人rbbp6基因的小幹擾rna及其應用的製作方法

2023-10-31 19:44:42 2

專利名稱：：人rbbp6基因的小幹擾rna及其應用的製作方法
技術領域：
：本發明涉及核酸
技術領域：
，具體地說涉及RNA幹擾技術，更具體地涉及具有抑制人RBBP6基因表達的小分子幹擾核酸及其應用。
背景技術：
：RNA幹擾是指由雙鏈RNA誘發的基因沉默現象，主要通過阻礙特定基因的翻譯或轉錄來抑制基因表達。研究表明，長度為21-23nt的小RNA分子(smallinterferingRNA,siRNA)是引起RNA幹擾的直接原因(TuschlT,ZamorePD,SharpPA,BartelDP.RNAidouble-strandedRNAdirectstheATP—dependentcleavageofmRNAat21to23nucleotideintervals.Cell2000，101:25-33.)。RNA幹擾在抑制基因表達方面具有高效性、簡單性和特異性，目前在基因功能研究和疾病治療中發揮了重要作用。近幾年來，RNA幹擾已經在腫瘤治療方面取得了一些成果(Uprichard，SusanL.ThetherapeuticpotentialofRNAinterference.FEBSLetters2005，579:5996-6007)。RBBP6，全稱為Retinoblastomabindingprotein6，定位於人類染色體16pl2.2。RBBP6基因編碼的蛋白定位於細胞核內。由於氨基端含有保守的鋅指結構域，RBBP6蛋白具有泛素酯酶活性，可促進Y-box結合蛋白(細胞周期正向調控因子)的降解(ScottRE,GiannakourosT，GaoS，PeidisP.FunctionalpotentialofP2P-R:aroleinthecellcycleandcelldifferentiationrelatedtoitsinteractionswithproteinsthatbindtomatrixassociatedregionsofDNA？JCellBiochem2003；90:6-12；ChibiM，MeyerM，SkepuA，GReesDJ，Moolman-SmookJC，PughDJ.RBBP6interactswithmultifunctionalproteinYB-IthroughitsRINGfingerdomain，leadingtoubiquitinationandproteosomaldegradationofYB-1.JMolBiol2008；384908-16)。RBBP6可以與腫瘤抑制因子p53和/或Rb，以及核骨架附著區結合因子形成複合體，通過細胞周期和細胞分化依賴的形式影響基因轉錄、基因表達和對細胞核的調節(ScottRE,GiannakourosT，GaoS，PeidisP.FunctionalpotentialofP2P-R:aroleinthecellcycleandcelldifferentiationrelatedtoitsinteractionswithproteinsthatbindtomatrixassociatedregionsofDNA？JCellBiochem2003；90:6-12.；LiLiDengB，XingGiTengY，TianC，ChengX,YinXiYangJ,GaoX，ZhuY，SunQ,ZhangLiYangX，HeF.PACTisanegativeregulatorofp53andessentialforcellgrowthandembryonicdevelopment.ProcNatlAcadSciUSA2007；104:7951-6；ScottRE,White-GrindleyE，RuleyHE，CheslerEJ,WilliamsRW.P2P-RexpressionisgeneticallycoregulatedwithcomponentsofthetranslationmachineryandwithPUM2，atranslationalrepressorthatassociateswiththeP2P—