，J.A.，1991a；Cleton-Jansen，A.M.等，J.Bacteriol.170(1988)2121-2125；Matsushita和Adachi，1993)和鮑氏不動桿菌(A.baumannii)(JP 11243949)的壁膜間隙中發現了s-GDH。
通過搜索序列資料庫，在大腸桿菌K-12和藍細菌(Synechocystissp.)中已鑑定出兩個與全長乙酸鈣不動桿菌s-GDH同源的序列。另外，分別在銅綠假單胞菌(P.aeruginosa)和百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)(Oubrie等，1999 a，b，c)以及中間腸桿菌(Enterobacter intermedium)(Kim，C.H.等，Current Microbiol.47(2003)457-461)的基因組中也發現了兩個與乙酸鈣不動桿菌s-GDH同源的不完全序列。這四種尚未表徵的蛋白質導出的胺基酸序列與乙酸鈣不動桿菌s-GDH密切相關，其中位於推定活性位點的許多殘基是絕對保守的。這些同源蛋白可能具有相似的結構並且催化相似的PQQ依賴性反應(Oubrie等，1999 a，b，c；Oubrie A.，Biochim.Biophys.Acta1647(2003)143-151；Reddy，S.，和Bruice，T.C.，J.Am.Chem.Soc.126(2004)2431-2438；Yamada，M.等，Biochim.Biophys.Acta 1647(2003)185-192)。
已經發現細菌s-GDH和m-GDH具有相當不同的序列和不同的底物專一性。例如，乙酸鈣不動桿菌含有兩種不同的PQQ依賴性葡糖脫氫酶一種稱為m-GDH，在體內有活性，另一種稱為s-GDH，僅可顯示體外活性。Cleton-Jansen等，1988；1989 a，b克隆出編碼所述兩種GDH酶的基因並且測定了這兩種GDH基因的DNA序列。在m-GDH和s-GDH之間沒有明顯的同源性，證實m-GDH和s-GDH代表兩種完全不同分子的事實(Laurinavicius，V.等，Biologija(2003)31-34)。
已經將得自乙酸鈣不動桿菌的s-GDH基因在大腸桿菌中克隆。在被導入細胞後，s-GDH穿過細胞質膜被轉運到壁膜間隙(Duine，J.A.，Energy generation and the glucose dehydrogenase pathway inAcinetobacter，載於「The Biology of Acinetobacter」(1991)295-312，NewYork，Plenum Press；Matsushita，K.和Adachi，O.，Bacterial quinoproteinsglucose dehydrogenase and alcohol dehydrogenase，載於「Principles andapplications of Quinoproteins」(1993)47-63，New York，MarcelDekker)。同得自乙酸鈣不動桿菌的天然s-GDH一樣，在大腸桿菌中表達的s-GDH也是一種同二聚體，其中每個單體具有一個PQQ分子和三個鈣離子(Dokter，P.等，Biochem.J.239(1986)163-167；Dokter，P.等，FEMS Microbiol.Lett.43(1987)195-200；Dokter，P.等，Biochem.J.254(1988)131-138；Olsthoorn，A. J.和Duine，J.A.，Arch.Biochem.Biophys.336(1996)42-48；Oubrie，A.，等，J.Mol.Biol.289(1999)319-333；Oubrie，A.等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 96(1999)11787-11791；Oubrie，A等.，Embo J.18(1999)5187-5194)。s-GDH將各種單糖和二糖氧化成相應的酮，酮再進一步水解成醛糖酸，並且s-GDH還能夠將電子提供給PMS(吩嗪硫酸甲酯)(phenazine metosulfate)、DCPIP(2，6-二氯酚靛酚)、WB(Wurster氏藍)、短鏈泛酸例如泛醌Q1和泛醌Q2(Matsushita，K.等，Biochem.28(1989)6276-6280；Matsushita，K.等，Antonie Van Leeuwenhoek 56(1989)63-72)、某些人工電子納體例如N-甲基二甲基苯基吡唑酮硫酸甲酯(Olsthoorn，A.J.和Duine，J.A.，Arch.Biochem.Biophys.336(1996)42-48；Olsthoorn，A.J.和Duine，J.A.，Biochem.37(1998)13854-13861)和導電聚合物(Ye，L.等，Anal.Chem.65(1993)238-41)。鑑於s-GDH針對葡萄糖的高比活(Olsthoorn，A.J.和Duine，J.A.，(1996)，參見上文)及其廣泛的人工電子納體特異性，所述酶非常適合於各種分析應用，特別適合用於診斷應用中葡萄糖測定的(生物)傳感器或測試條(Kaufmann，N.等，Development andevaluation of a new system for determining glucose from fresh capillaryblood and heparinized blood，載於「Glucotrend」(1997)1-16，BoehringerMannheim GmbH；Malinauskas，A.等；Sensors and Actuators，BChemical 100(2004)395-402)。
葡萄糖氧化可以被至少三組相當不同的酶(即NAD/P依賴性葡糖脫氫酶、黃素蛋白葡糖氧化酶或醌蛋白GDH)催化(Duine，J.A.，Biosens.Bioelectronics 10(1995)17-23)。已經觀察到還原型s-GDH的相當慢的自動氧化，證明對於s-GDH而言，氧是一種非常差的電子納體(Olsthoom和Duine，1996)。s-GDH可以有效地將電子由還原型醌提供給介導物，如PMS、DCPIP、WB和短鏈泛醌，例如Q1和Q2，但它不可以有效地將電子直接提供給氧。
用於監測例如糖尿病患者血液、血清和尿中葡萄糖水平的傳統測試條和傳感器使用葡萄糖氧化酶。該酶的性能依賴於氧濃度。在具有不同空氣氧濃度的不同海拔高度進行的葡萄糖檢測可產生假性結果。PQQ依賴性葡糖脫氫酶的主要優點是其與氧無關。這一重要特徵例如要論於US 6,103,509，在所述專利中，對膜結合GDH的某些特徵進行了研究。
對該領域的一個重要貢獻是將s-GDH與合適的介導物在一起使用。基於s-GDH的測定方法和測試條裝置詳細地公開於US5,484,708。該專利還包含關於建立測定和用於葡萄糖測量的基於s-GDH的測試條生產的詳細信息。其中所述方法以及所引用的文獻中所述的方法都通過引用結合到本文中。
與該領域相關並且包含關於具有葡糖脫氫酶活性的酶的各種應用模式的具體信息的其它專利或申請是US 5,997,817、US 6,057,120、EP 620 283和JP 11-243949-A。
使用s-GDH和當發生反應時產生顏色變化的指示劑的商業系統(Kaufmann等，1997，參見上文)是由Roche Diagnostics GmbH提供的Glucotrend系統。
儘管使用PQQ依賴性s-GDH有以上討論的優點，但也不得不考慮其在葡萄糖測定中的缺點。與m-GDH相比，所述酶具有相當廣的底物譜。也就是說，s-GDH不僅氧化葡萄糖，而且氧化若干其它糖類，包括麥芽糖、半乳糖、乳糖、甘露糖、木糖和核糖(Dokter等，1986a；Oubrie A.，Biochim.Biophys.Acta 1647(2003)143-151)。針對非葡萄糖的糖類的反應性在某些情況下可損害測定血糖水平的準確度。具體地說，用艾考糊精(葡萄糖聚合物)治療的腹膜透析患者可能在其體液例如血液中含有高水平的其它糖、尤其是麥芽糖(Wens，R.等，Perit.Dial.Int.18(1998)603-609)。
因此，臨床樣品例如得自糖尿病患者、尤其是腎臟併發症患者且尤其是透析患者的臨床樣品可能含有顯著水平的其它糖、尤其是麥芽糖。得自這類危急患者的樣品的葡萄糖測定結果可能被麥芽糖損害(Frampton，J.E.，和Plosker，G.L.，Drugs 63(2003)2079-2105)。
在文獻中有關試圖產生表現出底物專一性改變的修飾PQQ依賴性s-GDH的報導極少。Igarashi，S.等，Biochem.Biophys.Res.Commun.264(1999)820-824報導了在位置Glu277上引入一個點突變產生底物專一性模式改變的突變體。
