兩種抗HER2抗體‑毛殼素偶聯物及其製備方法和抗腫瘤應用與流程

2023-12-10 07:46:57

本發明涉及生物技術和藥物領域，具體地說，是兩種抗her2抗體-毛殼素偶聯物及其製備方法和抗腫瘤方面應用。
背景技術：
：人表皮生長因子受體2(her2)是具有酪氨酸激酶活性的表皮生長因子受體家族的一個成員。受體的聚合作用會導致受體酪氨酸殘基的磷酸化，並啟動多種信號通路導致細胞增殖和腫瘤發生，主要在乳腺癌中高度表達。her2基因的過表達不僅與腫瘤的發生發展相關外，還是一個重要的臨床治療監測及預後指標，並且是腫瘤靶向治療藥物選擇的一個重要靶點。對於該靶點的研究相對成熟，且已有針對該基因過度表達的藥物赫賽汀(herceptin)即曲妥珠單抗trastuzumab。曲妥珠單抗是一種重組dna衍生的人源化單克隆抗體，可選擇性地作用於人表皮生長因子受體-2(her2)的細胞外部位，阻斷信號通路，抑制腫瘤細胞的生長，赫賽汀還可以刺激自身的免疫細胞去摧毀癌細胞，僅對her2高表達的腫瘤有效。帕妥珠單抗也是一種通過生物技術方法生產的人源化單克隆抗體，通過結合her2，阻滯her2與其它her受體的雜二聚，抑制了與腫瘤生長相關的下遊信號傳導過程；與曲妥珠單抗所結合的表位不同，對低、中表達her2的腫瘤也有效。多硫代二酮哌嗪(epipolythiodioxopiperazines，etps)是一類主要由海洋真菌產生的重要活性次級代謝產物，其結構特徵為二酮哌嗪母核中含有硫橋。etps具有廣泛的生物活性，例如抗增殖、細胞毒、免疫抑制、抗病毒以及抗菌等，其中多種化合物更是展示出很高抗腫瘤活性。毛殼素(+)-chaetocin是etp領域一個「明星分子」，最早被發現於海洋真菌chaetroniumminutum的代謝產物中，近年來科學家圍繞該分子的抗腫瘤活性進行了大量研究，顯示該化合物具有組蛋白賴氨酸特異性甲基轉移酶(hkmts)抑制作用，可強烈抑制腫瘤細胞的生長。(+)-chaetocin的良好活性與其本身具有的二硫鍵也有較大關係，可能能夠以類似烷化劑的作用方式修飾靶細胞蛋白，阻斷諸多細胞通路進而導致腫瘤細胞死亡。抗體偶聯藥物是由單克隆抗體(mab)和強效毒性藥物通過生物活性連接器(linker)偶聯而成，它兼具了化學藥物和抗體藥物各自的優點，通過高效特異的抗原抗體反應，攜帶抗腫瘤藥物直達靶標，抗體內吞進入細胞，在溶酶體內再進一步降解並釋放藥物達到殺傷腫瘤細胞的目的。細胞毒性藥物用作adcs藥物的彈頭，承擔殺傷腫瘤細胞、發揮adcs療效的主要功能，是adcs的重要組成部分。近年來臨床中候選藥物彈頭高度集中於海兔毒素，美登素等藥物，尋找出新的藥物彈頭對adcs藥物的發展推進有重要的意義，而海洋天然產物是抗腫瘤活性物質的重要來源，具有很高的研究和開發價值，且目前尚無關於將trastuzumab和pertuzumab與其他海洋毒素偶聯，來治療her2介導的疾病的報導。技術實現要素：本發明的目的在於提供兩種抗her2抗體-毛殼素偶聯物及其製備方法和抗腫瘤方面應用。本發明的第一方面，提供兩種抗her2抗體-毛殼素偶聯物(t-l-c或p-l-c)，其結構式如下所示：其中，mab指曲妥珠單抗trastuzumab或帕妥珠單抗pertuzumab，經蛋白酶敏感型纈氨酸-瓜氨酸連接基(vc)與海洋毒素毛殼素(+)-chaetocin連接。