黑胸敗血芽孢桿菌穿孔毒素蛋白及其重組表達載體和應用的製作方法

2023-11-12 05:03:02 1

黑胸敗血芽孢桿菌穿孔毒素蛋白及其重組表達載體和應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了黑胸敗血芽孢桿菌穿孔毒素蛋白及其重組表達載體和應用，黑胸敗血芽孢桿菌穿孔毒素蛋白的胺基酸序列如SEQ?ID?NO.4所示，家蠶幼蟲添食黑胸敗血芽孢桿菌穿孔毒素蛋白後導致家蠶存活率降低，表明該基因是一個可導致鱗翅目昆蟲家蠶致死的毒性蛋白，能夠用於製備生物農藥殺蟲劑，特別是抗鱗翅目害蟲的生物農藥殺蟲劑，具有廣泛的應用前景。
【專利說明】黑胸敗血芽孢桿菌穿孔毒素蛋白及其重組表達載體和應用
【技術領域】
[0001]本發明屬於生物化學領域，具體涉及黑胸敗血芽孢桿菌穿孔毒素蛋白，還涉及含黑胸敗血芽孢桿菌穿孔毒素蛋白的重組表達載體和應用。
【背景技術】
[0002]細菌是植物、動物和人類的主要病原微生物之一，而毒素蛋白是其重要的毒力因子，主要類型為穿孔毒素蛋白(Pore-forming toxins,簡稱:PFT)。大多數細菌的PFT作用於宿主的細胞膜，形成孔洞使細胞內外離子平衡，導致細胞裂解破碎而死亡。目前已鑑定的細菌穿孔毒素蛋白超過300多種，根據其插入細胞膜磷脂雙分子層的結構特徵，可以分為a-PFT和β-PFT。其中β-PFT又可以分為smalP-PFT和CDCs兩種類型，它們的結合細胞方式、孔道形成機制和引起靶細胞反應不同。儘管有如此之多的細菌PFT，但由於絕大多數的PFT經口添食不會導致昆蟲死亡，所以真正在作物抗蟲方面有利用價值的並不常見。目前只有a-PFT的Bt Cry伴孢晶體毒素蛋白和β-PFT的Bt Cyt δ內毒素在生物農藥殺蟲劑或抵抗害蟲的轉基因植物分子育種等方面有產業上的應用。儘管轉Bt植物品種的大面積推廣應用極大地減輕了蟲害，也減少了農藥用量，並在保護環境的同時也挽回了大量的經濟損失；但長期使用同一抗性品種也導致了對Bt Cry伴孢晶體毒素蛋白具有抗性的昆蟲相繼出現。因此尋找新的靶標基因培育新的抗性品種迫在眉睫，但如何從數以萬計的病原微生物中鑑定出可以經口添食感染導致昆蟲死亡的穿孔毒素蛋白明顯非常困難。
[0003]黑胸敗血芽孢桿菌(Bacillus bombyseptieus,簡稱Bb)是鱗翅目模式昆蟲家蠶的主要細菌性病原之一，Bb感染家蠶後，在家蠶中腸組織中形成孔洞，進而通過這些孔洞侵入血淋巴引起家蠶細菌性敗血病。有學者通過電鏡掃描觀察到家蠶中腸上皮在Bb感染後有孔洞形成，暗示Bb產生了穿孔毒素蛋白·且家蠶在感染Bb後會很快死亡，表明Bb的穿孔毒素蛋白具有重要的生物學功能。因此，對該基因進行克隆進而對其生物學功能進行研究，將為新的生物殺蟲劑的開發奠定基礎。

【發明內容】

[0004]有鑑於此，本發明的目的之一在於提供黑胸敗血芽孢桿菌穿孔毒素蛋白，本發明的目的之二在於提供黑胸敗血芽孢桿菌穿孔毒素蛋白的編碼基因；本發明的目的之三在於提供含有上述編碼基因的重組表達載體，本發明的目的之四在於提供含有重組表達載體的工程菌；本發明的目的之五在於提供利用所述工程菌製備黑胸敗血芽孢桿菌穿孔毒素蛋白的方法，本發明的目的之六在於提供黑胸敗血芽孢桿菌穿孔毒素蛋白在製備生物農藥殺蟲劑中的應用。
[0005]1.黑胸敗血芽孢桿菌穿孔毒素蛋白，胺基酸序列如SEQ ID N0.4所示。
[0006]2.權利要求1所述黑胸敗血芽孢桿菌穿孔毒素蛋白的編碼基因。
[0007]優選的，所述編碼基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示。
[0008]3.含有所述編碼基因的重組表達載體。[0009]優選的，所述重組表達載體是將SEQ ID N0.3所示的核苷酸序列連入pET28a載體的BamH I和Xho I酶切位點而得。