Sode，EP 1 176 202報導，s-GDH中的某些胺基酸取代產生對葡萄糖的親和性提升的突變s-GDH。在EP 1 167 519中，同一作者就穩定性提升的突變s-GDH進行了報導。此外，同一作者在JP2004173538中就對葡萄糖的親和性提升的其它s-GDH突變體進行了報導。
Kratzsch，P.等，WO 02/34919報導，與其它糖類底物相比，尤其是與麥芽糖相比，s-GDH對葡萄糖的專一性可由s-GDH某些位置的胺基酸取代來提升。核心和關鍵是胺基酸位348上的置換。例如和底物麥芽糖相比，例如在348位含甘氨酸而不是野生型s-GDH中存在的蘇氨酸的突變s-GDH對底物葡萄糖具有極大提升的選擇性。
但是，儘管已報導了葡萄糖專一性的非常大的提升，但似乎這種提升經常與s-GDH穩定性的下降聯繫在一起。例如，愈發明顯的是，在348位含胺基酸取代的s-GDH突變體的專一性提升損害了穩定性，尤其是損害了熱穩定性。然而，穩定性例如在生產和長期儲存(例如葡萄糖測試條)當中是關鍵。
因此，非常需要並且臨床要求這種s-GDH突變形式其特徵在於合理的熱穩定性，或合理的熱穩定性以及對作為底物的葡萄糖的專一性提升。
本發明的任務是提供與野生型酶相比或與專一性提升但穩定性受累的突變體相比熱穩定性得到顯著提升的新型s-GDH突變體或變異體。
業已發現，有可能顯著提升野生型s-GDH以及設計用於提升葡萄糖專一性的s-GDH突變體(例如在348位突變的s-GDH)的熱穩定性，並至少部分地克服了上述問題。
通過提供如下文和所附權利要求書中詳述的本發明突變s-GDH已顯著提升了熱穩定性。由於新型s-GDH的提升的熱穩定性，所以有可能使各種應用領域中的葡萄糖測定取得顯著技術進步。
本發明的改良型s-GDH突變體可以巨大優勢用於生物樣品中葡萄糖的特異性檢測或測試，尤其是通過測試條裝置或通過生物傳感器進行的特異性檢測或測試。
發明概述本發明涉及一種PQQ依賴性s-GDH突變蛋白，其特徵在於在122位和124位中的至少一個中存在胺基酸賴氨酸，其中這些位置對應於由乙酸鈣不動桿菌(A.calcoaceticus)s-GDH野生型序列(SEQ ID NO2)已知的胺基酸位置。
編碼本發明的s-GDH突變蛋白的多核苷酸序列以及含這種多核苷酸序列的表達載體和含所述表達載體的宿主細胞也代表本發明的優選實施方案。
本發明還涉及本發明的突變體在葡萄糖檢測方法中的用途，尤其是在通過測試條裝置或用生物傳感器進行的葡萄糖檢測方法。
提供以下實施例、參考文獻、序列表和附圖以有助於理解本發明，本發明的真正範圍在所附權利要求書中敘述。應理解，可對所述方法進行各種修改而不違背本發明的精神。
附圖簡述

圖1按照序列同源性比對的乙酸鈣不動桿菌PQQ依賴性s-GDH(上面)和鮑氏不動桿菌s-GDH(下面)的蛋白質序列。
圖2在實施例1中提及的、分別含可溶性PQQ依賴性葡糖脫氫酶的野生型或突變型DNA序列的pACSGDH載體的說明。
圖3在實施例1中提及的、含可溶性PQQ依賴性葡糖脫氫酶的野生型DNA序列的pACSGDH載體的核苷酸(DNA)序列(SEQ IDNO16)。
發明詳述在第一個實施方案中，本發明涉及一種PQQ依賴性s-GDH的突變蛋白，其特徵在於在122位和124位中的至少一個中存在胺基酸賴氨酸，其中這些位置對應於由乙酸鈣不動桿菌s-GDH野生型序列(SEQ ID NO2)已知的胺基酸位置。
如上所述，具有葡糖脫氫酶活性(膜結合的和可溶性的)的兩種完全不同的醌蛋白酶類型一起被分組在EC 1.1.5.2下。這兩種類型似乎互不相關。
對於本發明而言，只有可溶性形式的GDH(s-GDH)是有關的，下文討論其改良變體。
本領域知道，可溶性PQQ依賴性葡糖脫氫酶的野生型DNA序列可以從不動桿菌屬(Acinetobacter)的菌株中分離出來。最優選的是從乙酸鈣不動桿菌模式菌株LMD 79.41中分離出來。該野生型s-GDH(成熟蛋白)的多肽序列和DNA序列分別在SEQ ID NO2和SEQ IDNO1中給出。不動桿菌屬的其它LMD菌株也可以用作野生型s-GDH的來源。可以將這類序列與從乙酸鈣不動桿菌中獲得的序列進行序列比對，並進行序列比較。如例如以上對大腸桿菌K-12所述(Oubrie，A.等，J.Mol.Biol.289(1999)319-333)，篩選其它細菌菌株的DNA文庫，以鑑定在這類基因組中與s-GDH相關的序列似乎也是可行的。可以用這類序列和尚未鑑定的同源序列來產生具有提升的熱穩定性的s-GDH突變體。
通過引用由s-GDH野生型序列SEQ ID NO2已知的胺基酸位置非常詳細地描述了本發明的成果，所述s-GDH野生型序列分離自乙酸鈣不動桿菌模式菌株LMD 79.41。對應於SEQ ID NO2位置的不同s-GDH分離株中的胺基酸位置易於通過合適的序列比較鑑別。
優選運用GCG軟體包10.2版(Genetics Computer Group，Inc.)的PileUp程序進行s-GDH序列與SEQ ID NO2野生型序列的多重比對和比較。PileUp使用Feng，D.F.和Doolittle，R.F.，J.Mol.Evol.25(1987)351-360的漸進式比對法的簡化形式建立多重序列比對，因此限定了用於相同、相似或不同胺基酸殘基的記分矩陣。該方法以兩個最相似序列的成對比對開始，產生兩個比對序列的聚類。該聚類然後可與比對序列的下一個最相關序列或聚類比對。序列的兩個聚類可通過兩個單個序列的成對比對的簡單延伸來比對。通過一系列漸進式成對比對實現最終比對，所述漸進式成對比對包含愈發不相似的序列和聚類，直至所有序列都已納入最終的成對比對中。可見，在其它同源s-GDH分子中的胺基酸位置易於被鑑別為對應於SEQ ID NO2中給出的乙酸鈣不動桿菌s-GDH的位置。這就是本文給出的胺基酸位置應被視為SEQ ID NO2的胺基酸位置或在另一個同源s-GDH分子中與其對應的位置的原因。
在本發明意義上，術語「突變體」或「變異體」是指與相應的野生型序列相比，在對應於SEQ ID NO2的122位或124位表現出至少一個胺基酸取代的s-GDH蛋白，其中存在於野生型中的胺基酸被賴氨酸取代。s-GDH突變體可包含其它取代和/或缺失和/或插入，前提是本發明的s-GDH突變體與SEQ ID NO2的s-GDH的差異不超過50個胺基酸，例如其表現出總共至多50個胺基酸取代。
如上所述，葡萄糖專一性的提升似乎在很大程度上可能以穩定性降低為代價。本領域專家會認識到，穩定性可涉及不同方面，分別例如儲存溫度和/或儲存時間。短期溫度應力模型常用於評價穩定性。本發明的穩定性以此短期溫度應力模型評價，因此稱為熱穩定性。熱穩定性通過檢測樣品的無應力和有應力的s-GDH酶活性來測定。通過將無應力樣品活性設定為100％，應力處理後的剩餘活性可以百分率計算。對於具有提升的底物專一性的s-GDH突變體，選擇65℃、30分鐘。使用這些條件，野生型酶剩下其原始活性的約80％，而葡萄糖專一性提升的大部分突變體在實施此短期應力模型後僅剩下其初始酶活性的10％或以下。
業已發現，s-GDH的兩個位置似乎對實現熱穩定性的顯著提升相當關鍵，即122位和124位。還已經發現，只有20個天然胺基酸之一的胺基酸賴氨酸的取代才對熱穩定性具有顯著作用。賴氨酸在122位和/或124位的取代提升了野生型s-GDH酶的熱穩定性。野生型酶無論如何也是相當穩定的，但122位和/或124位中的賴氨酸進一步提升了熱穩定性。顯著相關的是以下事實業已發現這些取代還對先前為提升葡萄糖專一性但以熱穩定性降低為代價而生產的突變體的熱穩定性具有顯著作用。
在一個優選實施方案中，本發明的s-GDH突變體在122位包含賴氨酸，所述位置對應於由乙酸鈣不動桿菌野生型s-GDH(SEQ IDNO2)已知的位置122。
在另一個優選實施方案中，本發明的s-GDH突變體在124位包含賴氨酸，所述位置對應於由乙酸鈣不動桿菌野生型s-GDH(SEQ IDNO2)已知的位置124。
在再另一個優選實施方案中，本發明的s-GDH突變體在122位和124位包含賴氨酸，所述位置分別對應於由乙酸鈣不動桿菌野生型s-GDH(SEQ ID NO2)已知的位置122和124。
如上所述，關鍵是可以提升葡萄糖專一性提升的s-GDH突變體(例如WO 02/34919公開的突變體)的熱穩定性。業已發現並證實，這可通過在122位和/或124位以賴氨酸取代天然胺基酸完成。在一個非常優選的實施方案中，本發明因此涉及一種s-GDH突變體，其在122位和/或124位中含有賴氨酸。另外含有一個或多個產生葡萄糖專一性提升(尤其是和麥芽糖相比)的其它修飾。
本發明的一個優選突變體的特徵在於，相對於分離自乙酸鈣不動桿菌的s-GDH野生型酶，其對葡萄糖的底物專一性相比於至少一種其它選定糖底物提升達至少兩倍，同時熱穩定性是由野生型酶檢測的熱穩定性的至少20％。
為了計算底物專一性或交叉反應性，一種容易的方法是將用葡萄糖作為底物測量的活性定為100％，並比較用其它所選糖測量的活性和葡萄糖數值。有時為了不累贅，僅僅使用術語專一性，而不一方面特別提及葡萄糖，另一方面特別提及所選其它糖底物。
本領域專家將會認識到，最好採用嚴格限定的測定條件以等摩爾濃度的所研究底物分子進行酶活性比較。否則必須對濃度差進行校正。