即，所述的抗her2抗體-毛殼素偶聯物分別為：一種具有以下結構式的抗her2抗體-毛殼素偶聯物trastuzumab-vc-chaetocin，即t-l-c：其中，抗her2抗體為選擇性作用於her2胞外區的曲妥珠單抗trastuzumab，trastuzumab經蛋白酶敏感型纈氨酸-瓜氨酸連接基(vc)與毛殼素(+)-chaetocin連接，式中的n代表藥物抗體偶聯比，所述的藥物抗體偶聯比n的範圍為1-8。優選的，所述的t-l-c中藥物抗體偶聯比n的範圍為1-2，即每個trastuzumab抗體分子偶聯1-2個(+)-chaetocin分子。一種具有以下結構式的抗her2抗體-毛殼素偶聯物pertuzumab-vc-chaetocin，即p-l-c：其中，抗her2抗體為her雜二聚化抑制劑帕妥珠單抗pertuzumab，pertuzumab經蛋白酶敏感型纈氨酸-瓜氨酸連接基(vc)與毛殼素(+)-chaetocin連接，式中的n代表藥物抗體偶聯比，所述的藥物抗體偶聯比n的範圍為1-8。優選的，所述的p-l-c中藥物抗體偶聯比n的範圍為1-2，即每個pertuzumab抗體分子偶聯1-2個(+)-chaetocin分子。本發明的第二方面，提供一種帶連接基藥物分子的製備方法，即vc-chaetocin，包括以下步驟(合成路徑見圖1)：(a)將毛殼素(+)-chaetocin與n,n-二異丙基乙胺混合溶解在n,n-二甲基甲醯胺中，在室溫氮氣保護下攪拌20min；取馬來醯亞胺修飾的纈氨酸-瓜氨酸二肽和n,n-二異丙基乙胺加入到反應液中，室溫下攪拌過夜；(b)反應完畢後加入三氟乙酸和乙酸淬滅反應液，油泵減壓濃縮，矽膠柱層析純化得到棕黃色固體，該固體即為所述帶連接基藥物分子。所述帶連接基藥物分子vc-chaetocin的部分合成反應條件參考專利文獻wo/2006/060533(conjugatesof1,8-bis-naphthalimideswithanantibody)；製備方法得到的帶連接基藥物分子vc-chaetocin尚無相關報導。本發明的第三方面，提供上述的抗her2抗體-毛殼素偶聯物(t-l-c或p-l-c)的製備方法，包括以下步驟：(a)利用sephadexg-25脫鹽柱將曲妥珠單抗或帕妥珠單抗原液置換為磷酸鹽反應緩衝液，超濾管濃縮調整抗體濃度，製備曲妥珠單抗或帕妥珠單抗抗體。由於原液ph值不是後面偶聯藥物的最優條件，且原液溶液中可能含有其他幹擾反應的物質，通過置換溶液，並用超濾管濃縮除去體系中的小分子及其他分子量小於30kda的雜質分子。(b)向抗her2抗體緩衝液中加入三(2-羧乙基)膦(tcep)，進行還原反應。由於抗her2抗體表面可反應的半胱氨酸最初是以鏈間二硫鍵的形式存在，因而不存在游離的半胱氨酸和連接基藥物分子vc-chaetocin偶聯，所以在與藥物分子偶聯前，需要將單抗鏈間二硫鍵還原打開得到游離狀態的半胱氨酸巰基。常見的二硫鍵還原劑為二硫蘇糖醇(dtt)，因dtt中含有巰基會與馬來醯亞胺修飾的纈氨酸-瓜氨酸二肽反應，這裡優選三(2-羧乙基)膦(tcep)，且tcep在水溶液中的穩定性和溶解性都很好；所述緩衝液為ph7.4的pbs緩衝液；tcep與抗her2抗體的摩爾比為12:1；所述還原反應的條件優選為：37℃水浴反應1.5h。(c)過sephadexg-25脫鹽柱純化被還原的單抗，加入合成得到的帶連接基的毛殼素(+)-chaetocin混合，進行偶聯反應。作為優選，所述連接基為馬來醯亞胺修飾的纈氨酸-瓜氨酸二肽。