[0010]4.含有權利要求4或5所述重組表達載體的工程菌。
[0011]優選的，所述工程菌為大腸桿菌BL21。
[0012]5.利用所述工程菌製備黑胸敗血芽孢桿菌穿孔毒素蛋白的方法，將工程菌擴大培養後加入IPTG誘導表達，離心收集菌體，PBS清洗後用液氮反覆凍融，然後超聲波破碎收集沉澱；沉澱分別用含質量分數為0.5%的Triton TM X_100、0.1~0.3Mm EDTA的PBS和含2M尿素、IOOmM NaCl的PBS清洗；再用含8M尿素、IOOmM NaCl的PBS重懸沉澱，使包涵體充分溶解；離心收集上清，抽濾，濾液含有尿素的PBS進行透析；最後用PBS溶液透析，然後用Ni親和柱純化，用PBS溶液和含有20mM咪唑的PBS洗去未結合的蛋白後，再分別用含200mM、500mM和IM咪唑的PBS洗脫，最後用PBS溶液透析，得黑胸敗血芽孢桿菌穿孔毒素蛋白。
[0013]6.所述黑胸敗血芽孢桿菌穿孔毒素蛋白在製備生物農藥殺蟲劑中的應用。
[0014]優選的，所述黑胸敗血芽孢桿菌穿孔毒素蛋白在製備抗鱗翅目害蟲的生物農藥殺蟲劑中的應用。
[0015]本發明的有益效果在於:本發明克隆得到了黑胸敗血芽孢桿菌穿孔毒素蛋白Bbtoxin-2,經口添食Bb toxin-2毒素蛋白後可導致家蠶死亡,該蛋白是除Bt Cry伴孢晶體
毒素蛋白外唯--個經口飼養家蠶可導致家蠶死亡的毒素蛋白，這將為開發新的生物農藥
殺蟲劑提供新的思路。
【專利附圖】

【附圖說明】
`[0016]為了使本發明的目的、技術方案和有益效果更加清楚，本發明提供如下附圖:
[0017]圖1為黑胸敗血芽孢桿菌穿孔毒素蛋白在BL21中誘導表達電泳檢測(1:對照沉澱；2:對照上清；3:16°C誘導20h沉澱；4:16°C誘導20h上清；5:37°C誘導4h沉澱；6:37°C誘導4h上清)。
[0018]圖2為黑胸敗血芽孢桿菌穿孔毒素蛋白原核表達純化SDS-PAGE電泳檢測。
[0019]圖3為4齡起家蠶添食Bb toxin-2生存率統計(1:添食等體積PBS的家蠶存活率；2:添食Bb toxin-2毒素蛋白的家蠶存活率)。
[0020]圖4為5齡期家蠶分別添食黑胸敗血芽孢桿菌穿孔毒素蛋白、PBS和非致病鈣粘蛋白CR12的結果(A:5齡期家蠶添食黑胸敗血芽孢桿菌穿孔毒素蛋白生存率統計；B:添食PBS後家蠶存活照片；C:添食非致病鈣粘蛋白CR12後家蠶存活照片；D:添食Bb toxin-2毒素蛋白後家蠶死亡照片)。
【具體實施方式】
[0021]下面將結合附圖，對本發明的優選實施例進行詳細的描述。實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如分子克隆實驗指南(第三版，J-薩姆布魯克等著)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。
[0022]實施例1、穿孔毒素蛋白Bb toxin-2的鑑定和克隆
[0023]從NCBI上下載目前已報導的α-PFT和β-PFT的蛋白質序列，具體如下:嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)氣單胞菌溶素(Aerolysin) (Genbank:AECl2846.1)、腐敗梭菌(Clostridium septicum) α 毒素(Alpha-toxin) (Genbank:AAB32892.1)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) α 毒素(Alpha-toxin) (Genbank:Ρ09616.2)、產胺鏈球菌(Streptococcus