必須選擇標準化和嚴格限定的測定條件，以便評價底物專一性(的提升)。s-GDH對葡萄糖作為底物以及對其它所選糖底物的酶活性如實施例章節所述進行測量。
根據對葡萄糖或所選不同糖(優選麥芽糖)的酶活性的這些測量結果，評價交叉反應性(及其提升)。
s-GDH對所選糖的(交叉)反應性的百分比如下計算交叉反應性[％]＝(對所選糖的活性/對葡萄糖的活性)×100％。
按照以上公式，野生型s-GDH對麥芽糖的(交叉)反應性測定為約105％(參見實施例7)。
按照以下公式，計算(提升的)專一性 與野生型酶相比，s-GDH形式對葡萄糖的專一性相對於麥芽糖(麥芽糖/葡萄糖)提升達至少10倍，因此s-GDH形式用麥芽糖作為底物具有的活性至多為用葡萄糖作為底物所測定活性的10.5％。或者，如果例如突變s-GDH對麥芽糖的交叉反應性為20％(如上所述測定和計算)，則與野生型s-GDH相比，該突變體因此具有5.25倍提升的底物專一性(麥芽糖/葡萄糖)。
術語對底物的「比活」在本領域眾所周知，優選用來描述每蛋白量的酶活性。採用葡萄糖或其它糖作為底物來測定GDH分子比活的各種方法對本領域而言是已知的(Igarashi，S.等，(1999)參見上文)。實施例8中詳細描述了一種可用於這種測量的優選方法。
儘管有可能選擇許多不同的糖分子並研究在與任何這種所選糖分子相比時的s-GDH葡萄糖專一性，但最好選擇臨床上相關的糖分子進行這種比較。優選的所選糖選自甘露糖、阿洛糖、半乳糖、木糖和麥芽糖。優選選擇麥芽糖或半乳糖，並測試相比於半乳糖或麥芽糖的情況下突變s-GDH對葡萄糖底物專一性的提升。在一個更優選的實施方案中，所選糖為麥芽糖。
在一個優選實施方案中，本發明的PQQ依賴性s-GDH突變蛋白在122位和/或124位包含賴氨酸，另外在選自以下的一個或多個位置含一個或多個胺基酸取代位置16、22、65、76、116、120、127、143、168、169、171、177、224、227、230、231、245、246、255、277，287、294、295、299、302、305、307、308、317、321、323、341、348、349、354、355、364、378、422、425、428和438。以上位置的大部分先前已被證明影響s-GDH對葡萄糖(相比於其它所選糖)的專一性，尤其是在和麥芽糖底物相比的情況下。WO 02/34919的完整公開內容通過引用納入本文中。
如在WO 02/34919中的描述，在對應於分離自乙酸鈣不動桿菌的野生型序列的s-GDH序列348位中，胺基酸取代可用於顯著提升s-GDH的葡萄糖專一性。在一個特別優選的實施方案中，本發明涉及在122位和/或124位含賴氨酸以及在348位含胺基酸取代的s-GDH突變體。優選348位的殘基蘇氨酸用選自丙氨酸、甘氨酸和絲氨酸的胺基酸殘基取代。在一個更優選的實施方案中，甘氨酸用於取代348位的蘇氨酸。術語T348G是技術人員知曉的，指348位的蘇氨酸被甘氨酸取代。
在另一個優選實施方案中，在122位和/或124位含賴氨酸的變異體s-GDH的特徵在於，428位的胺基酸殘基天冬醯胺用選自亮氨酸、脯氨酸和纈氨酸的胺基酸殘基取代。更優選通過脯氨酸在428位取代。
本發明的一組優選的s-GDH變異體在122位和/或124位包含賴氨酸，該變異體的特徵進一步在於348位的胺基酸殘基蘇氨酸和428位的胺基酸天冬醯胺均被取代，其中優選的取代基是以上概述的任一個。
在122位和/或124位包含賴氨酸的本發明突變體可選地還可被進一步修飾，以在對應於由乙酸鈣不動桿菌已知的s-GDH野生型序列(SEQ ID NO2)的169、171、245、341和/或349位的胺基酸位置包含一個或多個胺基酸取代。
在本發明變異體中在對應於由乙酸鈣不動桿菌已知的s-GDH野生型序列(SEQ ID NO2)169位的胺基酸被取代的情況下，優選天然胺基酸亮氨酸被苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸取代。更優選通過苯丙氨酸在169位取代。
在本發明變異體中在對應於由乙酸鈣不動桿菌已知的s-GDH野生型序列(SEQ ID NO2)171位的胺基酸被取代的情況下，優選天然胺基酸酪氨酸被選自丙氨酸、甲硫氨酸、甘氨酸的胺基酸取代。更優選通過甘氨酸在171位取代。
在本發明變異體中在對應於由乙酸鈣不動桿菌已知的s-GDH野生型序列(SEQ ID NO2)245位的胺基酸被取代的情況下，優選天然胺基酸穀氨酸被天冬氨酸、天冬醯胺或穀氨醯胺取代。更優選通過天冬氨酸在245位取代。
在本發明變異體中在對應於由乙酸鈣不動桿菌已知的s-GDH野生型序列(SEQ ID NO2)341位的胺基酸被取代的情況下，優選天然胺基酸甲硫氨酸被纈氨酸、丙氨酸、亮氨酸或異亮氨酸取代。更優選通過纈氨酸在341位取代。
在本發明變異體中在對應於由乙酸鈣不動桿菌已知的s-GDH野生型序列(SEQ ID NO2)349位的胺基酸被取代的情況下，優選天然胺基酸纈氨酸被丙氨酸或甘氨酸取代。更優選通過丙氨酸在349位取代。
還已發現通過在428位和429位之間插入胺基酸有可能進一步提升s-GDH變異體的底物專一性。這種在胺基酸428和胺基酸429之間包含胺基酸插入的突變體還代表了用於產生同時表現出提升的穩定性以及提升的專一性的突變體的優選原料。在一個優選實施方案中，本發明涉及在s-GDH的122位和/或124位包含賴氨酸以及在s-GDH的428位和429位之間包含胺基酸插入的突變s-GDH。
在又一個優選實施方案中，本發明的s-GDH突變體除了在122位和/或124位具有賴氨酸以外，還在胺基酸殘基428和429之間具有插入，並在選自以下的位置包含至少兩個胺基酸取代位置171、245、341、348和349，所述位置對應於由乙酸鈣不動桿菌已知的s-GDH野生型序列(SEQ ID NO2)的胺基酸位置。
在再一個優選實施方案中，本發明的s-GDH突變體除了在122位和/或124位具有賴氨酸以外，還在胺基酸殘基428和429之間具有插入，並在選自以下的位置包含至少三個胺基酸取代位置171、245、341、348和349，所述位置對應於由乙酸鈣不動桿菌已知的s-GDH野生型序列(SEQ ID NO2)的胺基酸位置。
技術專家會認識到，有可能進行胺基酸取代，例如沉默突變，其對s-GDH特性的影響未達顯著程度。但是，本發明變異體與SEQ IDNO2相比具有不超過50個胺基酸交換。優選地，所述變異體包含20個或以下的胺基酸取代，更優選存在僅10個胺基酸取代或更少的取代。
本發明的某些具體s-GDH變異體在實施例章節給出。具有低葡萄糖幹擾和可接受熱穩定性的s-GDH變異體包括分別在以下位置具有取代的突變體65+122+124+171+245+341+348+426+428+430+436、65+122+124+171+245+341+348+426+428+430和122+124+171+245+246+341+348+425+428。這3個變異體代表了本發明的進一步優選的實施方案。
胺基酸序列分析揭示，一方面來自乙酸鈣不動桿菌以及另一方面來自鮑氏不動桿菌的野生型s-GDH中發現的序列基序，似乎在本發明所鑑定和顯示的對於改進熱穩定性極為相關的122位和124位周圍非常保守。
包含胺基酸序列TYNKSTD(SEQ ID NO3)的PQQ依賴性s-GDH變異體代表本發明的優選實施方案，在所述變異體中天冬醯胺(N)或絲氨酸(S)被賴氨酸取代。SEQ ID NO3對應於乙酸鈣不動桿菌野生型s-GDH的位置120-126，或對應於鮑氏不動桿菌野生型s-GDH的位置120-126，但在122位(＝Xaa1)或124位(＝Xaa2)或這兩個位置中包含賴氨酸，由此分別替代天然胺基酸天冬醯胺或/和絲氨酸(乙酸鈣不動桿菌)。
本領域知道產生突變蛋白的多種可能性。基於公開了賴氨酸在突變s-GDH的122位和/或124位中極端重要性的本發明重大發現，技術人員現在可以容易地生產帶有這些和其它有利修飾的s-GDH的其它合適變異體。這種變異體例如可通過稱為隨機誘變(Leung，D.W.等，Technique 1(1989)11-15)和/或定向誘變(Hill，D.E.等，MethodsEnzymol 155(1987)558-68)的方法獲得。產生具有所需特性蛋白的一種替代方法是提供含有來自至少兩種不同來源的序列元件的嵌合構建體，或者全合成合適的s-GDH基因。本領域已知的這些方法可以與本發明中公開的信息聯合使用，以提供s-GDH突變體或變異體，其包含額外的胺基酸取代，所述取代與公開的在例如SEQ ID NO2的122位和/或124位上極為重要的賴氨酸組合。
例如可通過從分離自乙酸鈣不動桿菌模式菌株LMD 79.41的s-GDH基因開始以及通過從同源序列開始，生產本發明的s-GDH變異體。在本申請的正文中，術語「同源的」是指包含的s-GDH胺基酸序列與SEQ ID NO2相比具有至少90％的同一性。換句話說，在運用Pileup程序進行合適的比對後，這種同源s-GDH的至少90％胺基酸與SEQ ID NO2中所述胺基酸相同。