(其合成方法參考文獻：dubowchik,g.m.,firestone,r.a.,padilla,l.,etal.cathepsinb-labiledipeptidelinkersforlysosomalreleaseofdoxorubicinfrominternalizingimmunoconjugates:modelstudiesofenzymaticdrugreleaseandantigen-specificinvitroanticanceractivity[j].bioconjugatechemistry,2002,13(4):855-869.)。帶連接基的毛殼素(+)-chaetocin與抗her2抗體的摩爾比為10:1，所述偶聯反應的溫度優選為冰浴反應1.5h。(d)反應完成後，加入半胱氨酸溶液淬滅反應，過脫鹽柱純化，超濾管濃縮得到所述抗her2抗體-毛殼素偶聯物。所述加入的半胱氨酸為20倍過量摩爾比的20mm溶液，淬滅反應優選為冰浴下45min；由於本發明抗her2抗體-毛殼素偶聯物的分子量均大於140kda，而反應體系中存在的其他分子的分子量均小於2kda，採用脫鹽柱除去體系中的小分子，並用超濾管濃縮抗體，得到所述的抗her2抗體-毛殼素偶聯物。本發明的第四方面，提供上述的抗her2抗體-毛殼素偶聯物(t-l-c或p-l-c)在製備腫瘤治療藥物中的應用。優選的，所述的腫瘤為胃癌、肺癌、肝癌或乳腺癌。優選的，所述的腫瘤為her2陽性腫瘤。本發明的抗her2抗體-毛殼素偶聯物與未偶聯藥物的抗her2抗體相比，對her2陽性腫瘤細胞具有較高的親和力和較明顯的殺傷力。優選的，所述her2陽性腫瘤細胞為胃癌細胞sgc-7901，肺癌細胞nci-h460，肝癌細胞smmc-7721以及三種乳腺癌細胞skbr-3，au565及mba-md-231。更優選的，所述的her2陽性腫瘤細胞是乳腺癌細胞skbr-3，au565。本發明的有益效果為：1、本發明偶聯物具有抗her2抗體和(+)-chaetocin兩者的生物學功能，既具有trastuzumab或pertuzumab抗體對腫瘤細胞的殺傷能力，又具有(+)-chaetocin對組蛋白賴氨酸特異性甲基轉移酶(hkmts)的抑制作用，以及類似烷化劑的作用方式修飾靶細胞蛋白，在二者的協同作用下，表現出明顯的抗腫瘤效果；2、本發明偶聯物通過抗her2單抗與腫瘤細胞表面的her2受體特異結合，發生內吞作用將(+)-chaetocin轉運到腫瘤細胞內釋放發揮作用。本發明製備的抗體偶聯物對her2陽性細胞具有靶向作用，既可以增強對her2陽性腫瘤細胞的殺傷，也可減少(+)-chaetocin單獨給藥對正常細胞產生的毒副作用，對her2陽性表達的腫瘤細胞引起的癌症有巨大潛在治療應用價值。附圖說明圖1.本發明的連接基藥物分子vc-chaetocin的合成路徑；圖2.偶聯物t-l-c經還原後hplc分析圖：(a)trastuzumab；(b)t-l-c；圖3.偶聯物p-l-c經還原後hplc分析圖：(a)pertuzumab；(b)p-l-c；圖4.各濃度(+)-chaetocin對不同腫瘤細胞的增殖抑制作用(48h)；圖5.各濃度trastuzumab和t-l-c對不同細胞的抑制作用比較(72h)；圖6.各濃度pertuzumab和p-l-c對不同細胞的抑制作用比較(72h)；圖7.各濃度p-l-c和t-l-c對同種乳腺癌細胞的抑制作用(72h)比較(t檢驗：*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001)；圖8.p-l-c和t-l-c對不同乳腺癌細胞的抑制作用(72h)比較(t檢驗：*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001)。