pyogenes)溶血性鏈球菌產生的溶血素O (StreptolysinO) (Genbank:Q53957.1)、炭疽桿菌 str.A0174 (Bacillus anthracis str.A0174)anthrolysin O (ALO) (Genbank:EDT69040.1)、單核增生性李斯特菌(Listeriamonocytogenes)李斯特菌溶血素(Listeriolysin O) (Genbank:P13128.1)、蜂房芽胞桿菌(Paenibacillus alvei)蜂房桿菌溶素(Alveolysin) (Genbank:Ρ23564.I)、炭疽桿菌(Bacillus anthracis)炭疽毒素(Anthrax toxins) (Genbank:ΝΡ_052806.I)、蘇雲金芽抱桿菌(Bacillus thuringiensis) Bt CrylAa (Genbank:AAA22353.1)、蘇雲金芽抱桿菌(Bacillus thuringiensis) Bt Cry2Aa (Genbank: AAA22335.1 )、蘇雲金芽抱桿菌(Bacillus thuringiensis)Bt Cry3Aa(Genbank:AAA22336.1)、蘇雲金芽抱桿菌(Bacillusthuringiensis)Bt Cry4Aa(Genbank:CAA68485.1)、霍亂弧菌(Vibrio cholerae)霍亂弧菌溶細胞毒素 Vcc (Genbank: BAA09545.1)和白喉棒狀桿菌(Corynebacterium diphtheriae)白喉毒素(Diphtheria Toxin)(Genbank:NP_938615.1)。然後對 a-PFT 和 β-PFT 的蛋白質序列用BLAST軟體比對分析，序列比對分析主要包括:用a-PFT和β-PFT的胺基酸序列運行BLASTP程序檢索Bb基因組資料庫，採用檢索標準Ε〈10-1(ι，鑑定Bb穿孔毒素蛋白基因。最終鑑定獲得一個E值為8Ε-34，胺基酸相似性為49%的候選基因(Bb000863)，命名為Bb toxin-2ο
[0024]根據Bb基因組序列設計擴增Bb toxin-2的特異引物，Bb toxin-2的正向引物:5 1 -atgaaacgttctaaaacatactt-3 1 (SEQ ID N0.1),反向引物51 -ttttttctctactaatttcttattc-31 (SEQ ID N0.2)。以 Bb 基因組 DNA 為模板進行擴增，PCR反應條件為:95°C預變性5分鐘，然後95°C變性40秒、50°C退火40秒、72°C延伸80秒，共28個循環，最後72°C延伸10分鐘；PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳回收1000bp左右條帶，然後與PMD19-T Simpl e載體連接,連接反應體系嚴格按照Solution I連接酶使用說明進行，連接條件是在16°C條件下連接2小時，將連接產物轉化DH5a感受態細胞，獲得陽性克隆pMD19-T Simple/Bb toxin-2後測序驗證,測序結果如SEQ ID N0.3所示,經分析克隆的 Bb toxin-2 基因的 CDS 為 101 lbp，編碼 336 個胺基酸(SEQ ID N0.4)。
[0025]實施例2、Bb toxin-2原核表達、蛋白復性及純化