要理解的是，DNA序列和胺基酸序列的變異天然存在，或者可以採用本領域已知方法有意引入。這些變異可以在總體序列中導致至多10％的胺基酸差異，所述差異是由於與SEQ ID NO2相比所述序列中一個或多個胺基酸殘基的缺失、取代、插入、倒位或添加所致。這種氮基酸取代可以例如基於所涉及殘基的極性、電荷、溶解性、疏水性、親水性和/或兩親性方面的相似性來進行。例如，帶負電荷的胺基酸包括天冬氨酸和穀氨酸；帶正電荷的胺基酸包括賴氨酸和精氨酸；具有不帶電荷的極性頭基或非極性頭基、具有相似親水性數值的胺基酸包括下述胺基酸亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、甘氨酸、丙氨酸、天冬醯胺、穀氨醯胺、絲氨酸、蘇氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。考慮的其它變異包括前述多肽的鹽和酯以及前述多肽的前體，例如甲硫氨酸具有N末端取代的前體N-甲醯甲硫氨酸，其用作前導序列。可實施這種變異而不偏離本發明的範圍和精神。
按照現有技術中已知的方法或者按照實施例章節給出的方法，有可能獲得編碼如上討論的任何s-GDH突變體的多核苷酸序列。因此，本發明也包括編碼如上所述的本發明s-GDH突變蛋白的分離多核苷酸序列。
本發明還包括表達載體，其包含本發明的核酸序列，該序列有效連接至能夠引導其在宿主細胞中表達的啟動子序列。
本發明還包括表達載體，其包含本發明的核酸序列，該序列有效連接至能夠引導其在宿主細胞中表達的啟動子序列。優選載體是諸如圖2和圖3所示pACSGDH的質粒。
可用於本發明的表達載體通常含有複製起點、用於選擇的抗生素抗性、用於表達的啟動子和s-GDH基因變異體的全部或部分。所述表達載體還可以包括本領域已知的其它DNA序列，例如信號序列(用於更好地摺疊、轉運入周質或分泌)、用於更好地調節表達的誘導物或用於克隆的切割位點。
選定表達載體的特徵必須與待使用的宿主細胞匹配。例如，當在大腸桿菌細胞系統中克隆時，表達載體應含有從大腸桿菌細胞基因組中分離的啟動子(例如lac或trp)。可使用合適的複製起點例如ColE1質粒複製起點。合適的啟動子包括例如lac和trp。還優選所述表達載體包括編碼選擇標記的序列，例如抗生素抗性基因。作為選擇標記，可以方便地使用氨苄青黴素抗性或卡那黴素抗性。所有這些材料都是本領域已知的，並且是市售的。
含有所需編碼序列和控制序列的合適表達載體可以採用本領域已知的標準重組DNA技術來構建，所述技術中的許多技術描述於Sambrook等，載於「Molecular CloningA Laboratory Manual」(1989)Cold Spring Harbor，NY，Cold Spring Harbour Laboratory Press。
另外，本發明還涉及含有表達載體的宿主細胞，所述表達載體包含編碼全部或部分突變s-GDH的DNA序列。所述宿主細胞優選含有一種表達載體，其包含以下DNA序列之一的全部或部分，所述DNA序列編碼具有實施例2-8中所示的一個或多個突變的突變s-GDH。合適的宿主細胞包括例如可得自Pomega(2800 Woods HollowRoad，Madison，WI，USA)的大腸桿菌HB101(ATCC 33694)、可得自Stratagene(11011 North Torrey Pine Road，La Jolla，CA，USA)等的XL1-Blue MRF。
可通過本領域已知的各種方法，將表達載體導入宿主細胞中。例如，通過聚乙二醇介導的原生質體轉化法(Sambrook等，1989，參見上文)，可用表達載體進行宿主細胞轉化。然而，也可以使用用於將表達載體導入宿主細胞中的其它方法，例如電穿孔、基因槍注射(biolistic injection)或原生質體融合。
一旦已將含有s-GDH變異體的表達載體導入合適的宿主細胞中，則可以在允許目標s-GDH變異體表達的條件下培養所述宿主細胞。可通過即抗生素選擇容易地鑑別含目標表達載體的宿主細胞，其中所述表達載體具有編碼全部或部分突變s-GDH的DNA序列。s-GDH變異體的表達可通過不同方法鑑別，例如檢測s-GDH mRNA轉錄物的生產、用免疫學方法檢測基因產物或檢測基因產物的酶活性。優選應用酶測定。
本發明還教導了s-GDH變異體的產生和篩選。隨機誘變和飽和誘變如本領域所知來進行。篩選變異體的熱穩定性(無熱應力處理的活性與熱應力處理後的剩餘活性對比)。所選擇的測定條件適於確保可以測定例如由單個胺基酸取代引起的預期小增加。選擇或篩選合適突變體的一種優選模式在實施例3中給出。相比於起始酶(突變型或野生型)的任何變化或改進都可被清楚檢測。
當然，應當理解，並不是所有的表達載體和DNA調節序列都能同樣地用來表達本發明的DNA序列。對於同一表達系統而言，也不是所有的宿主細胞都可以同樣地起作用。然而，在不需過度不當實驗的情況下，本領域技術人員採用本文中提供的指南會在表達載體、DNA調節序列和宿主細胞中做出合適的選擇。
本發明還涉及生產本發明s-GDH變異體的方法，所述方法包括在適合於生產本發明突變s-GDH的條件下培養本發明的宿主細胞。對於細菌宿主細胞而言，典型培養條件是含有碳和氮源、合適抗生素和誘導劑(取決於所使用的表達載體)的液體培養基。典型的合適抗生素包括氨苄青黴素、卡那黴素、氯黴素、四環素等。典型誘導劑包括IPTG、葡萄糖、乳糖等。
優選本發明的多肽通過在表達突變s-GDH編碼DNA序列的宿主細胞中生產來獲得。本發明的多肽也可通過體外翻譯mRNA來獲得，該mRNA由編碼突變s-GDH的DNA序列編碼。例如，可以如上所述合成所述DNA序列，將其插入到合適的表達載體中，所述表達載體進而可以用於體外轉錄/翻譯系統。
包含以上定義和描述的分離多核苷酸的表達載體代表本發明的另一個優選實施方案，其中所述分離多核苷酸與能夠在無細胞肽合成系統中啟動其表達的啟動子序列有效連接。
然後，可以採用各種常規蛋白質純化技術分離並純化例如通過如上所述的方法生產的多肽。例如可以使用色譜法，例如離子交換色譜、凝膠過濾色譜和親和色譜。
本發明的改良s-GDH變異體的主要應用之一是用於測試條，以監測糖尿病患者的血糖水平。如上所述，PQQ依賴性葡糖脫氫酶對氧的不敏感性是超越葡萄糖氧化酶的巨大優勢。現在，使用具有提升的熱穩定性以及提升的葡萄糖專一性這二者的新型s-GDH變異體，可顯著降低由於例如待分析樣品中可能存在的麥芽糖、半乳糖和/或其它相關糖引起的幹擾。當然，可研究多種樣品。體液如血清、血漿、腸液或尿液是這類樣品的優選來源。
本發明還包括使用本發明的s-GDH突變體檢測、測定或測量樣品中葡萄糖的方法。尤其優選的是，用於檢測樣品中葡萄糖的改進方法的特徵在於，使用傳感器或測試條裝置進行葡萄糖的所述檢測、測定或測量。
用於檢測或測量樣品中葡萄糖的裝置也屬於本發明範圍，所述裝置包含符合本發明的s-GDH突變體以及所述測量需要的其它試劑。
熱穩定性提升的本發明s-GDH變異體還可以非常有利地用於生物傳感器中(D′Costa，E.J.等，Biosensors 2(1986)71-87；Laurinavicius，V.等，Analytical Letters 32(1999)299-316；Laurinavicius，V.等，Monatshefte fuer Chemie 130(1999)1269-1281；Malinauskas，A.等，Sensors and Actuators，BChemical 100(2004)395-402)，以在線監測樣品中或反應器中的葡萄糖。對於此目的，所述s-GDH變異體例如可用於包被具有鋨絡合物的氧不敏感玻璃電極，該鋨絡合物含氧化還原導電環氧化物網格(Ye等，1993，參見上文)，以更加準確地測定葡萄糖濃度。
在以下實施例中，所有的試劑、限制性酶和其它材料都得自RocheDiagnostics Germany，除非具體說明其它商業來源，並且按照供應商提供的說明來使用。DNA純化、表徵和克隆所使用的操作和方法在本領域眾所周知(Ausubel，F.等，載於「Current protocols in molecularbiology」(1994)，Wiley)，並且可根據技術人員的要求進行修改。
以下實施例進一步說明本發明。這些實施例不是用來限制本發明範圍，而是提供對本發明的進一步理解。
實施例1
野生型乙酸鈣不動桿菌可溶性PQQ依賴性葡糖脫氫酶在大腸桿菌中的克隆和表達按照標準方法從乙酸鈣不動桿菌菌株LMD 79.41中分離出s-GDH基因。將野生型s-GDH基因亞克隆到含有用於可調節表達的mgl啟動子的質粒中(參見專利申請WO 88/09373)。將新的構建體稱為pACSGDH(參見圖2和圖3)。將所述重組質粒導入選自大腸桿菌組的宿主生物體中。然後在合適條件下培養這些生物體，選擇顯示s-GDH活性的菌落。
採用QIAGEN Plasmid Maxi Kit(Qiagen)，按照生產商的方案，從200ml上述克隆的過夜培養物中分離質粒pACSGDH。將該質粒重懸於1ml雙蒸水中。使用Beckman DU 7400光度計測定質粒濃度。