RmRNA.JCellPhysiol2005；204:99-105)0RBBP6蛋白在食管癌組織中高水平表達(YoshitakeY，NakatsuraT，MonjiM，SenjuS，MatsuyoshiH，TsukamotoH，HosakaS，KomoriH，FukumaD，IkutaY，KatagiriT，FurukawaY，ItoH，ShinoharaM，NakamuraY，NishimuraY.Proliferationpotential—relatedprotein,anidealesophagealcancerantigenforimmunotherapy,identifiedusingcomplementaryDNAmicroarrayanalysis.ClinCancerRes2004;10:6437-48)。過表達的RBBP6蛋白可誘導骨肉瘤Saos2細胞的細胞周期阻滯於有絲分裂的前中期，誘導細胞凋亡，並能增強乳腺癌MCF-7細胞對抗腫^M^^HM^it^WilMii(ScottRE,GiannakourosΤ,GaoS,PeidisP.FunctionalpotentialofP2P-R:aroleinthecellcycleandcelldifferentiationrelatedtoitsinteractionswithproteinsthatbindtomatrixassociatedregionsofDNA？JCellBiochem2003；90:6-12；ScottRE,White-GrindleyE，RuleyHE，CheslerEJ,WilliamsRW.P2P-RexpressionisgeneticallycoregulatedwithcomponentsofthetranslationmachineryandwithPUM2，atranslationalrepressorthatassociateswiththeP2P-RmRNA.JCellPhysiol2005；204:99-105；GaoS,ScottRE.P2P-Rproteinoverexpressionrestrictsmitoticprogressionatprometaphaseandpromotesmitoticapoptosis.JCellPhysiol2002；193:199-207；GaoS，ScottRE.StableoverexpressionofspecificsegmentsoftheP2P—RproteininhumanMCF_7cellspromotescamptotheein-inducedapoptosis.JCellPhysiol2003；197445-52；ScottRE,GaoS.P2P-RdeficiencymodifiesnocodazoIeinducedmitoticarrestandUV-inducedapoptosis.AnticancerRes2002，22:3837-42)。基於目前已有的關於RBBP6基因在食管癌、骨肉瘤和乳腺癌的報導，可以推測RBBP6作為一個癌基因在腫瘤發生和進展過程中具有重要的功能，並有望成為抗腫瘤治療的有效靶點。
發明內容本發明的第一方面，提供了人RBBP6基因在腫瘤治療中的用途，即所述人RBBP6基因促進腫瘤細胞增殖，可作為針對腫瘤細胞的藥物治療靶標。所述藥物可以為小分子化學藥，抗體藥，也可以為核酸類藥物。優選的，所述腫瘤細胞的RBBP6基因可作為RNA幹擾藥物作用靶標。本發明的第二方面，提供了分離的人RBBP6基因小分子幹擾核糖核酸(siRNA)靶序列，其中所述靶序列為SEQIDNO1-172中任意一條序列。本發明還提供了包含SEQIDNO1_172中任意一條序列的核酸構建體和慢病毒。優選的，所述含有RBBP6基因siRNA序列的核酸構建體(也稱為RNA幹擾載體)為pGCSIL-GFP-RBBP6-siRNA(表達序列表中SEQIDN0.4)。本發明還提供了小分子幹擾核糖核酸(siRNA)，其包含正義RNA片段和反義RNA片段，所述正義RNA片段包含SEQIDNO1_172中任意一條序列編碼的RNA序列，其中正義RNA片段和反義RNA片段能形成雙鏈RNA，且能抑制人RBBP6基因的表達。