獲得轉基因硬質強筋小麥的方法及其專用表達載體的製作方法

2023-12-10 04:11:06 3

專利名稱：：獲得轉基因硬質強筋小麥的方法及其專用表達載體的製作方法
技術領域：
：本發明涉及獲得轉基因硬質強筋小麥的方法及其專用表達載體。
背景技術：
：籽粒硬度決定小麥的出粉率、澱粉顆粒的損傷程度和烘烤品質，是小麥品質改良的重要目標性狀，是衡量小麥品質優劣、貿易價格和最終用途的重要指標(Dubreil，L.S.Meliande，H.Chiron，J.P.，Compoint，L.，Quillien，G，，Branlard，D.andMarion，D.(1998)EffectofPuroindolinesonthebreadmakingpropertiesofwheatflour.CerealChem.75222-229)。控制硬度的主效基因pinA和pinB位於染色體5D短臂上，軟質對硬質為顯性。PINA和PINB統稱為富色氨酸蛋白(Puroindoline)共同作用形成脆弱蛋白(Friabilin)，從而影響籽粒質地的形成。當pinA和pinB基因為野生型時，小麥籽粒為軟質；當pinA不表達(PinA-D1a)或pinB(PinB-D1a)發生任何一種已報導的8種類型的突變，小麥籽粒則表現為硬質。Friabilin蛋白作為硬度的生化標記，在軟質麥水洗澱粉(water-washedstarch)表面含量較多，在硬質麥水洗澱粉表面含量較少，在硬粒小麥水洗澱粉表面不存在。KonduruKrishnamurthy和MichealJ.Giroux(KonduruKrishnamurthy，MichealJ.Giroux.2001.Exprssionofwheatpuroindolinegenesintransgenicriceenhancegrainsofness.NatureBiotechnology.19162-166)將pinA和pinB轉入不含有此基因的水稻(OryzasativaL.)，轉基因水稻的籽粒質地發生變化；Giroux等將野生型的pinB-D1a轉入攜帶pinB-D1b的硬質小麥『Hi-line』，轉基因植株表現出軟質，水洗澱粉中Friabilin含量增加明顯，籽粒硬度、破損澱粉顆粒數明顯減小。Hogg等將野生型的pinA-D1a和pinB-D1a分別和共同轉入硬質小麥『Hi-line，發現Friabilin的含量取決於野生型PINA和PINB的多少，而與Puroindoline總量無直接關係。目前，已報導的轉基因技術只限於將Puroindoline基因的野生序列轉入二倍體水稻和pinB-D1b小麥，獲得籽粒軟質的轉基因植株。通過控制Puroindoline的表達來改善提高穀物作物的籽粒硬度，目前尚未見報導。目前，我國生產上推廣種植的中優9507(pinB-D1b)、京9428和內鄉188等優質小麥品種，它們的蛋白質含量和麵筋強度均達到一級麵包小麥水平，只是因為其硬度不夠，大大降低了其加工品質和商業價值。通過常規育種方法很難在短時間內獲得硬質、高蛋白、強筋的優質麵包小麥品種。花粉管通道法介導的遺傳轉化方法已成功應用於不同植物的轉基因研究，並已經在我國的轉基因抗蟲棉培育中發揮了重要作用。和其他轉化方法相比，花粉管通道法在小麥遺傳轉化中，不受受體基因型和愈傷分化能力的限制，且避免了組織培養過程中所存在的體細胞變異，以其快速、簡便、成本低廉，而逐步得到重視和應用。但轉化時間、轉化載體的DNA濃度及受體植株花粉發育狀態均直接影響其轉化成功率和效率，致使不少嘗試者望而卻步。因此，花粉管通道法介導的遺傳轉化還需要在應用實踐中進一步優化和規範轉化程序，提高其可重複性和轉化效率。
發明內容本發明的目的是提供一種可用於獲得轉基因硬質強筋小麥的一對表達載體。本發明所提供的用於獲得轉基因硬質強筋小麥的一對表達載體，其中一個在多克隆位點插入有pinA，另一個在多克隆位點插入有pinB。為了提高pinA和pinB的表達效率，所述表達載體的啟動子均為Ubi啟動子；篩選標記基因均包括Bar基因。在所述表達載體中，在所述pinA或pinB的上遊，還含有Ω序列和/或kozak序列；在所述pinA或pinB的下遊含有poly(A)信號序列。為了能夠有效的表達PINA或PINB，所述kozak序列是指包括pinA或pinB起始密碼子在內的『CCATGC』；所述Ω序列在pinA或pinB基因上遊，中間間隔2bp，該序列含有『TTAAC』，能和80S核糖體結合，促進外源基因表達的90bp序列。