產量為600μg。然後，通過瓊脂糖凝膠電泳測定質粒的量。
實施例2誘變PCR為了在所述s-GDH基因中產生隨機突變，進行誘變PCR(聚合酶鏈反應)。pACSGDH質粒和編碼突變酶(來自誘變PCR的PCR產物)的DNA序列用限制性酶Sph I和Eco RI消化。凝膠純化所述產物。連接經消化的DNA序列，用等份連接反應混合物轉化感受態大腸桿菌細胞。隨後在含有氨苄青黴素的LB平板上選擇轉化體。
選擇單個菌落，讓其在含有氨苄青黴素的LB培養基中生長過夜，然後進行篩選(參見實施例3)。
誘變PCR反應混合物40ng pACSGDH1×無MgCl2的緩衝液(Roche Diagnostics GmbH，目錄號1699 105)dCTP，dTTP 1mMdATP，dGTP 0.2mM(Roche Diagnostics GmbH，目錄號1969 064)40pmol GF23-引物(5′-CGC GCA CGC GCA TGC CGC CGA TGT TC)(＝SEQ ID NO4)40pmol GR23(5′-GAC GGC CAG TGA ATT CTT TTC TA)(＝SEQ IDNO5)7mM MgCl20.6mM MnCl25U Taq DNA聚合酶(Roche Diagnostics GmbH，目錄號1146 165)Gene Amp PCR System 2400(Perkin Elmer)，30個循環95℃，1分鐘，45℃ 2分鐘，72℃ 2分鐘-採用得自Roche Diagnostics GmbH的High Pure PCR ProductPurification Kit(高純度PCR產物純化試劑盒(目錄號1 732 676))，按照生產商的方案純化PCR產物。
-PCR片段用25U SphI(Roche Diagnostics GmbH，目錄號606 120)在1×緩衝液H(Roche Diagnostics GmbH，目錄號1417 991)中於37℃消化過夜；加入25U EcoRI(Roche Diagnostics GmbH，目錄號703737)，再消化3.5小時。
-50μg pACSGDH用180U SphI和180U EcoRI在1×緩衝液H中於37℃消化4小時。
-採用瓊脂糖凝膠(0.8％)將經消化的pACSGDH和經消化的片段進行凝膠電泳-採用QIAquick Gel Extraction Kit(QIAquick凝膠提取試劑盒)(Qiagen，目錄號28706)，按照生產商的方案，提取所述DNA分子。
-使用Beckman DU 7400光度計，測定片段和消化載體的濃度。
-通過瓊脂糖凝膠電泳測定純化產物的量。
-使用1U T4-DNA連接酶(Roche Diagnostics GmbH，目錄號481220)，將100ng消化過的載體與140ng mPCR片段在20μl體積中於16℃連接過夜。
-使用BioRad E.coli Pulser(BioRad大腸桿菌脈衝儀(BioRad))，用1μl連接反應物以2.5KV在0.2cm電穿孔槽中電穿孔電感受態XL1F細胞(Stratagene)。
-在1ml LB中於37℃生長1小時後，將細菌平板接種到LB-氨苄青黴素瓊脂平板(100μg/ml氨苄青黴素)上，於37℃生長過夜。
-50％的表達克隆產生有酶活性的s-GDH，對其進行以下篩選方法。
實施例3熱穩定性篩選將上述瓊脂平板上的突變菌落揀選入含200μl LB-氨苄青黴素-培養基/孔的微量滴定板(MTP)中，於37℃保溫過夜。這些平板稱為母板。
從每個母板轉移5μl樣品/孔至每孔含5μl B(B＝Bacterial ProteinExtraction Reagent(細菌蛋白提取試劑)；Pierce No.78248))的MTP中，進行細胞破碎，然後加入240μl的0.0556mM吡咯並喹啉醌(PQQ)、50mM Hepes、15mM CaCl2pH 7.0/孔，用以活化s-GDH。為完成全酶形成，將MTP於25℃保溫2小時，然後於10℃保溫過夜。該平板稱為工作板。
從工作板轉移2×10μl樣品/孔至兩個空的MTP中。一個MTP經受短時間溫度應力(於70℃達30分鐘/培養箱)。在冷卻至室溫後，用含30mM葡萄糖的90μl介導物溶液測試經受應力的和未處理的MTP(參見實施例8)。
計算dE/分鐘，將未受應力樣品的數值設定為100％活性。將受溫度應力的MTP所獲得的數值與未處理的數值對比，並以活性百分率計算((例如受溫度應力的dE/分鐘/未處理的dE)*100)。這等同於以剩餘活性百分率表示的(變異)酶的熱穩定性。為了補償由於保溫期間MTP中的熱分布波動引起的結果偏差，在專用孔中加入野生型酶作為各個板的參比。
鑑別出以下突變體
剩餘活性的可變性源於MTP孔中不一致的熱分布、加熱過程中全酶分解為脫輔基酶和輔酶以及在熱應力後自發地再組裝為全酶。儘管如此，突變體A也一直顯示出高於野生型酶的剩餘酶活性值。
實施例4s-GDH突變體A編碼基因的測序分離含熱穩定性高於野生型的s-GDH突變體A基因的質粒(高純度質粒分離試劑盒，Roche Diagnostics GmbH，No.1754785)，採用ABI Prism Dye Terminator Sequencing Kit和ABI 3/73和3/77測序儀(Amersham Pharmacia Biotech)對該質粒測序。
使用以下引物有義鏈GDH15′-TTA ACG TGC TGA ACA GCC GG-3′(＝SEQ ID NO6)GDH25′-ATA TGG GTA AAG TAC TAC GC-3′(＝SEQ ID NO7)結果發現了已列於實施例3的表中的突變體A的胺基酸交換。
實施例5通過飽和誘變獲得的s-GDH突變體進行飽和誘變，以觀察突變體A中的兩個或僅一個胺基酸交換是否造成熱穩定性提升。此外，所述方法允許人們觀察在所鑑別位置的其它胺基酸交換是否可增強發現的作用。使用QuickChange定點誘變試劑盒(Stratagene，目錄號200518)分別地連續取代野生型s-GDH蛋白的122位和202位的野生型胺基酸。
用於誘變的5′-引物和3′-引物相互互補，並且在中心位置含有NNN。這3個隨機合成的核苷酸處於目標位置(分別為122或202)，其側翼是每個末端的12-16個核苷酸，所述核苷酸與模板的有義和反義DNA鏈相同。引物含有NNN來代替所述密碼子，因此所述寡核苷酸編碼每個可能的密碼子。
分別對122位和202位的每一個進行一個PCR反應。
按照手冊進行PCR反應和DpnI限制性內切核酸酶消化。
此後，用1μl每個反應物電穿孔XL1F細胞。讓細胞生長，如上所述測定所述克隆的s-GDH活性。
為了增加統計學可能性，在此評價中覆蓋全部20個可能的胺基酸取代，對每個位置篩選200個克隆(參見實施例3)。
其中使用以下引物對於122位有義鏈5′-TCGTTATACCTATNNNAAATCAACAGATA-3′(SEQ IDNO8)反義鏈5′-TATCTGTTGATTTNNNATAGGTATAACGA-3′(SEQ IDNO9)對於202位有義鏈5′-TAAAGTACTACGCNNNAATCTTGATGGAA-3′(SEQ IDNO10)反義鏈5′-TTCCATCAAGATTNNNGCGTAGTACTTTA-3′(SEQ IDNO11)結果在202位的胺基酸交換不改變熱穩定性。只有在122位的擺動產生具有增強的熱穩定性的克隆。最佳交換是N122K。
實施例6產生和麥芽糖相比具有對葡萄糖的高底物專一性以及增強的熱穩定性的突變體在WO 02/34919中，已鑑別出幾個在s-GDH的不同位置的胺基酸交換，並表明和例如麥芽糖相比，其增強對葡萄糖的底物專一性。此外，胺基酸交換T348G與在例如169、171、245、341和/或349位的其它位置胺基酸取代組合進一步增強底物專一性。選擇這些描述的突變體中的幾個，以通過導入已發現的胺基酸交換N122K提升其熱穩定性。點突變通過使用以下引物完成。
有義鏈5′-TCGTTATACCTATAAGAAATCAACAGATA-3′(SEQID NO12)反義鏈5′-TATCTGTTGATTTCTTATAGGTATAACGA-3′(SEQIDNO13)應用如實施例3所述的對熱穩定性的相同篩選，只是保溫溫度由70℃降至65℃，時間為30分鐘。
結果
由此清晰可見，對於全部突變體類型，額外的胺基酸交換N122K在選擇的應力模型中產生增強的熱穩定性，沒有影響底物專一性。
實施例7產生具有高底物專一性和進一步增強的熱穩定性的突變體在如WO 02/34919所述篩選增強的底物專一性的同時，使用m-PCR和飽和誘變在隨機位置如上所述擴展熱穩定性的篩選參數譜。
用與麥芽糖(2％)相比對葡萄糖具有高底物專一性、具有胺基酸交換Y171G+E245D+M341V+T348G+N428P的突變體E/0開始，發現了一個新的胺基酸交換S124K。