所述正義RNA片段和反義RNA片段可以存在於兩條不同的RNA鏈上，或者存在於一條RNA鏈上。優選的，所述核糖核酸為髮夾型單鏈RNA分子(shRNA)，其中正義RNA片段和反義RNA片段之間的互補區域形成雙鏈RNA區域。上述任一項所述的核糖核酸，其中正義RNA片段和反義RNA片段的長度為15-27個核苷酸，優選為19-23個核苷酸，具體為19、20或者21個核苷酸。本發明還提供了上述任一項在製備或篩選抗腫瘤藥物中的應用，所述腫瘤選自結直腸癌或肝癌。綜上所述，本發明設計了針對人RBBP6基因的172個RNA幹擾靶點序列，構建相應的RBBP6shRNA表達載體，其中編碼序列SEQIDNO4的RNA幹擾載體pGCSIL-GFP-RBBP6-siRNA能夠顯著下調RBBP6基因在mRNA水平和蛋白水平的表達。使用慢病毒(lentivirus，簡寫為Lv)作為基因操作工具攜帶RNA幹擾載體pGCSIL-GFP-RBBP6-siRNA能夠靶向地將針對RBBP6基因的RNA幹擾序列高效導入人結直腸腫瘤細胞RKO和人肝臟腫瘤細胞SMMC-7721，降低RBBP6基因的表達水平，顯著抑制上述腫瘤細胞的增殖和生長速度，是結直腸腫瘤和肝臟腫瘤的潛在臨床非手術治療方式。本發明的有益效果本發明提供的小幹擾核酸或者包含小幹擾核酸序列的核酸構建體、慢病毒能夠特異性抑制人RBBP6基因的表達，尤其是慢病毒，能夠高效侵染靶細胞，高效率地抑制靶細胞中RBBP6基因的表達，進而抑制腫瘤細胞的生長，在腫瘤治療中具有重要意義。圖1表示pGCSIL-GFP質粒DNA圖譜。圖2表示pGC-FU質粒DNA圖譜。圖3表示Lv-RBBP6-siRNA慢病毒侵染人結直腸腫瘤細胞RKO5天後，RBBP6mRNA的表達水平顯著降低。圖4表示Lv-RBBP6-siRNA慢病毒侵染人肝臟腫瘤細胞SMMC-77215天後，RBBP6mRNA的表達水平顯著降低。圖5表示Lv-RBBP6-siRNA慢病毒侵染人結直腸腫瘤細胞RKO5天後，引起細胞增殖抑制。圖6表示Lv-RBBP6-siRNA慢病毒侵染人肝臟腫瘤細胞SMMC-77215天後，引起細胞增殖抑制。具體實施例方式發明人發現，採用RNA幹擾方法下調人RBBP6基因的表達後可有效地抑制腫瘤細胞的增殖，表明RBBP6基因是原癌基因，可作為腫瘤治療的靶點。發明人進一步合成和測試了多種針對RBBP6基因的siRNA，篩選出了可有效抑制RBBP6的表達進而抑制人結直腸腫瘤細胞RKO和人肝臟腫瘤細胞SMMC-7721進程的siRNA，在此基礎上完成了本發明。本發明提供了一系列幹擾人RBBP6基因的小幹擾RNA(SiRNA)序列，構建了可特異性沉默RBBP6基因表達的慢病毒。本發明研究發現，針對人RBBP6基因設計的小幹擾RNA及RNA幹擾慢病毒，穩定並特異地下調RBBP6基因的表達，並有效地抑制人腫瘤細胞的增殖。本發明表明RBBP6基因可促進腫瘤細胞生長，有望成為腫瘤早期診斷和治療的靶點。而且，通過RNA幹擾方式沉默RBBP6基因的表達，可作為抑制腫瘤發展的有效手段。本發明的設計思路為本發明通過如下方法來篩選獲得一種人RBBP6基因RNA幹擾慢病毒從Genbank中調取人RBBP6基因序列；預測siRNA位點；合成針對RBBP6基因的有效的siRNA序列，兩端含酶切位點粘端的雙鏈DNAOligo；慢病毒載體雙酶切後與雙鏈DNAOligo連接；構建表達RBBP6基因siRNA序列的RNA幹擾質粒及表達RBBP6基因的過表達質粒；將RNA幹擾質粒與RBBP6基因過表達質粒共轉染人胚腎細胞；Westernblot檢測這些RNA幹擾質粒對RBBP6基因的蛋白表達水平的抑制作用，並根據抑制作用結果篩選有效幹擾質粒；將篩選得到的RNA幹擾質粒和慢病毒包裝需要的輔助載體(PackingMix，Sigma-aldrich公司)共轉染人胚腎細胞^3T，產生重組慢病毒顆粒，即可製得高效沉默RBBP6基因的慢病毒。基於上述方法，本發明提供了172個幹擾RBBP6基因的有效靶點(具體如SEQIDΝ01-172所示)，構建了特異幹擾人RBBP6基因的慢病毒。