其中，所述pinA可具有序列表中序列1的核苷酸序列；所述pinB可具有序列表中序列2的核苷酸序列所述Ubi啟動子可具有序列表中序列3的核苷酸序列，所述Bar基因可具有序列表中序列4的核苷酸序列。序列表中的序列1和序列2均由449個鹼基組成，序列3由2004個鹼基組成，序列4由552個鹼基組成。所述一對表達載體優選為pUBPa和pUBPb。本發明的第二個目的是提供一種獲得轉基因硬質強筋小麥的方法。本發明所提供的獲得轉基因硬質強筋小麥的方法，是將上述一對表達載體導入小麥中，獲得轉基因硬質強筋小麥。所述一對表達載體可通過花粉管通道法轉化小麥。所述花粉管通道法轉化小麥的方法為在正在開花的麥穗上只留下當天剛開的穎花，剪去小穗1/3穎殼，2-3小時後剪去柱頭，在剛剪去柱頭的花柱上注入一對濃度均0.5-1μg/μL的表達載體各5-10μL。所述小麥優為中優9507。本發明通過外源pinA和pinB在受體植株中高效穩定表達，與內源基因形成共抑制，從而抑制受體植株中pinA和pinB的表達，提高受體植株的籽粒硬度，為進一步通過基因工程方法快速改良我國現有小麥優良品種的籽粒硬度奠定基礎。本發明構建了在多克隆位點插入有pinA或pinB的植物表達載體，該植物表達載體採用了在單子葉植物中高效啟動外源基因表達的Ubi啟動子，並在目的基因的上遊加上Kozak序列、Ω序列和poly(A)信號序列，提高外源基因的表達穩定性與表達量。利用該表達載體將外源pinA和pinB導入小麥，獲得了轉基因植株，PCR檢測和southern雜交證實了外源基因在受體小麥基因組中的整合。水洗澱粉表面蛋白的定量分析表明外源基因的導入影響了Friabilin表達。研究結果表明，有兩個株系中的外源pinA和pinB與內源基因形成共抑制，受體植株中的Friabilin蛋白不表達，籽粒硬度大為提高。本發明為進一步明確pinA和pinB的功能，並通過基因工程方法快速改良我國現有單子葉植物(特別是小麥)品種的籽粒硬度奠定了基礎。圖1為pUBPa的構建過程示意2為pG4APa的酶切鑑定圖譜圖3為pUBPa的的酶切鑑定圖譜圖4為pUBPb的構建過程示意5為pG4APb的酶切鑑定圖譜圖6為pUBPb的的酶切鑑定圖譜圖7為轉基因植株的Barsta抗性篩選照片圖8為部分Barsta抗性植株的PCR檢測電泳圖譜圖9為不同轉基因植株的基因組southern雜交分析圖譜圖10為不同轉基因株系單籽粒水洗澱粉表明friabilin蛋白的SDS-PAGE分析圖譜具體實施方式轉基因受體優質麵包小麥品種中優9507(pinB-D1b)，特點為蛋白質含量高、強筋，但作為麵包品種，硬度偏低。實施例1、pUBPa及pUBPb的構建質粒載體pGEMPa和pGEMPb分別含有野生型基因pinA和突變型pinB-D1b基因，其構建方法如下利用我國小麥品種京411基因組DNA做模板，比較已報導的穀物作物中硬度主效基因PinA和PinB的胺基酸序列，根據保守區域，設計了兩對簡併引物，同時為了方便於克隆，在引物兩端分別添加了酶切位點。擴增PinA的引物pinA上遊引物(加BamHI位點)為5』-CGGGATCCAACATGAAG/TGCCCTCT/ATCCTCATAG，pinA下遊引物(加EcoRI位點)為5』-CGGAATTCCATCA/GCCAGTAATA/TGCCAATAGTGC；擴增PinB的引物pinB上遊引物(加KpnI位點)為5』-GGGGTACCCAT/AGAAGACCTTAT/GTCCTCCTAGC，pinB下遊引物(加EcoRI位點)為5』-CGGAATTCCAT/ACACCAGTAATAGCC/GACTAGG(以上引物由上海博亞生物技術有限公司合成)。按照常規方法進行PCR擴增PinA和PinB，擴增產物經1％瓊脂糖凝膠電泳分離後，回收目的條帶，pinA基因的特異性片段經EcoRI和BamHI酶切，pinB基因的特異性片段經EcoRI和KpnI酶切，酶切產物經酚氯仿抽提，乙醇沉澱後，溶解在超純水或TEbuffer中備用。然後與pGEM-3Z-f(+)(PromegaBiotech，Wis.)相應的酶切大片斷於16℃連接過夜，轉化JM109感受態細胞，經選擇性培養基培養，挑選白斑重組子進行酶切鑑定和序列分析，獲得pGEMPa和pGEMPb。pG4AB(毛立群，郭三堆.1996.Ω序列和3』poly(A)序列長度與基因表達效率的關係.植物學報，1998，40(7)1-3)為表達載體提供Ω序列、kozak序列和poly(A)序列。