一種含11型腺病毒纖毛蛋白基因的增殖型重組溶瘤腺病毒、其構建方法及其用途的製作方法

2023-12-09 09:20:51 1

專利名稱：一種含11型腺病毒纖毛蛋白基因的增殖型重組溶瘤腺病毒、其構建方法及其用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及基因工程學和病毒學，尤其涉及一種含人類B亞群11型腺病毒纖毛蛋白基因的增殖型重組溶瘤腺病毒、其構建方法及其用途。該腺病毒可以是11型腺病毒，也可以是用11型腺病毒纖毛頭的胺基酸序列取代非11型腺病毒的纖毛頭胺基酸序列而構成的雜合腺病毒。該腺病毒通過對其增殖必須基因進行的有效控制或突變而具有選擇性增殖能力。作為具有更廣的感染譜和改良感染能力的條件增殖型的重組病毒，本發明的重組溶瘤腺病毒可以用於基因治療尤其是腫瘤的基因治療。
背景技術：
惡性腫瘤是嚴重威脅人類生命健康的一大類疾病，隨著社會經濟的發展，腫瘤的主要危險因素不但未得到有效控制，反而愈演愈烈，是其發病率和死亡率持續上升。目前惡性腫瘤的常規治療難以收到預期的療效，特別是化療藥物的治療指數低，毒副作用大。近幾年，包括基因治療在內的綜合治療成為腫瘤臨床中不可或缺的一部分。我國的重組腺病毒p53注射液"Ad-p53"已於2004年上市，成為世界上第一個上市的癌症基因治療藥物(WangX等，Mol Cancer Ther. 2008Jun ;7 :1598-1603)。 腺病毒是腫瘤基因治療的最常用的病毒載體，它是一種雙鏈DNA病毒，基因組長約36kb，衣殼(c即sid)呈規則的20面體結構，直徑約80-110nm。衣殼含有240個六聯體(hexon)、12個五聯體(penton)及12根纖毛(fiber)，除此之外還有其他一些小蛋白，如A/I、WI、IX、111 a和IV a2等。六聯體是形成病毒衣殼20個三角形面的主要蛋白，12個頂端是5個五聯體亞單位和3個纖毛蛋白構成的複合物，12根纖毛(Fiber)以五聯體蛋白為基底由衣殼表面伸出，纖毛頂端形成頭節區(knob)。五聯體和纖毛的頭節區可與細胞表面的病毒受體結合，在病毒感染細胞過程中起著非常重要的作用(Gall JG等，J Virol. 1998 Dec ;72 :10260-10264 ;Sakurai F等，Curr Gene Ther. 2007Aug;7 :229-238)。
人類腺病毒家族有51個已知血清型，分為6個亞屬(A-F)。基因治療常用的人的2型(Ad2)及5型(Ad5)腺病毒在血清學分類上均屬C亞群，在DNA序列上有95%的同源性。腺病毒感染細胞的過程是從腺病毒纖毛的頭節區粘附到細胞表面的特異性受體開始的。C亞群腺病毒主要與柯薩奇B病毒共用一種受體，因此這種受體被稱為柯薩奇/腺病毒受體(coxsackie/adenovirus rec印tor， CAR)。但是，在人體內造血細胞、胚胎幹細胞、間充質幹細胞、某些表皮細胞和腫瘤細胞(如膀胱癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、前列腺癌、肺癌、乳腺癌、頭頸部腫瘤、黑色素瘤、神經膠質瘤等)表面，CAR是低表達甚至不表達的。由於以腺病毒為載體的基因治療中CAR介導的腺病毒進入靶細胞是基因轉移中的限速步驟，並且轉染效率與細胞表面CAR表達水平有關。低水平表達的CAR無疑是制約腺病毒轉導效率的主要原因，即表現出細胞對C亞群腺病毒載體的抗性作用(Kim J等，J Virol. 2002;76 :1892-1903 ;Cripe TP等，Cancer Res. 2001 Aprl ;61 :2953-2960 ;S證ki K等，ClinCancer Res. 2001 ;7 :120-126 ;Wesseling JG等，Gene Ther即y. 2001 ;8 :969-976 ;Bao Y
4等，Prostate. 2005 S印1 ;64 :401-407 ;Stoff-Khalili MA等，Gene Ther. 2005 Dec ;12 :1696-1706)。以CAR為受體的C亞群腺病毒還存在在體內會引起嚴重毒副作用、人體內廣泛存在的Ad5型腺病毒中和抗體很快清除病毒。這些問題限制了 Ad5和Ad2的廣泛應用。
B亞群腺病毒包括3型、7型、11型、16型、35型、50型腺病毒，該組腺病毒的感染細胞不通過CAR受體，主要以CD46分子為吸附受體(Fleischli C等，J Gen Virol. 2007Nov ;88 :2925-2934 ;Pache L等，Virology. 2008 Jun 5 ;375 :573-579 ;Pache L等，JVirol. 2008Aug ;82 :7923-7931) 。 CD46是一種廣泛表達的補體調節蛋白，這種蛋白幾乎表達在除了紅細胞以外所有人外周血細胞、各類幹細胞以及大多數腫瘤細胞表面。因此，利用CD46受體的腺病毒載體近來受到更廣泛的關注，人們針對腺病毒載體的靶向性修飾問題提出了許多策略。腺病毒Ad5/F35載體即是一種外殼改造的雜合病毒載體，它的主要結構是在現在的Ad5腺病毒載體的基礎上，其受體結合位置的纖毛改造成了 35型腺病毒(Ad35)的纖毛。因此，Ad5/F35的細胞受體從Ad5的CAR變成了 CD46，原有的感染吸附受體的改變，提高了它對血液細胞、幹細胞、腫瘤細胞的感染效率，感染譜比現在常用的Ad5更廣，且轉導效率普遍比Ad5高(Stone D等，Mol Ther. 2007Dec ;15 :2146-2153 ;Brouwer E等，CancerGene Ther. 2007Feb ;14 :211-219)。實驗結果證實，Ad5/F35載體對髓系來源的K562細胞的感染能力明顯優於常規的5型腺病毒載體，對B淋巴細胞的感染能力也略高於Ad5載體。AD5/F35的改造改變了載體的感染特性，但是其對細胞的毒性作用並沒有因此而增加，證實這種方式的改造載體在幹細胞、腫瘤細胞等轉導和基因治療研究中有更廣闊的應用空間。
此外，有實驗證實，B亞群腺病毒可能存在另一種感染細胞的特異受體。利用Ad5/ll-CMV-GFP和Ad5/35-CMV-GFP分別感染CD46陽性表達的A549和Hela細胞，Ad5/ll-CMV-GFP的感染效率均比Ad5/35-CMV-GFP高，而同時用這兩種載體去感染CD46陽性表達的CH0-C2細胞，效率幾乎一樣(Stone D等，J Virol. 2005 ;79 :5090-5104)。另夕卜，抗血清實驗顯示，Adll-Fiber的knob區能完全抑制Ad35與A549細胞的結合，而Ad35_Fiber的knob區並不能完全抑制Adll與A549細胞的結合(MeiYF等，Virology. 2002 ;295 :3043)。分別用Ad5、Ad5/11和Ad5/35感染11種食道癌細胞和6種口腔癌細胞，Ad5/11和Ad5/35對所有腫瘤細胞的感染效率均比Ad5要高很多，而且Ad5/ll和Ad5/35的感染效率不依賴於CD46的表達水平(Ling Y等 Oncol R印.2005 ; 14 :831-835)。因此推測可能有其他的受體參與調節Adll和Ad35對細胞的感染。 儘管以腺病毒為載體的腫瘤基因治療在實驗和臨床中取得了一些療效，但是，進一步提高腺病毒對腫瘤細胞的轉導效率、增強抗腫瘤基因的表達、使病毒載體具有更特異的靶向性，從而提高療效和安全性，是未來腫瘤基因治療研究的重點方向。