具體實施方式下面結合實施例對本發明提供的具體實施方式作詳細說明。實施例1：vc-chaetocin帶連接基藥物分子的製備製備步驟如下：(1)將毛殼素(+)-chaetocin15mg(0.022mmol)與n,n-二異丙基乙胺16.5μl(0.100mmol)，2.4mln,n-二甲基甲醯胺混合在室溫氮氣保護下磁力攪拌20min後，取馬來醯亞胺修飾的纈氨酸-瓜氨酸二肽37mg(0.050mmol)和n,n-二異丙基乙胺17μl(0.103mmol)加入到反應液中，室溫下攪拌過夜；(2)tlc監測反應完畢，0.40ml1.3m三氟乙酸和0.60ml乙酸淬滅反應液，油泵減壓旋蒸濃縮，矽膠柱層析純化，洗脫劑為二氯甲烷：甲醇＝6:1，得到棕黃色固體產物6-l-c6.8mg，收率：24.4％。1hnmr(500mhz,cd3od)δh(ppm):8.08(d,j＝6.0hz,2h,-ch＝ch-),7.57-7.30(m,10h,arh),6.76(d,j＝6.0hz,2h,arh),4.59-4.51(m,8h,-ch2o-,-ch-,-nhchco-),4.23-4.16(m,2h,-ch2-),3.52(t,j＝7.5hz,2h,-ch2n-),3.12(s,6h,-nch3),2.76-2.69(m,2h,-ch2nhco-),2.31-2.19(m,5h,-ch(ch3)2,-ch2-),1.64-1.58(m,6h,-ch2co-,-ch2-),1.35-1.31(m,6h,-ch2-),0.99-0.97(m,6h,-ch(ch3)2).esi-ms[(m+na)+]m/z:1317.3。本發明帶連接基藥物分子vc-chaetocin的合成路徑如圖1所示。實施例2：抗her2抗體-毛殼素偶聯物(t-l-c或p-l-c)的製備t-l-c偶聯物的製備方法包括：(1)通過sephadexg-25脫鹽柱將曲妥珠單抗原液(20mg/ml)置換為pbs反應緩衝液(ph7.4)，並用超濾管濃縮單抗調整濃度至10mg/ml；(2)取500μl(10mg/ml)曲妥珠單抗溶液，加入12倍過量摩爾比的20mmtcep溶液21μl，在37℃下孵育1.5h；(3)用含1mmdtpa的pbs過脫鹽柱，純化被還原的單抗，在冰浴條件下向單抗溶液中加入10倍過量摩爾比的5.38mm6-l-c溶液64μl，靜置反應1.5h；(4)加入20倍過量摩爾比的20mm半胱氨酸溶液35μl，靜置45min，pbs過脫鹽柱，超濾管濃縮至500μl，得到抗體偶聯藥物t-l-c(8.3mg/ml)。p-l-c偶聯物的製備方法包括：(1)通過sephadexg-25脫鹽柱將帕妥珠單抗原液(10mg/ml)置換為pbs反應緩衝液(ph7.4)，並用超濾管濃縮單抗調整濃度至8mg/ml；(2)取500μl(8mg/ml)帕妥珠單抗溶液，加入12倍過量摩爾比的20mmtcep溶液17μl，在37℃下孵育1.5h；(3)用含1mmdtpa的pbs過脫鹽柱，純化被還原的單抗；在冰浴條件下向單抗溶液中加入10倍過量摩爾比的5.38mm6-l-c溶液51μl，靜置反應1.5h；(4)加入20倍過量摩爾比的20mm半胱氨酸溶液27μl，靜置45min，pbs過脫鹽柱，超濾管濃縮至500μl，得到抗體偶聯藥物p-l-c(5.2mg/ml)。trastuzumab和pertuzumab單抗的半胱氨酸巰基與vc-chaetocin的馬來醯亞胺基團發生烷基化反應，變成了偶聯不同個數chaetocin的偶聯物。