一種新型下調miRNA-21表達的方法

2023-12-09 09:22:46

一種新型下調miRNA-21表達的方法
【專利摘要】本發明公開了一種新型下調miRNA-21表達的方法，在miRBase資料庫中檢索出>miR-21-5p的序列：5』-UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3』；其反義互補序列為：5』-TCAACATCAGTCTGATAAGCTA-3』，再與載體粘性末端互補連接，得到合成的正反義鏈；將合成的正反義鏈混合，95℃加熱5分鐘退火形成雙鏈，將退火的雙鏈DNA室溫連接30分鐘得到連接產物；取2-10μl連接產物轉化100μl感受態細胞DH5α，塗LB平板，含50μg/ml壯觀黴素，37℃孵育16小時，取6個陽性克隆，接種到含50μg/ml壯觀黴素的LB培養基中，按天根質粒小提試劑盒方法抽提質粒。本發明的有益效果是可以長效、便捷下調miR-21的表達。
【專利說明】-種新型下調miRNA-21表達的方法

【技術領域】
[0001] 本發明屬於生物基因【技術領域】，涉及一種新型下調miRNA-21表達的方法。

【背景技術】
[0002] 微小RNA-21 (microRNA-21，miR-21)是miRNA家族中的成員之一，具有重要的生物 學功能。目前，通過改變miR-21的活性或表達，從而研究其生物學功能的方法主要有抑制 劑（Inhibitor)、拮抗劑（Antagomir)及慢病毒載體等。然而，這些方法存在有效作用時間 短、操作困難、安全性能差等缺點，難以達到長效、便捷下調miR-21表達的目的。


【發明內容】

[0003] 本發明的目的在於提供一種新型下調miRNA-21表達的方法，解決了現有的改變 miRNA-21表達的方法有效作用時間短、操作困難的問題。
[0004] 本發明所採用的技術方案是按照以下步驟進行：
[0005] 步驟I :miR-21_AS0序列設計：在miRBase資料庫中檢索出〉miR-21_5p的序列： 5' -UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3';其反義互補序列為：5' -TCAACATCAGTCTGATAAGCTA-3'，再 與載體粘性末端互補連接，得到合成的正反義鏈；
[0006] 步驟2 :pcDNA-6. 2-miR-21-AS0載體構建：將合成的正反義鏈混合，95°C加熱5分 鍾退火形成雙鏈，將退火的雙鏈DNA室溫連接30分鐘得到連接產物；
[0007] 步驟3 :取2-10 μ 1連接產物轉化100 μ 1感受態細胞DH5 α，塗LB平板，含50 μ g/ ml壯觀黴素，37°C孵育16小時，取6個陽性克隆，接種到含50 μ g/ml壯觀黴素的LB培養基 中，按天根質粒小提試劑盒方法抽提質粒,重組質粒即為pcDNA-6. 2-miRNA-21-AS0。
[0008] 本發明的有益效果是不僅可以長效、便捷下調miR-21的表達，同時還可快捷地觀 察miR-21下調表達後的生物學效應。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0009] 圖1是本發明中miR-21-AS0序列的設計原理圖；
[0010] 圖2是pcDNA-6. 2-miRNA-21-AS0真核表達載體構建示意圖；
[0011] 圖3是該表達載體構建過程中的質粒電泳圖和測序結果；
[0012] 圖4是該表達載體轉染真核細胞後，miR-21表達水平檢測；
[0013] 圖5是該表達載體轉染真核細胞後，miR-21生物學效應檢測。