然後，將此新的胺基酸交換應用於實施例6的含N122K的已改進突變體，使用以下引物有義鏈5′-CCTATAAGAAAAAGACAGATACGCTCG-3′(SEQ IDNO14)反義鏈5′-CGAGCGTATCTGTCTTTTTCTTATAGG-3′(SEQ IDNO15)結果
上述結果表明，N122K位和S124K位上的胺基酸交換對突變體的熱穩定性具有額外的正面作用。
實施例8野生型或變異s-GDH的純化以及各自酶活性的分析培養大腸桿菌細胞(LB-Amp，37℃)，收集並重懸浮在磷酸鉀緩衝液pH 7.0中。通過French Press passage(700-900bar)進行細胞破碎。在離心後將上清液上樣到用10mM磷酸鉀緩衝液pH 7.0平衡的S-Sepharose(Amersham Pharmacia Biotec)柱。洗滌後，使用0-1M NaCl鹽梯度洗脫s-GDH。合併表現出s-GDH活性的級分，對磷酸鉀緩衝液pH 7.0透析，並在再平衡的S-Sepharose柱上再層析。合併活性級分，使用Superdex200柱(Amersham)進行凝膠過濾。合併活性級分，在加入CaCl2(3mM終濃度)後儲存於-20℃。
分別對純化的野生型和變異s-GDH進行酶檢測和蛋白測定。
使用Pierce的Protein Assay Reagent 23225號(以BSA、30分鐘、37℃做校準曲線)進行蛋白質測定。
用0.0556mM吡咯並喹啉醌(PQQ)、50mM Hepes、15mM CaCl2pH 7.0將s-GDH樣品稀釋至1mg蛋白/ml，並於25℃保溫30分鐘，用於再制或活化。
在活化後，用50mM Hepes、15mM CaCl2pH 7.0將樣品稀釋至約0.02U/ml，將50μl各種稀釋過的樣品加入到1000μl含0.315mg/ml作為介導物的(4-(二甲基氧膦基甲基)-2-甲基-吡唑並-[1.5a]-咪唑-3-基)-(4-亞硝基苯)-胺(參見專利US 5,484,708)和30mM糖的0.2M檸檬酸鹽緩衝溶液(pH 5.8；於25℃)中。
在25℃的前5分鐘中監測620nm的消光度。
1單位酶活性對應於在上述測定條件下1mMol介導物/分鐘的轉變。
計算活性＝(總體積*dE/分鐘[U/ml])(ε*樣品體積*1)(ε＝消光係數；ε620nm＝30[1*mmol-1*cm-1])。
分別用葡萄糖和麥芽糖(Merck，Germany)進行所述測定。
結果
實施例9有或沒有胺基酸交換N122K和S124K的純化突變體的溫度穩定性比較對野生型、突變體C/0和C/2(實施例8)的純化s-GDH樣品實施可選的溫度應力模型，該模型類似於生產和/或運輸的溫度應力條件。製備1mg酶蛋白/20mM磷酸鉀pH 7.0、0.016mg PQQ/ml的溶液，以活化s-GDH。在於室溫保溫30分鐘後，測定對葡萄糖的初始活性(參見實施例8)，將樣品於48℃的水浴中保溫。在30分鐘溫度應力後，檢測剩餘活性，並以百分率計算(與初始活性對比)。
結果
在這些選擇性溫度應力條件下也可以清晰看出N122K和S124K位置上的胺基酸交換的作用以及產生的溫度穩定性的改良。
實施例10在有或無麥芽糖的情況下測定葡萄糖在有或沒有麥芽糖的情況下可分別將野生型s-GDH和s-GDH變異體B/2、C/2和D/2應用於葡萄糖測定。參比樣品含有50mg葡萄糖/dl。「試驗」樣品分別含有50mg葡萄糖/dl以及100或200mg/dl麥芽糖。每一測定使用具有相同量的GDH活性(例如5U/ml；活性如在實施例8中測定)的酶溶液。
在比色杯中混合1ml 0.315mg(4-(二甲基氧膦基甲基)-2-甲基-吡唑並-[1.5a]-咪唑-3-基)-(4-亞硝基苯)-胺ml/0.2M檸檬酸pH 5.80.033ml參比或測試樣品通過將0.050ml s-GDH酶溶液(其是s-GDH過量的，用於轉變葡萄糖)加入比色杯中開始該測定。監測620nm的吸光度變化。2-5分鐘後，觀察到恆定值，計算dE/5分鐘。用野生型s-GDH測量參比樣品獲得的數值設定為100％。將其它數值與該參比值進行比較，計算百分率。
顯然，當使用新型也更穩定的本發明s-GDH變異體時，測試樣品中檢測到較少的麥芽糖幹擾。
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序列表110Roche Diagnostics GmbHF.Hoffmann-La Roche AG120吡咯並喹啉醌依賴性葡糖脫氫酶的突變體13022804 WO150EP040245931512004-10-1516016170PatentIn version 3.221012111362212DNA213乙酸鈣不動桿菌(Acinetobacter calcoaceticus)220
221CDS222(1)..(1362)4001gat gtt cct cta act cca tct caa ttt gct aaa gcg aaa tca gag aac48Asp Val Pro Leu Thr Pro Ser Gln Phe Ala Lys Ala Lys Ser Glu Asn1 5 10 15ttt gac aag aaa gtt att cta tct aat cta aat aag ccg cac gcg ttg96Phe Asp Lys Lys Val Ile Leu Ser Asn Leu Asn Lys Pro His Ala Leu20 25 30tta tgg gga cca gat aat caa att tgg tta act gag cga gca aca ggt144Leu Trp Gly Pro Asp Asn Gln Ile Trp Leu Thr Glu Arg Ala Thr Gly35 40 45aag att cta aga gtt aat cca gag tcg ggt agt gta aaa aca gtt ttt192Lys Ile Leu Arg Val Asn Pro Glu Ser Gly Ser Val Lys Thr Val Phe50 55 60cag gta cca gag att gtc aat gat gct gat ggg cag aat ggt tta tta240Gln Val Pro Glu Ile Val Asn Asp Ala Asp Gly Gln Asn Gly Leu Leu65 70 75 80
ggt ttt gcc ttc cat cct gat ttt aaa aat aat cct tat atc tat att288Gly Phe Ala Phe His Pro Asp Phe Lys Asn Asn Pro Tyr Ile Tyr Ile85 90 95tca ggt aca ttt aaa aat ccg aaa tct aca gat aaa gaa tta ccg aac336Ser Gly Thr Phe Lys Asn Pro Lys Ser Thr Asp Lys Glu Leu Pro Asn100 105 110caa acg att att cgt cgt tat acc tat aat aaa tca aca gat acg ctc384Gln Thr Ile Ile Arg Arg Tyr Thr Tyr Asn Lys Ser Thr Asp Thr Leu115 120 125gag aag cca gtc gat tta tta gca gga tta cct tca tca aaa gac cat432Glu Lys Pro Val Asp Leu Leu Ala Gly Leu Pro Ser Ser Lys Asp His130 135 140cag tca ggt cgt ctt gtc att ggg cca gat caa aag att tat tat acg480Gln Ser Gly Arg Leu Val Ile Gly Pro Asp Gln Lys Ile Tyr Tyr Thr145 150 155 160att ggt gac caa ggg cgt aac cag ctt gct tat ttg ttc ttg cca aat528Ile Gly Asp Gln Gly Arg Asn Gln Leu Ala Tyr Leu Phe Leu Pro Asn165 170 175caa gca caa cat acg cca act caa caa gaa ctg aat ggt aaa gac tat576Gln Ala Gln His Thr Pro Thr Gln Gln Glu Leu Asn Gly Lys Asp Tyr180 185 190cac acc tat atg ggt aaa gta cta cgc tta aat ctt gat gga agt att624His Thr Tyr Met Gly Lys Val Leu Arg Leu Asn Leu Asp Gly Ser Ile195 200 205cca aag gat aat cca agt ttt aac ggg gtg gtt agc cat att tat aca672Pro Lys Asp Asn Pro Ser Phe Asn Gly Val Val Ser His Ile Tyr Thr210 215 220ctt gga cat cgt aat ccg cag ggc tta gca ttc act cca aat ggt aaa720Leu Gly His Arg Asn Pro Gln Gly Leu Ala Phe Thr Pro Asn Gly Lys225 230 235 240tta ttg cag tct gaa caa ggc cca aac tct gac gat gaa att aac ctc768Leu Leu Gln Ser Glu Gln Gly Pro Asn Ser Asp Asp Glu Ile Asn Leu245 250 255att gtc aaa ggt ggc aat tat ggt tgg ccg aat gta gca ggt tat aaa816Ile Val Lys Gly Gly Asn Tyr Gly Trp Pro Asn Val Ala Gly Tyr Lys260 265 270