同時本發明還公開一種人RBBP6基因RNA幹擾慢病毒(Lv-RBBP6_siRNA)及其製備與應用。本研究發現，利用慢病毒介導的RNA幹擾方法，在降低RBBP6基因在腫瘤細胞中的表達後，可以有效抑制腫瘤細胞的增殖和生長。本研究表明，RBBP6基因是一個原癌基因，可促進腫瘤細胞增殖，在腫瘤發生和發展中具有重要的生物學功能，RBBP6基因可以為腫瘤治療的靶標，慢病毒介導的RBBP6基因特異性沉默可作為腫瘤治療的一種新手段。下面結合實施例進一步闡述本發明。應理解，實施例僅用於說明本發明，而非限制本發明的範圍。實施例中未註明具體條件的實驗方法及未說明配方的試劑均為按照常規條件，如[美]Sambrook.J等著；黃培堂等譯。分子克隆試驗指南，第三版。北京科學出版社2002中所述的條件或者製造商建議的條件進行或配置。實施例1針對人RBBP6基因RNA幹擾慢病毒的製備1.篩選針對人RBBP6基因的有效的siRNA靶點從Genbank調取RBBP6(NM_006910.4,NM_018703.3,NM_032626.5)基因信息；利用上海吉凱基因化學技術有限公司的設計軟體Genechem設計針對RBBP6基因的有效的siRNA靶點。在RBBP6基因的編碼序列(⑶幻區域內(針對NM_006910.4的1041位至6419位鹼基)，每隔一個鹼基起始獲得21個鹼基的序列，表1列出了其中172條針對RBBP6基因的有效siRNA靶點序列。表1靶向於人RBBP6基因的siRNA靶點序列權利要求1.一種分離的人RBBP6基因小分子幹擾核糖核酸(SiRNA)靶序列，其中所述靶序列為SEQIDNO1-172中任意一條序列。2.包含權利要求1任一項的序列的核酸構建體。3.包含權利要求1任一項的序列的慢病毒。4.一種小分子幹擾核糖核酸(siRNA)，其包含正義RNA片段和反義RNA片段，所述正義RNA片段包含權利要求1的序列編碼的RNA序列，所述正義RNA片段和所述反義RNA片段能形成雙鏈RNA，該雙鏈RNA能抑制人RBBP6基因的表達。5.如權利要求4所述的小分子幹擾核糖核酸，其中，所述正義RNA片段和反義RNA片段存在於兩條不同的RNA鏈上或者存在於同一條RNA鏈上。6.如權利要求5所述的小分子幹擾核糖核酸，其中，所述核糖核酸為髮夾型單鏈RNA分子，其中正義RNA片段和反義RNA片段之間的互補區域形成雙鏈RNA區域。7.權利要求4-6任一項所述的小分子幹擾核糖核酸，其中正義RNA片段和反義RNA片段的長度為15-27個核苷酸。8.根據權利要求7所述的小分子幹擾核糖核酸，其中正義RNA片段和反義RNA片段的長度為19-23個核苷酸。9.根據權利要求8所述的小分子幹擾核糖核酸，其中正義RNA片段和反義RNA片段的長度為19、20或者21個核苷酸。10.權利要求1-9任一項在製備或篩選抗腫瘤藥物中的應用。11.根據權利要求10所述的應用，所述腫瘤選自結直腸癌或肝癌。12.人RBBP6基因在製備或篩選腫瘤的藥物或製劑中的應用。13.如權利要求12中所述人RBBP6基因的應用，其特徵在於，所述人RBBP6基因作為針對腫瘤細胞的作用靶標應用於製備或篩選腫瘤的藥物或製劑。14.如權利要求13中所述人RBBP6基因的應用，其特徵在於，所述針對腫瘤細胞的作用靶標為RNA幹擾作用靶標。15.如權利要求12-14中任一所述人RBBP6基因的應用，其特徵在於，所述的製備或篩選腫瘤的藥物或製劑中，含有人RBBP6基因的RNA幹擾慢病毒。全文摘要本發明涉及一組針對人RBBP6基因的siRNA、其核酸構建體、表達該siRNA的慢病毒載體及慢病毒、以及它們的應用。選取人RBBP6基因編碼區的序列作為siRNA的靶位點，根據靶位點中連續的10-30(優選15-27，更優選19-23)個鹼基序列設計siRNA。通過基因克隆，獲得表達上述siRNA的核酸構建體及慢病毒。細胞實驗證明，上述siRNA能夠序列特異性降低人RBBP6基因的表達並能夠有效抑制腫瘤細胞的增殖。文檔編號A61K48/00GK102229928SQ20111012141公開日2011年11月2日申請日期2011年5月11日優先權日2011年5月11日發明者曹躍瓊,朱向瑩申請人:上海吉凱基因化學技術有限公司