【具體實施方式】
[0014] 下面結合附圖和【具體實施方式】對本發明進行詳細說明。
[0015] 本發明利用分子克隆及反義核酸技術構建含CMV啟動子的 pcDNA-6. 2-miR-21-AS0真核表達載體。該載體體外轉染真核細胞後，利用螢光定量PCR技 術檢測miR-21的表達，同時通過體外實驗觀察miR-21下調後的生物學效應。本發明屬於 生物【技術領域】，可以廣泛用於分子生物學和細胞生物學實驗中下調miR-21，並觀察其生物 學效應。
[0016] 本發明採用以下步驟進行：
[0017] 步驟I :miR-21_AS0序列設計：在miRBase資料庫中檢索出〉miR-21_5p的序列： 5' -UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3';其反義互補序列為：5' -TCAACATCAGTCTGATAAGCTA-3'，再 與載體粘性末端互補連接，得到合成的正反義鏈。圖1為miR-21-ASO序列的設計過程。
[0018] 步驟2 :pcDNA-6. 2-miR-21-AS0載體構建：將合成的正反義鏈混合，95 °C 加熱5分鐘退火形成雙鏈。將退火的雙鏈DNA室溫連接30分鐘得到連接產物， pcDNA-6. 2-miRNA-21-AS0 的真核表達載體構建完成。圖 2 為 pcDNA-6. 2-miRNA-21-AS0 真核 表達載體構建過程。其中，圖中：SV40,猴空泡病毒40(Simianvirus 40) ;EGFP，增強型綠色 突光蛋白(Enhanced green fluorescent protein) ;Spec，壯觀黴素抗性（Spectinomycin resistance) ;BSD，殺稻癌菌素抗性（Blasticidin resistance) ;Puc Ori,複製起始 位點（origin ofreplication) ;Pcmv，人巨細胞病毒啟動子（Human cytomegalovirus promoter)〇
[0019] 步驟3 :取2-10 μ 1連接產物轉化100 μ 1感受態細胞DH5a，塗LB平板（含50 μ g/ ml壯觀黴素）後，37°C孵育16小時。挑取6個陽性克隆，接種到含50 μ g/ml壯觀黴素的LB 培養基中。按天根質粒小提試劑盒方法抽提質粒，重組質粒即為pcDNA-6. 2-miRNA-21-AS0。
[0020] 將pcDNA-6. 2-miRNA-21-AS0送上海生物工程有限公司進行測序，並對測序結果 與目的序列進行Blast比對分析，如圖3所示，A為重組質粒電泳圖，B為重組質粒測序鑑定 示意圖。用含10%胎牛血清、l〇〇〇u/mL青黴素、100ug/mL鏈黴素的McCoy'5A細胞培養液， 於37°C、C0 2體積分數為5%條件下培養HCT116細胞。將人結腸癌HCT116細胞分為陰性對 照組及 miRNA-21-AS0 實驗組；分別作轉染 pcDNA6. 2-GW/EmGFP-miR-Ctrl (p-Cont)陰性對 照質粒及pcDNA-6. 2-miR-21-AS0(p-miR-21AS0)質粒處理；收集轉染72h後的細胞，提取總 RNA。利用Realtime PCR探針法檢測miR-21的表達水平。結果顯示：以U6作為內參，採用 2^ΔΔα方法計算miR-21相對表達水平，pcDNA-6. 2-miR-21-AS0轉染組中，miR-21表達水平 明顯下調（圖4)，提示該載體可以顯著下調miR-21的表達。
[0021] 進一步檢測了各轉染組中HCT116細胞生長的變化。分組轉染HCT116細胞72h後， 光鏡下觀察HCT116細胞的體外生長變化。結果發現與p-Cont轉染組相比，p-miR-21AS0 轉染組HCT116細胞的生長明顯受到抑制，細胞數量減少，圖5為該真核表達載體轉染細胞 後，miR-21生物學效應檢測圖。圖5A為光鏡；圖5B為CCK-8實驗結果。結果表明，含CMV 啟動子的p-miR-21-ASO真核表達載體不僅可以下調miR-21在真核細胞中的表達，同時，我 們也可通過體外轉染觀察miR-21下調表達後的生物學效應。
[0022] 其中，miR-21 序列：
[0023] 正義序列：5' -UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA _ 3' ；
[0024] miR-21-ASO 序列
[0025] 正義鏈：5 ' -TGCTTCAACATCAGTCTGATAAGCTATTTTTG-3 '，反義鏈：5 ' -CCTGCAAAAATA GCTTATCAGACTGATGTTGA-3' ；
[0026] 本發明的有益效果是，不僅可以長效、便捷下調miR-21的表達，同時還可快捷地 觀察miR-21下調表達後的生物學效應。
[0027] 以上所述僅是對本發明的較佳實施方式而已，並非對本發明作任何形式上的限 制，凡是依據本發明的技術實質對以上實施方式所做的任何簡單修改，等同變化與修飾，均 屬於本發明技術方案的範圍內。
[0028]

【權利要求】
1. 一種新型下調miRNA-21表達的方法，其特徵在於，按照以下步驟進行： 步驟1 :miR-21_AS0序列設計：在miRBase資料庫中檢索出〉miR-21_5p的序列： 5' -UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3';其反義互補序列為：5' -TCAACATCAGTCTGATAAGCTA-3'，再 與載體粘性末端互補連接，得到合成的正反義鏈； 步驟2 :pcDNA-6. 2-miR-21-AS0載體構建：將合成的正反義鏈混合，95°C加熱5分鐘退 火形成雙鏈，將退火的雙鏈DNA室溫連接30分鐘得到連接產物； 步驟3 :取2-10 ill連接產物轉化100 ill感受態細胞DH5 a，塗LB平板，含50 ii g/ml 壯觀黴素，37 °C孵育16小時，取6個陽性克隆，接種到含50 ii g/ml壯觀黴素的LB培養基中， 按天根質粒小提試劑盒方法抽提質粒，重組質粒即為pcDNA-6. 2-miRNA-21-ASO。
【文檔編號】C12N15/63GK104404071SQ201410708026
【公開日】2015年3月11日 申請日期:2014年11月28日 優先權日:2014年11月28日
【發明者】徐林, 陶弋婧, 周涯, 郭萌萌, 趙娟娟 申請人:遵義醫學院