一種用於評價中藥複方治療膿毒症藥效的新方法
2023-12-10 05:02:56 1
專利名稱：一種用於評價中藥複方治療膿毒症藥效的新方法
技術領域：
本發明涉及中藥複方的藥效評價方法。
背景技術：
膿毒症是嚴重創傷、燒傷、休克、大手術後常見的併發症，是創傷、燒傷等危重患者重要的死亡原因之一，也是I⑶病房病人死亡的第一大原因[1]。流行病學調查顯示，美國 1995年有75萬例膿毒症發生，其中有21萬例死亡；法國2001年有6萬例膿毒症患者死亡。我國每年患各種感染病人達2億人次，發熱病人達3億人次，全身炎症反應症候群病人達3000萬人次。每年膿毒症病人超過300萬人，因此造成多髒衰的死亡人數高達50萬人以上。儘管對其治療給予巨大的投資，嚴重膿毒症的病死率仍居高不下，病死率始終徘徊在 28%到50%之間。更為嚴重的是，在最近20年中，嚴重膿毒症的發生率增加了 75%，其發病率增高的原因尚不十分清楚，可能與免疫抑制病人增多、侵入性治療檢查的增加、微生物耐藥、老年人人口的增長有關。有關專家預計，隨著人口老齡化的進程，到2020年，僅在美國每年就會有100萬例以上膿毒症病例發生[2_1(|]。因為膿毒症可以形成膿毒性休克液可以造成多個功能衰竭而引起死亡。膿毒症問題具有全球性的威脅和挑戰，其平均治療費用很高，美國約為2. 2萬美元/例，年耗資近200 個億，歐洲年耗資近100億，隨著發病率的激增，對國民經濟的發展也是一個沉重負擔。膿毒症的臨床治療一直主要依靠液體復甦、廣譜抗生素、低劑量糖皮質激素、血糖控制、活化蛋白C等支持療法。對於膿毒症的治療，國際膿毒症聯席會雖然推出了 「2004 嚴重膿毒症和膿毒症休克治療指南」，但其實際上並沒有創新的治療方法，只是對現行的一些治療方法的總結或重新評估，旨在為臨床醫生提供治療嚴重膿毒症或膿毒性休克的指南，有助於改善患者預後，但要真正實現2002年巴塞隆納宣言中「降低25 %死亡率」的目標尚有距離。總的來說，目前對膿毒症的治療效果還非常差。由於過度炎症反應是膿毒症的重要特徵，一直以來，現代醫學的治療策略一直針對促炎因子。人們曾試用抗內毒素抗體、抗TNF-α抗體、IL- 1受體拮抗劑、磷脂酶A2拮抗劑、PAF拮抗劑、抗氧化劑、凝血酶抑制劑、皮質激素、Y-幹擾素、粒細胞集落刺激因子 (GM-CSF)等治療，儘管某些治療在實驗動物中取得良好效果，但在病人中未能提高治癒率及生存率。中醫沒有膿毒症的概念，但自春秋戰國時的《黃帝內經》至漢代張仲景的《傷寒論》 與六經辨證，清代葉天士的《溫熱論》與衛氣營血辨證，都是以急性感染性疾病而論著，且幾千年來治療了大量病人，積累了豐富的經驗。根據其臨床特點，中醫學可將其歸屬於傷寒、 溫病的範疇。可以說幾千年的中醫學發展歷史中始終貫穿著對「膿毒症」的研究，即中醫學在治療膿毒症方面積累了豐富的經驗。自上個世紀70年代，國內以王今達教授、王寶恩教授等為代表開展的中西醫結合治療本病的臨床與基礎研究，國內北京友誼醫院、北京中醫藥大學東直門醫院、天津市第一中心醫院、天津市中西醫結合急腹症研究所等單位，對膿毒症的中西醫結合診治進行了深入研究，取得了由單純西醫治療的效果，並總結出了對膿毒症的病機和中醫治法的認識、制訂出了中西醫結合診療標準及規範，總結篩選出多個具有良好療效的中藥複方，顯示出中醫藥治療膿毒症具有潛在的優勢[11_22]。雖然，目前臨床上所採用的中藥複方顯示了良好的治療效果，但由於目前卻沒有客觀有效的中藥複方藥效學評價方法，故無法知道所用複方是否是最佳的，也無法進行進一步的藥物開發研究。因此，從中醫藥理論及其用藥原則出發，結合現代科學技術，重新建立一種與中藥複方的多成分、多途徑、多靶點的特徵相適應的新的藥效評價模式是本發明的出發點。在此處鍵入技術領域描述段落。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種新的中藥複方治療膿毒症的藥效評價方法。本發明所指的動物模型是大鼠膿毒症模型。本發明所指的評價指標是血漿內源性總代謝產物的變化規律。本發明所用的測定技術是氫核磁共振。本發明所指的數據處理方法是主成分分析和最小偏二乘法