[0026]由於全長Bb toxin-2基因的N端含有31個胺基酸的信號肽序列,而信號肽會影響蛋白表達，因此對Bb toxin-2進行原核表達時去除了該信號肽。然後根據克隆獲得的全長Bb toxin-2設計不含信號肽的特異引物,正向引物為:5' -cgggaXcccaaacaacatcgcaagttgt-3/ (SEQ ID N0.5),下劃線為 BamH I 酶切位點，反向引物 5' -cctcgagttattttttctctactaatttcttattc-3' (SEQ ID N0.6)，下劃線為 Xho I 酶切位點，然後以 pMD19_T Simple/Bb toxin-2質粒為模板進行PCR擴增，反應條件為:94°C預變性5分鐘，然後95°C變性40秒、52 °C退火40秒、72°C延伸80秒，共28個循環，最後72°C延伸10分鐘；PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳鑑定並回收，回收產物用BamHI和Xho I雙酶切，回收Bb toxin-2基因片段，同時將pET28a載體用BamH I和Xho I進行雙酶切，回收載體骨架，將回收的Bb toxin-2酶切片段和pET28a骨架片段進行連接轉化，獲得pET28a/Bb toxin-2重組質粒，然後送往華大基因公司測序，將測序確認正確的重組質粒轉化表達感受細胞大腸桿菌BL21，加入IPTG至終濃度為0.2mM後在16°C條件下培養20h和37°C條件下培養4小時分別進行Bb toxin毒素蛋白誘導表達，SDS-PAGE電泳檢測，結果如圖1所示,結果顯示Bb toxin-2毒素蛋白主要是以包涵體形式表達。
[0027]將含pET28a/Bb toxin-2重組質粒的大腸桿菌BL21和大腸桿菌Rosetta擴大培養後在7000rpm條件下離心10分鐘收集菌體，PBS清洗3次後液氮反覆凍融3次，然後超聲波破碎30min，16000rpm離心30分鐘收集沉澱；沉澱用洗滌液I (含有0.5%Triton TMx-100,0.1- 0.3Mm EDTA的PBS)和洗滌液2 (含有2M尿素，IOOmM NaCl的PBS)分別清洗；再用20-30mL的含有8M尿素，IOOmM NaCl的PBS重懸沉澱，4°C緩慢搖動12小時，使包涵體充分溶解；4°C，16000rpm離心30分鐘，收集上清，上清用0.45 μ m濾膜抽濾後進行蛋白復性。
[0028]Bb toxin-2蛋白復性:將濾液依次用含有6M、4M、2M和IM尿素的PBS進行透析，每隔12小時換液一次；最後用PBS溶液透析4次，每隔6小時換液一次，獲得含復性Bbtoxin-2毒素蛋白的混合蛋白。
[0029]將含復性Bb toxin-2毒素蛋白的混合蛋白上柱到用PBS平衡過的Ni親和柱中，分別用30mL PBS溶液和含有20mM咪唑的PBS快速衝洗柱子以洗去未結合的蛋白，再分別用IOmL含200mM、500mM和IM咪唑的PBS緩慢衝洗柱子並收集洗脫液，大約每2ml收集一管，收集到的洗脫液進行SDS-PAGE電泳檢測；純化獲得的Bb toxin-2毒素蛋白用PBS溶液透析36小時，每6小時更換透析液一次，最後進行SDS-PAGE電泳檢測，結果如圖2所示。由圖2可知，純化獲得了 Bb toxin-2毒素蛋白，其分子量約為35kda。然後用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定其Bb toxin-2穿孔毒素蛋白濃度,結果顯示Bb toxin-2穿孔毒素蛋白的濃度為:1.49μ g/μ L0 [0030]實施例3、Bb toxin-2毒素蛋白添食鱗翅目昆蟲家蠶的存活率檢測
[0031]鱗翅目昆蟲家蠶DZ品種蠶卵進行浸酸(鹽酸比重為1.073，溫度為46°C，時間為5分鐘)以解除滯育，然後置於15°C、85%溼度的黑暗環境中催青至孵化，將蟻蠶收於高壓滅菌的培養皿中，放置於溫度和溼度分別控制在25°C、80%的生化培養箱中飼養。