gat gat agt ggc tat gct tat gca aat tat tca gca gca gcc aat aag864Asp Asp Ser Gly Tyr Ala Tyr Ala Asn Tyr Ser Ala Ala Ala Asn Lys275 280 285tca att aag gat tta gct caa aat gga gta aaa gta gcc gca ggg gtc912Ser Ile Lys Asp Leu Ala Gln Asn Gly Val Lys Val Ala Ala Gly Val290 295 300cct gtg acg aaa gaa tct gaa tgg act ggt aaa aac ttt gtc cca cca960Pro Val Thr Lys Glu Ser Glu Trp Thr Gly Lys Asn Phe Val Pro Pro305 310 315 320tta aaa act tta tat acc gtt caa gat acc tac aac tat aac gat cca1008Leu Lys Thr Leu Tyr Thr Val Gln Asp Thr Tyr Asn Tyr Asn Asp Pro325 330 335act tgt gga gag atg acc tac att tgc tgg cca aca gtt gca ccg tca1056Thr Cys Gly Glu Met Thr Tyr Ile Cys Trp Pro Thr Val Ala Pro Ser340 345 350tct gcc tat gtc tat aag ggc ggt aaa aaa gca att act ggt tgg gaa1104Ser Ala Tyr Val Tyr Lys Gly Gly Lys Lys Ala Ile Thr Gly Trp Glu355 360 365aat aca tta ttg gtt cca tct tta aaa cgt ggt gtc att ttc cgt att1152Asn Thr Leu Leu Val Pro Ser Leu Lys Arg Gly Val Ile Phe Arg Ile370 375 380aag tta gat cca act tat agc act act tat gat gac gct gta ccg atg1200Lys Leu Asp Pro Thr Tyr Ser Thr Thr Tyr Asp Asp Ala Val Pro Met385 390 395 400ttt aag agc aac aac cgt tat cgt gat gtg att gca agt cca gat ggg1248Phe Lys Ser Asn Asn Arg Tyr Arg Asp Val Ile Ala Ser Pro Asp Gly405 410 415aat gtc tta tat gta tta act gat act gcc gga aat gtc caa aaa gat1296Asn Val Leu Tyr Val Leu Thr Asp Thr Ala Gly Asn Val Gln Lys Asp420 425 430gat ggc tca gta aca aat aca tta gaa aac cca gga tct ctc att aag1344Asp Gly Ser Val Thr Asn Thr Leu Glu Asn Pro Gly Ser Leu Ile Lys435 440 445ttc acc tat aag gct aag1362Phe Thr Tyr Lys Ala Lys450
2102211454212蛋白質213乙酸鈣不動桿菌(Acinetobacter calcoaceticus)4002Asp Val Pro Leu Thr Pro Ser Gln Phe Ala Lys Ala Lys Ser Glu Asn1 5 10 15Phe Asp Lys Lys Val Ile Leu Ser Asn Leu Asn Lys Pro His Ala Leu20 25 30Leu Trp Gly Pro Asp Asn Gln Ile Trp Leu Thr Glu Arg Ala Thr Gly35 40 45Lys Ile Leu Arg Val Asn Pro Glu Ser Gly Ser Val Lys Thr Val Phe50 55 60Gln Val Pro Glu Ile Val Asn Asp Ala Asp Gly Gln Asn Gly Leu Leu65 70 75 80Gly Phe Ala Phe His Pro Asp Phe Lys Asn Asn Pro Tyr Ile Tyr Ile85 90 95Ser Gly Thr Phe Lys Asn Pro Lys Ser Thr Asp Lys Glu Leu Pro Asn100 105 110Gln Thr Ile Ile Arg Arg Tyr Thr Tyr Asn Lys Ser Thr Asp Thr Leu115 120 125Glu Lys Pro Val Asp Leu Leu Ala Gly Leu Pro Ser Ser Lys Asp His130 135 140Gln Ser Gly Arg Leu Val Ile Gly Pro Asp Gln Lys Ile Tyr Tyr Thr145 150 155 160Ile Gly Asp Gln 6ly Arg Asn Gln Leu Ala Tyr Leu Phe Leu Pro Asn165 170 175
Gln Ala Gln His Thr Pro Thr Gln Gln Glu Leu Asn Gly Lys Asp Tyr180 185 190His Thr Tyr Met Gly Lys Val Leu Arg Leu Asn Leu Asp Gly Ser Ile195 200 205Pro Lys Asp Asn Pro Ser Phe Asn Gly Val Val Ser His Ile Tyr Thr210 215 220Leu Gly His Arg Asn Pro Gln Gly Leu Ala Phe Thr Pro Asn Gly Lys225 230 235 240Leu Leu Gln Ser Glu Gln Gly Pro Asn Ser Asp Asp Glu Ile Asn Leu245 250 255Ile Val Lys Gly Gly Asn Tyr Gly Trp Pro Asn Val Ala Gly Tyr Lys260 265 270Asp Asp Ser Gly Tyr Ala Tyr Ala Asn Tyr Ser Ala Ala Ala Asn Lys275 280 285Ser Ile Lys Asp Leu Ala Gln Asn Gly Val Lys Val Ala Ala Gly Val290 295 300Pro Val Thr Lys Glu Ser Glu Trp Thr Gly Lys Asn Phe Val Pro Pro305 310 315 320Leu Lys Thr Leu Tyr Thr Val Gln Asp Thr Tyr Asn Tyr Asn Asp Pro325 330 335Thr Cys Gly Glu Met Thr Tyr Ile Cys Trp Pro Thr Val Ala Pro Ser340 345 350Ser Ala Tyr Val Tyr Lys Gly Gly Lys Lys Ala Ile Thr Gly Trp Glu355 360 365