人11型腺病毒載體與傳統的C組腺病毒載體相比，有諸多的優點血清中中和抗體的陽性率較低；與Ad5、 Ad35之間也沒有交叉免疫反應；感染細胞不依賴CAR受體，對包括造血幹細胞、原代腫瘤細胞、腫瘤幹細胞在內的許多重要細胞都有較高感染效率；肝臟毒性低，免疫副作用小。因此，開發Adll載體，高效轉染多數幹細胞和腫瘤細胞，靶向殺滅腫瘤幹細胞，實現徹底殺滅腫瘤的目的，將有十分重要的意義。 基因治療方案中採用的腺病毒載體，多數採用沒有複製能力的增殖缺陷型腺病毒。雖然增殖缺陷型腺病毒在體內外顯示了一定的安全性，然而至今在臨床試驗中應用的大多數此類腺病毒載體尚存在表達外源基因的時間短、免疫原性較強、高滴度時有明顯的細胞毒性等許多缺點，因此臨床療效不佳。 要解決上述問題，需要一種能在腫瘤細胞中具有特異性增殖能力、能提高外源基因拷貝數和表達量、並且可以溶解殺死腫瘤細胞的條件增殖型腺病毒載體，即溶瘤腺病毒載體。國內外溶瘤腺病毒項目進展較快，國內上海三維公司的H101項目2005年底被批准上市(Yu W等，Curr Cancer Drug Targets. 2007 Mar ;7 :141-148)。越來越多的數據證明，溶瘤腺病毒有希望成為新一代的腫瘤治療藥物。

發明內容
所要解決的技術問題 基因治療方案中採用的腺病毒載體，多數採用人類C亞群5型腺病毒(Ad5)，其感染細胞的過程依賴於CAR。但是，在人體內造血細胞、胚胎幹細胞、間充質幹細胞、某些表皮細胞和腫瘤細胞表面，CAR低表達甚至不表達。因此，低水平表達的CAR成為制約該類型腺病毒轉導效率的主要原因，即表現出細胞對C亞群腺病毒載體的抗性作用。以CAR為受體的C亞群腺病毒還存在在體內會引起嚴重毒副作用、人體內廣泛存在的5型腺病毒中和抗體很快清除病毒。 基因治療方案中採用的腺病毒載體，多數採用沒有複製能力的增殖缺陷型腺病毒。該類腺病毒載體普遍存在表達外源基因的時間短、免疫原性較強、高滴度時有明顯的細胞毒性等許多缺點，影響了其臨床療效。 因此，進一步提高病毒載體對腫瘤細胞的轉導效率、增強抗腫瘤基因的表達、使病毒載體具有更特異的靶向性，從而提高療效和安全性，是未來腫瘤基因治療研究的重點方向。 採用的技術方案 本發明的目的在於提供一種可用於多種人體腫瘤的基因治療的增殖型重組溶瘤腺病毒，該重組溶瘤腺病毒能夠克服當前增殖缺陷型腺病毒載體(如Ad-p53)轉運及表達抗癌基因效率低下、無靶向性的缺點，克服以人Ad5增殖型腺病毒載體(如H101、0NYX-015)僅具有單一抗腫瘤機制、對腫瘤細胞感染力低下、安全性不佳等缺點，其抗腫瘤療效得以提
高，安全性得以改善。 為實現上述目的，本發明提供一種含B亞群11型腺病毒纖毛頭(knob)胺基酸編碼序列的增殖型重組溶瘤腺病毒，其特徵在於，該重組病毒的基因組含B亞群11型腺病毒纖毛頭(knob)胺基酸編碼序列，所述11型腺病毒纖毛蛋白編碼序列，既可以是11型腺病毒，也可以是用人類11型腺病毒纖毛頭(knob)的胺基酸序列取代非11型腺病毒的纖毛頭胺基酸序列而構成。 在實施例中，該增殖型重組溶瘤腺病毒的骨架序列是5型腺病毒(Ad5)，並由11型腺病毒纖毛頭的胺基酸序列取代5型腺病毒的纖毛頭胺基酸序列，其纖毛蛋白編碼序列如SEQ ID N0:1所示。病毒載體構建方面，通過兩種實施方案來說明含ll型腺病毒纖毛蛋白基因的增殖型重組溶瘤腺病毒的功能的改進和用途，一是採用人端粒酶逆轉錄酶(hTERT)啟動子調控Ela基因，同時用人缺氧反應元件(HRE)調控Elb區基因(Elb-55kDa和Elb-19kDa基因)，構建增殖型溶瘤腺病毒，二是對Elb-55kDa實施突變，使其失去活性，從而使病毒的增殖獲得腫瘤特異性。在外源基因選擇方面，通過兩種實施方案來說明含11型腺病毒纖毛蛋白基因的增殖型重組溶瘤腺病毒介導基因表達的功能和用途，一是攜帶人趨化因子CCL5基因，二是攜帶綠色螢光蛋白報告基因EGFP。 含11型腺病毒纖毛蛋白基因的增殖型重組溶瘤腺病毒能夠識別CD46膜受體和可能存在的其他特異受體，從而能高效感染人造血系統細胞、間充質幹細胞、樹突狀細胞、腫瘤幹細胞、原代腫瘤細胞等重要細胞，且免疫原性較低，與傳統的C組腺病毒載體無交叉免疫反應；該腺病毒基因組通過基因缺失或者基因調節的有效控制，使其選擇性地在腫瘤細胞內增殖，而在正常細胞內基本不增殖；該腺病毒可作為基因轉移的載體，在其基因組中同時插入多種抗腫瘤治療基因，使腫瘤治療基因隨病毒的複製在腫瘤細胞內高效表達。通過病毒增殖和抗癌基因雙重作用，特異性殺滅腫瘤細胞，用於治療多種人體腫瘤。
人類腺病毒有A、B、C、D、E、F 6個不同亞屬，它們對宿主細胞的親嗜性、致瘤性及疾病史各不相同。本發明涉及腺病毒B亞群ll型。 本發明提供一種含11型腺病毒纖毛蛋白基因的增殖型重組溶瘤腺病毒，其特徵在於，腺病毒基因組的纖毛蛋白編碼序列由人11型腺病毒纖毛蛋白基因組成。所述11型腺病毒纖毛蛋白基因，既可以是完整的野生型11型腺病毒的纖毛蛋白編碼序列，也可以是由11型腺病毒纖毛頭的胺基酸序列取代非11型腺病毒的纖毛頭胺基酸序列雜合而成。該病毒能夠識別CD46膜受體和其他可能存在的特異受體，而不再依賴於CAR受體，從而使其感染人腫瘤細胞的感染譜更廣，轉導效率更高，提高了它對人造血系統細胞、間充質幹細胞、樹突狀細胞、腫瘤幹細胞、原代腫瘤細胞等重要細胞的感染效率。在實施方案中，所述重組腺病毒的11型纖毛蛋白基因序列如SEQ ID N0 :1所示，其中(l)第1-134位鹼基5型腺病毒纖毛的tail蛋白編碼序列；(2)第135-981位鹼基11型腺病毒纖毛的shaft、knob蛋白編碼序列。 另一方面，本發明提供一種含11型腺病毒纖毛蛋白基因的增殖型重組溶瘤腺病毒，其特徵在於，該腺病毒基因組通過腫瘤特異性啟動子對增殖必需基因的有效控制，使其選擇性地在腫瘤細胞內增殖，而在正常細胞內基本不增殖，從而使其靶向人腫瘤細胞，保證腺病毒在腫瘤細胞內高度增殖，發揮溶瘤作用。該腫瘤特異性啟動子可以是以下任何一種腫瘤特異性啟動子或增強子(a)癌胚抗原啟動子、增強子及其突變體序列；(b)甲胎蛋白啟動子、增強子及其突變體序列；(c)人表皮生長因子受體家族(EGFRs)的受體酪氨酸激酶(包括EGFR、 Her-2、 Her_3和Her_4)啟動子、增強子及其突變體序列；(d)乳腺癌相關抗原DF3/MUC1啟動子、增強子及其突變體序列；(e)血管內皮生長因子(VEGF)受體KDR的啟動子、增強子及其突變體序列；(f)L-plastin啟動子、增強子及其突變體序列；(g)凋亡抑制蛋白家族(IAP)成員的啟動子、增強子及其突變體序列；(h)前列腺素特異性抗原的啟動子、增強子及其突變體序列；(i)缺氧誘導因子-l(HIF-l)調控的缺氧反應元件保守序列；(j)轉錄因子E2F啟動子、增強子及其突變體序列；和(k)人端粒酶亞基啟動子。