單克隆抗體和(+)-chaetocin有不同的最大吸收波長，但(+)-chaetocin的最大吸收波長在302nm左右，在此處抗體也有吸收，所以對t-l-c和p-l-c在280nm處進行hplc分析，同時以trastuzumab和pertuzumab單抗為參照，觀察保留時間和峰形的變化。純抗體經還原後，在280nm處會有輕鏈(圖2a，3a峰1)、重鏈(圖2a峰2，3a峰3)兩個主峰；偶聯(+)-chaetocin後，如圖2b和圖3b，輕重鏈的出峰時間和峰形都發生明顯的變化，由於兩種單抗的結構組成不同，藥物接上的位置個數不同對抗體極性、分子量等方面的影響也不同，所以輕重鏈出峰時間會有所差異，如曲妥珠單抗在接上藥物分子後出峰時間推遲。由hplc分析顯示抗體已偶聯上(+)-chaetocin，但偶聯上的藥物個數較少。本實驗中偶聯物的濃度測定：採用紫外分光光度法，測定在280nm處的紫外吸收值，通過朗伯比爾定律計算抗體的濃度。本實驗中偶聯比的測定方法：測定偶聯比是指測定每個單抗分子上接有小分子藥物的個數，即偶聯物中藥物與抗體的摩爾比。可採用紫外分光光度法和ellman-bca法兩種方法測定。紫外分光光度法：利用紫外分光光度計測定抗體和藥物分子最大吸收波長處的吸光度，繪製出280nm和302nm處的標準曲線，然後通過測定抗體偶聯藥物在兩波長處的吸光度，根據朗伯比爾定律計算出抗體和藥物分子的量，求得(+)-chaetocin/抗體比。ellman-bca法：ellman『s試劑可用於比色法測定生物樣品中的自由巰基含量，bca法是常用的蛋白濃度定量方法，，靈敏度高，取量少，操作簡單，形成的顏色複合物穩定性好；偶聯物通過還原劑將二硫鍵打開變成游離的巰基，然後利用ellman法計算出未反應巰基的含量，再結合bca法確定偶聯物濃度計算偶聯比。通過兩種方法得到的偶聯比具有很好的一致性，結果如表1所示。表1兩種測定偶聯比方法結果對比樣品t-l-cp-l-ca280(nm)0.6640.397a302(nm)0.0720.060dar(uv法)1.811.89a412(nm)0.0220.011a570(nm)0.5580.416dar(ellman-bca法)1.791.86實施例3：體外細胞增殖測定生物活性實驗在本實施例中，研究了毛殼素(+)-chaetocin對各腫瘤細胞系增殖的作用；以her2陽性細胞skbr-3、au565，her2陰性細胞mba-md-231和正常細胞hacat為對象，測定trastuzumab、pertuzumab單抗和t-l-c、p-l-c偶聯物的生物學活性。本實施例採用cck-8試劑來評價藥物的抗增殖作用。試劑的主要成分是水溶性四唑鹽wst-8，wst-8被細胞內脫氫酶生物還原後生成橙黃色水溶性的甲臢(formazan)，生成的甲臢量與活細胞數量成線性相關。本實施例選擇的細胞系有：胃癌細胞sgc-7901，肺癌細胞nci-h460，肝癌細胞smmc-7721，乳腺癌細胞skbr-3，au565，mba-md-231以及人正常永生化角質形成細胞hacat。本實驗首先研究了毛殼素(+)-chaetocin對各腫瘤細胞系增殖的作用。