Asn Thr Leu Leu Val Pro Ser Leu Lys Arg Gly Val Ile Phe Arg Ile370 375 380Lys Leu Asp Pro Thr Tyr Ser Thr Thr Tyr Asp Asp Ala Val Pro Met385 390 395 400Phe Lys Ser Asn Asn Arg Tyr Arg Asp Val Ile Ala Ser Pro Asp Gly405 410 415Asn Val Leu Tyr Val Leu Thr Asp Thr Ala Gly Asn Val Gln Lys Asp420 425 430Asp Gly Ser Val Thr Asn Thr Leu Glu Asn Pro Gly Ser Leu Ile Lys435 440 445Phe Thr Tyr Lys Ala Lys45021032117212蛋白質213人工220
223s-GDH的修飾胺基酸序列的120-126位220
221misc_feature223位置3(122)的Asn和/或位置5(124)的Ser被Lys取代4003Thr Tyr Asn Lys Ser Thr Asp1 5210421126212DNA213人工
220
223m-PCR有義鏈的引物4004cgcgcacgcg catgccgccg atgttc 26210521123212DNA213人工220
223m-PCR反義鏈的引物4005gacggccagt gaattctttt cta 23210621120212DNA213人工220
223測序引物GDH 1有義鏈4006ttaacgtgct gaacagccgg 20210721120212DNA213人工220
223測序引物GDH 2有義鏈4007atatgggtaa agtactacgc 20210821129212DNA213人工
220
223用於在122位搖擺的引物(有義鏈)220
221misc_feature222(14)..(16)223n是a、c、g或t4008tcgttatacc tatnnnaaat caacagata29210921129212DNA213人工220
223用於在122位搖擺的引物(反義鏈)220
221misc_feature222(14)..(16)223n是a、c、g或t4009tatctgttga tttnnnatag gtataacga292101021129212DNA213人工220
223用於在202位搖擺的引物(有義鏈)220
221misc_feature222(14)..(16)223n是a、c、g或t40010taaagtacta cgcnnnaatc ttgatggaa29
2101121129212DNA213人工220
223用於在202位搖擺的引物(反義鏈)220
221misc_feature222(14)..(16)223n是a、c、g或t40011ttccatcaag attnnngcgt agtacttta292101221129212DNA213人工220
223用於N122K有義鏈的引物40012tcgttatacc tataagaaat caacagata292101321129212DNA213人工220
223用於N122K反義鏈的引物40013tatctgttga tttcttatag gtataacga292101421127212DNA213人工220
223用於N122K和S124K有義鏈的引物
40014cctataagaa aaagacagat acgctcg 272101521127212DNA213人工220
223用於N122K和S124K反義鏈的引物40015cgagcgtatc tgtctttttc ttatagg 27210162114373212DNA213人工220
223序列載體pACSGDH40016cactaactga ttacgcaccg catgtaaccg ttttcaatct gtgagtaaat tcacagttta 60ttaacattgt gatagctatg atgacaacgt ttgtcgcact gtaactaacg tgtaacagtt 120agttgtcagt tttgctgggg tatttcgctt ataaaaaccg ttatcacaat atcccgcgac 180taccggacaa aaataaagag ttgaataaga gcttatccca ttagggctat tttacttgcc 240attttggacc tgggcagtgc tcgccaaaac gcgttagcgt tttgaacgcg ctagcggcgg 300cccgaagggc gagcgtagcg agtcaaacct cacgtactac gtgtacgctc cggtttttgc 360gcgctgtccg tgtccaaact gctgcgccaa taacgcctgg tgggataggc tctaaatacg 420cttcggcgtt cagtaacacg cgttaacgtg ctgaacagcc gggcattttt ttacgctata 480ccctacataa taaaaccgga gctaccatga ataagaaggt actgaccctt tctgccgtga 540tggcaagtct gttattcggc gcgcacgcgc atgccgccga tgttcctcta actccatctc 600aatttgctaa agcgaaatca gagaactttg acaagaaagt tattctatct aatctaaata 660
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1.一種PQQ依賴性s-GDH突變蛋白，其特徵在於在122位和124位中的至少一個中存在胺基酸賴氨酸，其中這些位置對應於由乙酸鈣不動桿菌(A.calcoaceticus)s-GDH野生型序列(SEQ ID NO2)已知的胺基酸位置。
2.權利要求1的突變體，其中所述122位的胺基酸為賴氨酸。
3.權利要求1的突變體，其中所述124位的胺基酸為賴氨酸。
4.權利要求1的突變體，其中所述胺基酸賴氨酸存在於122位和124位兩者。
5.權利要求1-4中任一項的突變體，所述突變體在選自以下的一個或多個位置另外含有一個或多個胺基酸取代位置16、22、65、76、116、120、127、143、168、169、171、177、224、227、230、231、245、246、255、277、287、294、295、299、302、305、307、308、317、321、323、341、348、349、354、355、364、378、422、425、428和438。
6.權利要求5的突變體，其中所述一個或多個另外的胺基酸取代為在348位的取代。
7.權利要求5的突變體，其中所述一個或多個另外的胺基酸取代為在428位的取代。
8.權利要求5的突變體，其中所述一個或多個另外的胺基酸取代為在348位和428位兩者的取代。
9.權利要求6的突變體，其中348位的蘇氨酸被丙氨酸、甘氨酸或絲氨酸取代。
10.一種分離的多核苷酸，所述多核苷酸編碼權利要求1-9中任一項的s-GDH突變蛋白。
11.一種包含權利要求10中定義的分離多核苷酸的表達載體，所述多核苷酸有效連接至能夠啟動所述多核苷酸在宿主細胞中表達的啟動子序列。
12.一種宿主細胞，所述宿主細胞包含權利要求11的表達載體。
13.一種生產s-GDH變異體的方法，所述方法包括在適合於生產所述酶變異體的條件下培養權利要求12的宿主細胞。
14.一種使用權利要求1-9中任一項的s-GDH突變體檢測、測定或測量樣品中葡萄糖的方法，所述改進包括使所述樣品與所述突變體接觸。
15.權利要求14的方法，所述方法的進一步特徵在於所述葡萄糖的檢測、測定或測量使用傳感器或測試條裝置進行。
16.一種用於檢測或測量樣品中的葡萄糖的裝置，所述裝置包含權利要求1-9中任一項的s-GDH突變體和所述測量需要的其它試劑。
全文摘要
本發明涉及一種PQQ依賴性s－GDH突變蛋白，其特徵在於在122位和124位中的至少一個中存在胺基酸賴氨酸，其中這些位置對應於由乙酸鈣不動桿菌(A.calcoaceticus)s－GDH野生型序列(SEQ ID NO2)已知的胺基酸位置。本發明還公開了編碼這種突變s－GDH的基因，以及這些s－GDH突變體的不同用途，具體地說是用於測定樣品中的葡萄糖濃度的用途。
文檔編號C12Q1/32GK101040044SQ200580034780
公開日2007年9月19日 申請日期2005年10月14日 優先權日2004年10月15日
發明者M·博尼茨－杜拉特, P·克拉茨施, R·施穆克 申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司