本發明提供一種含11型腺病毒纖毛蛋白基因的增殖型重組溶瘤腺病毒，其特徵在於，至少一個病毒增殖必需基因受一種腫瘤特異性啟動子控制。該病毒增殖必需基因可以是Ela。該溶瘤腺病毒能夠在在腫瘤細胞內特異性地增殖複製，表達Ela，發揮Ela抗腫瘤作用。Ela可以通過抑制Her-2/neu基因的轉錄、阻斷NF- k B的活性、提高免疫細胞的殺傷效應、增強轉移抑制基因nm23的表達等多種途徑，誘導腫瘤細胞凋亡，抑制腫瘤侵襲轉移，提高腫瘤細胞對化療、放療的敏感性。該溶瘤腺病毒與化療和放療合用，能夠增強腫瘤細胞對化療和放療的敏感性，進一步提高治療效果。 本發明提供一種含11型腺病毒纖毛蛋白基因的增殖型重組溶瘤腺病毒，其特徵在於，至少一個病毒增殖必需基因受一種腫瘤特異性啟動子控制。腫瘤特異性啟動子控制的病毒增殖必需基因還可以是Elb-55kDa、 Elb-19kDa、 E2或E4，該增殖必需基因可以是野生型的，也可以是經過缺失、突變等改造的基因變體。 本發明提供一種含11型腺病毒纖毛蛋白基因的增殖型重組溶瘤腺病毒，其特徵在於，其Elb-55kDa蛋白功能喪失，通過對編碼Elb-55kDa蛋白的基因序列進行全部缺失、點突變、部分缺失、插入突變或者插入終止密碼子等方式。Elb-55kDa是腺病毒在正常細胞增殖複製必需的而在腫瘤細胞中複製時的非必需的蛋白，Elb-55kDa編碼基因的選擇性缺失可以使腺病毒在腫瘤細胞內保持增殖複製的能力，而在正常細胞中失去複製能力。
本發明提供一種含11型腺病毒纖毛蛋白基因的增殖型重組溶瘤腺病毒，其特徵在於，其Elb-19kDa蛋白功能喪失通過對編碼Elb-19kDa蛋白的基因序列進行全部缺失、點突變、部分缺失、插入突變或者插入終止密碼子等方式。腺病毒Elb-19kDa基因與凋亡抑制基因Bcl-2同源，編碼的Elb-19kDa蛋白能夠結合Bax或/和Bak啟動下遊的凋亡抑制程序，Elb-19kDa還可以破壞Fas介導的凋亡過程，保護感染的細胞免受TNF-a介導的殺傷作用。Elb-19kDa基因失活，因而該病毒在腫瘤細胞內增殖的特異性得以提高，而在正常細胞內的增殖活性被削弱。Elb-19kDa蛋白功能的喪失，不但能夠促進腫瘤細胞凋亡通路的恢復，而且有利於病毒在正常細胞內的快速清除以及在腫瘤細胞內的快速釋放和播散，使該溶瘤腺病毒治療腫瘤的特異性更好，效能更強。 本發明提供一種含11型腺病毒纖毛蛋白基因的增殖型重組溶瘤腺病毒，其特徵在於，其基因組中預置了多克隆位點，可作為基因轉移的載體。該位點可以在Ela啟動子上遊，也可以在Ela和Elb之間，或在E3區，便於攜帶各種抗腫瘤基因表達盒。將抗腫瘤基因插入該病毒的外源基因多克隆位點，發揮多重抗腫瘤效能。隨著病毒在腫瘤內的特異性增殖複製，其攜帶的抗腫瘤基因的拷貝數和表達量得到提高，從而抑制腫瘤細胞生長或殺滅腫瘤細胞。 本發明提供一種含11型腺病毒纖毛蛋白基因的增殖型重組溶瘤腺病毒，其特徵在於，其抗腫瘤基因的選擇還可以是下列任意一種(a)幹擾素系列免疫調節因子基因；(b)白細胞介素系列免疫調節因子基因；(c)細胞集落剌激因子基因；(d)抑癌基因；(e)原癌基因反義序列；(f)人腫瘤表皮生長因子受體家族(EGFRs)的抗體基因；(g)具有抗血管生成的內皮抑素、血管抑素及其片段、纖溶酶原激活因子抑制劑、Canstatin、血小板反應蛋白等核苷酸序列；(h)細胞凋亡誘導因子家族基因；(i)血管內皮生長因子抗體基因；(j)藥物前提轉化基因(又稱自殺基因)；和(k)腫瘤壞死因子基因。 本發明提供一種含11型腺病毒纖毛蛋白基因的增殖型重組溶瘤腺病毒，其特徵在於，抗腫瘤基因表達盒中編碼序列受人類巨細胞病毒(CMV)啟動子的控制，該順式作用元件插入抗腫瘤基因序列的轉錄起始位點與翻譯起始位點之間，保證該基因蛋白在病毒感染的腫瘤內部高效表達，發揮生物學活性。抗腫瘤基因還可以受下列啟動子控制(a)癌胚抗原啟動子、增強子及其突變體序列；(b)甲胎蛋白啟動子、增強子及其突變體序列；(c)人表皮生長因子受體家族(EGFRs)的受體酪氨酸激酶(包括EGFR、 Her_2、 Her_3和Her-4)啟動子、增強子及其突變體序列；(d)乳腺癌相關抗原DF3/MUC1啟動子、增強子及其突變體序列；(e)血管內皮生長因子(VEGF)受體KDR的啟動子、增強子及其突變體序列；(f)L-plastin啟動子、增強子及其突變體序列；(g)凋亡抑制蛋白家族(IAP)成員的啟動子、增強子及其突變體序列；(h)前列腺素特異性抗原的啟動子、增強子及其突變體序列；(i)缺氧誘導因子-l(HIF-l)調控的缺氧反應元件保守序列；(j)轉錄因子E2F啟動子、增強子及其突變體序列；和(k)人端粒酶亞基啟動子。 本發明提供一種含11型腺病毒纖毛蛋白基因的增殖型重組溶瘤腺病毒，其特徵在於，抗腫瘤基因表達盒中編碼序列的加尾序列為SV40 Poly A，該順式作用元件插入基因核苷酸序列的翻譯終止密碼子之後。 本發明提供一種含11型腺病毒纖毛蛋白基因的增殖型重組溶瘤腺病毒，其特徵在於，至少一個病毒增殖必需基因受一種腫瘤特異性啟動子控制。其多個增殖必需基因之間可以由多核糖體進入位點(IRES)序列連接，使之共同受腫瘤特異性啟動子調控，或由多個腫瘤特異性啟動子分別調控。實施例中，以雙啟動子分別控制Ela和Elb基因，人端粒酶逆轉錄酶(hTERT)啟動子控制Ela基因，人缺氧反應元件(HRE)調控Elb區基因(Elb_55kDa和Elb-19kDa基因)。 本發明提供一種含11型腺病毒纖毛蛋白基因的增殖型重組溶瘤腺病毒，其特徵在於，該病毒突變體由人類腺病毒載體、腫瘤特異性啟動子的順式作用元件、人類11型腺病毒纖毛蛋白基因和抗腫瘤基因表達盒可操作地連接而成。該增殖型溶瘤腺病毒由含人類11型腺病毒纖毛蛋白基因的骨架質粒與攜帶抗腫瘤基因的腺病毒穿梭質粒在293細胞內通過Cre-loxP重組酶切割系統定點重組而產生。其含人類11型腺病毒纖毛蛋白基因的骨架質粒序列如SEQ ID N0:2所示，其中(l)第l-85位鹼基腺病毒ITR序列；(2)第562-700位鹼基SV40\AN序列；(3)第1245-2294位鹼基pSP13Cre序列；(4)第2375-2716位鹼基HCMV\IE序列；(5)第2962-3819位鹼基amp編碼序列；(6)第4901-4934位鹼基LoxP序列;(7)第31516-31649位鹼基:5型腺病毒纖毛蛋白的tail編碼序列；(8)第31649-32496位鹼基11型腺病毒纖毛蛋白基因的shaft、 knob編碼序列；(8)第35554-35655位鹼基腺病毒ITR序列；(9)其餘5型腺病毒基因組序列，見MicrobixBiosystems公司的pBHGloxdeltaEl， 3Cre序列。