sgc-7901、nci-h460、au565細胞在含10％胎牛血清的1640培養基中，smmc-7721、mba-md-231細胞在含10％胎牛血清的dmem培養基中，skbr-3細胞在含10％胎牛血清的mccoy’s5a培養基中，於37℃，5％co2培養箱中培養；六種細胞分別以6×103-8×103個細胞每孔的密度接種至96孔板，100μl/孔，培養24h後，吸出96孔板中原有培養基，加入不同濃度的培養液稀釋的毛殼素(+)-chaetocin，100μl/孔，每個濃度設復孔，並設相應濃度的溶媒對照及無細胞培養基孔，37℃，5％co2培養箱中培養48h後，每孔加10μlcck-8，37℃，5％co2培養箱中培養40-60min，測定450nm下的od值，並計算毛殼素(+)-chaetocin對各種細胞的ic50值(μm)。計算結果如表2所示，對各腫瘤細胞的增殖抑制作用如圖4。表2毛殼素(+)-chaetocin對個細胞的ic50值(μm)由表2及圖4可見，毛殼素(+)-chaetocin對各腫瘤細胞都有明顯的殺傷作用，可以用作抗體偶聯藥物的藥物彈頭。本實驗使用純單抗trastuzumab、pertuzumab以及得到的兩種偶聯物t-l-c、p-l-c對兩種her2過表達的腫瘤細胞系進行了體外細胞培養增殖作用的研究，同時也對her2陰性腫瘤細胞及正常細胞進行了體外細胞培養增殖作用的研究。au565細胞在含10％胎牛血清的1640培養基中，mba-md-231、hacat細胞在含10％胎牛血清的dmem培養基中，skbr-3細胞在含10％胎牛血清的mccoy’s5a培養基中，於37℃，5％co2培養箱中培養；四種細胞分別以6×103-8×103個細胞每孔的密度接種至96孔板，100μl/孔，培養24h後，吸出96孔板中原有培養基，加入不同濃度的培養液稀釋的trastuzumab、pertuzumab、t-l-c或p-l-c(0.1μm孔徑的無菌濾膜過濾除菌)，100μl/孔，每個濃度設復孔，並設相應濃度的溶媒對照及無細胞培養基孔，37℃，5％co2培養箱中培養72h後，每孔加10μlcck-8，37℃，5％co2培養箱中培養1-2h，測定450nm下的od值，對各細胞的增殖抑制作用比較如圖5、6、7、8所示。由圖5和6可見，將(+)-chaetocin偶聯到抗體上後，與純單抗進行比較，t-lc和p-l-c對her2高表達的兩種乳腺癌細胞的殺傷能力都強於未接藥物的trastuzumab和pertuzumab單抗，而對her2陰性細胞mba-md-231和正常細胞hacat都沒有明顯的抑制作用，表明偶聯物只特異性殺傷her2陽性細胞。由圖7所示，比較兩種不同adc藥物對同種乳腺癌細胞的抑制作用，p-l-c的抑制作用都強於t-l-c，p-l-c和t-l-c接上藥物個數相近，但活性表現有差異，可能是由於pertuzumab和trastuzumab結構及作用機制不同，或pertuzumab在接上(+)-chaetocin後的內吞能力強於trastuzumab，具體機制有待進一步研究。由圖8所示，不管是t-l-c還是p-l-c，對這兩種來源相同(同一病灶，轉移性乳腺癌)的乳腺癌細胞都有明顯的抑制作用，說明所得到的偶聯物對這一類乳腺癌都有較好的抑制效果；t-l-c對兩種乳腺癌細胞的活性表現在各濃度段都存在差異，p-l-c對兩種乳腺癌的活性表現在高濃度段的差異較明顯。綜上所述，本發明所述的抗her2抗體-毛殼素偶聯物t-l-c和p-l-c具有明顯的抗腫瘤活性，且具有良好的靶向性，能將小分子毒性藥物轉運到腫瘤部位，提供了一種新型的用於治療her2陽性的轉移性乳腺癌細胞的抗體偶聯藥物。以上已對本發明創造的較佳實施例進行了具體說明，但本發明創造並不限於所述實施例，熟悉本領域的技術人員在不違背本發明創造精神的前提下還可做出種種的等同的變型或替換，這些等同的變型或替換均包含在本申請權利要求所限定的範圍內。當前第1頁12