[0032]對4齡期家蠶幼蟲飢餓6小時，以60 μ g/頭經口添食純化獲得的Bb toxin-2毒素蛋白，設置3個重複區，每個重複區40頭蠶，同時設置添食相同體積PBS為對照，連續統計存活率和死亡率，結果如圖3所示。統計結果顯示，添食Bb toxin-2毒素蛋白後家蠶幼蟲的死亡率明顯高於添食PBS的對照組，添食Bb toxin-2毒素蛋白的4齡期家蠶的死亡率大約為70%，而對照組的家蠶並沒有出現死亡。
[0033]對5齡期家蠶幼蟲飢餓6小時，以60 μ g/頭經口添食純化獲得的Bb toxin-2毒素蛋白，設置3個重複區，每個重複區40頭蠶，同時設置添食相同體積PBS和添食等量的採用相同分離純化方法獲得的非致病鈣粘蛋白CR12的家蠶作為對照區，連續統計存活率和死亡率，結果如圖4A所示。統計結果顯示，添食Bb toxin-2毒素蛋白後家蠶幼蟲的死亡率明顯高於添食PBS和非致病鈣粘蛋白CR12的對照組，並且添食Bb toxin-2毒素蛋白5齡期家蠶的死亡率大約為50%，而對照組的家蠶並沒有出現死亡；然後觀察添食PBS和非致病鈣粘蛋白CR12後家蠶幼蟲(圖4B和圖4C)以及添食Bb toxin-2毒素蛋白後死亡家(圖4C)。通過添食Bb toxin-2毒素蛋白來觀察Bb toxin-2穿孔毒素蛋白對鱗翅目昆蟲家蠶是否具有致病性。統計結果表明，添食Bb toxin-2毒素蛋白後家蠶幼蟲的存活率顯著下降，說明鑑定到的Bb toxin-2基因是編碼一個可導致鱗翅目昆蟲家蠶幼蟲致死的毒性蛋白，可作為靶標基因應用於抗鱗翅目害蟲的轉基因作物的分子育種。
[0034]最後說明的是，以上優選實施例僅用以說明本發明的技術方案而非限制，儘管通過上述優選實施例已經對本發明進行了詳細的描述，但本領域技術人員應當理解，可以在形式上和細節上對其作出各種·各樣的改變，而不偏離本發明權利要求書所限定的範圍。
【權利要求】
1.黑胸敗血芽孢桿菌穿孔毒素蛋白，其特徵在於:胺基酸序列如SEQID N0.4所示。
2.權利要求1所述黑胸敗血芽孢桿菌穿孔毒素蛋白的編碼基因。
3.根據權利要求2所述的編碼基因，其特徵在於:所述編碼基因的核苷酸序列如SEQID N0.3 所示。
4.含有權利要求2所述編碼基因的重組表達載體。
5.根據權利要求4所述的重組表達載體，其特徵在於:所述重組表達載體是將SEQIDN0.3所示的核苷酸序列連入pET28a載體的BamH I和Xho I酶切位點而得。
6.含有權利要求4或5所述重組表達載體的工程菌。
7.根據權利要求6所述工程菌，其特徵在於:所述工程菌為大腸桿菌BL21。
8.利用權利要求7所述工程菌製備黑胸敗血芽孢桿菌穿孔毒素蛋白的方法，其特徵在於:將工程菌用IPTG誘導表達，離心收集菌體，PBS清洗後用液氮反覆凍融，然後超聲波破碎收集沉澱；沉澱分別用含質量分數為0.5%的Triton TM X_100、0.1~0.3Mm EDTA的PBS和含2M尿素、IOOmM NaCl的PBS清洗；再用含8M尿素、IOOmM NaCl的PBS重懸沉澱，使包涵體充分溶解；離心收集上清，抽濾，濾液用含有尿素的PBS透析；最後用PBS溶液透析，然後用Ni親和柱純化，用PBS溶液和含有20mM咪唑的PBS洗去未結合的蛋白後，再分別用含200mM、500mM和IM咪唑的PBS洗脫，最後用PBS溶液透析，得黑胸敗血芽孢桿菌穿孔毒素蛋白。
9.權利要求1所述黑胸敗血芽孢桿菌穿孔毒素蛋白在製備生物農藥殺蟲劑中的應用。
10.根據權利要求9所述的應用，其特徵在於:所述黑胸敗血芽孢桿菌穿孔毒素蛋白在製備抗鱗翅目害蟲的生物農藥殺蟲劑中的應用。
【文檔編號】A01N47/44GK103626854SQ201310629013
【公開日】2014年3月12日 申請日期:2013年11月28日 優先權日:2013年11月28日
【發明者】程廷才, 林平, 金盛凱, 常懷譜, 夏慶友 申請人:西南大學