實現的技術效果 1.本發明提供一種含11型腺病毒纖毛蛋白基因的增殖型重組溶瘤腺病毒，該腺病毒具有外源基因的多克隆位點，可用於構建多種抗腫瘤基因治療的腺病毒產品，為腫瘤的基因治療建立一種療效可靠的技術平臺。 2.本發明提供的溶瘤腺病毒具有多重抗腫瘤機制和特異性優勢1)該重組病毒的基因組含11型腺病毒纖毛蛋白蛋白編碼序列，使病毒能夠識別CD46膜受體，從而高效感染人造血系統細胞、間充質幹細胞、樹突狀細胞、腫瘤幹細胞、原代腫瘤細胞等重要細胞；2)以腫瘤特異性啟動子調控腺病毒增殖必須基因表達，使病毒在大多數類型的人類腫瘤細胞中增殖並破壞腫瘤細胞，其調控具有嚴謹性和安全性；3)在腫瘤細胞內高效而特異性表達的Ela，促進病毒增殖，同時其本身也具有抗腫瘤作用；4)將編碼抗腫瘤基因的核苷酸序列插入該病毒的基因組中，隨著病毒在腫瘤內的特異性增殖複製，其攜帶的抗腫瘤基因的拷貝數和表達量增加，從而抑制腫瘤生長。 3.本發明提供的溶瘤腺病毒，比國內目前已上市的基因治療產品重組p53腺病毒注射液"Ad-p53"具有更好的廣譜性和感染效率，療效得到提高；比國內目前已上市的增殖 腺病毒產品H101具有更好的療效和更高的安全性，適應於人類絕大多數類型惡性腫瘤的 治療。 附圖簡述

圖1表示含11型腺病毒纖毛蛋白基因編碼序列的腺病毒載體pCL0N9-F11的構建 流程。 圖2表示腺病毒包裝質粒pPE3的構建流程。
圖3表示pPE3-F11構建流程。 圖4表示L02正常肝細胞，MOI = 10感染Ad5-EGFP，螢光細胞約佔25%左右。
圖5表示L02正常肝細胞，MOI = 10感染SG511-EGFP，螢光細胞約佔85%左右。
圖6表示S匪C-7721肝癌細胞，M01 = 10感染Ad5-EGFP，螢光細胞約佔35%左右。
圖7表示SMMC-7721肝癌細胞，MOI = 10感染SG511-EGFP，螢光細胞約佔95%左 右。 圖8表示用人CCL5基因引物擴增1_4號腺病毒克隆，均能擴增出349bp條帶，與 陽性對照(P) —致，說明1-4號腺病毒均含有CCL5基因。其中Ml :100bp DNA Ladder ;N : 陰性對照；P :陽性對照(pENTR12-CCL5) ;1-4 :SG511-CCL5病毒克隆 圖9表示SG511-CCL5在肝癌細胞中隨著時間呈幾何倍數增殖，具有良好的增殖能 力，而在正常細胞株BJ中的增殖倍數很低。 圖10表示SG511-CCL5治療組同其他對照組相比，顯示出更強的抑制腫瘤生長作 用，腫瘤體積一直明顯小於對照組，有顯著統計學差異(P < 0. 05)，說明嵌合增殖型腺病毒 SG511-CCL5對肝癌動物模型有很強的抗腫瘤作用，能明顯抑制腫瘤的生長發展。
發明詳述 下面通過實施例闡述本發明的實施方式，所述實施例僅用於例示性闡示本發明， 其不限制本發明的保護範圍，本領域技術人員根據本發明通過同等的變型和改良的技術方 案都包含在本發明中。 在實施例中，第一方案以人端粒酶逆轉錄酶(hTERT)啟動子控制5型腺病毒Ela， 用人缺氧反應元件(HRE)調控Elb區基因(Elb-55kDa和Elb-19kDa基因)為例；第二方案 對Elb-55kDa實施突變，使其失去活性，從而使病毒的增殖獲得腫瘤特異性，構建含11型腺 病毒纖毛蛋白基因的溶瘤腺病毒載體。在實施例的具體實施中，以人趨化因子CCL5基因和 綠色螢光蛋白報告基因(EGFP)為例設立兩種策略，構建攜帶目的基因的腺病毒載體。
具體實施例方式
實施例1 :含11型腺病毒纖毛蛋白基因編碼序列的腺病毒載體pCL0N9-F11的構
建 第一步合成含11型腺病毒纖毛蛋白基因編碼序列如SEQ ID N0:3所示，命名 Ad5Fll，其中(l)第236-369位鹼基5型腺病毒纖毛tail蛋白編碼序列；(2)第367-1216 位鹼基11型腺病毒纖毛shaft、 knob蛋白編碼序列；(3)其餘鹼基5型腺病毒基因組序 歹lj， i Microbix Biosystems &^]白勺pBHGloxdeltaEl， 3Cre ，歹lj。第二步合成VT176序列(SEQ ID NO :4)禾PVT177序列(SEQ IDNO :5)，構建pCL0N9
10載體。Ad5F11序列經Pacl+Hindlll酶切，回收2656bp片段，與pCL0N9/PacI+Hind111酶切 的載體連接，構建成pCL0N9-Fll，經酶切和測序鑑定確認。構建步驟如圖l所示。
實施例2 :BJ5183細胞內同源重組第一步pCL0N9-F11經HindlII+Aat11酶切，回收5913bp片段。 第二步合成ADP序列(SEQ ID NO :6)，如圖2所示，構建腺病毒包裝質粒pPE3。第三步pPE3載體經PacI酶切，回收線性化載體。pCL0N9-Fll/HindlII+Aat11 4
微升，pPE3/PacI 2微升，共同轉化感受態大腸桿菌BJ5183(Qbiogene公司)。鋪板培養，
挑取克隆進行酶切鑑定，正確者命名為pPE3-Fll，經大樣質粒提取純化，保存於深低溫冰箱
中。pPE3-F11構建流程如圖3所示。 實施例3 :含Adll腺病毒纖毛蛋白基因的腺病毒在體外對培養細胞的感染力實驗
第一步以人端粒酶逆轉錄酶(hTERT)啟動子控制5型腺病毒Ela，插入位點 Notl+Swal，構建腺病毒載體pQW-hTERT-Ep-HRE (見專利ZL028138198， 一種高效表達抗癌 基因的腫瘤細胞內特異性增殖的病毒及其用途；現改名為pSG502)。其中hTERT啟動子調控 Ela基因，同時用人缺氧反應元件(HRE)調控Elb區基因(Elb-55kDa和Elb-19kDa基因)。 所述hTERT啟動子核心序列如SEQ ID NO :7所示，缺氧反應元件HRE序列如SEQ ID NO :8 所示。 第二步將EGFP基因(SEQ ID NO :9)插pSG502，構建成pSG502-EGFP， EGFP插入 位點為EcoRI+SalI。 第二步含有EGFP基因的腺病毒質粒pSG502-EGFP與骨架質粒pPE3_Fll共轉染 HEK293細胞(購於加拿大Microbix Biosystems公司，該細胞由剪切的5型腺病毒DNA轉 化，含5型腺病毒El區，腺病毒DNA對其具有高轉染率，通過細胞內重組產生具有感染力的 腺病毒)，進行細胞內重組。轉染具體方法步驟參見Invitrogen公司的LipoFectamine2000 試劑盒操作說明書。重組產物經PCR鑑定正確者命名為SG511-EGFP。 EGFP基因PCR引物 為上遊引物5'-GCTCTAGAGAATTCACCATGGTGAGCAAGGGC-3' (SEQ ID NO : 10)，下遊引物5'-CGGGATCCGTCGACTTATTACCTAGATCCGGTGG-3， (SEQ ID NO :11)，擴增片段793bp。