pAHC25(ChristensenAH，QuailPH.1996.Ubiquitinpromoter-basedvectorsforhigh-levelexpressionofselectableand/orscreenablemarkergenesinmonocotyledonousplants.TransgenicResearch，5213-218)提供表達載體所需的Ubiqutin啟動子(2.0kb)、Nos強終止子及由Ubiqutin啟動子調控的Bar盒子(3.0kb)。PCR引物pTpina1(上遊)5』aactgcaggaaggccctcttcctcatag3(含PstI酶切位點)pTpina2(下遊)5』ccgctcgagcatcaccagtaatagccaa3』(含XhoI酶切位點)pTpinb1(上遊)5』aactgcaggaagaccttattcctcctagc3』(含PstI酶切位點)pTpinb2(下遊)5』ccgctcgagcatcaccagtaatagcca3』(含XhoI酶切位點)。1、pUBPa的構建pUBPa的構建過程如圖1所示，具體方法如下以pGEMPa為模板，在引物pTpina1和pTpina2的引導下，PCR擴增pinA。其中，擴增體系10μl10×PCR緩衝液(含15mMMg2+)，8μldNTP(每種2.5mM)，pTpina1(20μM)，pTpina2(20μM)，2μlpGEMPaDNA(0.2-1.0μg)，TaqDNA聚合酶(5U/μl)1μl，加H2O定容至100μl。反應程序95℃前變性5min，94℃變性1min，55℃退火30sec，72℃延伸1min，共35個循環，最後72℃後延伸10min。PCR擴增結束後，將PCR擴增體系於0.8％的瓊脂糖凝膠電泳，採用「六一」廠DYC-P31AI型電泳槽；80V，80min，EB染色10min，觀察，結果得到約0.5kb片段，回收此片段，再經XhoI和PstI雙酶切回收，與經XhoI和PstI雙酶切pG4AB得到的約4.0kb片段連接，將連接產物通過CaCl2法轉化大腸桿菌JM109，經氨苄青黴素抗性篩選，得到陽性克隆，提質粒，將質粒用XhoI和PstI雙酶切，XhoI單酶切，PstI單酶切進行酶切鑑定，結果如圖2所示，表明pG4APa經XhoI和PstI雙酶切後得到0.5kb和4.0kb的兩個片段；pG4APa經XhoI單酶切得到4.5kb片段；pG4APa經PstI單酶切得到4.5kb片段；說明重組質粒pG4APa的結構正確。圖2中，1.PCRMarker；2.pG4APa經XhoI和PstI雙酶切；3.pG4APa經XhoI單酶切；4.pG4APa經PstI單酶切；5.1kbDNALadderMarker。pAHC25經BsmHI和SacI完全雙酶切，得到5.5kb、2.3kb、1.9kbs三個片段(圖3)，回收2.3kb、5.5kb兩個片段，分別含有Bar盒子、Ubi啟動子，與用BamHI完全酶切再用SacI部分酶切pG4APa質粒DNA後回收得到含有Ω序列、poly(A)序列、pinA基因的約0.75kb外源片段進行三片段連接，先是0.75kb與2.3kb連接12h，再加入5.5kb片段連接反應，連接產物轉化大腸桿菌JM109感受態細胞，經氨苄青黴素抗性篩選，得到陽性克隆，提質粒，獲得重組質粒pUBPa，其圖譜及酶切鑑定結果如圖3所示，表明pUBPa經BamHI和SacI完全雙酶切得到5.5kb、2.2kb、0.45kb和0.3kb的四個片段；pAHC25對照經BamHI和SacI完全雙酶切出現約5.5kb、2.3kb、1.9kb三個片段。說明pUBPa的結構正確。圖3中，1.pAHC25經BamHI和SacI完全雙酶切；2，3.pUBPa經BamHI和SacI完全雙酶切；4.1kbDNALadderMarker。2、pUBPb的構建pUBPb的構建過程如圖4所示，具體方法如下以pGEMPb為模板，在引物pTpinb1和pTpinb2的引導下，PCR擴增pinB。其中，擴增體系10μl10×PCR緩衝液(含15mMMg2+)，8μldNTP(每種2.5mM)，pTpinb1(20μM)，pTpinb2(20μM)，2μlpGEMPbDNA(0.2-1.0μg)，TaqDNA聚合酶(5U/μl)1μl，加H2O定容至100μl。反應程序95℃前變性5min，94℃變性1min，55℃退火30sec，72℃延伸1min，共35個循環，最後72℃後延伸10min。