本發明涉及大鼠膿毒症模型，樣品採集、處理，氫核磁共振測定、數據處理和分析以及結果判斷方式由下述方式完成。1.大鼠膿毒症模型的製作
模型組以健康Wistar大鼠9隻，雌雄各半，體重210 230g。實驗前1 禁食、不限水，實驗時以10%水合氯醛按lml/kg劑量進行腹腔注射麻醉，無菌條件下開腹，分離盲腸， 在距其末端2cm處以1號絲線結紮，再用18號針頭在盲腸末端穿孔2處，將盲腸放回腹腔後逐層關腹造模。正常組以健康Wistar大鼠9隻，雌雄各半，體重210 230g。實驗前12h禁食、 不限水，實驗時以10%水合氯醛按lml/kg劑量進行腹腔注射麻醉，無菌條件下開腹，逐層關腹。治療組以健康Wistar大鼠9隻，雌雄各半，體重210 230g。在造模後，分別給予方劑流浸膏的蒸餾水稀釋藥液灌胃，劑量為24g生藥/kg、12g生藥/kg、6g生藥/kg，每日 1次，連續72h。2.樣品的採集處理
正常組、模型組、中藥複方治療組分別進行腹主動脈取血。血液經高速低溫離心(轉速15, OOOrpm ；時間10分鐘；溫度:4°C )。取上清400 1，添加200 1 0. 05%TSP重水溶液？ 5mm核磁共振樣品管中，混勻，於4 °C冰箱保存，備用。3.氫核磁共振測定
上述樣品在27°C的條件下，在Bruker AV 11-600 MHz核磁共振譜儀上，調用CPMG馳豫編輯脈衝序列。採用預飽和方式抑制水峰，飽和時間為^，譜寬8000Hz，採樣點數64k，累加次數1 次，預飽和頻率和中心頻率都在水峰位置，獲得自由衰減信號(FID信號)。FID信號經過傅立葉變換轉為一維NMR譜圖。以TSP為化學位移參考峰的位置，設為Oppm。分別從δ 10. 0-0. Oppm以每段0. 04ppm積分，去除δ 4. 8-4. 6水峰，以δ 2. 60-2. 64ppm作為積分標準1，將所有數據以表格EXCEL格式儲存。4.數據處理和分析
將EXCEL格式儲存的數據，先對每組數據進行歸一化處理，然後導入SIMPCA-11軟體， 啟動主成分分析模式進行分析。5.結果判斷方式
將獲得的各主成分分別為坐標進行二維圖形製作。將治療組的二維分布點區域與正常組的二維分布點區域和模型組二維分布點區域比較，如治療組回歸正常組局域，則判斷該中藥複方為有效；如治療組沒有回歸正常組局域，仍處於模型組局域，則判定該中藥複方為無效；如治療組沒有回歸正常組局域，也不同於模型組局域，則判定該中藥複方為有毒副作用。
圖1是實施例1正常組和模型組的大鼠血漿總代謝物的PCA分析結果圖示。圖2是實施例1正常組、模型組與清熱解毒方治療組血清總代謝物的模式識別分析結果圖示。圖3是實施例2正常組和模型組的大鼠血漿總代謝物的PCA分析結果圖示。圖4是實施例2正常組、模型組與清熱解毒方治療組血清總代謝物的模式識別分析結果圖示。
具體實施方式
實施方式1:
實驗以健康Wistar大鼠27隻，雌雄各半，體重210 230g，分為正常組、模型組、清熱解毒方治療組，每組9隻。模型組實驗前1 禁食、不限水，實驗時以10%水合氯醛按Iml/ kg劑量進行腹腔注射麻醉，無菌條件下開腹，分離盲腸，在距其末端2cm處以1號絲線結紮， 再用18號針頭在盲腸末端穿孔2處，將盲腸放回腹腔後逐層關腹造模。清熱解毒方治療組在造模後，分別給予方劑流浸膏的蒸餾水稀釋藥液灌胃，劑量為24g生藥/kg、12g生藥/kg、 6g生藥/kg，每日1次，連續72h。然後正常組、模型組、清熱解毒方治療組治療組分別進行腹主動脈取血。血液經高速低溫離心(轉速15，OOOrpm ；時間10分鐘；溫度4°C )。取上清400ml，添加200ml 0. 05%TSP重水溶液f5mm核磁共振樣品管中，混勻，於4 °C冰箱保存，上述樣品在27°C的條件下，在Bruker AV 11-600 MHz核磁共振譜儀上，調用CPMG 馳豫編輯脈衝序列。採用預飽和方式抑制水峰，飽和時間為^，譜寬8000Hz，採樣點數64k， 累加次數1 次，預飽和頻率和中心頻率都在水峰位置。FID信號經過傅立葉變換轉為一維NMR譜圖。以TSP為化學位移參考峰的位置，設為Oppm。分別從δ 10. 0-0. Oppm以每段 0. 04ppm積分，去除δ 4. 8-4. 6水峰，以δ 2. 60-2. 64ppm作為積分標準1，將所有數據以表格EXCEL格式儲存，用於模式識別分析。模式識別採用主成分分析(principal component analysis, PCA)。分析結果如下(分別用二維圖形直觀表示)。1.正常組和模型組的大鼠血漿總代謝物的PCA分析結果(見圖1)
圖1中的每個點都代表一個樣本(Δ正常組；+模型組)。可以看出，每個樣本並不重疊，說明樣本之間存在個體差異，與實際狀況一致。但正常組和模型組內的樣本分別相對集中，且樣本的組與組間有明顯的差異，說明樣本個體差異小於組間差異。實驗結果證明不同生理狀態下的總代謝物譜確實是不同的。2.正常組、模型組與清熱解毒方治療組血清總代謝物的模式識別分析結果(圖2): 從圖2中( 正常組；Δ模型組；+清熱方治療組)可以看出，模型大鼠經清熱解毒方
治療7 後，其中7個樣本的血漿總代謝物確實已基本回歸正常組區域，但尚未完全與正常組的樣本重合，說明該方在給藥7 後顯示了非常良好的治療效果，但尚未完全治癒。另一個樣本則處於既不同於正常組，也不同於模型組的第三方，說明該方對個別模型動物有毒副作用。可判斷清熱解毒方對膿毒症的有效率約為87. 5%的治療，至完全治癒尚需要延長治療時間。但該方有一定的毒副作用，需要進一步確定。
實施方式2:
實驗以健康Wistar大鼠27隻，雌雄各半，體重210 230g，分為正常組、模型組、涼血活血方治療組，每組9隻。模型組實驗前1 禁食、不限水，實驗時以10%水合氯醛按Iml/ kg劑量進行腹腔注射麻醉，無菌條件下開腹，分離盲腸，在距其末端2cm處以1號絲線結紮， 再用18號針頭在盲腸末端穿孔2處，將盲腸放回腹腔後逐層關腹造模。涼血活血方治療組在造模後，分別給予方劑流浸膏的蒸餾水稀釋藥液灌胃，劑量為24g生藥/kg、12g生藥/kg、 6g生藥/kg，每日1次，連續72h。然後正常組、模型組、清熱涼血活血方治療組治療組分別進行腹主動脈取血。血液經高速低溫離心(轉速15，OOOrpm ；時間10分鐘；溫度4°C )。 取上清400ml，添加200ml 0. 05%TSP重水溶液f5mm核磁共振樣品管中，混勻，於4°C冰箱保存，備用。上述樣品在27°C的條件下，在Bruker AV 11-600 MHz核磁共振譜儀上，調用CPMG 馳豫編輯脈衝序列。採用預飽和方式抑制水峰，飽和時間為^，譜寬8000Hz，採樣點數64k， 累加次數1 次，預飽和頻率和中心頻率都在水峰位置。FID信號經過傅立葉變換轉為一維NMR譜圖。以TSP為化學位移參考峰的位置，設為Oppm。分別從δ 10. 0-0. Oppm以每段 0. 04ppm積分，去除δ 4. 8-4. 6水峰，以δ 2. 60-2. 64ppm作為積分標準1，將所有數據以表格EXCEL格式儲存，用於模式識別分析。模式識別採用主成分分析(principal component analysis, PCA)。分析結果如下(分別用二維圖形直觀表示)。1.正常組和模型組的大鼠血漿總代謝物的PCA分析結果(見圖3)
圖3中的每個點都代表一個樣本(Δ正常組；+模型組)。可以看出，每個樣本並不重疊，說明樣本之間存在個體差異，與實際狀況一致。但正常組和模型組內的樣本分別相對集中，且樣本的組與組間有明顯的差異，說明樣本個體差異小於組間差異。2.正常組、模型組與涼血活血方治療組血清總代謝物的模式識別分析結果(圖4): 從圖4中可看出( 正常組；Δ模型組；+涼血方治療組)，模型大鼠經涼血活血方治療
7 後，8個治療樣本中有4個樣本，即50%樣本的血清漿總代謝物確實已回歸正常組，顯示了良好的治療效果，而另4個樣本(50%)樣本還處於模型組區域附近，但也顯示了向正常組區域回歸的趨勢，說明該方在給藥7 後，對膿毒症有50%的治療效果。在此處鍵入技術領域描述段落。
權利要求
1.一種中藥複方治療膿毒症的藥效評價方法，其內容包括(1)動物模型；(2)樣品採集；(3)測定方法；(4)數據處理和分析；(5)藥效判斷等部分。
2.如權利要求1中所述的(1)動物模型，動物可以為大鼠、小鼠、豚鼠、兔、犬、猴等；造模方法可以是本發明中的盲腸結紮穿孔法等手術法，也可以是藥物致模法；權利要求1中所述的(2)樣品採集，可以是本發明中的採集血漿，也可以是採集尿液、 糞便、唾液、或組織勻漿液。
3.如權利要求1中所述的(3)測定方法，可以是本發明中的氫核磁共振法，也可以是高速液相層析法、超高速液相層析法、毛細管電泳法，質譜法、以及以上技術的聯用方法， 如高速液相層析-氫核磁共振連用法，超高速液相層析-氫核磁共振連用法，高速液相層析-質譜連用法，超高速液相層析-質譜連用法，質譜-質譜連用法等。
4.如權利要求1中所述的(4)數據處理和分析，可以是本發明中的主成分分析法，也可以是PLS法，PLS-DA法，或者是採用各種數據過濾後的分析法。
5.如權利要求1中所述的(5)藥效判斷方法，主要是以治療後的內源性總代謝產物在以各種提取的主成分為坐標所作的二維或三維中樣品點分布區域，以正常和模型樣品點分布區域為基準進行比較，如治療後的樣品點分布區域回歸正常樣品點分布區域，可判定該藥為有效；如治療後的樣品點分布區域沒有回歸正常樣品點分布區域，仍處於模型樣品點分布區域，可判定該藥為無效；如治療後的樣品點分布區域既沒有回歸正常樣品點分布區域，又與模型樣品點分布區域不同，可判定該藥為有毒副作用。
全文摘要
本發明涉及中藥複方治療膿毒症的藥效評價方法。以膿毒症模型大鼠為對象，以其血漿中的總代謝產物為分析對象，以1H-NMR為檢測手段，採用主成分分析或最小偏二乘法為數據處理方法，以正常組、模型組和治療組的血漿中總代謝產物的變化規律為指標，以治療後的血漿中總代謝產物是否回歸正常判斷中藥複方是否具有藥效的方法。
文檔編號G01N33/15GK102183618SQ20111005214
公開日2011年9月14日 申請日期2011年3月4日 優先權日2011年3月4日
發明者劉洪斌, 吳鹹中, 李雲志, 李文華, 羅喬奇, 黃連, 黃靜 申請人:四川大學