第三步將EGFP基因插入腺病毒質粒pDC315 (MicrobixBiosystems公司)中的 EcoRI+Sall位點，構建成pDC315-EGFP，與骨架質粒pPE3進行細胞內重組，重組產物經PCR 鑑定正確者命名為Ad5-EGFP，作為對照病毒。該對照病毒為含5型腺病毒纖毛蛋白基因的 病毒載體。 第四步正常細胞株和腫瘤細胞株分別按5X 105細胞/孔鋪在6孔板中，在37°C 孵箱5% C02培養，第二天換無血清液體lml，然後按MOI = 10分別加入重組溶瘤腺病毒 SG511-EGFP和Ad5-EGFP， 24小時後螢光顯微鏡下觀察。 觀察結果圖4中為L02正常肝細胞，M01 = 10感染Ad5-EGFP，螢光細胞約佔25% 左右。圖5中為L02正常肝細胞，M01 = 10感染SG511-EGFP，螢光細胞約佔85X左右。圖 6中為SMMC-7721肝癌細胞，MOI = 10感染Ad5-EGFP，螢光細胞約佔35%左右。圖7中為 SMMC-7721肝癌細胞，M01 = 10感染SG511-EGFP，螢光細胞約佔95%左右。表明SG511-EGFP 感染能力明顯強於Ad5-EGFP。 實施例4 :含11型腺病毒纖毛蛋白基因編碼序列、Elb-55kDa失活的溶瘤腺病毒的
重組
以我們前期構建成功的Elb-55kDa失活的腺病毒載體pXC-delElb (錢其軍等，中 華醫學雜誌.2002,82 :557-560)為基礎，與pPE3_Fll共轉染HEK293細胞，重組含11型腺 病毒纖毛蛋白基因編碼序列的腺病毒SG211，該病毒Elb-55kDa失活，獲得在腫瘤細胞內特 異增殖的能力。 實施例5 :攜帶抗腫瘤基因的腺病毒載體的構建 本發明提供一種含11型腺病毒纖毛蛋白基因的重組溶瘤腺病毒，其特徵在於，通 過基因缺失或者基因調節的有效控制，使其選擇性地在腫瘤細胞內增殖；其基因組中預置 了多克隆位點，該位點可以攜帶各種抗腫瘤基因表達盒。溶瘤腺病毒載體以人端粒酶逆轉 錄酶(hTERT)啟動子控制5型腺病毒Ela基因，同時用人缺氧反應元件(HRE)調控Elb區 基因(Elb-55kDa和Elb-19kDa基因)為例，抗腫瘤基因以人趨化因子CCL5基因為例。同 時構建非增殖的腺病毒載體為對照病毒。 第一步以人端粒酶逆轉錄酶(hTERT)啟動子控制5型腺病毒Ela，插入位點 Notl+Swal，構建腺病毒載體pSG502 (見專利ZL028138198)。其中hTERT啟動子核心序列 如SEQ ID NO :7所示。 第二步合成含有人趨化因子CCL5基因核苷酸序列(SEQ IDN0 :12)，其 5'端和3'端分別引入EcoRI和BamHI位點，經EcoRI+BamHI酶切後分別插入質粒 pENTRll(Invitrogen LifeTechnology Inc.)和pDC315多克隆位點區，構成pENTR12-CCL5 和pDC315-CCL5，再分別與骨架質粒pPE3-F11進行重組，重組產物經酶切鑑定正確者命名 為pPE3-Fll-CCL5和Ad5Fll-CCL5。 實施例6 :含11型腺病毒纖毛蛋白基因的溶瘤腺病毒的細胞內重組及擴增純化
本發明提供一種含11型腺病毒纖毛蛋白基因的增殖型重組溶瘤腺病毒，對腫瘤 細胞具有良好感染能力和靶向性。 第一步將構建好的5型腺病毒質粒pSG502，與含有11型腺病毒纖毛蛋白基因 的雜合腺病毒載體質粒pPE3-Fll-CCL5，通過LipoFectamine2000共同轉染HEK293細胞。 pPE3-Fll-CCL5含有5型腺病毒右臂，缺失El區，其重組酶系統Cre/LoxP可以保證病毒 的高效重組。在載體共轉染後的9-14天，陸續出現病毒空斑，經過三次病毒空斑純化(具 體方法參見GeneTransfer and Expression Protocols, Murray EJ主編，Humana Press, Clifton， New Jersey)，重組得到溶瘤腺病毒SG511_CCL5。 第二步重組溶瘤腺病毒的鑑定，以腺病毒Ela基因引物排除野生型腺病毒，以人 CCL5基因引物鑑定重組腺病毒是否含有CCL5序列。腺病毒Ela基因引物上遊引物5' _c ggaattcaccatgagacatattatc-3， (SEQ ID NO : 13)，下遊引物5，-gcgtcgacttatggcctggggcg -3' (SEQID NO :14)，擴增片段1005bp。人CCL5基因引物為上遊引物5，-CGGAATTCACCATG AAGGTCTCCGCGGCAG-3' (SEQ ID NO :15)，下遊引物5'-CGGGATCCCTATAACTGGAAGTCATCATCCAT TG-3' (SEQ ID NO :16)，擴增片段349bp。 如圖8所示，以人CCL5基因引物擴增1_4號腺病毒克隆，均能擴增出349bp條帶， 與陽性對照(P) —致，說明l-4號腺病毒均含有CCL5基因。 第三步重組溶瘤腺病毒在HEK293細胞中大量擴增，應用氯化銫梯度離心的方法 純化腺病毒(具體方法參見GeneTransfer andExpression Protocols, Murray EJ主編， Humana Press, Clifton， Newjersey)。用TCID50法測得重組溶瘤腺病毒SG511-CCL5的滴度達到2. 79X101Qpf ii /ml。 實施例7 :重組溶瘤腺病毒SG511-CCL5的在體外培養的腫瘤細胞內增殖實驗
正常細胞株和腫瘤細胞株分別按5X 105細胞/孔鋪在6孔板中，在37t:孵箱5% C02培養，第二天換無血清液體lml，然後按MOI = 5加入重組溶瘤腺病毒SG511-CCL5，培養 90分鐘後，用磷酸鹽緩衝液(PBS)洗兩次，將病毒洗去，與加入5%胎牛血清的培養液培養， 分別在0小時、48小時、96小時收集，凍融三次，用TCID50法來檢測病毒滴度(方法參見美 國Qbiogene公司的AdEasyTM操作手冊)。以0小時病毒滴度為參照，算出病毒在48小時、 96小時的增殖倍數，結果發現SG511-CCL5在肝癌細胞中隨著時間呈幾何倍數增殖，具有良 好的增殖能力，而在正常細胞株BJ中的增殖倍數很低，具體如圖9所示。
實施例8 :重組溶瘤腺病毒SG511-CCL5動物實驗 第一步4 6周齡BALB/C裸鼠50隻，平均重量22 27g，由上海中科院實驗動 物培育中心提供，清潔級動物實驗室飼養。 第二步體外培育人肝癌細胞S匪C-7721，取對數生長期貼壁生長細胞，0. 25%胰 酶消化，離心、收集細胞後用PBS液重懸，3000g室溫離心2分鐘，棄上清，再用PBS液重懸後 離心收集細胞，調整細胞懸液濃度至5 X 107個/ml 。 第三步於裸鼠右肋背部皮下接種S匪C-7721細胞，O. lml/只。接種三周左右後， 可見接種部位皮下長出米粒大小硬結，移植瘤模型建成。待瘤體直徑生長至7-9mm時開始 治療。挑選40隻皮下腫瘤生長至7-9mm的S匪C-7721移植瘤進行治療，將裸鼠隨機分分為 5組。給藥途徑為直接瘤內多點注射。 第四步每日觀察小鼠的生活狀態並定期測量腫瘤的體積，定期測量一次腫瘤的 最長徑(A)及其垂直徑(B)，按公式(AXB2)/2計算腫瘤的體積，觀察不同劑量組的療效。