PCR擴增結束後，將PCR擴增體系於0.8％的瓊脂糖凝膠電泳，採用「六一」廠DYC-P31AI型電泳槽；80V，80min，EB染色10min，觀察，結果得到約0.5kb片段，回收此片段，再經XhoI和PstI雙酶切回收，與經XhoI和PstI雙酶切pG4AB得到的約4.0kb片段連接，將連接產物通過CaCl2法轉化大腸桿菌JM109，經氨苄青黴素抗性篩選，得到陽性克隆，提質粒，將質粒用XhoI和PstI雙酶切，XhoI單酶切，PstI單酶切進行酶切鑑定，結果如圖5所示，表明pG4APb經XhoI和PstI雙酶切後得到0.5kb和4.0kb的兩個片段；pG4APb經XhoI單酶切得到4.5kb片段；pG4APb經PstI單酶切得到4.5kb片段；說明重組質粒pG4APb的結構正確。圖5中，1.PCRMarker；2，3.pG4APb經XhoI單酶切；4，5.pG4APb經PstI單酶切；6，7.pG4APb經XhoI和PstI雙酶切；5.1kbDNALadderMarker。pAHC25經BamHI和SacI完全雙酶切，得到5.5kb、2.3kb、1.9kbs三個片段(圖6)，回收2.3kb、5.5kb兩個片段，分別含有Bar盒子、Ubi啟動子，與用BamHI和SacI完全雙酶切pG4APb質粒DNA後回收得到含有Ω序列、poly(A)序列、pinA基因的約0.75kb外源片段進行三片段連接，先是0.75kb與2.3kb連接，過夜，再加入5.5kb片段連接反應，連接產物轉化大腸桿菌JM109感受態細胞，經氨苄青黴素抗性篩選，得到陽性克隆，提質粒，獲得目的重組質粒pUBPb，其酶切鑑定結果如圖6所示，表明pUBPb質粒DNA經BamHI和SacI完全雙酶切出現約5.5kb、2.2kb、0.75kb三條目的片段，pAHC25對照經BamHI和SacI完全雙酶切出現約5.5kb、2.3kb、1.9kb三個片段；可能的克隆子經BamHI和SacI完全雙酶，進一步說明了0.75kb外源片段替換的是pAHC25中SacI(2775)酶切位點與BamHI(5048)酶切位點之間的片段而非gus的位置，可能在回收2.3kb片段時將一部分的1.9kb片段收到。圖6中，1.pAHC25經BamHI和SacI完全雙酶切；2.pUBPb經BamHI和SacI完全雙酶切；3.可能的克隆子經BamHI和SacI完全雙酶切；4.1kbDNALadderMarker。實施例2、同時轉質粒pUBPa和pUBPb獲得硬質、強筋轉基因小麥1、小麥花粉管通道轉化參照《分子克隆》(SambrookJ，David.W.RussellMolecuarCloningAlaboratoryManual，3rded.科學出版社，2002，8.30-32)方法分別大量提取pUBPa、pUBPb質粒DNA，PEG純化。經純化後的質粒DNA，溶於PH7.6的TE緩衝液中，終濃度為1μg/μL。小麥中優9507揚花後開始選材掛牌，12天後至盛花期選擇正在開花的麥穗，去除未開過的穎花和已開過的穎花，每穗只留下當天剛開的穎花，剪去小穗1/3穎殼，2-3小時後剪去柱頭。用微量注射器在剛剪去柱頭的花柱上注入5μL含有1μg/μLpUBPa和5μL含有1μg/μLpUBPb重組質粒的溶液，並用TE溶液作對照，套上雜交袋。植株正常成熟後收穫籽粒2300粒。2、轉化後代Basta篩選收穫的籽粒經H2O2浸種、催芽後播於盆缽內育苗，播種成苗率達90％以上。長至三葉期時，經100mg/L抗性篩選劑Basta塗抹第三葉片的1/3面積，五天後進行抗性篩選。當對照(未轉pUBPa和pUBPb質粒的植株)葉片出現枯萎現象時，選擇葉片生長正常轉基因植株移栽溫室，一周後篩選得到89株Basta抗性植株(圖7)。圖7中，1非轉基因植株2轉基因植株。3、轉化後代PCR檢測抗性篩選後獲得的89株Basta抗性植株新鮮葉片50mg，按SDS鹼法提取小麥基因組總DNA。引物是用Ubi啟動子的部分序列及外源基因的全長而設計，PCR擴增產物全長約為700bp。PCR反應所用引物為上海生工公司合成。用於檢測外源pinA基因的上遊引物序列為5』-GGCATATGCAGCATCTATTC-3』，下遊引物為5』-CTACACCAGTAATAGCCAA-3』；用於檢測pinB基因的上遊引物序列為5』-GGCATATGCAGCATCTATTC-3』，下遊引物為5』-CATCACCAGTAATAGCCACTA-3』。結果得到52棵陽性株。其中部分Barsta抗性植株的PCR檢測結果如圖8所示，陽性植株的PCR擴增產物中均有700bp的條帶。圖8中，MPCRMarker；1-12，PCR陽性植株13陰性對照；箭頭示目的條帶。4、轉化後代的southernblot分析利用pinA基因的PCR擴增產物做雜交探針，採用Promega公司Primc-a-GeneLabelingSystem試劑盒進行探針標記，α-32P-dCTP購自北京亞輝生物公司。