實驗設置帶CCL5基因的非增殖型的腺病毒Ad5Fll-CCL5和不帶CCL5基因的增 殖型腺病毒SG511(其名稱為人腺病毒5/11嵌合型SG511，保藏日為2009年1月9日，保 藏號為CCTCC-V2000903，保藏地點為中國典型培養物保藏中心)為對照病毒。結果發現 SG511-CCL5治療組同其他對照組相比，顯示出更強的抑制腫瘤生長作用，腫瘤體積一直明 顯小於對照組，有顯著統計學差異(P < 0. 05)，說明雜合增殖型腺病毒SG511-CCL5對肝癌 動物模型有很強的抗腫瘤作用，能明顯抑制腫瘤的生長發展(見圖10)。 SG511-CCL5治療 組同其他對照組相比，顯示出更強的抑制腫瘤生長作用，腫瘤體積一直明顯小於對照組，有 顯著統計學差異(P < 0. 05)，說明嵌合增殖型腺病毒SG511-CCL5對肝癌動物模型有很強的 抗腫瘤作用，能明顯抑制腫瘤的生長發展。
序列表 〈110〉第二軍醫大學東方肝膽外科醫院 〈120〉 一種含11型腺病毒纖毛蛋白基因的增殖型重組溶瘤腺病毒、其構建方法及 其用途 〈130〉IDC080XXX
〈160>16 〈170>PatentIn version 3. 2
〈210>1
〈211>981
〈212>DNA〈213〉 11纖毛序列〈400>1atgaagcgcgcaagaccgtctg皿gateccttcaaccccgtgtetccatetg3C3Cgg皿60accggtcctccaactgtgccttttcttectcctccctttgtetcccccaa120gagagtccccctggagttcttgttteacccC3C3ggCgg3180tctctecagcte腿gtggg郷gggactt織gtggatg3C3CC皿Cggttttttgaaa240gtgccaccacaccactcgtt皿gactggtcactcteteggttteccacte300ggagccggattggg朋cg朋ctttgtetca皿tteggac33ggacttec3360ttcaattcaaacaacatttgcattgatgacccttetggacaggagtc皿c420cccaccgaagccaactgtcatccagtgaatcteatgattg■cteacactegttea朋ctggagcactegtcactgcatttgtttetgttetaggagtetct540atetgcteactec3C3C3gattectgcagagctgtttttc600gattctectggteatttectaactegactctcatccctcaaaactccact660tC3gg3C3朋acatggctectggtgccattacteatgcteaaggtttcatgcccagcacg720actgcctetcctttcaatgateattctegaactecatttecggaacttgt780tectecacagctegtgatcgcactgcttttcccattgacatetctgtcatgctteaccga8403gagc朋tea3tg3Cg3g3Catcatettgtattcgteteacttggtcctgg皿C3C3gg3■gatgccccag3ggtgC3朋Cctctgctecaaccctegtcacctccccattteccttttec960tecatcagag朋gacgactg981〈210>2〈211>35655〈212>DNA〈213>Ad5/ll重組載體序列〈220〉〈221>misc—feature〈222〉 (721) (721)〈223>n isa， c， g，或t〈220〉〈221>misc—feature〈222〉 (849) . (849)〈223>n isa， c， g，或t〈220〉〈221>misc—feature〈222〉 (874) . (874)〈223>n isa， c， g，或t〈220〉〈221>misc—feature〈222>(1118) . (1118)
〈223〉n isa， c， g，或t〈220〉〈221〉misc_feature〈222〉(1197). (1197)〈223〉n isa， c， g，或t〈220〉〈221〉misc_feature〈222〉 (2254) (2254)〈223〉n isa， c， g，或t〈400〉2ttettttgga郷gggtggagtttgtgacgtggcgcgggg60cgtggg雄ggggcgggtgacgtegtegtgtggcgg朋gtgtgatgttgc朋gtgtggcg120皿gcgacggatgtggc朋朋gtgacgtttttggtgtgcgccggatccaca180ggacgggtgtggtcgccatgatcgcgtagtcgategtggctccaagtegcg皿gCg3gC3240ggactgggcggcggcca朋gcggtcggacagtgctccgag皿cgggtgcgcatega朋tt300gcatcaacgcatatagcgct3gC3gC3CgCcatagtgactggcgatgctgtcgg朋tgga360cgatetcccgc朋gaggcccggcagteccggcat朋cc朋gcctatgcctacagcatcca420gggtgacggtgccg郷atg3Cg3tg3gCgcattgttagatttcatacacggtgcctgac■tgcgttegcaatttaactgtgate朋cteccgcatte皿gcttetcgttcg咖tttggg540ggatcttcgatgctegacgatccagacatgttgatgagtttgg3C3朋CC600ac朋cteg朋aaaatgcttttttgtgatgctattgcttta660tttgtaaccattataagctggttgctcgaagtcgacgatcCg朋C3朋Cg720nccc朋cacccgtgcgttttattctgtctttttattgccgatcccctcag780c皿g朋ggcgateg皿ggcgatgcgctgcg皿tcgggagcggcgateccgte朋gcacg3840gg朋gcggncagcccattcgccgccatgtttttnagcaatgccaacgcta■tgtcctgatagcggtccgcc3C3CCC3gCCtcgacaattccaacctteccc皿gagttcg960ccaaactcagacatcacttt3gC皿皿CCgcgccgtgcttcttcctcggtggcattcatc1020cagcactecgcatacttttgg3C3gg朋3Cgc皿cggatettgagtcaat1080atcaggcattctatcgctcagctttacagtgacaatgncggctggcgact1140gcttecagacagcactacatattttccgtcgatgttga朋tcctttctcatatgtcncca1200ateattetegcaatcatttacgcgtteatggcteatcgccatcttccagc12603ggCgC3CC3ttgcccctgtttcactetcc郷ttecggatetegttcatgacaatettt1320acattggtccagccaccagcttgcatgatctccggtettgaaactccagcgcgggccate1380tctcgcgcggctccgacacgggcactgtgtCC3g3CC3ggccaggtatctCtg3CC3g3g1440tcatccttegcgccgtaaatc皿tcgatg3gttgcttcaaaaatcccttcc郷gcgcga1500gttgategctggctggtggc卿tggcgcggcaacaccattttttctgacccggc皿皿c1560aggtegttettcggatcatcagctecaccagagacgg3朋tccatcgctcgaccagttta1620gttacccccaggct皿gtgccttctctacacctgcggtgcteaccagcgttttcgttctg1680cc朋tetggattaacattctcccaccgtcagtecgtg卿tetcttteaccctgatcctg
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〈400>3gccgtteattaagatcttettcccttteac60ttctgtccag tttettcagcagcacctcct tgccctcctc120ccagctctggtettgcagcttcctcctggctgcaaactttctccacaatc teaatggaat180gtcagtttcctcctgttcctgtccatccgcacccactetcttcatgttgt tgcagatgaa240gcgcgcaagaccgtctgaagateccttcaa ccccgtgtetccatetg3C3 cgga皿ccgg300tcctccaactgtgccttttcttectcctccctttgtetccccc皿tgggt ttc皿gagag360tccccctggagttcttectt皿ccccactaacaaccacag gcggatctct4203C3gctea朋gtggg郷gggacttecagtgg3tg3C3CC皿Cggttttt tg皿3g皿皿■cateagtgcc3CC3C3CC3Ctcgtteagactggtcactctateggtttec cacteggagc540cggattgggaggac皿ggac ttecattc皿600atttgcattgatgac皿tetteacaccttatgg3C3gg3g tc皿ccccac660cg皿gcc皿ctgtcaaatcatgaactccag tgaatcteatgattgcaaat teattcteac720actegtte皿3Ctgg3gC3Ctegtcactgcatttgtttetgtteteggag tetcteac皿780tttteatetgcteactecacgcagagctgt ttttcgattc840
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〈212>DNA〈213>引物序列〈400>5agctteatte atctegatgcggccgcggatccactagtctcgagaccggtc51〈210>6〈211>1067〈212>DNA〈213>5型腺病毒ADP基因序列〈400>6tgacacatgc agctcccggag3CggtC3C3gcttgtctgtaagcggatgcCgggElgC卿60caagcccgtc agggcgcgtcagcgggtgttggcgggtgtcggggctggctteactetgcg120gcatcagagc agattgtectgagagtgcaccatetgcggtgtga朋teccgcacagatgc180gteaggag朋朋teccgcatcaggcgccattcgccattcaggctgcgcaactgttggg朋240gggcgatcgg tgcgggcctcttcgctettecgccagctggcg腿gggggatgtgctgca300aggcgattea gttgggteacgccagggttttcccagtcacgacgttgtea朋cgacggcc360agtgaattga ccggtctcgag￡ictegtgg￡itccgcggccgccgcteccggacttecatct4203cc3ca朋te cacccc朋gtttctgcctttgtcaateactgggateacttgggCEltgtgg■tggttctcca tegcgcttetgtttgtetgccttettettetgtggctcatctgctgccte540朋gcgca朋c gcgcccgaccacccatctetagtcccatcattgtgcteca600gatgg朋tcc ategattggaCgg3Ctg朋3cacatgttcttttctcttacagtetgatte660朋tgag3cat gattcctcgagtttttetettectgacccttgttgcgctttttttgtgcg720tgctccacat tggcteagteategtteatt朋gcttggcgteatcatggtcategctgtt780tcctgtgtga aattgttetccgctcacaattCC3C3C朋Catecgagccgg朋gcate朋840gtgteaagcc tggggtgcct￡l￡ltg￡lgtg￡lgcteactcacatteattgcgttgcgctcact■gcccgctttc cagtcgggaaacctgtcgtgccagctgcatteatg朋tcggccaacgcgc960ggggEl卿gg cggtttgcgtattgggcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgc1020gctcggtcgt tcggctgcgg cgagcggtetcagctcactc咖ggcg1067〈210>7〈211>271〈212>DNA〈213>hTERT啟動子核心序列〈400>73g3tctC3C3 gacgcccaggaccgcgcttcccacgtggcgg3ggg3Ctgg gg3CCCgggC60acccgtcctg ccccttcaccttccagctccgcctcctccgcgcggaccccgccccgtccc120gacccctccc gggtccccggcccagccccctccgggccctcccagcccctccccttcctt180tccgcggccc cgccctctcctcgcggcgcgagtttcaggcagcgctgcgtcctgctgcgc240acgtgggaag ccctggccccggccactcgag271〈210>8〈211>247