選擇PCR檢測呈陽性的植株，提取基因組DNA，取30ug進行HindIII酶切處理，1％的瓊脂糖電泳小時後，轉至Hybond+尼龍膜，按Xia等(LanqinXia，SanduiGuo.2001.IntegrationandinheritancestabilityofBttoxingeneinthebivalentinsect-resistanttransgeniccottonplants.ChineseScienceBulletin，46(16)1372-1375)方法進行Southern雜交。洗膜後，壓磷屏24h，掃屏10分鐘左右進行雜交信號檢測。結果如圖9所示，轉基因植株與陽性對照一樣，得到大小分別為5.5kb、3.5kb、1.2kb和450bp的雜交條帶，而非轉基因植株無這些條帶，證實外源基因已整合到受體植株的基因組中(圖9)。圖9中，1-4為不同轉基因株系；5，6為非轉基因植株；7為陽性對照(該陽性對照為pinA全長序列的PCR擴增產物)；8為1kbladder。5、轉化後代的Friabilin蛋白分析取轉基因植株種子，橫切，對不含胚的一半籽粒(含胚的半粒種子用於成苗)，採用Bettge等(A.D.Bettge，C.F.MorrisandG.A.Greenblatt.1995.Assessinggenotypicsoftnessinsinglewheatkernelsusingstarchgranule-associatedfriabilinasabiochemicalmarker.Euphytica，8665-72)的方法提取friabilin蛋白，然後進行SDS-PAGE分析此蛋白在不同轉基因植株中的表達情況，每個轉基因株系設三次重複。同時，以未轉基因材料和硬粒小麥為對照。結果如圖10所示，表明和對照相比，不同轉基因株系中，小麥籽粒水洗澱粉表面Friabilin蛋白含量不同(圖10)，其中有三個株系(轉基因植株3-9，轉基因植株3-10，轉基因植株6-14)表現為Friabilin蛋白含量增加，有兩個株系(轉基因植株6-9，轉基因植株9-33)中的外源pinA和pinB與內源基因形成共抑制，受體植株中的Friabilin蛋白不表達，籽粒硬度大為提高。圖10中，1.硬粒小麥；2.轉基因植株6-9；3.轉基因植株3-9；4.轉基因植株3-10；5.轉基因植株9-33；6.非轉基因植株；7.轉基因植株6-14；箭頭示Friabilin蛋白條帶。水洗澱粉表面蛋白的定量分析表明外源基因的導入影響了Friabilin表達。這可能是由於不同轉基因株系中，外源puroindoline基因的整合拷貝數不同，外源基因的高拷貝和高表達引起外源基因和內源基因共抑制，從而導致Friabilin蛋白不表達。序列表16042101211449212DNA213小麥屬小麥(TriticumaestivumL.)4001atgaaggccctcttcctcataggactgcttgctctggtagcgagcaccgcctttgcgcaa60tatagcgaagttgttggcagttacgatgttgctggcgggggtggtgctcaacaatgccct120gtagagacaaagctaaattcatgcaggaattacctgctagatcgatgctcaacgatgaag180gatttcccggtcacctggcgttggtggaaatggtggaagggaggttgtcaagagctcctt240ggggagtgttgcagtcggctcggccaaatgccaccgcaatgccgctgcaacatcatccag300gggtcaatccaaggcgatctcggtggcatcttgggatttcagcgtgatcgggcaagcaaa360gtgatacaagaagccaagaacctgccgcccaggtgcaaccagggccatccctgcaacatc420cccggcactattggctattactggtgatg4492102211449212DNA213小麥屬小麥(TriticumaestivumL.)4002atgaagaccttattcctcctagctctccttgctcttgtagcgagcacaaccttcgcgcaa60tactcagaagttggcggctggtacaatgaagttggcggaggaggtggttctcaacaatgt120ccgcaggagcggccgaagctaagctcttgcaaggattacgtgatggagcgatgtttcaca180atgaaggattttccagtcacctggcccacaaaatggtggaagagcggctgtgagcatgag240gttcgggagaagtgctgcaagcagctgagccagatagcaccacaatgtcgctgtgattct300atccggcgagtgatccaaggcaggctcggtggcttcttgggcatttggcgaggtgaggta360ttcaaacaacttcagagggcccagagcctcccctcaaagtgcaacatgggcgccgactgc420aagttccctagtggctattactggtgatg44921032112004212DNA213人工序列2202234003aagcttgcatgcctgcagtgcagcgtgacccggtcgtgcccctctctagagataatgagc60attgcatgtctaagttataaaaaattaccacatattttttttgtcacacttgtttgaagt120gcagtttatctatctttatacatatatttaaactttactctacgaataatataatctata180gtactacaataatatcagtgttttagagaatcatataaatgaacagttagacatggtcta240aaggacaattgagtattttgacaacaggactctacagttttatctttttagtgtgcatgt300gttctcctttttttttgcaaatagcttcacctatataatacttcatccattttattagta360catccatttagggtttagggttaatggtttttatagactaatttttttagtacatctatt420ttattctattttagcctctaaattaagaaaactaaaactctattttagtttttttattta480ataatttagatataaaatagaataaaataaagtgactaaaaattaaacaaatacccttta540agaaattaaaaaaactaaggaaacatttttcttgtttcgagtagataatgccagcctgtt600aaacgccgtcgacgagtctaacggacaccaaccagcgaaccagcagcgtcgcgtcgggcc660aagcgaagcagacggcacggcatctctgtcgctgcctctggacccctctcgagagttccg720ctccaccgttggacttgctccgctgtcggcatccagaaattgcgtggcggagcggcagac780gtgagccggcacggcaggcggcctcctcctcctctcacggcacggcagctacgggggatt840cctttcccaccgctccttcgctttcccttcctcgcccgccgtaataaatagacaccccct900ccacaccctctttccccaacctcgtgttgttcggagcgcacacacacacaaccagatctc960ccccaaatccacccgtcggcacctccgcttcaaggtacgccgctcgtcctcccccccccc1020ccctctctaccttctctagatcggcgttccggtccatggttagggcccggtagttctact1080tctgttcatgtttgtgttagatccgtgtttgtgttagatccgtgctgctagcgttcgtac1140acggatgcgacctgtacgtcagacacgttctgattgctaacttgccagtgtttctctttg1200gggaatcctgggatggctctagccgttccgcagacgggatcgatttcatgattttttttg1260tttcgttgcatagggtttggtttgcccttttcctttatttcaatatatgccgtgcacttg1320tttgtcgggtcatcttttcatgcttttttttgtcttggttgtgatgatgtggtctggttg1380ggcggtcgttctagatcggagtagaattctgtttcaaactacctggtggatttattaatt1440ttggatctgtatgtgtgtgccatacatattcatagttacgaattgaagatgatggatgga1500aatatcgatctaggataggtatacatgttgatgcgggttttactgatgcatatacagaga1560tgctttttgttcgcttggttgtgatgatgtggtgtggttgggcggtcgttcattcgttct1620agatcggagtagaatactgtttcaaactacctggtgtatttattaattttggaactgtat1680gtgtgtgtcatacatcttcatagttacgagtttaagatggatggaaatatcgatctagga1740taggtatacatgttgatgtgggttttactgatgcatatacatgatggcatatgcagcatc1800tattcatatgctctaaccttgagtacctatctattataataaacaagtatgttttataat1860tattttgatcttgatatacttggatgatggcatatgcagcagctatatgtggattttttt1920agccctgccttcatacgctatttatttgcttggtactgtttcttttgtcgatgctcaccc1980tgttgtttggtgttacttctgcag20042104211552212DNA213人工序列2202234004atggctagcccagaacgacgcccggccgacatccgccgtgccaccgaggcggacatgccg60cggtctgcaccatcgtcaaccactacatccgagacaagcacggtcaacttccgtaccgag120ccgcagggaaccgcaggagtggacggacgacctcgtccgtctgcgggagcgctatccctg180gctcgtcgccgaggtggacggcgaggtcgccggcatcgcctacgcgggcccctggaaggc240acgcaacgcctacgactggacggccgagtcgaccgtgtacgtctccccccgccaccagcg300gacgggactgggctccacgctctacacccacctgctgaagtccctggaggcacagggctt360caagagcgtggtcgctgtcatcgggctgcccaacgacccgagcgtgcgcatgcacgaggc420gctcggatatgccccccgcggcatgctgcgggcggccggcttcaagcacgggaactggca480tgacgtgggtttctggcagctggacttcagcctgccggtaccgccccgtccggtcctgcc540cgtcaccgagat55權利要求1.用於獲得轉基因硬質強筋小麥的一對表達載體，其中一個在多克隆位點插入有pinA，另一個在多克隆位點插入有pinB。2.根據權利要求1所述的一對表達載體，其特徵在於所述表達載體的啟動子均為Ubi啟動子；篩選標記基因均包括Bar基因。3.根據權利要求1或2所述的一對表達載體，其特徵在於在所述表達載體中，在所述pinA或pinB的上遊，還含有Ω序列和/或kozak序列；在所述pinA或pinB的下遊含有poly(A)信號序列。4.根據權利要求3所述的一對表達載體，其特徵在於所述Ω序列與所述pinA或pinB基因相距2bp；kozak的核苷酸序列為CCATGC。5.根據權利要求4所述的一對表達載體，其特徵在於所述一對表達載體為pUBPa和pUBPb。6.獲得轉基因硬質強筋小麥的方法，是將權利要求1-5中任一項權利要求所述的一對表達載體導入小麥中，獲得轉基因硬質強筋小麥。7.根據權利要求6所述的方法，其特徵在於所述一對表達載體通過花粉管通道法轉化小麥。8.根據權利要求7所述的方法，其特徵在於所述花粉管通道法轉化小麥的方法為在正在開花的麥穗上只留下當天剛開的穎花，剪去小穗1/3穎殼，2-3小時後剪去柱頭，在剛剪去柱頭的花柱上注入一對濃度均0.5-1μg/μL的表達載體各5-10μL。9.根據權利要求8所述的方法，其特徵在於所述小麥為中優9507。全文摘要本發明公開了獲得轉基因硬質強筋小麥種子的方法及其專用表達載體。本發明的用於獲得轉基因硬質強筋小麥的一對表達載體，其中一個在多克隆位點插入有pinA，另一個在多克隆位點插入有pinB。獲得轉基因硬質強筋小麥的方法，是將所述一對表達載體導入小麥中，獲得轉基因硬質強筋小麥。本發明為進一步明確pinA和pinB的功能，並通過基因工程方法快速改良我國現有小麥品種的籽粒硬度奠定了基礎。文檔編號C12N15/29GK1749400SQ20041007813公開日2006年3月22日申請日期2004年9月17日優先權日2004年9月17日發明者何中虎,夏蘭芹,陳新民申請人:中國農業科學院作物育種栽培研究所