〈212>DNA〈213>HRE序列〈400>8actegtccacagtgcatecg tgggctccaacaggtcctcttccacagtgc atecgtgggc60tccaacaggtcctcttccac3gtgcatecgtgggctccaacaggtcctct tccacagtgc120atecgtgggctccaacaggtcctcttccac3gtgcatecgtgggctccaa caggtcctct180tggteggcgtgtecggtggg aggtctetet皿gcagagctcgtttegtga accgtcagat240cactegt247〈210>9〈211>747〈212>DNA〈213>EGFP報告基因序列〈400>9EltggtgElgCElElgggCgElggElgctgttcaccggggtggtgcccatcctggt cgagctggac60ggcgacgtea3CggCC3C朋gttcagcgtgtccggcgagggcgagggcga tgccacctec120ggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggc皿gctgcccgtgcc ctggcccacc180ctcgtgaccaccctgacctecggcgtgcagtgcttcagccgcteccccga ccacatgaag240cagcacgacttcttcaagtccgccatgcccg皿ggctecgtccaggagcg caccatcttc300ttc朋ggacgacggc朋ctecaagacccgcgccg郷tga3gttCg3ggg Cg3C3CCCtg360gtg朋ccgcatcgagctg朋gggcatcgac3CggC皿C3t cctggggcac420朋gCtgg3gtC3gCC3C皿Cgtctetetcatggccgac皿gcag皿g皿c■ggcatcaaggtgaacttcaagatccgccac皿C3tCg3ggacggcagcgt gcagctcgcc540gaccactecc3gC3g朋C3Cccccatcggcgacggccccgtgctgctgcc cgacaaccac600tecctgagcacccagtccgcCCtg3gC皿3gaccccaacg3g皿gcgcga tcaratggtc660ctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagct gtec皿gtcc720ggactcagatccaccggatcteggtea747〈210>10〈211>32〈212>DNA〈213>引物序列〈400>10gctctegagaattcaccatg:gtgagc卿g gc32〈210>11〈211>34〈212>DNA〈213>引物序列〈400>11cgggatccgtcgacttatta,cctagatccg gtgg34〈210>12
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一種增殖型重組溶瘤腺病毒，其特徵在於該重組腺病毒含B亞群11型腺病毒纖毛頭的胺基酸編碼序列；並且該病毒基因組至少一個病毒增殖必需基因被突變或者被缺失而失去功能，或所述病毒在增殖必需基因序列的轉錄起始位點與翻譯起始位點ATG之間可操作地插入順式作用元件，所述元件控制基因組中至少一個病毒增殖必需基因的轉錄。
2. 權利要求l的增殖型重組溶瘤腺病毒，其特徵在於該重組腺病毒纖毛頭的胺基酸序 列為人類B亞群11型腺病毒纖毛頭的胺基酸序列。
3 根據權利要求1所述的增殖型重組溶瘤腺病毒，其特徵在於所述病毒在增殖必需基 因序列的轉錄起始位點與翻譯起始位點ATG之間可操作地插入的是腫瘤特異性啟動子的 順式作用元件。
4. 根據權利要求3所述的增殖型重組溶瘤腺病毒，其特徵在於所述腫瘤特異性啟動子 選自(a) 癌胚抗原啟動子、增強子及其突變體序列；(b) 甲胎蛋白啟動子、增強子及其突變體序列；(c) 人表皮生長因子受體家族的受體酪氨酸激酶啟動子、增強子及其突變體序列；(d) 乳腺癌相關抗原DF3/MUC1啟動子、增強子及其突變體序列；(e) 血管內皮生長因子受體KDR的啟動子、增強子及其突變體序列；(f) L-plastin啟動子、增強子及其突變體序列；(g) 凋亡抑制蛋白家族成員的啟動子、增強子及其突變體序列；(h) 前列腺素特異性抗原的啟動子、增強子及其突變體序列；(i) 缺氧誘導因子-1調控的缺氧反應元件保守序列； (j)轉錄因子E2F啟動子、增強子及其突變體序列；禾口 (k)人端粒酶亞基啟動子、增強子及其突變體序列 中的至少一種。
5 根據權利要求1所述的增殖型重組溶瘤腺病毒，其特徵在於所述病毒增殖必需基因 是野生型的或者經過突變的編碼Ela、Elb-55kDa、Elb-19kDa、E2或E4的基因。
6. 根據權利要求l所述的增殖型重組溶瘤腺病毒，其特徵在於所述病毒增殖必需 基因是經過點突變、插入突變、插入終止密碼子、完全或部分缺失而失活的Elb-55kDa或 Elb-19kDa基因。
7. 根據權利要求1所述的增殖型重組溶瘤腺病毒，其特徵在於其還可操作地連接有外 源基因表達盒。
8. 根據權利要求7所述的增殖型重組溶瘤腺病毒，其特徵在於所述外源基因選自(a) 幹擾素類免疫調節因子的基因；(b) 白細胞介素類免疫調節因子的基因；(c) 細胞集落剌激因子的基因；(d) 抑癌基因;(e) 原癌基因的反義序列；(f) 人腫瘤表皮生長因子受體家族的抗體基因；(g) 編碼抗血管生成因子的內皮抑素、血管抑素及其片段、纖溶酶原激活因子抑制劑、 Canstatin、血小板反應蛋白的核苷酸序列；(h) 細胞凋亡誘導因子家族的基因；(i) 血管內皮生長因子抗體的基因；(j)自殺基因；禾口(k)腫瘤壞死因子的基因中的至少一種。
9. 根據權利要求1所述的增殖型重組溶瘤腺病毒，其特徵在於所述病毒載體為選自C亞群的2型或者5型腺病毒中的至少一種。
10. 權利要求1的增殖型重組溶瘤腺病毒，其保藏日為2009年1月9日，保藏編號為CCTCC-V200903 ，保藏地點為中國典型培養物保藏中心。
11. 構建權利要求2所述的增殖型重組溶瘤腺病毒的方法，其特徵在於通過基因工程方法用人類B亞群11型腺病毒纖毛頭的胺基酸序列取代非11型腺病毒的纖毛頭胺基酸序列；且使所述病毒的至少一個增殖必需基因被突變或者被缺失而失去功能，或使所述病毒在增殖必需基因序列的轉錄起始位點與翻譯起始位點ATG之間可操作地插入順式作用元件，所述元件控制基因組中至少一個病毒增殖必需基因的轉錄。
12. 權利要求1所述增殖型重組溶瘤腺病毒載體，其作為基因的載體而用於製備基因治療藥物。
全文摘要
本發明涉及基因工程學和病毒學，尤其涉及一種含人類B亞群11型腺病毒纖毛蛋白基因的增殖型重組溶瘤腺病毒、其構建方法及其用途。該腺病毒可以是11型腺病毒，也可以是用11型腺病毒纖毛蛋白的編碼序列取代非11型腺病毒的纖毛蛋白編碼序列而構成的雜合腺病毒。該腺病毒通過對其增殖必須基因進行的有效控制或突變而具有選擇性增殖能力。作為具有更廣的感染譜和改良感染能力的條件增殖型的重組病毒，本發明的重組溶瘤腺病毒可以用於基因治療尤其是腫瘤的基因治療。
文檔編號A61P35/00GK101781636SQ20091004551
公開日2010年7月21日 申請日期2009年1月19日 優先權日2009年1月19日
發明者吳孟超, 吳紅平, 李琳芳, 蘇長青, 錢其軍 申請人:中國人民解放軍第二軍醫大學東方肝膽外科醫院